Summary
De huidige methoden voor het analyseren van de therapietrouw van patiënten aan complexe resistente tuberculose (DR-TB) regimes kunnen onjuist en resource-intensief zijn. Onze methode analyseert haar, een gemakkelijk verzamelde en opgeslagen matrix, voor concentraties van 11 DR-TB medicijnen. Met behulp van LC-MS / MS, kunnen we bepalen sub-nanogram drug niveaus die kunnen worden gebruikt om beter te begrijpen drug therapietrouw.
Abstract
Resistente tuberculose (DR-TB) is een groeiende bedreiging voor de volksgezondheid en de beoordeling van therapeutische geneesmiddelen kan belangrijke klinische voordelen hebben. Plasma drug niveaus zijn de huidige gouden standaard beoordeling, maar vereisen phlebotomie en een koude keten, en vangen slechts zeer recente naleving. Onze methode maakt gebruik van haar, een matrix die gemakkelijk wordt verzameld en reflecterend van de lange termijn therapietrouw, om te testen voor 11 anti-TB medicijnen. Eerder werk van onze groep toont aan dat antiretrovirale geneesmiddelen niveaus in het haar worden geassocieerd met HIV-resultaten. Onze methode voor DR-TB drugs gebruikt 2 mg haar (3 cm proximale aan de wortel), die wordt verpulverd en geëxtraheerd in methanol. Monsters worden geanalyseerd met een enkele LC-MS / MS-methode, kwantificeren 11 drugs in een 16 min run. Lagere grenswaarden voor kwantificering (LLOQs) voor de 11 geneesmiddelen variëren van 0,01 ng/mg tot 1 ng/mg. De aanwezigheid van geneesmiddelen wordt bevestigd door het vergelijken van verhoudingen van twee overgangen van massaspectrometrie. Monsters worden gekwantificeerd met behulp van de area-ratio van het medicijn met de deuterated, 15N-, of 13C-gelabelde drug isotopologue. We gebruikten een kalibratiecurve variërend van 0,001-100 ng/mg. Toepassing van de methode op een gemaksmonster van haarmonsters die werden verzameld bij DR-TB-patiënten op direct waargenomen therapie (DOT) gaf aan dat geneesmiddelenniveaus in het haar binnen het lineaire dynamische bereik van negen van de elf geneesmiddelen (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacine, moxifloxacine, clofazimine, bedaquiline, pretomanid) werden vermeld. Geen enkele patiënt was prothionamide, en de gemeten niveaus voor ethionamide waren dicht bij zijn LLOQ (met verder werk in plaats daarvan het onderzoeken van de geschiktheid van ethionamide metaboliet voor het monitoren van blootstelling). Samengevat beschrijven we de ontwikkeling van een multi-analytpanel voor DR-TB-geneesmiddelen in haar als een techniek voor therapeutische geneesmiddelenmonitoring tijdens resistente tbc-behandeling.
Introduction
In de eenentwintigste eeuw is resistente tbc (DR-TB) een evoluerende catastrofe voor reeds zwakke nationale tbc-bestrijdingsprogramma's, waarbij bevestigde gevallen alleen al in de afgelopen vijf jaar verdubbelden, goed voor bijna een derde van alle sterfgevallen in verband met antimicrobiële resistentie wereldwijd1,2. Succesvolle behandeling van DR-TB heeft conventioneel vereist langere en meer toxische tweedelijns regimes dan de behandeling van drugsgevoelige tbc. Bovendien hebben patiënten met DR-tbc vaak aanzienlijke reeds bestaande uitdagingen voor therapietrouw, die in eerste instantie hebben bijgedragen tot het ontstaan van resistentie3.
In tegenstelling tot hiv-infectie waarbij virale belastingen kunnen worden gebruikt om de behandeling te controleren, zijn surrogaateindpunten van de respons op de behandeling bij tbc vertraagd en onbetrouwbaar op individueel niveau4. Monitoring van de therapietrouw van patiënten, een belangrijke voorspeller van subtherapeutische anti-tbc-medicijnconcentratie en behandelingsfalen, is ook een uitdaging. Zelfgerapporteerde therapietrouw lijdt aan recall bias en de wens om providers te behagen5,6. Pil tellingen en medicatie event monitoring systemen (MEMS) kan meer doelstelling7, maar niet meten van de werkelijke drugsgebruik8,9,10. Geneesmiddelenniveaus in biomatrices kunnen zowel therapietrouw als farmacokinetische gegevens opleveren. Daarom worden plasmamedicijnniveaus vaak gebruikt bij de controle van therapeutische geneesmiddelen11,12. In het kader van de monitoring van de therapietrouw van geneesmiddelen vertegenwoordigen plasmaniveaus echter blootstelling op korte termijn en worden ze beperkt door aanzienlijke intra- en interpatiëntvariabiliteit bij het bepalen van het juiste referentiebereik voor therapietrouw. "Witte vacht" effecten, waar de therapietrouw verbetert voorafgaand aan de kliniek of studie bezoeken, verder bemoeilijkt het vermogen van plasma niveaus om nauwkeurige drug therapietrouw patronen13.
