Summary
Une méthode pour l’analyse non ciblée des métabolites et des lipides de grain de blé est présentée. Le protocole comprend une méthode d’extraction de métabolites en acétonitrile et une méthodologie de spectrométrie de chromatographie-masse liquide inversée, avec acquisition dans des modes d’ionisation électrospray positive et négative.
Abstract
Comprendre les interactions entre les gènes, l’environnement et la gestion dans la pratique agricole pourrait permettre une prévision et une gestion plus précises du rendement et de la qualité des produits. Les données sur la métabolomique fournissent une lecture de ces interactions à un moment donné et sont informatives sur le statut biochimique d’un organisme. En outre, les métabolites individuels ou des panneaux de métabolites peuvent être utilisés comme biomarqueurs précis pour la prévision et la gestion des rendements et de la qualité. Le métabolome végétal devrait contenir des milliers de petites molécules aux propriétés physicochimiques variées qui offrent une occasion de perspicacité biochimique sur les traits physiologiques et la découverte de biomarqueurs. Pour exploiter cela, l’un des principaux objectifs des chercheurs en métabolomique est de saisir autant de diversité physicochimique que possible au sein d’une seule analyse. Nous présentons ici une méthode de métabolomique non ciblée basée sur la chromatographie liquide-masse pour l’analyse du grain de blé cultivé sur le terrain. La méthode utilise le gestionnaire de solvant quaternary chromatographique liquide pour introduire une troisième phase mobile et combine un gradient traditionnel de phase inversée avec un gradient de lipide-amenable. La préparation des grains, l’extraction de métabolites, l’analyse instrumentale et les flux de travail de traitement des données sont décrits en détail. Une bonne précision de masse et la reproductibilité du signal ont été observées, et la méthode a donné environ 500 dispositifs biologiquement pertinents par mode d’ionisation. En outre, des signaux de fonction méabolite et lipidique significativement différents entre les variétés de blé ont été déterminés.
Introduction
Comprendre les interactions entre les gènes, l’environnement et les pratiques de gestion dans l’agriculture pourrait permettre une prévision et une gestion plus précises du rendement et de la qualité des produits. Les métabolites végétaux sont influencés par des facteurs tels que le génome, l’environnement (climat, précipitations, etc.) et dans un contexte agricole, la façon dont les cultures sont gérées (c.-à-d. l’épandage d’engrais, les fongicides, etc.). Contrairement au génome, le métabolome est influencé par tous ces facteurs et donc les données métabololomics fournit une empreinte biochimique de ces interactions à un moment donné. Il y a habituellement l’un des deux objectifs d’une étude basée sur la métabolomique : premièrement, pour parvenir à une compréhension plus profonde de la biochimie de l’organisme et aider à expliquer le mécanisme de réponse à la perturbation (stress abiotique ou biotique) par rapport à la physiologie; et deuxièmement, associer les biomarqueurs à la perturbation à l’étude. Dans les deux cas, le résultat de cette connaissance est une stratégie de gestion plus précise pour atteindre l’objectif d’améliorer la taille et la qualité des rendements.
Le métabolome végétal devrait contenir des milliersde petites molécules aux propriétés physicochimiques variées. À l’heure actuelle, aucune plateforme de métabololomie (principalement la spectrométrie de masse et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire) ne peut capturer le métabolome entier en une seule analyse. Le développement de ces techniques (préparation d’échantillons, extraction et analyse de métabolites), qui fournissent une couverture aussi importante que possible du métabolome au sein d’une seule série analytique, est un objectif clé pour les chercheurs en métaabolomique. Les analyses médabolomics non ciblées antérieures du grain de blé ont combiné les données de multiples séparations chromatographiques et les polarités d’acquisition et/ou l’instrumentation pour une plus grande couverture métabolome. Toutefois, cela a exigé que les échantillons soient préparés et acquis séparément pour chaque modalité. Par exemple, Beleggia et coll.2 ont préparé un échantillon dérivatisé pour l’analyse GC-MS des analytes polaires en plus de l’analyse GC-MS des analytes nonpolaires. Das et coll.3 ont utilisé des méthodes GC- et LC-MS pour améliorer la couverture dans leurs analyses; toutefois, cette approche nécessiterait généralement des préparations d’échantillons distinctes telles que décrites ci-dessus ainsi que deux plates-formes d’analyse indépendantes. Les analyses antérieures des céréales de blé à l’aide de GC-MS2,3,4 et LC-MS3,5 plates-formes ont donné 50 à 412 (55 identifiés) caractéristiques pour GC-MS, 409 pour les plates-formes combinées GC-MS et LC-MS et plusieurs milliers pour une analyse lipidomicique LC-MS5. En combinant au moins deux modes en une seule analyse, une couverture métabolome étendue peut être maintenue, augmentant la richesse de l’interprétation biologique tout en offrant des économies dans le temps et le coût.
