Summary
En metode for umålrettet analyse av hvetekornmetabolitter og lipider presenteres. Protokollen inkluderer en acetonitrile metabolitt ekstraksjonsmetode og reversert fase flytende kromatografi-massespektrometri metodikk, med oppkjøp i positive og negative elektrospray ioniseringmoduser.
Abstract
Å forstå samspillet mellom gener, miljø og forvaltning i landbrukspraksis kan gi mer nøyaktig prediksjon og styring av produktutbytte og kvalitet. Metabolomikkdata gir en avlesning av disse interaksjonene på et gitt tidspunkt og er informativ av organismens biokjemiske status. Videre kan individuelle metabolitter eller paneler av metabolitter brukes som presise biomarkører for utbytte og kvalitetsprediksjon og ledelse. Plantemetabolomen er spådd å inneholde tusenvis av små molekyler med varierte fysikokjemiske egenskaper som gir en mulighet for en biokjemisk innsikt i fysiologiske egenskaper og biomarkøroppdagelse. For å utnytte dette, et viktig mål for metabolomikk forskere er å fange så mye av fysikokjemisk mangfold som mulig innenfor en enkelt analyse. Her presenterer vi en flytende kromatografi-massespektrometribasert umålrettet metabolomikkmetode for analyse av feltdyrket hvetekorn. Metoden bruker flytende kromatograf kvartær løsningsmiddel manager for å introdusere en tredje mobil fase og kombinerer en tradisjonell omvendt fase gradient med en lipid-mottagelig gradient. Kornforberedelse, metabolittutvinning, instrumentell analyse og databehandlingsarbeidsflyter er beskrevet i detalj. God massenøyaktighet og signalreproduserbarhet ble observert, og metoden ga ca. 500 biologisk relevante egenskaper per ioniseringsmodus. Videre ble signifikant forskjellige metabolitter og lipidfunksjonssignaler mellom hvetevarianter bestemt.
Introduction
Å forstå samspillet mellom gener, miljø og ledelsespraksis i landbruket kan gi mer nøyaktig prediksjon og styring av produktutbytte og kvalitet. Plantemetabolitter påvirkes av faktorer som genomet, miljøet (klima, nedbør etc.), og i landbruket, måten avlinger forvaltes (dvs. anvendelse av gjødsel, soppdrepende etc.). I motsetning til genomet påvirkes metabolomet av alle disse faktorene, og dermed gir metabolomikkdata et biokjemisk fingeravtrykk av disse interaksjonene på et bestemt tidspunkt. Det er vanligvis ett av to mål for en metabolomikkbasert studie: for det første for å oppnå en dypere forståelse av organismens biokjemi og bidra til å forklare reaksjonsmekanismen for perturbasjon (abiotisk eller biotisk stress) i forhold til fysiologien; og for det andre, for å knytte biomarkører til perturbasjonen under studien. I begge tilfeller er resultatet av å ha denne kunnskapen en mer presis forvaltningsstrategi for å nå målet om forbedret avkastningsstørrelse og kvalitet.
Plantemetabolomen er spådd å inneholde tusenvisav 1 av små molekyler med varierte fysikokjemiske egenskaper. Foreløpig ingen metabolomics plattformer (overveiende masse spektrometri og kjernefysisk magnetisk resonans spektroskopi) kan fange hele metabolome i en enkelt analyse. Utvikle slike teknikker (prøveforberedelse, metabolittutvinning og analyse), som gir så stor dekning av metabolomet som mulig innenfor en enkelt analytisk løp, er et viktig mål for metabolomikk forskere. Tidligere umålrettede metabolomikkanalyser av hvetekorn har kombinert data fra flere kromatografiske separasjoner og oppkjøpavpolariteter og/eller instrumentering for større metabolomdekning. Dette har imidlertid krevd at prøvene skal tilberedes og anskaffes separat for hver modalitet. Beleggia et al.2 utarbeidet for eksempel et avledet utvalg for GC-MS-analysen av polaranalytter i tillegg til GC-MS-analysen av de ikke-polare analytter. Das et al.3 brukte både GC- og LC-MS-metoder for å forbedre dekningen i sine analyser; Denne tilnærmingen vil imidlertid generelt kreve separate prøvepreparater som beskrevet ovenfor, samt to uavhengige analytiske plattformer. Tidligere analyser av hvetekorn ved hjelp av GC-MS2,3,4 og LC-MS3,5 plattformer har gitt 50 til 412 (55 identifisert) funksjoner for GC-MS, 409 for kombinert GC-MS og LC-MS og flere tusen for en LC-MS lipidomics analyse5. Ved å kombinere minst to moduser i en enkelt analyse, kan utvidet metabolomdekning opprettholdes, noe som øker rikdommen av biologisk tolkning samtidig som den tilbyr besparelser både i tid og kostnad.