Haar is een alternatieve biomatrix die langdurige blootstelling aan geneesmiddelen kan meten14,15. Veel geneesmiddelen en endogene metabolieten nemen in het haar eiwit matrix uit de systemische circulatie als haar groeit. Als dit dynamische proces blijft tijdens de haargroei, de hoeveelheid geneesmiddel afgezet in de haarmatrix hangt af van de continue aanwezigheid van het geneesmiddel in de circulatie, waardoor haar een uitstekende tijdelijke uitlezing van de inname van geneesmiddelen. Haar als biomatrix heeft het extra voordeel dat het gemakkelijk wordt verzameld zonder de noodzaak van koude keten voor opslag en verzending in vergelijking met bloed. Bovendien is haar niet-biogevaarlijk, wat extra haalbaarheidsvoordelen in het veld biedt.
Haar drug niveaus zijn al lang gebruikt in forensische toepassingen16. In de afgelopen tien jaar hebben de niveaus van haarantiretrovirale (ARV) aangetoond nut bij de beoordeling van de therapietrouw van geneesmiddelen in hiv-behandeling en preventie, waaraan onze groep heeft bijgedragen. ARV-niveaus in het haar zijn de sterkste onafhankelijke voorspellers van behandelingsresultaten bij hiv-infectie17,18,19,20,21. Om te bepalen of haarniveaus van DR-TB-patiënten hetzelfde nut zullen hebben bij het voorspellen van de uitkomst van de behandeling, gebruikten we LC-MS/MS om een methode te ontwikkelen en te valideren voor het analyseren van 11 DR-TB medicijnen in kleine haarmonsters. Als een eerste beoordeling van de prestaties van de test, maten we DR-TB drugs niveaus in een gemak monster van patiënten met DR-TB ontvangen direct waargenomen therapie (DOT) in de West-Kaap, Zuid-Afrika22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle patiënten hebben schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven voorafgaand aan het verzamelen van haarmonsters. We kregen de goedkeuring van de Institutional Review Board van de Universiteit van Kaapstad en de Universiteit van Californië, San Francisco.
1. Haarbemonstering
- Schriftelijke geïnformeerde toestemming verkrijgen.
- Gebruik schone schaar te snijden ongeveer 20-30 hoofdhuid haarlokken uit de occipital regio zo dicht mogelijk bij de hoofdhuid mogelijk.
- Plaats tape rond de distale kant van het haar om directionaliteit aan te geven. Vouw haar monster in een aluminiumfolie vierkant en op te slaan op kamertemperatuur. Label het distale uiteinde van het haar om mogelijke besmetting door extra behandeling van het proximale uiteinde te voorkomen.
- Naast patiënt monsters, verzamelen "blanco haar": een hoofdhuid haar monster van iemand die niet heeft genomen TB medicatie. Verzamel een grote hoeveelheid (>30 mg leeg haar voor elke 20 patiëntmonsters).
2.
- Label kraal buizen. Elk patiëntmonster vereist één buis. Label 12 buizen van "C0" tot "C11", een voor elk van de 12 kalibratiepunten. Label een buis voor low quality control, een buis voor medium kwaliteitscontrole en een buis voor hoge kwaliteitscontrole. Ten slotte, label een buis voor Matrix Blank.
- Open het aluminiumfolievierkant met haarmonster. Als het haarmonster langer is dan 3 cm, knip haar op 3 cm van het proximale uiteinde en gebruik dat proximale gedeelte voor analyse.
- Weeg 2 mg van het haarmonster in een kraalbuis.
- Weeg 2 mg leeg haar in 16 extra kraalbuizen. Deze zullen worden gebruikt als de kalibratiepunten, kwaliteitscontroles en matrix blanco. De buizen zullen dezelfde extractieprocedure volgen als de monsters van de patiënt, afgezien van het feit dat ze worden verrijkt met referentienormen voor geneesmiddelen op niveaus die zijn aangegeven in stappen 2.8 en 2.9.
- Plaats alle kraalbuizen in de homogenisator. Voer homogenisator uit met een snelheid van 6,95 m/s. Run gedurende twee cycli van 30 s per stuk, met een rustperiode van 15 s tussen de twee cycli.
- Maak interne standaard mix en voeg het toe aan de monsters.
- Voeg ~40 mL methanol toe aan een 50 mL volumekolf.
- Maak in amberglazen flacons de mengsels van de interne normen in tabel 1,waarbij methanol als oplosmiddel wordt gebruikt.
OPMERKING: Methanol is zeer vluchtig. Laat alle flesjes tijdens dit proces afgedekt om verlies als gevolg van verdamping te voorkomen. - Voeg uit deze mengsels het in tabel 1 vermelde volume toe aan de 50 mL volumekolf. Vul de kolf vervolgens tot 50 mL met methanol.
- Dop en meng de volumetrische kolf. Voeg 500 μL van het mengsel toe aan elk van de verpulverde haarbuizen, met uitzondering van de matrixlege buis. Voeg 500 μL methanol toe aan de lege buis van de matrix.
- Maak referentiestandaardmixen.
- Vormen nette referentienormen van de volgende geneesmiddelen met methanol om de concentratie in de tabel in stap 2.7.2 te krijgen. Slechts 1 mL van de volgende concentraties is noodzakelijk.
- Voeg 1768 μL methanol toe aan een flacon en voeg vervolgens de in tabel 2 vermelde referentiestandaard toe aan dezelfde flacon om 2 mL eindvolume te krijgen. Label deze flacon "Ref Std Mix 1x". Vortex.
- Spike 100 μL van "Ref Std Mix 1x" in 900 μL methanol in een nieuwe flacon. Label deze flacon "Ref Std Mix 10x". Vortex.
- Spike 100 μL van "Ref Std Mix 10x" in 900 μL methanol in een nieuwe flacon. Label deze flacon "Ref Std Mix 100x". Vortex.