Pour permettre la séparation efficace d’un large éventail d’espèces lipidiques par chromatographie de phase inversée, les méthodologies lipidiques modernes utilisent généralement une forte proportion d’isopropanol dans le solvant d’elution6, fournissant une commodité aux classes lipidiques qui pourraient autrement ne pas être résolues par la chromatographie. Pour une séparation efficace des lipides, la phase mobile de départ est également beaucoup plus élevée dans la composition organique7 que les méthodes chromatographiques de phase inversée typiques, qui considèrent d’autres classes de molécules. La composition organique élevée au début du gradient rend ces méthodes moins adaptées à de nombreuses autres classes de molécules. Plus particulièrement, la chromatographie liquide de phase inversée emploie un gradient de solvant binaire, commençant par une composition principalement aqueuse et augmentant dans la teneur organique pendant que la force d’elution de la chromatographie est augmentée. À cette fin, nous avons cherché à combiner les deux approches pour parvenir à la séparation des classes de lipides et non-lipidiques des métabolites au sein d’une seule analyse.
Ici, nous présentons une méthode chromatographique qui utilise une troisième phase mobile et permet une phase inversée traditionnelle combinée et une méthode de chromatographie lipidique appropriée à l’aide d’une seule préparation d’échantillon et d’une colonne analytique. Nous avons adopté bon nombre des mesures de contrôle de la qualité et des étapes de filtrage des données qui ont déjà été mises en œuvre dans des études méabolomics principalement cliniques. Ces approches sont utiles pour déterminer les caractéristiques robustes avec une recrétabilité technique élevée et la pertinence biologique et exclut celles qui ne répondent pas à ces critères. Par exemple, nous décrivons l’analyse répétée de l’échantillon8, qc correction9,données filtrant9,10 et l’imputation des entités manquantes11.
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Protocol
Cette méthode est appropriée pour 30 échantillons (environ 150 graines par échantillon). Trois répliques biologiques de dix variétés de blé cultivées sur le terrain ont été utilisées ici.
1. Préparation des grains
- Récupérez des échantillons (grains entiers) dans un stockage de -80 oC.
REMARQUE : Le séchage du gel des graines est recommandé peu de temps après la récolte si des échantillons sont prélevés sur plusieurs saisons. Cela minimise tout changement dans la concentration de métabolites qui peuvent se produire après différentes périodes de stockage. Pour ce faire, transférer les graines dans un tube de centrifugeuse en plastique de 15 ml (environ 300 graines rempliront le tube) et recouvrir de papier d’aluminium. Percer le papier d’aluminium deux-trois fois à l’aide d’une épingle et congeler sécher les grains entiers pendant la nuit (environ 24 h). Les échantillons peuvent être retournés au congélateur de -80 oC à ce stade, soit l’étape suivante peut être effectuée. - Broyer les graines à l’aide d’un mélangeur de laboratoire pour deux pistes en mode élevé pour 20 s.
REMARQUE : Le mélangeur utilisé pour ce protocole nécessite un minimum d’environ 150 graines pour remplir le mélangeur à la hauteur de la lame et donner un échantillon de grain relativement homogène moulu. - Retirer le mélangeur de la base et appuyez sur le côté du mélangeur pour amener tout grain grossièrement moulu à la surface de l’échantillon. Les matières grossières peuvent être jetées ou entreposées.
- Transférer le matériau finement moulu ressemblant à de la poudre du mélangeur à un tube de microcentrifuge en plastique de 2 ml.
REMARQUE : Laver le mélangeur avec de l’eau déionisée et rincer avec le MeOH de qualité LC-MS entre les échantillons. Assurez-vous que le mélangeur est complètement sec avant de passer à l’échantillon suivant. - Remettre les échantillons de grain finement moulu au congélateur ou passer à l’étape suivante (extraction de métabolites).
2. Préparation du solvant d’extraction
REMARQUE : Préparer le solvant d’extraction le même jour que l’exécution des extractions.
- Préparer au moins 2 ml de 1 mg/mL de chaque norme. Utilisez l’acétylure (ACN) pour préparer 2-aminoanthracene, miconazole et d6-acide transcinnamique. Utilisez de l’eau pour préparer 13C6-sorbitol.
- Prendre 2 ml de chaque norme de 1 mg/mL et ajouter à un flacon volumetricrique de 100 ml.
- Remplir le flacon volumetrique à la ligne avec de l’acétonitrile. Assurez-vous que 100 ml d’acétonitrile contiennent 20 g/mL de chacune des normes internes : 2-aminoanthracene, miconazole, 13C6-sorbitol, d6-acide transcinnamique.
