Summary
Los métodos actuales para analizar la adherencia de los pacientes a regímenes complejos de tuberculosis farmacorresistente (DR-TB) pueden ser inexactos e intensivos en recursos. Nuestro método analiza el cabello, una matriz fácilde de recoger y almacenar, para concentraciones de 11 medicamentos DR-TB. Usando LC-MS/MS, podemos determinar los niveles de fármacos subnanogramos que se pueden utilizar para entender mejor la adherencia a los medicamentos.
Abstract
La tuberculosis farmacorresistente (TB-DR) es una amenaza creciente para la salud pública, y la evaluación de los niveles de medicamentos terapéuticos puede tener importantes beneficios clínicos. Los niveles de fármacos plasmáticos son la evaluación estándar de oro actual, pero requieren flebotomía y una cadena de frío, y capturan sólo una adherencia muy reciente. Nuestro método utiliza el cabello, una matriz que se recoge fácilmente y refleja la adherencia a largo plazo, para probar 11 medicamentos antituberculosos. El trabajo previo de nuestro grupo muestra que los niveles de medicamentos antirretrovirales en el cabello están asociados con los resultados del VIH. Nuestro método para fármacos DR-TB utiliza 2 mg de cabello (3 cm proximal a la raíz), que se pulveriza y se extrae en metanol. Las muestras se analizan con un único método LC-MS/MS, cuantificando 11 fármacos en una carrera de 16 minutos. Los límites más bajos de cuantificación (LLOQ) para los 11 fármacos oscilan entre 0,01 ng/mg y 1 ng/mg. La presencia de fármacos se confirma comparando las relaciones de dos transiciones de espectrometría de masas. Las muestras se cuantifican utilizando la relación de área del fármaco con la isotopotopopotopopoca delaterated, 15N-, o 13Con etiqueta C. Utilizamos una curva de calibración que va desde 0.001-100 ng/mg. La aplicación del método a una muestra de conveniencia de muestras capilares recogidas de pacientes con TB-DR en terapia observada directamente (DOT) indicó niveles de fármacos en el cabello dentro del rango dinámico lineal de nueve de los once fármacos (isoniazida, pirazinamida, ethambutol, linezolid, levofloxacino, moxifloxacino, clofazimine, bedaquilina, pretomanide). Ningún paciente estaba tocando protionamida, y los niveles medidos de etionamida estaban cerca de su LLOQ (con trabajo adicional en lugar de examinar la idoneidad del metabolito de etionamida para monitorear la exposición). En resumen, describimos el desarrollo de un panel multianálisis para fármacos contra la TUBERCULOSIS en el cabello como una técnica para el monitoreo terapéutico de fármacos durante el tratamiento de la tuberculosis farmacorresistente.
Introduction
En el siglo XXI, la tuberculosis farmacorresistente (TB-DR) es una catástrofe en evolución para los ya débiles programas nacionales de control de la tuberculosis, con casos confirmados que se duplican solo en los últimos 5 años, lo que representa casi un tercio de todas las muertes relacionadas con la resistencia a los antimicrobianos en todo el mundo1,2. El tratamiento exitoso de la TB-DR ha requerido convencionalmente regímenes de segunda línea más largos y tóxicos que el tratamiento para la tuberculosis sensible a los medicamentos. Además, los pacientes con TB-DR a menudo tienen importantes desafíos preexistentes a la adherencia, lo que contribuyó a la aparición de resistencia inicialmente3.
A diferencia de la infección por VIH, en la que se pueden utilizar cargas virales para controlar el tratamiento, las variables sustitutas de la respuesta al tratamiento en la tuberculosis se retrasan y no son fiables en un nivel individual4. El control de la adherencia de los pacientes, un importante predictor de la concentración de fármacos antituberculosos y la insuficiencia del tratamiento, también es un desafío. La adherencia autoinformada sufre de sesgo de recuerdo y el deseo de complacer a los proveedores5,,6. Los recuentos de píldoras y los sistemas de monitoreo de eventos de medicamentos (MEMS) pueden ser más objetivo7 pero no miden el consumo real de drogas8,9,10. Los niveles de fármacos en las biomatrices pueden proporcionar datos de adherencia y farmacocinéticos. Por lo tanto, los niveles plasmáticos de fármacos se utilizan comúnmente en la monitorización terapéutica de fármacos11,12. Sin embargo, en el contexto de la monitorización de la adherencia a los medicamentos, los niveles plasmáticos representan una exposición a corto plazo y están limitados por una variabilidad significativa dentro e interpaciente al determinar el rango de referencia de adherencia adecuado. Efectos de "capa blanca", donde la adherencia mejora antes de las visitas a la clínica o al estudio, complica aún más la capacidad de los niveles plasmáticos para proporcionar patrones precisos de adherencia a los medicamentos13.