- Spike 100 μL van "Ref Std Mix 100x" in 900 μL methanol in een nieuwe flacon. Label deze flacon "Ref Std Mix 1000x". Vortex.
- Spike de kalibratie curve buizen door het toevoegen van de hoeveelheid Ref Std Mix beschreven in tabel 3.
- Maak QC-mixen en spike-kwaliteitscontrolebuizen.
- Label 5 flesjes "QC-A" tot en met "QC-E".
- Voeg de volgende hoeveelheden methanol toe aan de vijf gelabelde flacons:
QC-A: 990 μL
QC-B: 940 μL
QC-C: 950 μL
QC-D: 980 μL
QC-E: 950 μL
- Met behulp van de 1 mg/mL drugsvoorraden die in stap 2.7.1 zijn gecreëerd, voegt u 10 μL toe aan de hieronder vermelde specifieke flesjes. Voor de BDQ- en CLF-voorraden, die zich op 0,5 mg/mL bevinden, voegt u 20 μL toe aan de onderstaande flacons.
QC-A: PTH
QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
QC-D: PTH, EMB
QC-E: CLF, BDQ, PTM
OPMERKING: Sommige geneesmiddelen zijn aanwezig in meerdere mixen. - Label een flacon als "QC-A df100". Verdun 10 μL QC-A in 990 μL methanol.
- Label een flacon als "Low QC stock". Voeg 1832 μL methanol toe aan deze flacon. Voeg hieronder de hoeveelheden QC-mixen toe:
QC-A df100: 80 μL
QC-B: 8 μL
QC-C: 80 μL
- Label een flacon als "Mid QC voorraad". Voeg 760 μL methanol toe aan deze flacon. Voeg hieronder de hoeveelheden QC-mixen toe:
QC-A df100: 800 μL
QC-B: 40 μL
QC-C: 400 μL
- Label een flacon als "High QC voorraad". Voeg 1376 μL methanol toe aan deze flacon. Voeg hieronder de hoeveelheden QC-mixen toe:
QC-D: 160 μL
QC-E: 320 μL
MFX, 1mg/mL voorraad: 16 μL
INH, 1mg/mL voorraad: 32 μL
LFX, 1mg/mL voorraad: 32 μL
LZD, 1mg/mL voorraad: 32 μL
PZA, 1mg/mL voorraad: 32 μL
- Spike 10 μL Lage QC-voorraad in de Lage QC-kraalbuis.
- Spike 10 μL Mid QC voorraad in de Mid QC kraal buis.
- Spike 10 μL High QC voorraad in de High QC kraal buis.
- Plaats alle buizen in hete shaker gedurende 2 uur bij 37 °C. Schudden moet langzaam genoeg zijn dat het water niet spatten op de buizen.
- Verwijder buizen uit shaker. Breng vloeistof uit kraalbuizen over in nieuwe microcentrifugebuizen. Label deze microcentrifuge buizen op dezelfde manier.
- Voeg 500 μL methanol toe aan de oude buizen. Pet en vortex.
- Breng voor de tweede keer vloeistof uit de kraalbuizen over in de bijbehorende microcentrifugebuis. Het is goed om verpulverd haar over te dragen. Dit zal uiteindelijk worden gecentrifugeerd.
- Centrifugeer de microcentrifugebuizen gedurende 10 min op 2.800 x g.
- Verwijder de vloeistof voorzichtig en breng deze met bijbehorende etiketten in nieuwe centrifugebuizen. Zorg ervoor dat u de haarpellet niet verstoort of overbrengt.
- Verdamp de vloeistof in de centrifugebuizen tot droogheid bij 32 °C.
- Reconstrueren van de monsters door 200 μL mobiele fase A (HPLC-grade water met 1% mierenzuur) toe te voegen aan de droge buizen. Vortex.
- Breng de vloeistof over op amberflesjes met 250 μL wisselplaten.
3. LC-MS/MS-preparaat
- Maak een liter mobiele fase A (HPLC-grade water met 1% mierenzuur) door wat HPLC-kwaliteit water toe te voegen aan een volumekolf van één liter. Voeg vervolgens 10 mL >95% mierenzuur toe aan die kolf en vul vervolgens aan de lijn met hplc-waardig water.
- Maak een liter mobiele fase B (acetonitril met 0,1% mierenzuur) door het toevoegen van wat acetonitril aan een een-liter volumetrische kolf. Voeg vervolgens 1 mL >95% mierenzuur toe aan die kolf en vul vervolgens met acetonitril aan de lijn.
- Installeer een kolom van 2 x 100 mm met een deeltjesgrootte van 2,5 μm en een poriegrootte van 100 Å met polaire endcapped, ether-gebonden fenylkralen volledig gemaakt van poreus silica in het kolomcompartiment. Zorg ervoor dat kolom heeft ook fabrikant aanbevolen guard cartridge geïnstalleerd.
- Open de software voor gegevensverwerving en dubbelklik op Hardwareconfiguratie. Markeer LCMS en klik op Profiel activeren.
- Klik op Nieuw subprojectof klik, als er al andere subprojecten bestaan, op Subproject kopiëren. Geef het subproject een naam.
- Klik op Nieuw document. Dubbelklik op Acquisitiemethode. Klik op Massaspec in het venster Acquisitiemethode.
- Wijzig de vervolgkeuzelijst Scantype in MRM (MRM). Zorg ervoor dat Polariteit is ingesteld op Positief.