3. Extraction de métabolites
- Peser 200 mg de grain finement moulu dans un tube de microcentrifuge de 2 ml.
- Ajouter 500 l de solvant d’extraction à 200 mg d’échantillon de grain finement moulu.
- Mélanger à l’aide d’un homogénéisateur pour 2 pistes de 20 s à 6500 tr/min.
- Centrifugeuse à 4 oC pendant 5 min à 16 100 x g.
- Transférer le supernatant dans un tube en plastique de 2 ml.
- Répétez cette procédure des étapes 3.1 à 3.5 deux fois plus pour donner un volume supernatant total d’environ 1,5 mL.
- Vortex pour mélanger le supernatant.
- Transférer un volume égal (55 ll) de chaque extrait dans un tube séparé de 2 ml pour faire un échantillon d’extrait de grain mis en commun.
- Transférer un aliquot de 50 L de l’extrait dans une fiole de verre.
REMARQUE : Les extraits peuvent être congelés (-80 oC) à ce stade ou passer à l’étape suivante et donner suite à l’analyse LC-MS.
4. Préparation de solutions pour l’analyse LC-MS
AVERTISSEMENT : Pour l’acide concentré, ajoutez toujours de l’acide à l’eau/solvant.
- Préparer 50 ml de solution de stock formate d’ammonium de 1 M. Peser 3.153 g de format d’ammonium et transférer à un flacon volumetrique de 50 ml. Remplissez le flacon volumetrique à la ligne avec LC-MS grade H2O.
- Préparer 1 L de la phase mobile A composée de format ammonium de 10 mM, 0,1% d’acide formique. Pour ce faire, ajoutez environ 500 ml d’eau de qualité LC-MS à un flacon volumetrique de 1 L. Ajouter 10 ml de 1 M de stock de format d’ammonium et 1 ml d’acide formic. Remplissez le flacon volumetrique à la ligne avec LC-MS grade H2O. Transférer à une bouteille de 1 L et sonicate pendant 15 min à degas.
- Préparer 1 L de phase B mobile composée de format ammonium de 10 mM en 79:20:1 acetonitrile:isopropyl alcool:eau, 0,1% rapport acide formic. Ajouter 200 ml d’isopropanol à un flacon volumetrique de 1 L. Ajouter 10 ml de 1 M de stock de format d’ammonium et 1 ml d’acide formic. Remplissez le flacon volumetrique à la ligne avec l’acétonitrile. Transférer à une bouteille de 1 L et sonicate pendant 15 min à degas.
REMARQUE : Diluer le format ammonium de 1 M dans l’alcool isopropyl (IPA) avant d’ajouter l’ACN. Le format Ammonium est insoluble en CAN. - Préparer 1 L de la phase C mobile composée de format ammonium de 10 mM dans le rapport de 89:10:1 isopropyl alcool:acetonitrile:eau. Pour ce faire, ajoutez environ 500 ml d’isopropanol, 10 ml de stock de format d’ammonium de 1 M et 100 ml d’acétonitrile à un flacon volumetrique de 1 L. Remplir à la ligne avec de l’isopropanol. Transférer à une bouteille de 1 L et sonicate pendant 15 min à degas.
- Préparation des solvants de lavage du système LC-MS
- Remplacez la solution de lavage à la tête de pompe par une solution fraîche. Utilisez 50 % de méthanol, 10 % d’alcool isopropyl ou autre, comme le recommande le fabricant.
- Préparer des solutions de lavage d’aiguilles solides et faibles pour laver la fluidité d’injection avant et après l’injection de l’échantillon. Pour le lavage fort, ajouter des volumes égaux d’ACN et IPA. Pour le lavage faible, préparer une solution de 10% ACN (nécessitant environ 500 ml et 1 L de chacun des lavages forts et faibles respectivement pour ce protocole et le nombre d’échantillons) dans des bouteilles séparées.
- Réglez les volumes de lavage d’aiguilles à 600 L et 1800 L pour les lavages forts et faibles, respectivement.
5. Préparation d’échantillons pour l’analyse LC-MS
- Selon la procédure d’exploitation standard des fabricants pour la préparation de 400 ng/L leucine enkephalin, pipette 7,5 ml d’eau dans le flacon de 12 ml de leucine-enkephalin contenant 3 mg de leucine-enkephalin. Congeler à -80 oC en aliquots de 50 l.
- Préparer 100 ml de 5 % d’ACN contenant 200 ng/mL leucine-enkephalin (50 lL de 400 ng/L leucine enkephalin). Préparez-vous le même jour que l’analyse LC-MS.
- Ajoutez 950 L d’acétonitrile de 5 % contenant la leucine-enkephaline standard d’injection à l’aliquot de l’échantillon de 50 L préparé à partir de l’étape 3.