El cabello es una biomatriz alternativa que puede medir la exposición a largo plazo a fármacos14,,15. Muchos fármacos y metabolitos endógenos se incorporan a la matriz de proteína capilar de la circulación sistémica a medida que crece el cabello. A medida que este proceso dinámico continúa durante el crecimiento del cabello, la cantidad de droga depositada en la matriz capilar depende de la presencia continua de la droga en circulación, haciendo del cabello una excelente lectura temporal de la ingesta de drogas. El cabello como biomatriz tiene la ventaja adicional de ser fácilmente recogido sin la necesidad de cadena de frío para el almacenamiento y el envío en comparación con la sangre. Además, el cabello no es biopeligroso, lo que proporciona ventajas de viabilidad adicionales en el campo.
Los niveles de drogas capilares se han utilizado durante mucho tiempo en aplicaciones forenses16. Durante la última década, los niveles de antirretroviral del cabello han demostrado utilidad en la evaluación de la adherencia a las drogas en el tratamiento y la prevención del VIH, a lo que nuestro grupo contribuyó. Se ha demostrado que los niveles de ARV en el cabello son los predictores independientes más fuertes de los resultados del tratamiento en la infección por VIH17,18,19,20,21. Para determinar si los niveles capilares de pacientes con TB-DR tendrán la misma utilidad para predecir el resultado del tratamiento, utilizamos LC-MS/MS para desarrollar y validar un método para analizar 11 medicamentos de TB-DR en muestras de cabello pequeño. Como evaluación inicial del rendimiento del ensayo, medimos los niveles de fármacos contra la tuberculosis retro en una muestra de conveniencia de pacientes con TB-DR que reciben terapia observada directamente (DOT) en el Cabo Occidental, Sudáfrica22.
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Protocol
Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito antes de la recolección de muestras de cabello. Obtuvimos la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Ciudad del Cabo y la Universidad de California, San Francisco.
1. Muestreo capilar
- Obtener consentimiento informado por escrito.
- Use tijeras limpias para cortar aproximadamente 20-30 hebras de cabello del cuero cabelludo de la región occipital lo más cerca posible del cuero cabelludo.
- Coloque la cinta alrededor del lado distal del cabello para indicar la direccionalidad. Doble la muestra de cabello en un cuadrado de papel de aluminio y guárdelo a temperatura ambiente. Etiquetar el extremo distal del cabello para evitar una posible contaminación por manipulación adicional del extremo proximal.
- Además de las muestras de pacientes, recoja "pelo en blanco": una muestra de cabello del cuero cabelludo de alguien que no ha tomado medicamentos para la tuberculosis. Recoger una gran cantidad (>30 mg de pelo en blanco por cada 20 muestras de pacientes).
2. Extracción de drogas
- Tubos de cuentas de etiquetas. Cada muestra de paciente requiere un tubo. Etiquete 12 tubos de "C0" a "C11", uno para cada uno de los 12 puntos de calibración. Etiquete un tubo para control de baja calidad, un tubo para control de calidad media y un tubo para control de alta calidad. Por último, etiquete un tubo para Matrix Blank.
- Abra el cuadrado de papel de aluminio que contiene la muestra de cabello. Si la muestra de pelo es de más de 3 cm, corte el cabello a 3 cm del extremo proximal y use esa porción proximal para el análisis.
- Pesar 2 mg de la muestra de cabello en un tubo de cuentas.