- Klik op Lijst importeren en selecteer de LCMS-methode transitions.csv van het CSV-bestand die is opgenomen in Aanvullende materialen.
- Schuif naar beneden en stel de duur in op 16.751 min. De juiste cyclustijd en het aantal cycli worden automatisch ingevuld.
- Klik in de linkerzijbalk op Geïntegreerde Valco-klep. Zorg ervoor dat de positienaam voor stap 0 A is. Typ in de kolom Totale tijd (min) 0,4 op de eerste rij en 13 op de tweede rij.
- Stel in de kolom Positie rij één in op B en rij twee naar A.
- Klik in de linkerzijbalk op Binaire pomp. Stel de tabel verloop en de stroomsnelheid in volgens tabel 4.
- Klik op de linkerzijbalk op Autosampler. Het injectievolume wijzigen in 10 μL. Klik op Temperatuurregeling ingeschakeld en ingesteld op 4 °C.
- Klik in de linkerzijbalk op Kolomvak. Stel zowel de rechter- als de linkertemperatuur in op 50 °C.
- Methode sluiten en opslaan.
- Batch maken door op Nieuw document te klikken en Batch acquisitie teselecteren . Typ een vaste naam en selecteer de nieuw gemaakte methode in de vervolgkeuzebalk.
- Maak in een spreadsheet een batch die deze volgorde volgt: kalibratiecurve, kwaliteitscontroles, patiëntmonsters, kalibratiecurve, kwaliteitscontroles, patiëntmonsters, kalibratiecurve, kwaliteitscontroles. Voeg oplosmiddelblanco injecties toe aan het begin en einde van de run, evenals voor en na de kalibratiecurve, kwaliteitscontroles en patiëntmonsters. Doe ten minste acht oplosmiddelblanco injecties na injecties van de kalibratiecurve en hoogwaardige controleflacon om de overdracht van analyte te verminderen.
OPMERKING: Afhankelijk van de leeftijd van de kolom moeten mogelijk meer blanco injecties met oplosmiddelen worden toegevoegd. - Typ in de kolom naast de steekproefnamen de juiste autosamplerpositie voor de overeenkomstige flacon.
- Klik op Set toevoegen. Typ in het pop-upvenster het aantal monsters in de batch.
- Kopieer en plak voorbeeldnamen en flaconlocaties uit de spreadsheet naar de nieuw gemaakte batch.
- Ga naar het tabblad Verzenden. Klik op Verzenden.
- Maak in een spreadsheet een batch die deze volgorde volgt: kalibratiecurve, kwaliteitscontroles, patiëntmonsters, kalibratiecurve, kwaliteitscontroles, patiëntmonsters, kalibratiecurve, kwaliteitscontroles. Voeg oplosmiddelblanco injecties toe aan het begin en einde van de run, evenals voor en na de kalibratiecurve, kwaliteitscontroles en patiëntmonsters. Doe ten minste acht oplosmiddelblanco injecties na injecties van de kalibratiecurve en hoogwaardige controleflacon om de overdracht van analyte te verminderen.
- Equilibrate systeem door het inbrengen van oplosmiddellijn A in mobiele fase A en oplosmiddellijn B in mobiele fase B. Open de zuiveringsklep op de binaire pomp.
- Stel de oplosmiddelsamenstelling in op 50% B op 4 mL/min debiet. Zet de binaire pomp aan.
- Na 5 min, daling stroom tot 0,3 mL/min. Sluit de zuiveringsklep. Controleer op eventuele lekken.
- Druk in de software op Equilibrate op de bovenste werkbalk. Stel de tijd in op >5 min, druk op OK.
- Nadat het instrument is geequilibrated, zullen de modules rechtsonder in het venster groen lijken. Controleer of de druk is gestabiliseerd en start de batch door op Voorbeeld starten te klikken.
4. Gegevensanalyse
- Nadat de batch is voltooid, opent u de kwantitatiesoftware. Klik op het toverstokje om een nieuwe tabel Resultaten te maken.
- Klik op Bladeren om naar de juiste map te navigeren en markeer het gegevensbestand en klik op de pijl met rechts aanwijzen om de gegevens naar het geselecteerde gebied te verplaatsen. Klik op Volgende.
- Selecteer Nieuwe methode maken en klik op Nieuw. Voer de naam van de nieuwe kwantingsmethode in en druk op Opslaan en vervolgens Volgende.
- Selecteer de eerste injectie van het middelste kalibratiepunt. Druk op Volgende.
- Vink alle overgangen van de interne standaarden in de IS-kolom aan.
- Selecteer de bijbehorende IS-kolom voor de kwantorovergangen voor de referentiestandaarden. IS Name Klik op Volgende.
- Blader door de overgangen om ervoor te zorgen dat de automatisch geselecteerde bewaartijd juist is. Zorg ervoor dat Gaussian Smoothing is ingesteld op 1,5. Alle andere standaardinstellingen kunnen blijven zoals het is (d.w.z. Ruispercentage 100%, Basislijn Sub. Venster 2,00 min, Piek splitsing 2 punten).
OPMERKING: Wijzig indien gewenst de automatische integratieparameters op dit punt. Aangezien deze parameters veranderen op basis van instrument setup, hebben we niet opgenomen de onze hier. - Klik op Voltooien om de kwantitatiemethode op de batch toe te passen.
- Klik linksboven De knop piekcontrole weergeeft de knop Piekcontrole om chromatogrammen weer te geven. Navigeer door de overgangen met de linkerzijbalk. Scroll door elke injectie van elke kwantorovergang en integreer indien nodig handmatig de juiste piek.