- Vortex pour mélanger l’échantillon préparé.
6. Configuration LC-MS
REMARQUE : Une description détaillée de la configuration de la méthode d’instrument et d’acquisition est décrite dans le guide utilisateur du fabricant. Un guide général et les détails spécifiques à ce protocole sont décrits ci-dessous. Les étapes suivantes peuvent être complétées à tout moment avant d’acquérir les données.
- Ouvrez un profil matériel LC-MS.
- Configurez la méthode chromatographique telle qu’décrite dans le tableau 1. Assurez-vous que le système LC est équipé d’un gestionnaire de solvants quaternary pour mettre en place ce gradient.
REMARQUE : L’IPA est un solvant visqueux. Il devrait être introduit à un faible débit et un temps d’équilibre suffisant devrait être utilisé avant d’augmenter la composition à 98,0%. Ces mesures empêcheront le système LC de surpressurer et d’arrêter. - Configurez les méthodes d’acquisition de spectromètres de masse pour chacun des modes ToF-MS positifs et négatifs sur la gamme m/z 50-1 300.
REMARQUE : L’instrument utilisé pour les travaux présentés ici nécessite des méthodes positives et négatives pour être calibrés et exécutés individuellement (c.-à-d. que la polarité de commutation dans une méthode n’est pas possible). - Si la colonne LC est nouvelle, conditionnez la colonne selon la recommandation du fabricant.
REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être franchies directement avant l’acquisition de données. - Dans un profil matériel « MS uniquement », étalonner le spectromètre de masse selon les recommandations du fabricant. Terminez cette étape avant chaque mode d’acquisition, en veillant à ce que le système se stabilise dans chaque modalité donnée avant l’étalonnage.
- Purger et rincer le système de fluidité LC à l’aide de solvants de qualité LC-MS, y compris les solvants mobiles de phase et de lavage.
- Équilibrez le système LC en utilisant les conditions de démarrage de la méthode LC, en veillant à ce que la pression de la colonne se stabilise.
- Injecter du format de sodium (0,5 mM dans 90 % d’IPA) au début de la séquence de l’échantillon (décrite ci-dessous) pour vérifier l’étalonnage de l’instrument.
- Configurez la table de séquence d’instruments de sorte que les blancs solvables et préparatoires (extraction) soient analysés en premier ; suivis d’échantillons de QC mis en commun (6-10) pour le conditionnement du système; puis la liste d’échantillons randomisées avec échantillons de QC s’exécute à intervalles réguliers (p. ex., chaque injection sur cinq) comme réplique technique. Exécuter deux échantillons de QC à la fin de la séquence.
REMARQUE : Il est utile d’inclure la date et l’ordre d’injection/acquisition dans le nom de fichier de l’échantillon ainsi que l’id d’échantillon. Par exemple : YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological réplique. Avant de commencer, assurez-vous que la pression de la colonne LC est stable et que le LC est connecté à la SP.
7. Traitement des données
REMARQUE : Un flux de travail général de traitement des données est présenté à la figure 1.
- Vérifiez la qualité des données (précision de masse standard interne (calcul ci-dessous) et reproductibilité du signal) pendant que la séquence est en cours d’exécution. Pour vérifier la reproductibilité du signal, l’inspection visuelle des spectres superposés devrait suffire.
REMARQUE : Erreur de masse (ppm) ((masse théorique - masse mesurée) / masse théorique) x 106 - Générer une matrice alignée d’intensité de pointe contenant des échantillons x normes internes (alignées par le temps de rétention et les valeurs m/z).
- Ouvrez le logiciel de traitement des données (voir Tableau des matériaux). Sous la maison et Ouvrez,cliquez sur Données. Naviguez vers l’emplacement approprié du fichier et ouvrez tous les fichiers de données.
- Sous la maison 'gt; Séquence 'gt; Type de Traitement, sélectionnez Quantitation à partir du menu drop-down.
- Sous la maison -gt; Méthode -gt; Quan, cliquez sur Les composants de calibration. Remplissez chaque champ à l’aide des détails fournis dans le tableau 2. Cliquez sur OK.
- Sur le panneau gauche dans les colonnes à côté des fichiers de données, remplissez le type d’échantillon en cliquant à droite sur la cellule et en sélectionnant Inconnu. Remplissez le niveau comme n/a.
- Sous la maison et le traitement, sélectionnez Séquence. Choisissez un emplacement pour enregistrer la séquence, puis cliquez sur Processus.
- Sous la maison et les résultats, sélectionnez Quan. Du spectateur Quan, sélectionnez Export fonctionne à l’analyseur de matrice.