For å tillate effektiv separasjon av et bredt spekter av lipidarter ved reversert-fase kromatografi, bruker moderne lipidomics metoder vanligvis en høy andel av isopropanol i elutionløsningsmiddelet6, noe som gir amenability til lipidklasser som ellers kan være uløst av kromatografien. For en effektiv lipidseparasjon er startfasen også mye høyere i organisk sammensetning7 enn de typiske reverserte fasekromatikkene, som vurderer andre klasser av molekyler. Den høye organiske sammensetningen ved starten av gradienten gjør disse metodene mindre egnet for mange andre klasser av molekyler. Spesielt, reversert fase flytende kromatografi benytter en binær løsemiddel gradient, starter med en for det meste vandig sammensetning og øker i organisk innhold som elution styrken av kromatografi en økt. For dette formål forsøkte vi å kombinere de to tilnærmingene for å oppnå separasjon av både lipid- og ikke-lipidklasser av metabolitter i en enkelt analyse.
Her presenterer vi en kromatistisk metode som bruker en tredje mobilfase og muliggjør en kombinert tradisjonell omvendt fase og lipidomikk-passende kromatografimetode ved hjelp av et enkelt prøvepreparat og en analytisk kolonne. Vi har vedtatt mange av kvalitetskontrolltiltak ene og datafiltreringstrinnene som tidligere er implementert i overveiende kliniske metabolomikkstudier. Disse tilnærmingene er nyttige for å bestemme robuste funksjoner med høy teknisk reproduserbarhet og biologisk relevans og utelukker de som ikke oppfyller disse kriteriene. Vi beskriver for eksempel gjentatt analyse av det samlede QC-eksemplet8, QC-korreksjon9,datafiltrering9,,10 og imputering av manglende funksjoner11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne metoden passer for 30 prøver (ca. 150 frø per prøve). Tre biologiske replikater av ti forskjellige feltdyrkede hvetevarianter ble brukt her.
1. Fremstilling av korn
- Hent prøver (fullkorn) fra -80 °C lagring.
MERK: Frystørking av frø anbefales kort tid etter innhøsting hvis prøver samles inn fra flere sesonger. Dette minimerer eventuelle endringer i metabolittkonsentrasjon som kan oppstå etter varierende lagringsperioder. For å gjøre dette, overføre frø til en 15 ml plast sentrifuge rør (ca 300 frø vil fylle røret) og dekke med aluminiumsfolie. Pierce folien to-tre ganger ved hjelp av en pin og fryse tørke hele korn over natten (ca 24 timer). Prøvene kan enten returneres til fryseren -80 °C på dette stadiet, eller neste trinn kan utføres. - Grind frøene ved hjelp av en laboratorieblender for to løp på høy modus for 20 s.
MERK: Blenderen som brukes til denne protokollen krever minst 150 frø for å fylle blenderen til bladhøyde og gi en relativt homogent malt kornprøve. - Fjern blenderen fra basen og trykk på siden av blenderen for å bringe grovt maltkorn til overflaten av prøven. Grovt materiale kan kastes eller lagres.
- Overfør pulverlignende finmalt materiale fra blenderen til et 2 ml mikrosentrifugerør i plast.
MERK: Vask blenderen med deionisert vann og skyll med LC-MS-klasse MeOH mellom prøvene. Pass på at blenderen er helt tørr før du går videre til neste prøve. - Returner finmalt kornprøver til fryseren eller fortsett til neste trinn (metabolittekstraksjon).
2. Tilberedning av ekstraksjonsløsningsmiddel
MERK: Klargjør ekstraksjonsløsningsmiddel samme dag som å utføre ekstraksjonene.
- Forbered minst 2 ml 1 mg/ml av hver standard. Bruk acetonitrile (ACN) til å forberede 2-aminoanthracene, miconazol og d6-transcinnaminsyre. Bruk vann til å forberede 13C6-sorbitol.
- Ta 2 ml av hver 1 mg/ml standard og legg til en 100 ml volumetrisk kolbe.