- Als u een piek handmatig wilt integreren, klikt u op de knop Handmatige integratiemodus inschakelen, zoomt u in op het chromatogram door op de x- of y-as te klikken en te slepen en vervolgens een lijn van de ene basislijn naar de andere basislijn te tekenen, de piek te definiëren. Figuur 3 toont twee chromatogrammen: een die INH heeft, en daarom handmatig is geïntegreerd, en een andere die geen INH heeft.
LET OP: Alle injecties moeten worden geïntegreerd met dezelfde parameters. Piekbreedte kan een richtlijn bieden voor het vasthouden aan deze parameters, maar soms zal de piekbreedte verschillen. Om een piek te kwantificeren, moet de retentietijd binnen ±0,15 min van de verwachte retentietijd voor dat analyt (zoals gedefinieerd door de referentiestandaardpieken) liggen, kwalitatief bevestigd als met de verwachte kwantor-kwalificatieverhouding (zoals afgebeeld in figuur 2), en een signaal-ruisverhouding van meer dan 10 hebben.
- Als u een piek handmatig wilt integreren, klikt u op de knop Handmatige integratiemodus inschakelen, zoomt u in op het chromatogram door op de x- of y-as te klikken en te slepen en vervolgens een lijn van de ene basislijn naar de andere basislijn te tekenen, de piek te definiëren. Figuur 3 toont twee chromatogrammen: een die INH heeft, en daarom handmatig is geïntegreerd, en een andere die geen INH heeft.
- Stel in de kolom Monstertype de kalibratiecurve-injecties (met uitzondering van de lege kalibratiecurve-injecties) in op Standaard. Stel de kwaliteitscontroleinjecties in op kwaliteitscontrole. Laat de resterende injecties als onbekend.
OPMERKING: Dit wordt ingesteld voor alle overgangen. - Typ in de kolom Werkelijke concentratie de concentraties in tabel 5 voor alle kalibratiecurve- en kwaliteitscontrole-injecties.
- Klik op de tweede linksboven Geeft de kalibratiecurveknop weer. Klik op de knop Regressie.
- Stel het type weging in op 1/x en druk op OK.
- Valideer de kalibratiecurve- en kwaliteitscontrolemonsters om ervoor te zorgen dat de batch succesvol is uitgevoerd.
- Voor elke referentieovergang van de kwantor (geen interne standaardovergangen) kijkt u naar de nauwkeurigheid van elke kalibratiecurve-injectie (in de kolom Nauwkeurigheid). Ten minste twee derde van de ijkpunten moet een nauwkeurigheid hebben binnen 80-120%.
- Voor kalibratiepunten die ver buiten de verwachte nauwkeurigheid liggen, kan de injectie een uitschieter zijn. Uitschieters uitsluiten als hun berekende concentratie meer dan twee standaardafwijkingen verwijderd is van de andere twee injecties van dat flesje. Klik op de "et peak naar 'niet gevonden knop boven elk chromatogram.
- Controleer of de R-waarde boven de kalibratiecurve >0,975 is.
- Controleer of alle kwaliteitscontrole-injecties een nauwkeurigheid hebben binnen 80-120%.
- Als aan alle bovenstaande voorwaarden is voldaan, is de partij geslaagd en kunnen monsters worden gekwantificeerd. Klik op Bewerken op de werkbalk en klik vervolgens op Hele tabel kopiëren. Plak de tabel in een spreadsheet.
- Neem het gemiddelde van de berekende concentratie van de twee monsterinjecties om de gerapporteerde concentratie van elk monster te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een illustratie van een chromatogram met bevestigde niveaus van alle 11 DR-TB drugs wordt getoond in figuur 1. De bewaartijd voor elke analyt kan veranderen bij het gebruik van verschillende instrumenten en kolommen, dus de exacte bewaartijd moet individueel worden bepaald.
De geëxtraheerde Ionchromatogrammen (EIC's) voor een bepaald geneesmiddel (isoniazid, INH) in een van de calibrators (blanco haarmonster verrijkt met REFERENTIEnormen van DR-TB-geneesmiddelen) worden weergegeven in figuur 2. De kwantificeerder en qualifier overgangen worden gebruikt om de aanwezigheid van het geneesmiddel kwalitatief te bevestigen, omdat de verhouding tussen het gebied van kwantificeerder en het kwalificatiegebied constant blijft tussen monsters. De interne standaard wordt ook gecontroleerd om ervoor te zorgen dat elke monsterinjectie wordt genormaliseerd.
Voor het doel van de demonstratie, analyseerden we een gemak monster van 15 haarmonsters onder een totale studie populatie van 96 patiënten die DR-TB drugs onder DOT voorwaarden uit West-Kaap, Zuid-Afrika. Tabel 6 bevat representatieve niveaus van DR-TB-geneesmiddelen over de laagste en hoogste niveaus gemeten voor elke analyt. Hoewel gegevens voor 15 patiëntmonsters worden gepresenteerd, had elke analyt geen 15 niveaus gemeld omdat elke patiënt op een andere combinatie van DR-TB-medicijnen zit. Geen van de patiënten was op prothionamide, en slechts een enkele patiënt was het nemen van pretomanid.