- Pesar 2 mg de pelo en blanco en 16 tubos de cuentas adicionales. Estos se utilizarán como puntos de calibración, controles de calidad y matriz en blanco. Los tubos seguirán el mismo procedimiento de extracción que las muestras del paciente, además de ser pinchados con normas de referencia de fármacos en los niveles indicados en los pasos 2.8 y 2.9.
- Coloque todos los tubos de cuentas en el homogeneizador. Ejecute el homogeneizador a velocidad de 6,95 m/s. Ejecute dos ciclos de 30 s cada uno, con un período de descanso de 15 s entre los dos ciclos.
- Haga una mezcla estándar interna y agréguela a las muestras.
- Añadir 40 ml de metanol a un matraz volumétrico de 50 ml.
- En viales de vidrio ámbar, realice las mezclas de las normas internas que se muestran en la Tabla 1,utilizando el metanol como disolvente.
NOTA: El metanol es muy volátil. Deje todos los viales tapados durante este proceso para evitar la pérdida debida a la evaporación. - A partir de esas mezclas, añada el volumen mostrado en la Tabla 1 al matraz volumétrico de 50 ml. A continuación, llene el matraz a 50 ml con metanol.
- Tapar y mezclar el matraz volumétrico. Añadir 500 l de la mezcla a cada uno de los tubos de pelo pulverizados, excepto para el tubo en blanco de matriz. Añadir metanol de 500 ml al tubo en blanco de la matriz.
- Haga mezclas estándar de referencia.
- Constituir normas de referencia ordenadas de los siguientes fármacos con metanol para obtener la concentración que se muestra en la tabla en el paso 2.7.2. Sólo se requiere 1 ml de las siguientes concentraciones.
- Añadir 1768 l de metanol a un vial y, a continuación, añadir las cantidades de estándar de referencia enumeradas en la Tabla 2 al mismo vial para obtener un volumen final de 2 ml. Etiquete este vial "Ref Std Mix 1x". Vórtice.
- Espiga de 100 ml de "Ref Std Mix 1x" a 900 l de metanol en un vial nuevo. Etiquete este vial "Ref Std Mix 10x". Vórtice.
- Espiga de 100 ml de "Ref Std Mix 10x" a metanol de 900 ml en un vial nuevo. Etiquete este vial "Ref Std Mix 100x". Vórtice.
- Espiga de 100 ml de "Ref Std Mix 100x" a metanol de 900 ml en un vial nuevo. Etiquete este vial "Ref Std Mix 1000x". Vórtice.
- Espelibre los tubos de curva de calibración añadiendo la cantidad de Ref Std Mix descrita en la Tabla 3.
- Cree mezclas de control de calidad y tubos de control de calidad de picos.
- Etiqueta 5 viales "QC-A" a "QC-E".
- Añada las siguientes cantidades de metanol a los cinco viales etiquetados:
QC-A: 990 ?L
QC-B: 940 l
QC-C: 950 sL
QC-D: 980 sL
QC-E: 950 l
- Usando las existencias de medicamentos de 1 mg/ml creadas en el paso 2.7.1, añada 10 l a los viales específicos que se enumeran a continuación. Para las existencias de BDQ y CLF, que se encuentran a 0,5 mg/ml, añada 20 ml a los viales que se enumeran a continuación.
QC-A: PTH
QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
QC-D: PTH, EMB
QC-E: CLF, BDQ, PTM
NOTA: Algunos medicamentos están presentes en múltiples mezclas. - Etiquete un vial como "QC-A df100". Diluir 10 l de QC-A en metanol de 990 ml.
- Etiquete un vial como "Stock de bajo control de calidad". Añadir 1832 l de metanol a este vial. Agregue las cantidades de mezclas de control de calidad que se detallan a continuación:
QC-A df100: 80 l
QC-B: 8 l
QC-C: 80 sL
- Etiquete un vial como "Stock de control de calidad medio". Añadir 760 l de metanol a este vial. Agregue las cantidades de mezclas de control de calidad que se detallan a continuación:
QC-A df100: 800 ?L
QC-B: 40 sL
QC-C: 400 sL
- Etiquete un vial como "Alto stock de control de calidad". Añadir 1376 l de metanol a este vial. Agregue las cantidades de mezclas de control de calidad que se detallan a continuación:
QC-D: 160 l
QC-E: 320 l
MFX, 1mg/ml stock: 16 ?L
InH, 1mg/ml stock: 32 ?L
LFX, 1mg/mL stock: 32 ?L
LZD, 1mg/ml stock: 32 ?L
PZA, 1mg/ml: 32 ?L
- Espiga de 10 l de bajo qc en el tubo de abalorios de bajo control de calidad.