- Fyll volumetrisk kolbe til linjen med acetonitrile. Sørg for at 100 ml acetonitrile inneholder 20 μg/ml av hver av de interne standardene: 2-aminoanthracene, miconazol, 13C6-sorbitol, d6-transcinnamikersyre.
3. Metabolittekstraksjon
- Vei 200 mg finmalt korn i et 2 ml mikrosentrifugerør.
- Tilsett 500 μL ekstraksjonsløsningsmiddel til 200 mg finmalt kornprøve.
- Bland ved hjelp av en homogenisator for 2 kjører på 20 s på 6500 rpm.
- Sentrifuge ved 4 °C i 5 min ved 16 100 x g.
- Overfør supernatanten til et 2 ml plastrør.
- Gjenta denne fremgangsmåten fra trinn 3.1 til 3.5 to ganger til for å gi et totalt supernatant volum på ca. 1,5 ml.
- Vortex å blande supernatant.
- Overfør et likt volum (55 μL) av hvert ekstrakt til et separat 2 ml rør for å lage en samlet kornekstraktprøve.
- Overfør en 50 μL aliquot av ekstraktet til et hetteglass i glass.
MERK: Ekstrakter kan fryses (-80 °C) på dette tidspunktet eller gå videre til neste trinn og følge gjennom til LC-MS-analysen.
4. Utarbeidelse av løsninger for LC-MS-analyse
FORSIKTIG: For konsentrert syre, tilsett alltid syre til vann/løsemiddel.
- Forbered 50 ml 1 M ammoniumformat lagerløsning. Vei 3.153 g ammoniumformat og overfør til en 50 ml volumetrisk kolbe. Fyll volumetrisk kolbe til linjen med LC-MS klasse H2O.
- Forbered 1 L av den mobile fasen A bestående av 10 mM ammoniumformat, 0,1% maursyre. For å gjøre dette, tilsett ca 500 ml LC-MS-klasse vann til en 1 L volumetrisk kolbe. Tilsett 10 ml 1 M ammoniumformat lager og 1 ml maursyre. Fyll volumetrisk kolbe til linjen med LC-MS klasse H2O. Overfør til en 1 L flaske og sonicate i 15 min til degas.
- Forbered 1 L mobil fase B bestående av 10 mM ammoniumformat i 79:20:1 acetonitrile:isopropylalkohol:vann, 0,1 % formic acid ratio. Tilsett 200 ml isopropanol til en 1 L volumetrisk kolbe. Tilsett 10 ml 1 M ammoniumformat lager og 1 ml maursyre. Fyll volumetrisk kolbe til linjen med acetonitrile. Overfør til en 1 L flaske og sonicate i 15 min til degas.
MERK: Fortynn 1 M ammoniumformatet i isopropylalkoholen (IPA) før du legger til ACN. Ammoniumformat er uoppløselig i CAN. - Forbered 1 L mobil fase C bestående av 10 mM ammoniumformat i forholdet 89:10:1 isopropylalkohol:acetonitrile:vann. For å gjøre dette, legg til ca 500 ml isopropanol, 10 ml 1 M ammoniumformat lager og 100 ml acetonitrile til en 1 L volumetrisk kolbe. Fyll til linjen med isopropanol. Overfør til en 1 L flaske og sonicate i 15 min til degas.
- Utarbeidelse av LC-MS system vaske løsemidler
- Skift ut vaskeløsningen for pumpehode med frisk oppløsning. Bruk 50% metanol, 10% isopropylalkohol eller annet som anbefalt av produsenten.
- Forbered sterke og svake nålevaskløsninger for vasking av injeksjonsvæskene før og etter prøveinjeksjon. For sterk vask, legg til like volumer av ACN og IPA. For den svake vasken, forberede en løsning på 10% ACN (som krever ca 500 ml og 1 L av hver av de sterke og svake vaskene henholdsvis for denne protokollen og antall prøver) i separate flasker.
- Sett nålevaskevolumene til henholdsvis 600 μL og 1800 μL for de sterke og svake vaskene.
5. Utarbeidelse av prøver for LC-MS-analyse
- I henhold til produsentenes standard driftsprosedyre for fremstilling av 400 ng/μL leucine enkephalin, pipette 7,5 ml vann i hetteglasset 12 ml leucin-enkephalin som inneholder 3 mg leucin-enkephalin. Frys ved -80 °C i 50 μL aliquots.
- Forbered 100 ml 5 % ACN som inneholder 200 ng/ml leucin-enkephalin (50 μL av 400 ng/μL leucine enkephalin). Forbered deg samme dag som LC-MS-analyse.