- Du visualiseur des résultats de l’analyseur de matrice, cliquez sur Export en csv. Enregistrez le fichier sous forme de fichier de tableur.
- Dans les logiciels de feuilles de calcul, calculez l’écart moyen, standard et l’écart relatif standard de l’intensité (zone de pointe) de chaque norme interne.
- Générer une matrice alignée d’intensité de pointe contenant des échantillons x caractéristiques non ciblées (alignées par le temps de rétention et les valeurs m/z).
- Ouvrez le logiciel d’analyse de découverte de petites molécules (voir Tableau des matériaux) et sélectionnez Le fichier et le nouveau pour créer une nouvelle expérience. Nommez l’expérience et choisissez l’emplacement pour enregistrer et stocker des fichiers expérimentaux. Cliquez sur Next.
- Sélectionnez le type d’instrument utilisé (spectromètre de masse haute résolution), le format de données (profil) et la polarité (positive ou négative). Cliquez sur Next. Sélectionnez tous les adducts disponibles dans la bibliothèque et modifiez la bibliothèque d’adducts au besoin. Cliquez sur Créer l’expérience. Une nouvelle page se chargera là où le reste du traitement des données se poursuivra/se produira.
- Importer des fichiers de données. Sélectionnez le format de fichier, puis sélectionnez l’importation. Naviguez vers l’emplacement des données et sélectionnez les fichiers de données à importer. L’avancement sera affiché pour chaque fichier sur le panneau gauche de la page.
- Une fois les fichiers de données importés, sélectionnez Démarrer le traitement automatique. Choisissez une méthode pour choisir une référence d’alignement. Laissez le logiciel évaluer tous les exécutions pour la pertinence, donner une liste d’échantillons appropriés (c.-à-d., échantillons de QC) ou choisir la référence la plus appropriée, c’est-à-dire un échantillon de MI-séquence QC. Sélectionnez Oui, alignez automatiquement mes courses .gt; Next.
- Sélectionnez Suivant sur la page de conception de l’expérience (cela peut être configuré plus tard).
- Sélectionnez Effectuer Peak Picking, puis définir les paramètres. Sous l’onglet Peak Picking Limits, sélectionnez l’intensité absolue de l’Ion et entrez 100. Sélectionnez appliquer une largeur de pointe minimale et entrer 0,01 min. Sélectionnez OK -gt; Finition. Lorsque le traitement est terminé, sélectionnez Fermer.
REMARQUE : Les limites de sélection maximale peuvent être optimisées pour d’autres types de fichiers de données au besoin. - En bas à droite de l’écran, sélectionnez Section Complete. Examinez les exécutions alignées et assurez-vous que chaque échantillon est aligné sur la référence. Les scores d’alignement étaient de 90% pour les données présentées ici. Sélectionnez Section Complète.
- Sur la page suivante, sélectionnez entre la conception du sujet. Nommez la conception. Sélectionnez Group les courses manuellement et créer la conception. Ajouter l’état, cliquez sur la condition 1 et nommez le groupe de manière appropriée. Cliquez sur la section complète.
REMARQUE : Continuez d’ajouter des conditions appropriées pour utiliser les statistiques du logiciel. Comme nous n’avons utilisé le logiciel que pour générer une matrice non ciblée, nous avons utilisé une seule condition étiquetée « tous ». - Sur la page suivante, sélectionnez Section Complète. Ne pas refaire la cueillette maximale.
- Passez en revue la déconvolution, puis cliquez sur Section Complète.
- Aller au fichier 'gt; Mesures composées d’exportation. Désélectionner toutes les propriétés non voulues dans la sortie. Cliquez sur OK. Choisissez un emplacement pour enregistrer le fichier .csv. Cliquez sur Enregistrer le fichier ouvert et Closeouvert .
- Filtrer les données à l’aide des blancs d’extraction pour supprimer les artefacts (logiciel de feuille de calcul).
- Pour chaque fonction RT x m/z, dans une nouvelle colonne, calculez la réponse moyenne dans les blancs d’extraction.
- Pour chaque fonction RT x m/z, calculez la réponse moyenne dans tous les autres échantillons (y compris les échantillons de QC).
- Calculer l’intensité maximale % des blancs dans les échantillons (réponse moyenne en réponse vierge/moyenne dans les échantillons x 100).
- Trier la colonne de pourcentage de contribution des valeurs les plus basses aux plus hautes.
- Supprimer les fonctionnalités qui ont une contribution d’intensité de 5 millions d’euros à partir de blancs.
- Filtrer les valeurs manquantes et corriger les signaux de fonctionnalité aux signaux dans les échantillons de QC mis en commun.
- Ouvrez le logiciel de traitement des données(Tableau des matériaux). Cliquez sur le bouton View MatrixAnalyzer. Cliquez sur le bouton Open Data File.