Figuur 1. Een illustratie van een representatief chromatogram dat pieken van de 11 analyten in de DR-TB-methode (EMB= ethambutol) laat zien; INH= isoniazid; PZA= pyrazinamide; ETH= ethionamide; PTH= prothionamide; LFX= levofloxacine; MFX= moxifloxacine; LZD= linezolid; PTM= pretomanid; BDQ= bedaquiline; CLF= clofazimine). Omdat de gevoeligheid van de methode voor elke analyt anders is, waren INH, LZD, LFX, MFX en LZD verrijkt op 20 ng/mg haar, terwijl BDQ, CLF, EMB, ETH, PTH en PTM werden geprikt op 2 ng/mg haar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Twee geëxtraheerde Ionchromatogrammen (EIC's) uit een injectie van kalibratiepunt 9 (C9), isoniazid (INH) bij 20 ng/mg. De bovenste EIC toont zowel de INH-kwantificrovergang (blauw, gelabeld INH-2) als de INH-kwalificatieovergang (rood, met het label INH-3). De onderste EIC toont respons van INH-d4, de interne standaard (IS) die wordt gebruikt om INH te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Screenshots van het proces van kwantificering. Het bovenste gedeelte is een gedeeltelijke monsterlijst met injectiegegevens voor één analyt (INH, isoniazid) over 12 kalibratiepunten (gelabeld C0-C11), drie QC-niveaus en zes monsters. Linksonder is de kalibratiecurve, variërend van 0,5 ng/mg –100 ng/mg. Ondoorzichtige blauwe stippen zijn kalibratiepunten. Transparante blauwe vierkantjes zijn kwaliteitscontrolepunten. De R-waarde wordt linksboven weergegeven (0,99722) met een weging van 1/x. De twee chromatogrammen rechtsonder illustreren een monster met INH (bovenste chromatogram) en een monster zonder INH (onderste chromatogram). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Drugs in elke mix | Concentratie van elk medicijn in mix | Volume van de mix toegevoegd aan 50mL vol. kolf |
| Mix 1: CLF-d7, EMB-d4 | 10 μg/mL | 40 μL |
| Mix 2: LFX-d8, PTH-d5 | 10 μg/mL | 10 μL |
| Mix 3: BDQ-d6, LZD-d3, MFX 13C-d3, OPC (IS voor PTM) | 10 μg/mL | 20 μL |
| Mix 4: PZA 15N-d3 | 10 μg/mL | 200 μL |
| Mix 5: INH-d4 | 10 μg/mL | 100 μL |
Tabel 1. Concentratie en hoeveelheid van elke interne standaard toe te voegen aan een 50 mL volumetrische kolf.
| Drug | Voorraadconcentratie | Volume toegevoegd |
| BDQ BDQ | 0,5 mg/mL | 8 μL |
| Clf | 0,5 mg/mL | 8 μL |
| Emb | 1 mg/mL | 4 μL |
| Pth | 1 mg/mL | 4 μL |
| PTM (PTM) | 1 mg/mL | 4 μL |
| Inh | 1 mg/mL | 40 μL |
| LFX (LFX) | 1 mg/mL | 40 μL |
| LZD (LZD) | 1 mg/mL | 40 μL |
| MFX MFX | 1 mg/mL | 40 μL |
| Pza | 1 mg/mL | 40 μL |
Tabel 2. Bedrag van elke drug referentie standaard toe te voegen aan "Ref Std Mix 1" flacon.
| Labelnaam | Flacon afkomstig uit | Volume toegevoegd |
| C0 | N/a | 0 μL |
| C1 | Ref Std Mix df1000 | 5 μL |
| C2 | Ref Std Mix df1000 | 10 μL |
| C3 | Ref Std Mix df1000 | 20 μL |
| C4 | Ref Std Mix df100 | 5 μL |
| C5 | Ref Std Mix df100 | 10 μL |
| C6 | Ref Std Mix df100 | 20 μL |
| C7 | Ref Std Mix df10 | 5 μL |
| C8 | Ref Std Mix df10 | 10 μL |
| C9 | Ref Std Mix df10 | 20 μL |
| C10 | Ref Std Mix df1 | 5 μL |
| C11 | Ref Std Mix df1 | 10 μL |
Tabel 3. Bedrag van elke Ref Std Mix intermediate toe te voegen aan de 12 kalibratiepunten.
| Totale tijd (min) | Debiet (μL/min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 450 | 95 | 5 |
| 0.3 | 450 | 95 | 5 |
| 2.3 | 450 | 0 | 100 |
| 5 | 550 | 0 | 100 |
| 11 | 550 | 0 | 100 |
| 11.1 | 550 | 95 | 5 |
| 13 | 450 | 95 | 5 |
| 16.75 | 450 | 95 | 5 |
Tabel 4. De stroomsnelheid en de mobiele fasegradiënt die voor elke injectie worden gebruikt.
| Kalibratiepunt | Werkelijke concentratie van BDQ, CLF, ETH, EMB, PTH, PTM (ng/mg) | Werkelijke concentratie van INH, LFX, LZD, MFX, PZA (ng/mg) |
| C0 | 0 | 0 |
| C1 | 0.005 | 0.05 |
| C2 | 0.01 | 0.1 |
| C3 | 0.02 | 0.2 |
| C4 | 0.05 | 0.5 |
| C5 | 0.1 | 1 |
| C6 | 0.2 | 2 |
| C7 | 0.5 | 5 |
| C8 | 1 | 10 |
| C9 | 2 | 20 |
| C10 | 5 | 50 |
| C11 | 10 | 100 |
Tabel 5. Definitieve concentratie van analyten in elk kalibratiepunt.