- Tilsett 950 μL av 5% acetonitrile som inneholder injeksjonsstandarden leucine-enkephalin til 50 μL-prøven aliquot tilberedt fra trinn 3.
- Vortex for å blande den tilberedte prøven.
6. LC-MS-oppsett
MERK: En detaljert beskrivelse av oppsett av instrument- og anskaffelsesmetode er beskrevet i produsentens brukerhåndbok. En generell veiledning og detaljene som er spesifikke for denne protokollen, er beskrevet nedenfor. Følgende trinn kan fullføres når som helst før du anskaffer dataene.
- Åpne en LC-MS-maskinvareprofil.
- Definer den kromatografiske metoden som beskrevet i tabell 1. Kontroller at LC-systemet er utstyrt med en kvartær løsningsmiddelleder for å sette opp denne gradienten.
MERK: IPA er et viskøs løsningsmiddel. Det bør innføres med lav strømningshastighet og en tilstrekkelig likegyldighetstid bør brukes før sammensetningen økes til 98,0%. Disse trinnene vil hindre LC-systemet fra å overpresse og stoppe. - Definer massespektrometeretanskaffelsesmetoder for hver av de positive og negative ToF-MS-modusene over m/z-området 50-1300.
MERK: Instrumentet som brukes til arbeidet som presenteres her krever positive og negative metoder som skal kalibreres og kjøres individuelt (dvs. polaritetsveksling innenfor en metode er ikke mulig). - Hvis LC-kolonnen er ny, må du betingelse kolonnen i henhold til produsentens anbefaling.
MERK: Følgende trinn bør fullføres rett før datainnsamling. - I en maskinvareprofil for MS bare kalibrerer du massespektrometeret i henhold til produsentens anbefalinger. Fullfør dette trinnet før hver bruksmåte, slik at systemet har stabilisert seg i hver gitt modalitet før kalibrering.
- Tøm og skyll LC-fluidics-systemet ved hjelp av LC-MS-klasseløsemidler, inkludert mobile fase- og vaskeløsemidler.
- Equilibrate LC-systemet ved hjelp av LC-metodens startforhold, slik at kolonnetrykket har stabilisert seg.
- Injiser natriumformat (0,5 mM i 90 % IPA) i begynnelsen av prøvesekvensen (beskrevet nedenfor) for å kontrollere instrumentkalibreringen.
- Sett opp instrumentsekvenstabellen slik at løsemiddel og forberedende (ekstraksjon) blanks analyseres først; etterfulgt av samlede QC-prøver (6-10) for systemkondisjonering; deretter den randomiserte prøvelisten med QC-prøver kjører med jevne mellomrom (f.eks. hver femte injeksjon) som tekniske replikater. Kjør to QC-prøver på slutten av sekvensen.
MERK: Det er nyttig å inkludere dato- og injeksjons-/anskaffelsesrekkefølgen i eksempelfilnavnet samt eksempel-ID-en. For eksempel: Åååå MMDD_Injection number_Variety_Biological replikere. Før du trykker på start, må du kontrollere at LC-kolonnetrykket er stabilt og at LC er koblet til MS.
7. Databehandling
MERK: En generell arbeidsflyt for databehandling presenteres i figur 1.
- Kontroller datakvaliteten (intern standard massenøyaktighet (beregning nedenfor) og signalreproduserbarhet) mens sekvensen kjører. For å sjekke signalreproduserbarhet, bør visuell inspeksjon av overlaid spectra være tilstrekkelig.
MERK: Massefeil (ppm) = ((Teoretisk masse – målt masse) / teoretisk masse) x 106 - Generer en matrise med justert toppintensitet som inneholder prøver x interne standarder (justert etter oppbevaringstid og m/z-verdier).
- Åpne databehandlingsprogramvaren (se Materialtabellen). Klikk Data under Hjem > Åpne. Naviger til riktig filplassering og åpne alle datafiler.
- Velg Antall fra rullegardinmenyen under Hjem > Sekvens > Behandlingstype.
- Klikk Kalibreringskomponenter under Hjem > Metode > Quan. Fyll ut hvert felt ved hjelp av detaljene i tabell 2. Klikk OK.
- Fyll ut eksempeltypen i venstre panel i kolonnene ved siden av datafilene ved å høyreklikke på cellen og velge Ukjent. Fyll ut nivået som i/t.
- Velg Sekvens under Hjem > Behandling. Velg en plassering for å lagre sekvensen, og klikk deretter Prosess.