- Naviguez jusqu’à l’emplacement du fichier .csv contenant l’intensité maximale des caractéristiques RT x m/z pour chaque échantillon (matrice non ciblée). Sélectionnez Open.
- Sous l’onglet échantillons de QC, remplissez chaque paramètre au besoin. Pour l’ensemble de données décrit ici, utilisez QC category-QC, ignorez les catégories-vide, type impute no, seuil de couverture 80, échelle en utilisant l’échelle no échelle, la transformation de journal de décocher, l’utilisation correcte de spline de lissage, lissage 0,25.
- En haut à droite du panneau de matrice, cliquez sur le bouton de lecture correction QC.
- Une fois que la correction a été effectuée en haut à droite du panneau de matrice, cliquez sur Enregistrer les résultats. Naviguez vers un emplacement approprié et enregistrez le fichier de résultats .csv.
- Filtrer les données pour supprimer les fonctionnalités qui ont 'gt;20% RSD dans les échantillons de QC.
- Disposer les données de sorte que les échantillons sont en rangées et les fonctionnalités sont en colonnes.
- Dans une nouvelle colonne, calculez l’intensité maximale moyenne pour les échantillons de QC.
- Dans une nouvelle colonne, calculez l’écart standard de l’intensité maximale pour les échantillons de QC.
- Calculer l’écart standard relatif de l’intensité maximale pour les échantillons de QC : (écart standard QC/moyenne QC) x 100.
- Trier les caractéristiques de la plus basse à la plus haute %RSD et supprimer les fonctionnalités qui ont un QC RSD -gt;20%.
- Filtrer les données pour supprimer les fonctionnalités à faibleéchantillonRSD /RSDQC ratios (par exemple, lt;1).
- Dans une nouvelle colonne, calculez l’intensité maximale moyenne pour les échantillons.
- Dans une nouvelle colonne, calculez l’écart standard de l’intensité maximale pour les échantillons.
- Calculer l’écart standard relatif de l’intensité maximale des échantillons : (écart standard d’échantillon/moyenne d’échantillon) x 100.
- Dans une nouvelle colonne, divisez les échantillons RSD par le QC RSD.
- Trier les valeurs(ratios DSD échantillon/RSDQC) de plus haut en plus bas et supprimer les caractéristiques avec un rapport 'lt;1.
- Imputer les valeurs manquantes (plusieurs méthodes disponibles en ligne).
- Formatez la feuille de calcul de sorte que les échantillons sont en rangées et les caractéristiques sont en colonnes. La première colonne doit être le nom de fichier des échantillons. Créez une colonne supplémentaire à côté des noms de fichiers et entrez les groupes d’échantillons. Dans ce cas, les échantillons ont été regroupés par variété.
- Enregistrez la feuille de calcul sous forme de fichier .csv.
- Rendez-vous sur la page d’accueil du pipeline analytique web pour les métabolomiques à haut débit (voir Tableau des matériaux)et cliquez ici pour commencer.
- Cliquez sur Analyse statistique. Dans le cadre de Télécharger vos données, sélectionnez type de données : tableau d’intensité maximale, Format : Échantillons en lignes (non appréhpjs) puis choisissez le fichier.
- Naviguez vers le fichier .csv, sélectionnez Open et sélectionnez Soumettre.
- Sur la page suivante, sélectionnez estimation de valeur manquante. Uncheck étape 1 (cela a été effectué dans AnalyzerPro XD). Dans l’étape 2, choisissez une méthode pour estimer les valeurs manquantes.
REMARQUE : Pour les données présentées ici - «estimer les valeurs manquantes» avec «KNN» a été sélectionné. - À ce stade, la matrice de données peut être téléchargée (sélectionner Télécharger à partir du panneau gauche de la page Web) ou procéder à d’autres analyses statistiques.