| Drug | Lod (ng/mg haar) |
LLOQ (LLOQ) (ng/mg haar) |
ULOQ (ng/mg haar) |
Monsterwaarden (ng/mg haar) Monsters: UC-04, UC-08, UC-11, UC-16, UC-25, UC-36, UC-69, UC-83, UC-89, UC-90, UC-91, UC-104, UC-105, UC-108, UC-109 |
| Bedaquiline | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64 |
| Clofazimine Clofazimine | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01 |
| Ethambutol Ethambutol | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76 |
| Ethionamide Ethionamide | 0.01 | 0.01 | 10 | |
| Isoniazid Isoniazid | 0.05 | 0.5 | 100 | |
| Levofloxacine | 0.1 | 0.5 | 100 | 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96 |
| Linezolid | 0.1 | 0.5 | 100 | 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22 |
| Moxifloxacine (Moxifloxacine) | 0.05 | 0.5 | 100 | 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64 |
| Pretomanid Pretomanid | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.57 |
| Prothionamide Prothionamide | 0.002 | 0.01 | 10 | |
| Pyrazinamide | 0.05 | 1 | 100 | 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66 |
Tabel 6. Representatieve niveaus van geneesmiddelen gemeten bij 15 patiënten die DR-TB-medicijnen gebruikten onder DOT. De detectiegrens (LOD), de ondergrens van de kwantificering (LLOQ) en de bovengrens van de kwantificering (ULOQ) van de methode voor elk geneesmiddel worden ter vergelijking gegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We rapporteren hier het protocol voor de methode die we ontwikkelden en valideren voor het kwantificeren van 11 anti-TB medicijnen die worden gebruikt bij de behandeling van DR-TB in kleine haarmonsters met LC-MS/MS. Geen enkele andere methode voor het kwantificeren van deze 11 geneesmiddelen in het haar is eerder ontwikkeld, gevalideerd en gepubliceerd. Onze methode kan subnanogramniveaus van geneesmiddelen kwantificeren in slechts 20-30 haarstrengen van ongeveer 3 centimeter (cm) in lengte (~2 mg) en is al gevalideerd22. Het lage gewicht van het geanalyseerde haar betekent dat patiënten die betrokken zijn bij de studie discreet kunnen deelnemen en mogelijk kunnen terugkeren voor herhaalde tests zonder angst voor het blootstellen van kale hoofdhuid. We hebben eerder gepubliceerde gegevens over het verband tussen DR-TB drug niveaus in haar en DR-behandeling resultaten23. Daarom is de ontwikkeling en validatie van deze multi-analyt panel methode vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang op het gebied van DR-TB therapeutische drug monitoring.
Haar vereist andere homogenisatietechnieken dan die welke nodig zijn met vloeibare biomatrices. Pulverization van haarstrengen toegestaan efficiënte toegang van extractie oplosmiddel tot analyten in de haarmatrix. Dus, een belangrijk kenmerk van onze methode is de snelle en gemakkelijke extractie proces van drugs uit haar met behulp van de verpulverde monsters. Incubatietijd tijdens het extractieproces is slechts twee uur, als gevolg van de grote toegankelijke oppervlakte van verpulverd haar, en er is geen clean-up stap, als gevolg van de kleine steekproef grootte (2 mg). Er moet echter voor worden gezorgd dat de afbraak van geneesmiddelen tijdens het extractieproces wordt beperkt. Het protocol maakt gebruik van een twee-cyclus verpulvering, met een 45 s afkoeling s periode tussen de cycli. Dit proces voorkomt oververhitting en mogelijk vernederende de drugs in het haar.
In tegenstelling tot veel haaranalyses voor drugs van misbruik, gebruikt deze methode geen wasstap. DR-TB drugs komen in capsule of tablet vorm, het beperken van mogelijke bronnen van externe besmetting en de daaropvolgende noodzaak om haar te wassen voorafgaand aan de analyse. Toekomstige studies kunnen analyseren wasmiddel van DR-TB patiënt haar om externe besmetting te beoordelen.
Hoewel haarverpulvering bevordert efficiënte drug extractie, het heeft zijn eigen beperkingen. Ons laboratorium heeft vastgesteld dat als haar wordt verpulverd in de kraalr uptor en achtergelaten bij kamertemperatuur, de concentratie van een aantal van de 11 drugs afneemt over weken en maanden. Dit kan te wijten zijn aan het grote oppervlak van het verpulverde haar blootgesteld aan de atmosfeer die oxidatie en andere afbraakreacties kan bevorderen. Als een stabiliteitsstudie van de geneesmiddelen in het haar gewenst is, kan haar met een schaar in kleine segmenten van <1 cm worden gesneden, met de hand worden gehomogeniseerd en vervolgens weken of maanden op kamertemperatuur worden gelaten tijdens de stabiliteitsstudie. Wanneer deze knippende haren wordt verpulverd op de dag van de analyse, hebben we geen significante afbraak van geneesmiddelen in de tijd waargenomen. Vandaar, bij het uitvoeren van het beschreven protocol, raden we aan dat het haar wordt verpulverd op de dag dat het wordt geëxtraheerd. Evenzo moeten alle drugsmengsels onder de 10 μg/mL-concentraties worden bereid op de dag van extractie.