- Velg Kvantan under Hjem > Resultater. Velg Eksporter kjøringer til matriseanalysatori Quan-visningsprogrammet. Quan
- Fra analyseprogrammet for matriseanalysatorklikker, klikk Eksporter til csv. Lagre filen som en regnearkfil.
- I regnearkprogramvare beregner du gjennomsnittlig, standardavvik og relativ standardavvik for intensiteten (toppområdet) for hver interne standard.
- Generer en matrise med justert toppintensitet som inneholder prøver x umålrettede funksjoner (justert etter oppbevaringstid og m/z-verdier).
- Åpne programvaren for analyse av små molekyloppdagelser (se Materialtabellen) og velg Fil > Ny for å opprette et nytt eksperiment. Gi eksperimentet et navn, og velg stedet du vil lagre og lagre eksperimentfiler. Klikk Neste.
- Velg instrumenttypen som brukes (massespektrometer med høy oppløsning), dataformat (profil) og polariteten (positiv eller negativ). Klikk Neste. Velg alle adduktene som er tilgjengelige i biblioteket, og rediger adduct-biblioteket etter behov. Klikk opprett eksperiment. En ny side lastes inn der resten av databehandlingen vil fortsette/skje.
- Importer datafiler. Velg filformatet, og velg deretter importer. Bla til dataplassering, og velg datafilene som skal importeres. Fremdriften vises for hver fil på venstre panel på siden.
- Når datafiler er importert, velger du Start automatisk behandling. Velg en metode for å velge en justeringsreferanse. Enten la programvaren vurdere alle kjøringer for egnethet, gi en liste over egnede prøver (dvs. QC prøver) eller velge referansen mest egnet dvs. Velg Ja, juster kjøringene mine automatisk > Neste.
- Velg Neste på eksperimentutformingssiden (dette kan konfigureres senere).
- Velg Utfør toppplukking, og angi deretter parametere. Velg Absolutt ionintensitet under kategorien Toppplukkgrenser, og angi 100. Velg Bruk en minimum stilvidde og angi 0,01 min. Velg OK > Fullfør. Når behandlingen er fullført, velger du Lukk.
MERK: Toppplukkgrenser kan optimaliseres for andre datafiltyper etter behov. - Velg Inndeling fullførtnederst til høyre på skjermen. Se gjennom justerte kjøringer, og kontroller at hvert eksempel er justert etter referansen. Justeringspoengene var > 90% for dataene som presenteres her. Velg Delen fullført.
- Velg mellom emneutforming på neste side. Gi designen et navn. Velg Grupper kjøringene manuelt og Opprett utforming. Legg til betingelse, klikk på Betingelse 1 og gi gruppen navnet på riktig måte. Klikk delen fullført.
MERK: Fortsett å legge til betingelser etter behov for å bruke statistikk i programvaren. Siden vi bare brukte programvaren til å generere en umålrettet matrise, brukte vi en enkelt tilstand merket "alle". - Velg Inndeling fullførtpå neste side. Ikke re-do peak plukking.
- Se gjennom deconvolution, og klikk deretter Seksjon fullført.
- Gå til Fil > Eksporter sammensatte målinger. Fjern merket for eventuelle egenskaper som ikke er ønsket i utdataene. Klikk OK. Velg en plassering for å lagre CSV-filen. Klikk Lagre > Åpne fil > Åpne mappe eller Lukk.
- Filtrer dataene ved hjelp av ekstraksjonsblankene for å fjerne artefakter (regnearkprogramvare).
- For hver RT x m/z-funksjon, i en ny kolonne, beregner du gjennomsnittlig svar i ekstraksjonsemner.
- For hver RT x m/z-funksjon beregner du gjennomsnittlig respons i alle andre prøver (inkludert QC-eksempler).
- Beregn % toppintensitet for tomme i prøver (gjennomsnittlig respons i tomt/gjennomsnittlig svar i prøver x 100).
- Sorter prosentbidragskolonnen fra laveste til høyeste verdier.
- Fjern funksjoner som har > 5% intensitetbidrag fra emner.
- Filtrer manglende verdier og korriger funksjonssignalene til signaler i samlede QC-prøver.
- Åpne databehandlingsprogramvaren (Materialtabell). Klikk Vis MatrixAnalyzer-knappen. Klikk åpne datafil-knappen.
- Naviger til CSV-filplasseringen som inneholder toppintensiteten til RT x m/z-funksjoner for hvert eksempel (umålrettet matrise). Velg Åpne.