- Espiga de 10 l de control medio qc en el tubo de cuentas Mid QC.
- Espiga de 10 l de alto control de calidad en el tubo de cuentas de alto control de calidad.
- Colocar todos los tubos en una coctelera caliente durante 2 h a 37 oC. El temblor debe ser lo suficientemente lento como para que el agua no salpique sobre los tubos.
- Retire los tubos de la coctelera. Transfiera el líquido de los tubos de perla a nuevos tubos de microcentrífuga. Etiquete estos tubos de microcentrífuga de la misma manera.
- Añadir metanol de 500 ml a los tubos antiguos. Gorra y vórtice.
- Por segunda vez, transfiera el líquido de los tubos de perla al tubo de microcentrífuga correspondiente. Está bien transferir el cabello pulverizado. Esto eventualmente será centrifugado.
- Centrifugar los tubos de microcentrífuga durante 10 min a 2.800 x g.
- Retire cuidadosamente el líquido y transfieralo a nuevos tubos centrífugos con las etiquetas correspondientes. Tenga cuidado de no molestar o transferir el pellet para el cabello.
- Evaporar el líquido en los tubos centrífugos hasta sequerlo a 32 oC.
- Reconstituir las muestras añadiendo 200 l de fase móvil A (agua de grado HPLC con 1% de ácido fórmico) a los tubos secos. Vórtice.
- Transfiera el líquido a viales de ámbar con inserciones de 250 ml.
3. Preparación de LC-MS/MS
- Haga un litro de fase móvil A (agua de grado HPLC con 1% de ácido fórmico) añadiendo un poco de agua de grado HPLC a un matraz volumétrico de un litro. Luego agregue 10 ml de ácido fórmico >95% a ese matraz, y luego llene a la línea con agua de grado HPLC.
- Hacer un litro de fase móvil B (acetonitrilo con 0,1% ácido fórmico) añadiendo un poco de acetonitrilo a un matraz volumétrico de un litro. Luego agrega 1 ml de >95% de ácido fórmico a ese matraz, y luego llene la línea con acetonitrilo.
- Instale una columna de 2 x 100 mm con un tamaño de partícula de 2,5 mm y un tamaño de poro de 100 o con perlas de fenilo ligadas al éter con punta polar, totalmente hechas de sílice porosa en el compartimiento de la columna. Asegúrese de que la columna también tenga instalado el cartucho de protección recomendado por el fabricante.
- Abra el software de adquisición de datos y haga doble clic en Configuración de hardware. Resalte LCMS y haga clic en Activar perfil.
- Haga clic en Nuevo subproyectoo, si ya existen otros subproyectos, haga clic en Copiar subproyecto. Asigne un nombre al subproyecto.
- Haga clic en Nuevo documento. Haga doble clic en Método de adquisición. Haga clic en Especificación física en la ventana Método de adquisición.
- Cambie el menú desplegable Tipo de análisis a MRM (MRM). Asegúrese de que Polarity esté establecido en Positivo.
- Haga clic en Importar lista y seleccione el método transitions.csv del archivo .csv MDR-TB que se incluye en Materiales suplementarios.
- Desplácese hacia abajo y establezca la Duración en 16.751 min. El tiempo de ciclo y el número de ciclos adecuados se rellenarán automáticamente.
- En la barra lateral izquierda, haga clic en Válvula Valco integrada. Asegúrese de que el nombre de la posición del paso 0 es A. En la columna Tiempo total (min), escriba 0,4 en la primera fila y 13 en la segunda fila.
- En la columna Posición, establezca la fila uno en B y la fila dos en A.
- En la barra lateral izquierda, haga clic en Bomba binaria. Establezca la tabla de gradiente y caudal de acuerdo con la Tabla 4.