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Representative Results
Le métabolome végétal est influencé par une combinaison de son génome et de son environnement, et en plus dans un contexte agricole, le régime de gestion des cultures. Nous démontrons que les différences génétiques entre les variétés de blé peuvent être observées au niveau des métabolites, ici, avec plus de 500 composés mesurés montrant des concentrations significativement différentes entre les variétés dans le seul grain. Une bonne précision de masse (erreur de 10 ppm) et la reproductibilité du signal (-lt;20% RSD) des normes internes(figure 2) ont été observées pour les modes d’ionisation négatifs et positifs(tableau 3). La préparation de l’échantillon décrit et l’analyse à base de spectrométrie de masse liquide ont donné des caractéristiques décoloutées en mode ionisation négative et des caractéristiques décolocalises de l’adresse suivante : 'gt;1300 en mode ionisation positive'. Des blancs préparatoires(figure 3) ont été inclus pour déterminer si les méthodes de préparation et d’analyse de l’échantillon introduisaient des caractéristiques d’artefact, et donc toutes les influences non biologiques éliminées de la matrice de données. Il a été constaté que 421 signaux en mode négatif et 835 signaux en mode positif présentaient des intensités de signal égales ou supérieures à 5 % de l’intensité moyenne du signal dans les échantillons de grain. Ces fonctionnalités ont été supprimées et après d’autres étapes de filtrage des données (étape 7 et figure 1),le mode négatif retourné 483 caractéristiques et le mode positif retourné 523 caractéristiques, formant l’instantané métabolique. La méthode a réussi à détecter les caractéristiques, qui avaient des intensités significativement différentes entre les variétés de blé(figure 4) avec des caractéristiques significatives de l’ensemble des deux modes d’ionisation. En mode d’ionisation négative, la majorité des caractéristiques significatives se trouvaient dans le gradient de phase inversée et en mode d’ionisation positive, la majorité des caractéristiques significatives se trouvaient dans le gradient lipidique(figure 4).
Figure 1 : Le flux de travail utilisé dans cette analyse pour la vérification, le traitement et le filtrage des données. L’étape 1 est effectuée à l’aide du logiciel d’acquisition/d’affichage des données de l’instrument afin que des évaluations « à la volée » puissent être effectuées. Cela comprend le calcul de l’erreur de masse (ppm) des normes internes et la superposition de pics standard internes pour l’évaluation visuelle de la reproductibilité des données. Les étapes 2-7 décrivent la procédure de traitement des données décrite dans le protocole, étape 7. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : chromatogrammes d’ion extraits. Chromatogrammes d’ion extraits de 13C6-sorbitol (bleu foncé), leucine-enkephalin (rose), d6-acide trans-cinnamique (orange), 2-aminoanthracene (vert) et miconazole (bleu clair) normes internes en mode positif (top) et négatif (électrospray ). Les temps de rétention standard internes et les intensités sont affichés. ESI et ESI - S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Superposition totale de chromatogrammes ion (TIC) de blancs préparatatifs montrant des acquisitions en mode négatif (rose) et en mode positif (bleu). Une norme interne, le miconazole, est montrée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Superposition totale de chromatogrammes ion (TIC), montrant des acquisitions en mode négatif (rose) et positive (bleu) et le nombre de caractéristiques significativement différentes entre la variété de blé à travers le gradient chromagraphique. En mode négatif, le plus grand nombre de fonctionnalités significatives a été trouvé lorsque la composition mobile de phase B était élevée. En mode positif, le plus grand nombre de fonctionnalités significatives a été trouvé lorsque la composition mobile de phase C était élevée. Une norme interne, le miconazole, est montrée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Segment | Temps | Débit | %A | %B | %C | Courbe |
| (min) | (mL/min) | |||||
| 1 | Initiale | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Tableau 1 : Programme chronométré par chromatographie liquide des compositions de phase mobile.
| Paramètre | Norme interne | ||||
| 13 C6-sorbitol | Leucine-enkephalin | d6-acide transcinnamique | 2-amino-anthracene | Miconazole | |
| Quan m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Tolérance de masse (amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Temps de rétention | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Fenêtre de temps de rétention | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Type de détection | Plus | Plus | Plus | Plus | Plus |
| Type de réponse | Zone | Zone | Zone | Zone | Zone |
| Seuil de zone | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Seuil de largeur | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Seuil de hauteur | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Rapport signal-bruit | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Lissage | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Tableau 2 : Paramètres de détection de pointe pour les normes internes dans les modes d’acquisition positifs (et négatifs).
| Précision de masse (ppm) | %RSD Avant correction QC | %RSD Après correction QC | ||
| Mode négatif | 13 C6-sorbitol | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-acide transcinnamique | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Leucine-enkephalin | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Mode positif | 13 C6-sorbitol | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Leucine-enkephalin | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-acide transcinnamique | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-aminoanthracene | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Miconazole | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Tableau 3 : Exemple(n30) de l’exactitude de la masse standard interne (ppm) et de la reproductibilité du signal avant et après la correction du QC exprimée comme écart standard relatif (%).