- Fyll ut hver parameter etter behov under kategorien QC-eksempler. For datasettet som er beskrevet her, bruk QC kategori = QC, ignorere kategorier = tom, impute type = ingen, dekningterskel = 80, skala ved hjelp av = ingen skalering, fjern merket loggtransformering, riktig ved hjelp av = utjevning spline, utjevning = 0,25.
- Klikk på avspillingsknappen QC-korrigeringøverst til høyre i matrisepanelet.
- Når rettelsen er utført øverst til høyre i matrisepanelet, klikker du Lagre resultater. Naviger til en passende plassering og lagre CSV-resultatfilen.
- Filtrer dataene for å fjerne funksjoner som har > 20% RSD i QC-eksempler.
- Ordne dataene slik at eksempler er i rader og funksjoner er i kolonner.
- I en ny kolonne beregner du den gjennomsnittlige toppintensiteten for QC-prøver.
- I en ny kolonne beregner du standardavviket for toppintensiteten for QC-prøver.
- Beregn det relative standardavviket for toppintensiteten for QC-prøver: (QC standardavvik/QC-gjennomsnitt) x 100.
- Sorter funksjonene fra laveste til høyeste %RSD, og fjern funksjoner som har en QC RSD > 20%.
- Filtrer dataene for å fjerne funksjoner med laveRSD-eksempel/RSDQC-forhold (f.eks. <1).
- I en ny kolonne beregner du den gjennomsnittlige toppintensiteten for prøver.
- I en ny kolonne beregner du standardavviket for toppintensiteten for prøver.
- Beregn det relative standardavviket for toppintensiteten til prøvene: (eksempelstandardavvik/eksempelgjennomsnitt) x 100.
- Del prøvene RSD i en ny kolonne.
- Sorter verdiene(RSD-eksempel/RSDQC-forhold) fra høyeste til laveste og fjern funksjoner med et forhold <1.
- Impute mangler verdier (flere metoder tilgjengelig online).
- Formater regnearket slik at eksempler er i rader og funksjoner, er i kolonner. Den første kolonnen skal være eksempelfilnavnet. Opprett en ekstra kolonne ved siden av filnavnene, og skriv inn eksempelgrupperingene. I dette tilfellet ble prøvene gruppert etter variasjon.
- Lagre regnearket som en CSV-fil.
- Gå til hjemmesiden for den nettbaserte analytiske rørledningen for metabolomikk med gjennomstrømming (se Materialliste) og klikk Klikk her for å starte.
- Klikk Statistisk analyse. Under Last opp dataenedine velger du Datatype: toppintensitetstabell, Format: Eksempler i rader (ikke paret) og deretter Velg fil.
- Naviger til CSV-fil, velg Åpne, og velg deretter Send.
- Velg Manglende verdiestimering påneste side. Fjern merket for trinn 1 (dette ble utført i AnalyzerPro XD). I trinn 2 velger du en metode for å estimere manglende verdier.
MERK: For dataene som presenteres her - ble "estimat manglende verdier" med "KNN" valgt. - På dette stadiet kan datamatrisen lastes ned (velg Last ned fra venstre panel på nettsiden) eller fortsett å utføre ytterligere statistiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plantemetabolomen påvirkes av en kombinasjon av genom og miljø, og i tillegg i en landbrukssetting, avlingsforvaltningsregimet. Vi viser at genetiske forskjeller mellom hvetevarianter kan observeres på metabolittnivå, her, med over 500 målte forbindelser som viser betydelig forskjellige konsentrasjoner mellom varianter i kornet alene. God massenøyaktighet (<10 ppm-feil) og signalreproduserbarhet (<20 % RSD) av interne standarder (figur 2) ble observert for både negative og positive ioniseringsmoduser (tabell 3). Den beskrevne prøveforberedelsen og flytende kromatografi-massespektrometribasert analyse ga > 900 deconvoluted funksjoner i negativ ioniseringsmodus og > 1300 deconvoluted funksjoner i positiv ioniseringsmodus. Forberedende emner (Figur 3) ble inkludert for å avgjøre om prøveforberedelses- og analysemetodene introduserte artefaktfunksjoner, og dermed alle ikke-biologiske påvirkninger eliminert fra datamatrisen. Det ble funnet at 421 signaler i negativ modus og 835 signaler i positiv modus hadde signalintensiteter lik eller større enn 5% av gjennomsnittlig signalintensitet i kornprøver. Disse funksjonene ble fjernet, og etter ytterligere datafiltreringstrinn (trinn 7 og figur 1), returnerte den negative modusen 483 funksjoner og den positive modusen returnerte 523 funksjoner, og dannet det metabolske øyeblikksbildet. Metoden var vellykket i å oppdage funksjoner, som hadde betydelig forskjellige intensiteter mellom hvetevarianter (Figur 4) med > 500 betydelige funksjoner på tvers av begge ioniseringsmoduser. I negativ ioniseringsmodus var de fleste betydelige funksjoner i omvendt fasegradient og i positiv ioniseringsmodus var de fleste betydelige funksjoner i lipidgradienten (figur 4).