Er zijn geen eerder gepubliceerde methoden beschikbaar om de geschiktheid te beoordelen van de lineaire dynamische bereiken (LLOQ-ULOQ) die we voor elk tbc-medicijn in de multi-analytmethode hebben vastgesteld. Echter, het gemak monster van haar monsters uit West-Kaap, Zuid-Afrika, geeft de geschiktheid van de lineaire dynamische bereik van deze methode. Met uitzondering van ethionamide, pretomanid en prothionamide, meer dan 95% van de geneesmiddelen niveaus die we gemeten bij deze patiënten zijn binnen het lineaire dynamische bereik van elke analyt. Slechts één patiënt nam pretomanid (die werd gedetecteerd), en geen patiënten waren het nemen van prothionamide. Voor ethionamide, we veronderstellen dat het geneesmiddel niet kan storten op het haar matrix goed, als onze LOD is 0,01 ng/mg haar (of 10 pg/mg haar) en toch slechts een van de acht patiënten die ethionamide heeft niveaus groter dan 0,02 ng/mg haar. Verder onderzoek is gerechtvaardigd om de farmacokinetiek van verschillende tbc-geneesmiddelen in het haar te bepalen. Een mogelijk alternatief voor het monitoren van geneesmiddelen zoals ethionamide is bijvoorbeeld het ontwikkelen van een methode die gericht is op hun metaboliet(s) in plaats daarvan. We hebben een soortgelijke observatie gemaakt voor delamanid, een nieuwe DR-TB medicatie, die aanvankelijk deel uitmaakte van dit panel. Een methode gericht op delamanid's metaboliet is momenteel in het proces van wordt gevalideerd in ons laboratorium, omdat de metaboliet wordt gevonden in hogere concentraties dan de ouder drug. Dezelfde procedure kan worden uitgevoerd voor ethionamide. De medicijnconcentraties in tabel 6 worden als een groep gepresenteerd omdat de individuele resultaten en klinische resultaten niet de focus van dit methodedocument zijn. Individuele beoordeling van deze groep patiënten is elders gepubliceerd23.
De patiënten die kleine haarsteekproeven voor de demonstratiestudie bijdragen werden toegediend een verscheidenheid van drugregimes via DOT in een intramurale plaatsen, en alle regimes werden gedocumenteerd volgens verzorgingsverslagen tijdens de intramurale periode. Echter, zoals gebruikelijk is bij DR-TB patiënten, eerdere, slecht gedocumenteerde drug regimes waren ook toegediend voorafgaand aan hun intramurale verblijf. Dit leidde tot detectie van geneesmiddelen in geduldig haar die niet werden opgemerkt op hun intramurale dossiers. Daarom konden we deze monsters niet gebruiken om de specificiteit van de methode te bepalen, omdat we niet konden bepalen of deze monsters echt valse positieven waren. In plaats daarvan testten we haar van patiënten die geen DR-TB-medicijnen gebruikten. Er werden geen DR-TB-geneesmiddelen in deze monsters aangetroffen, wat aangeeft dat de methode specifiek is.
Hoewel onze methode toont het nut van het gebruik van haar in het meten van DR-TB drugs, haaranalyse heeft zijn eigen set van beperkingen. Omdat haar is een solide matrix, stekelen van drug referentienormen tijdens de methode validatie niet mogelijk voor de normen 'volledige integratie in de matrix als met urine en bloed. Dus, herstel beoordeling is beperkt tot de detectie van drugs na spiking op de vaste matrix, en niet de werkelijke ophalen van de matrix. Ook omdat haar is een alternatieve matrix die nog steeds wordt onderzocht voor het testen, geen direct beschikbare referentiebereiken voor medicijnen zijn beschikbaar om de geschiktheid van de methode te beoordelen. Meer farmacokinetische studies over de integratie van geneesmiddelen in het haar zal nuttig zijn om verder te begrijpen het nut van haar drug niveaus in therapietrouw monitoring. Tot slot, de juiste collectie van haar monsters op veldsites heeft zijn eigen unieke uitdagingen. Terwijl het verzamelen en opslaan van haarmonsters minder middelen vereist dan andere biomatrices, moet ervoor worden gezorgd dat de distale en proximale uiteinden van haarstrengen langer dan 2 cm worden geïdentificeerd. Een goede etikettering maakt analyse van specifieke segmenten van de strengen mogelijk; in het geval van onze methode werd de drie centimeter haar die het dichtst bij de hoofdhuid ligt gebruikt om de meest recente gegevens over medicatietherapie te bepalen. Een goede etikettering vereist training en kwaliteitsborging procedures op de sites.
Samengevat hebben we het eerste multi-analytpanel ontwikkeld voor het analyseren van TB-medicijnen die worden gebruikt voor DR-TB via LC-MS/MS in kleine haarmonsters. Gezien de haalbaarheid van het verzamelen en opslaan van haar in resource-beperkte instellingen, onze methode vertegenwoordigt een potentieel belangrijke vooruitgang op het gebied van TB therapeutische drug monitoring. Objectieve maatregelen voor blootstelling aan geneesmiddelen die rekening houden met zowel de therapietrouw als de individuele farmacokische variabiliteit kunnen een vroege indicatie geven van ineffectieve behandelingsregimes, waardoor zowel de individuele behandeling als de communautaire overdracht van DR-TB24worden beperkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Allergy and Infectious Diseases RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe en Monica Gandhi).
Acknowledgments
De auteurs willen professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail en Marietjie Pretorius van het University of Cape Town Lung Institute bedanken die de verzameling haarmonsters voor de studie faciliteerden. De auteurs erkennen verder dankbaar de bijdragen van de deelnemers aan deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, Suppl 1 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