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Discussion
Ici, nous présentons une méthode de métabolomique non ciblée basée sur le LC-MS pour l’analyse du grain de blé. La méthode combine quatre modes d’acquisition (phase inversée et phase inversée lipidique avec ionisation positive et négative) en deux modes en introduisant une troisième phase mobile dans le gradient de phase inversée. L’approche combinée a produit environ 500 caractéristiques biologiquement pertinentes par polarité ion, dont environ la moitié d’intensité significativement différente entre les variétés de blé. Des changements importants dans la concentration de métabolites dans le grain de différentes variétés de blé indiquent une biochimie altérée, qui peut être liée à la résistance aux maladies, à la tolérance au stress et à d’autres traits phénotypiques qui sont importants pour la qualité et le rendement des grains. Par exemple, des approches métabolomiques ont été utilisées pour décrire de nouveaux mécanismes de défense12 et proposer le rôle des métabolites dans la tolérance à la sécheresse13. Les applications futures de ce protocole pourraient être en mesure de relier davantage les profils biochimiques de variétés particulières à des traits génétiques qui sont souhaitables pour certains environnements et pratiques de gestion. À son tour, cela permettrait la production d’une qualité et d’un rendement optimaux pour certains génotypes.
L’inclusion de normes internes est essentielle à ce protocole pour permettre à l’utilisateur de déterminer les changements dans le signal, les décalages de temps de rétention et comme indicateurs de précision de masse. Les changements de signal peuvent indiquer, par exemple, l’extraction sous-optimale, l’injection (y compris les blocages du système liquide) ou les performances du détecteur. Les décalages de temps de rétention peuvent indiquer de mauvaises performances de la pompe, une gradation inappropriée du gradient de phase mobile ou que la phase stationnaire de la colonne LC s’est détériorée. Une faible précision de masse peut être révélatrice d’un étalonnage à la dérive et que le système nécessite un réétalonnage. Dans tous les cas ci-dessus, le système doit être arrêté, et l’entretien/remplacement approprié des pièces effectuées. Nous avons inclus quatre normes dans la solution d’extraction utilisée pour préparer le grain et une norme dans l’échantillon final ajouté avant l’injection. On a pris soin de s’assurer que les normes étaient à l’égard de chaque mode d’ionisation et qu’elles couvraient une gamme de délais de rétention; cependant, nous reconnaissons que ce éventail de normes pourrait être amélioré avec l’inclusion d’une norme de lipides étiquetée. Il a été démontré que le grain de blé contient des centaines de triacylglycerols (TAGs)5, dont l’un serait un ajout approprié à ce protocole. L’inclusion de blancs préparatoires et d’échantillons de QC mis encommun 8 sont également des étapes cruciales dans ce protocole. Des milliers de dispositifs d’ions sont détectés dans des méthodes de spectrométrie de masse non ciblées et il est important d’exclure ceux qui ne sont présents que dans des échantillons vierges et aussi ceux qui ne sont pas détectés de façon reproductible (c.-à-d. à %élevé RSD) tout au long de l’analyse.
Bien que la méthode actuelle permete d’économiser beaucoup de temps et de ressources, si un gestionnaire de solvant quaternary n’est pas disponible, la phase inversée standard et les méthodes lipidiques peuvent être utilisées pour obtenir les mêmes résultats. Le volume d’extraction utilisé dans ce protocole suffirait à l’analyse de modes d’acquisition supplémentaires. Ce protocole décrit une extraction d’acétonitrile. En cas de succès, un solvant d’extraction alternatif, ou combinaison de solvants, fournira une couverture différente de métabolite, qui peut à son tour fournir plus de fonctionnalités et / ou donner une meilleure (ou une moindre) efficacité d’extraction de certains composés. Nous n’avons pas tenté d’établir l’identité métabolite des mesures statistiquement significatives résolues dans ce protocole; cependant, les bases de données spectrales de masse pour les métabolites et les lipides des plantes sont disponibles et se développent5,14,15. Pour identifier les métabolites, les spectres de masse tandem (MS/MS) devraient être collectés en plus des données complètes d’analyse. Ceux-ci peuvent être recueillis au cours de la course initiale à l’aide d’échantillons mis en commun et d’une méthode appropriée de SP/MS ou sur extrait réservé (stocké à -80 oC) une fois que les métabolites d’intérêt ont été déterminés. Nous avons observé de grands changements de composés entre les variétés, de sorte que nous recommandons de faire les deux et dans le second cas, en utilisant une variété connue pour contenir une forte concentration du composé d’intérêt pour obtenir le spectre MS/MS de la plus haute qualité.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient souligner le programme de bourses d’études sur l’agriculture et l’alimentation du premier ministre de l’Australie-Occidentale (Ministère de l’emploi, du tourisme, des sciences et de l’innovation, gouvernement de l’Australie-Occidentale) et du premier ministre, le professeur Simon Cook (Centre for Digital Agriculture, Curtin University et Murdoch University). Les essais sur le terrain et la collecte d’échantillons de céréales ont été appuyés par le programme Royalties for Regions du gouvernement de l’Australie-Occidentale. Nous remercions Grantley Stainer et Robert Français pour leur contribution aux essais sur le terrain. Bioplatforms Australia, financé par le NCRIS, est reconnu pour le financement de l’équipement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
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