Figur 1: Arbeidsflyten som brukes i denne analysen for datakontroll, behandling og filtrering. Trinn 1 utføres ved hjelp av datainnhentings-/visningsprogramvaren på instrumentet slik at "on-the-fly"-vurderinger kan utføres. Dette inkluderer beregning av massefeilen (ppm) av interne standarder og overlegg interne standardtopper for visuell vurdering av datareproduserbarhet. Trinn 2-7 beskriver databehandlingsprosedyren som er beskrevet i protokollen, trinn 7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ekstrahert ionkromatogram. Ekstrahert ionkromatogram av 13C6-sorbitol (mørk blå), leucin-enkephalin (rosa), d6-trans-cinnamic acid (oransje), 2-aminoanthracene (grønn) og miconazol (lyseblå) interne standarder i positive (topp) og negative (nederst) elektrospray ionisering (ESI) moduser. De interne standard oppbevaringstider og intensiteter vises. ESI + og ESI - Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Totalt ionkromatogram (TIC) overlegg av forberedende emner som viser negativ modus (rosa) og positiv modus (blå) oppkjøp. En intern standard, miconazol, vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Totalt ionkromatogram (TIC) overlegg, som viser negativ modus (rosa) og positiv modus (blå) oppkjøp og antall funksjoner som er vesentlig forskjellige mellom hvetevariasjon på tvers av kromatografisk gradient. I negativ modus ble det største antallet betydelige funksjoner funnet da mobilfase B-sammensetningen var høy. I positiv modus ble det største antallet betydelige funksjoner funnet da mobil fase C-sammensetning var høy. En intern standard, miconazol, vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Segmentet | Tid | Strømningshastighet | %A (%A) | %B (%B) | %C (%C) | Kurve |
| (min) | (ml/min) | |||||
| 1 | Første | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Tabell 1: Tidsprogrammet for flytende kromatografi av mobile fasekomposisjoner.
| Parameteren | Intern standard | ||||
| 13. C6-sorbitol | Leucin-enkephalin | d6-transcinnaminsyre | 2-amino-antracene | Miconazole (andre betydninger) | |
| Quan m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Massetoleranse (amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Oppbevaringstid | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Vinduet Oppbevaringstid | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Registreringstype | Høyeste | Høyeste | Høyeste | Høyeste | Høyeste |
| Svar type | Området | Området | Området | Området | Området |
| Terskel for areal | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Bredde terskel | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Høydeterskel | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Signal-til-støy-forhold | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Utjevning | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Tabell 2: Parametere for toppregistrering for interne standarder i positive (og negative) anskaffelsesmoduser.
| Massenøyaktighet (ppm) | %RSD før QC-korrigering | %RSD etter QC-korreksjon | ||
| Negativ modus | 13. C6-sorbitol | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-transcinnaminsyre | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Leucin-enkephalin | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Positiv modus | 13. C6-sorbitol | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Leucin-enkephalin | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-transcinnaminsyre | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-aminoanthracene | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Miconazole (andre betydninger) | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Tabell 3: Eksempel (n=30) intern standard massenøyaktighet (ppm) og signalreproduserbarhet før og etter QC-korreksjon uttrykt som relativ standardavvik (%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en LC-MS-basert umålrettet metabolomikkmetode for analyse av hvetekorn. Metoden kombinerer fire anskaffelsesmoduser (omvendt fase og lipid-mottagelig omvendt fase med positiv og negativ ionisering) i to moduser ved å introdusere en tredje mobilfase i omvendt fasegradient. Den kombinerte tilnærmingen ga ca 500 biologisk relevante egenskaper per ion polaritet med omtrent halvparten av disse betydelig forskjellige i intensitet mellom hvetesorter. Betydelige endringer i metabolittkonsentrasjon i kornet av forskjellige hvetevarianter indikerer endret biokjemi, som kan være knyttet til sykdomsresistens, stresstoleranse og andre fenotyske egenskaper som er viktige for kornkvalitet og utbytte. For eksempel har metabolomikk tilnærminger blitt brukt til å beskrive nye forsvarsmekanismer12 og foreslå rollen som metabolitter i tørketoleranse13. Fremtidige anvendelser av denne protokollen kan være i stand til å ytterligere koble biokjemiske profiler av bestemte varianter til genetiske egenskaper som er ønskelig for visse miljøer og ledelse praksis. I sin tur ville dette tillate produksjon av optimal kornkvalitet og utbytte for utvalgte genotyper.