- En la barra lateral izquierda, haga clic en Autosampler. Cambie el volumen de la inyección a 10 s. Haga clic en Control de temperatura activado y, a 4 oC.
- En la barra lateral izquierda, haga clic en Compartimiento de columnas. Establezca las temperaturas derecha e izquierda a 50 oC.
- Método de cierre y guardado.
- Cree lote haciendo clic en Nuevo documento y seleccionando Adquisición de lote. Escriba un nombre de conjunto y seleccione el método recién creado en la barra desplegable.
- En una hoja de cálculo, cree un lote que siga este orden: curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración, controles de calidad. Añada inyecciones en blanco solventes al inicio y al final de la carrera, así como antes y después de la curva de calibración, los controles de calidad y las muestras de pacientes. Coloque al menos ocho inyecciones de disolvente en blanco después de las inyecciones de la curva de calibración y del vial de control de alta calidad para reducir el arrastre de analitos.
NOTA: Es posible que sea necesario añadir más inyecciones en blanco con disolventes en función de la edad de la columna. - En la columna adyacente a los nombres de muestra, escriba la posición del muestreador automático correspondiente para el vial correspondiente.
- Haga clic en Agregar conjunto. En la ventana emergente, escriba el número de muestras del lote.
- Copie y pegue nombres de muestra y ubicaciones de viales de la hoja de cálculo en el lote recién creado.
- Vaya a la pestaña Submit Enviar.
- En una hoja de cálculo, cree un lote que siga este orden: curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración, controles de calidad. Añada inyecciones en blanco solventes al inicio y al final de la carrera, así como antes y después de la curva de calibración, los controles de calidad y las muestras de pacientes. Coloque al menos ocho inyecciones de disolvente en blanco después de las inyecciones de la curva de calibración y del vial de control de alta calidad para reducir el arrastre de analitos.
- Sistema de equilibrio mediante la inserción de la línea de disolvente A en la fase móvil A y la línea de disolvente B en la fase móvil B. Abra la válvula de purga en la bomba binaria.
- Ajuste la composición del disolvente a 50% B a un caudal de 4 ml/min. Encienda la bomba binaria.
- Después de 5 min, disminuya el flujo a 0,3 ml/min. Cierre la válvula de purga. Compruebe si hay fugas.
- En el software, pulse Equilibrate en la barra de herramientas superior. Ajuste el tiempo a >5 min, pulse OK.
- Después de que el instrumento se haya equilibrado, los módulos en la parte inferior derecha de la ventana aparecerán en verde. Compruebe que la presión se ha estabilizado y, a continuación, inicie el lote haciendo clic en Iniciar muestra.
4. Análisis de datos
- Una vez completado el lote, abra el software de cuantificación. Haga clic en el icono de varita para crear una nueva tabla de resultados.
- Haga clic en Examinar para ir a la carpeta adecuada y, a continuación, resalte el archivo de datos y haga clic en la flecha hacia la derecha para mover los datos al área Seleccionado. Haga clic en Siguiente.
- Seleccione Crear nuevo método y haga clic en Nuevo. Introduzca el nuevo nombre del método de cuantificación y pulse Guardar y, a continuación, Siguiente.
- Seleccione la primera inyección del punto de calibración central. Pulse Siguiente.
- Marque todas las transiciones de las normas internas en la columna IS.
- Para las transiciones del cuantificador para las normas de referencia, seleccione el IS correspondiente en la columna Nombre IS. Haga clic en Siguiente.
- Desplácese por las transiciones para asegurarse de que el tiempo de retención seleccionado automáticamente es preciso. Asegúrese de que El suavizado gaussiano esté establecido en 1.5. Todos los demás ajustes predeterminados pueden permanecer tal está (es decir, Porcentaje de ruido 100%, Sub de línea base. Ventana 2.00 min, Peak Splitting 2 puntos).
NOTA: Si lo desea, modifique los parámetros de integración automática en este punto. Dado que estos parámetros cambian en función de la configuración del instrumento, no hemos incluido el nuestro aquí. - Haga clic en Finalizar para aplicar el método de cuantificación al lote.
- Haga clic en la parte superior izquierda Muestra el botón de revisión de picos para ver los cromatogramas. Navegue a través de las transiciones usando la barra lateral izquierda. Desplácese por cada inyección de cada transición de cuantificador e integre manualmente el pico correcto si es necesario.
- Para integrar manualmente un pico, haga clic en el botón Habilitar modo de integración manual, haga zoom en el cromatograma haciendo clic y arrastrando a lo largo del eje X o Y y, a continuación, dibuje una línea de una línea base a la otra línea base, definiendo el pico. La Figura 3 muestra dos cromatogramas: uno que tiene INH, y por lo tanto se ha integrado manualmente, y otro que no tiene INH.
NOTA: Todas las inyecciones deben integrarse con los mismos parámetros. El ancho de pico puede proporcionar una guía para adherirse a estos parámetros, pero a veces el ancho de pico será diferente. Para cuantificar un pico, el tiempo de retención debe estar dentro de los 0,15 min del tiempo de retención previsto para ese analito (según lo definido por los picos estándar de referencia), se confirma cualitativamente como que tiene la relación cuantificador/calificador esperada (como se muestra en la Figura 2),y tener una relación señal-ruido superior a 10.
- Para integrar manualmente un pico, haga clic en el botón Habilitar modo de integración manual, haga zoom en el cromatograma haciendo clic y arrastrando a lo largo del eje X o Y y, a continuación, dibuje una línea de una línea base a la otra línea base, definiendo el pico. La Figura 3 muestra dos cromatogramas: uno que tiene INH, y por lo tanto se ha integrado manualmente, y otro que no tiene INH.
- En la columna Tipo de muestra, establezca las inyecciones de curva de calibración (con la excepción de las inyecciones de curva de calibración en blanco) en Estándar. Establezca las inyecciones de control de calidad en Control de calidad. Deje las inyecciones restantes como Desconocido.
NOTA: Esto se establecerá en todas las transiciones. - En la columna Concentración real, escriba las concentraciones que se encuentran en la Tabla 5 para todas las curvas de calibración y las inyecciones de control de calidad.
- Haga clic en el segundo desde la parte superior izquierda Muestra el botón de curva de calibración. Haga clic en el botón Regresión.
- Establezca Tipo de ponderación en 1/x y pulse OK.
- Valide la curva de calibración y las muestras de control de calidad para asegurarse de que el lote se ejecutó correctamente.
- Para cada transición de referencia del cuantificador (no transiciones estándar internas), mire la precisión de la inyección de cada curva de calibración (en la columna Precisión). Al menos dos tercios de los puntos de calibración deben tener una precisión dentro del 80-120%.
- Para puntos de calibración muy fuera de la precisión esperada, la inyección puede ser un valor atípico. Excluya los valores atípicos si su concentración calculada es superior a dos desviaciones estándar de las otras dos inyecciones de ese vial. Haciendo clic en el botón "et peak to 'not found above each each cromatogram.
- Compruebe que el valor R mostrado encima de la curva de calibración es >0,975.
- Compruebe que todas las inyecciones de control de calidad tienen una precisión dentro del 80-120%.
- Si se cumplen todas las condiciones anteriores, el lote ha pasado y las muestras se pueden cuantificar. Haga clic en Editar en la barra de herramientas y, a continuación, haga clic en Copiar tabla completa. Pegue la tabla en una hoja de cálculo.
- Tome el promedio de la concentración calculada de las dos inyecciones de muestra para determinar la concentración notificada de cada muestra.
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Representative Results
En la Figura 1se muestra una ilustración de un cromatograma con niveles confirmados de los 11 fármacos contra la tuberculosis antirretropara desastres. El tiempo de retención para cada analito puede cambiar cuando se utilizan diferentes instrumentos y columnas, por lo que el tiempo de retención exacto debe determinarse individualmente.
Los cromatógramas de iones extraídos (EICI) para un medicamento en particular (isoniazida, INH) en uno de los calibradores (muestra de cabello en blanco pinchada con normas de referencia de fármacos DR-TB) se muestran en la Figura 2. Las transiciones cuantificadora y calificador se utilizan para confirmar cualitativamente la presencia de la droga, ya que la relación entre el área del cuantificador y el área del calificador permanece constante entre las muestras. El estándar interno también se supervisa para garantizar que cada inyección de muestra está normalizada.