Inkludering av interne standarder er avgjørende for denne protokollen for å tillate brukeren å bestemme endringer i signal, oppbevaring tidskift og som indikatorer på massenøyaktighet. Endringer i signal kan indikere for eksempel sub optimal ekstraksjon, injeksjon (inkludert fluidiske systemblokkeringer) eller detektorytelse. Oppbevaringstidsskift kan indikere dårlig pumpeytelse, upassende kontrollering av mobile fasegradering eller at LC-kolonnestasjonsfasen har forverret seg. Dårlig massenøyaktighet kan indikere en drevkalibrering og at systemet krever rekalibrering. I alle de ovennevnte tilfellene bør systemet stoppes, og riktig vedlikehold/utskifting av deler som utføres. Vi inkluderte fire standarder i ekstraksjonsløsningen som ble brukt til å tilberede korn og en standard i den endelige prøven som ble lagt til før injeksjon. Det ble tatt hensyn til at standarder var mottagelige for hver ioniseringsmodus og dekket en rekke oppbevaringstider; Vi erkjenner imidlertid at denne rekke standarder kan forbedres med inkludering av en merket lipidstandard. Det har blitt vist at hvetekorn inneholder hundrevis av triacylglycerols (TAGs)5, hvorav noen ville være et passende tillegg til denne protokollen. Inkluderingen av forberedende emner og samlede QC-prøver8 er også kritiske trinn i denne protokollen. Tusenvis av ionfunksjoner oppdages i umålrettede massespektrometrimetoder, og det er viktig å ekskludere de som bare finnes i tomme prøver, og også de som ikke reproduserbart oppdages (dvs. høy %RSD) gjennom analysen.
Selv om den nåværende metoden sparer betydelig tid og ressurser, hvis en kvartær løsemiddelleder ikke er tilgjengelig, kan standard reversertfase og lipidmetoder brukes til å oppnå de samme resultatene. Ekstraksjonsvolumet som brukes i denne protokollen vil være tilstrekkelig for analyse av flere oppkjøpsmoduser. Denne protokollen beskriver en acetonitrile ekstraksjon. Selv om det lykkes, vil et alternativt ekstraksjonsløsningsmiddel, eller kombinasjon av løsemidler, gi en annen metabolittdekning, som igjen kan levere flere funksjoner og/eller gi bedre (eller en mindre) ekstraksjonseffektivitet av noen forbindelser. Vi har ikke forsøkt å fastslå metabolittidentiteten til de statistisk signifikante målingene som er løst i denne protokollen; Imidlertid er massespektrale databaser for plantemetabolitter og lipider tilgjengelig og utvikler5,14,15. For å identifisere metabolittene må tandemmassespektra (MS/MS) samles inn i tillegg til fullstendige skannedata. Disse kan samles inn i løpet av den første kjøringen ved hjelp av samlede prøver og en passende MS/MS-metode eller på reservert ekstrakt (lagret ved -80 °C) når metabolitter av interesse er fastslått. Vi observerte store foldendringer av forbindelser mellom varianter, så vi vil anbefale å gjøre begge deler og i andre omgang, ved hjelp av en rekke kjent for å inneholde en høy konsentrasjon av forbindelsen av interesse for å oppnå høyeste kvalitet MS / MS spektrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne West Australian Premier's Agriculture and Food Fellowship program (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) og Premier's Fellow, Professor Simon Cook (Senter for Digitalt landbruk, Curtin University og Murdoch University). Feltforsøk og kornprøvesamling ble støttet av regjeringen i Western Australias royalties for regioner-program. Vi anerkjenner Grantley Stainer og Robert French for deres bidrag til feltforsøk. NCRIS-finansierte Bioplatforms Australia er anerkjent for utstyrsfinansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