A efectos de demostración, analizamos una muestra de conveniencia de 15 muestras de cabello entre una población de estudio total de 96 pacientes que toman medicamentos contra la tuberculosis dr en condiciones de DOT de Western Cape, Sudáfrica. En el Cuadro 6 se presentan niveles representativos de medicamentos contra la tuberculosis antirretroparado en los niveles más bajos y más altos medidos para cada analito. Aunque se presentan datos de 15 muestras de pacientes, cada analito no tenía 15 niveles notificados porque cada paciente está en una combinación diferente de medicamentos de la TB-DR. Ninguno de los pacientes tomaba protionamida, y sólo un paciente estaba tomando pretomania.
Figura 1. Ilustración de un cromatograma representativo que muestra los picos de los 11 analitos en el método DR-TB (ethambutol EMB; INH isoniazida; PzApirida; ETH- etionamida; Protiona diomida PTH; LFX levofloxacino; Moxifloxacino MFX; Líneazolida LZD; Pretomanid PTM; Baquilina BDQ; Clofazimine de CLF). Debido a que la sensibilidad del método para cada analito es diferente, INH, LZD, LFX, MFX y LZD se pincharon a 20 ng/mg de cabello, mientras que BDQ, CLF, EMB, ETH, PTH y PTM se pincharon a 2 ng/mg de cabello. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Dos cromatógramas de iones extraídos (EIC) de una inyección de punto de calibración 9 (C9), isoniazida (INH) a 20 ng/mg. El EIC superior muestra tanto la transición del cuantificador INH (azul, etiquetado INH-2) como la transición del calificador INH (rojo, etiquetado INH-3). El EIC inferior muestra la respuesta de INH-d4, el estándar interno (IS) utilizado para cuantificar el INH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Capturas de pantalla del proceso de cuantificación. La parte superior es una lista de muestras parcial que muestra los datos de inyección de un analito (INH, isoniazida) en 12 puntos de calibración (etiquetados C0-C11), tres niveles de control de calidad y seis muestras. La parte inferior izquierda es la curva de calibración, que oscila entre 0,5 ng/mg –100 ng/mg. Los puntos azules opacos son puntos de calibración. Los cuadrados azules transparentes son puntos de control de calidad. El valor R se muestra en la parte superior izquierda (0.99722) con una ponderación 1/x. Los dos cromatogramas en la parte inferior derecha ilustran una muestra con INH (cromatograma superior) y una muestra sin INH (cromatograma inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medicamentos en cada mezcla | Concentración de cada medicamento en mezcla | Volumen de mezcla añadido al matraz de 50ml vol. |
| Mezcla 1: CLF-d7, EMB-d4 | 10 g/ml | 40 l |
| Mezcla 2: LFX-d8, PTH-d5 | 10 g/ml | 10 l |
| Mezcla 3: BDQ-d6, LZD-d3, MFX 13C-d3, OPC (IS para PTM) | 10 g/ml | 20 l |
| Mezcla 4: PZA 15N-d3 | 10 g/ml | 200 l |
| Mezcla 5: INH-d4 | 10 g/ml | 100 l |
Tabla 1. Concentración y cantidad de cada estándar interno para añadir a un matraz volumétrico de 50 ml.
| Droga | Concentración de stock | Volumen añadido |
| Bdq | 0,5 mg/ml | 8 l |
| Clf | 0,5 mg/ml | 8 l |
| Emb | 1 mg/ml | 4 l |
| Pth | 1 mg/ml | 4 l |
| Ptm | 1 mg/ml | 4 l |
| Inh | 1 mg/ml | 40 l |
| LFX | 1 mg/ml | 40 l |
| LZD | 1 mg/ml | 40 l |
| Mfx | 1 mg/ml | 40 l |
| Pza | 1 mg/ml | 40 l |
Cuadro 2. Cantidad de cada estándar de referencia de fármaco para agregar al vial "Ref Std Mix 1".
| Nombre de la etiqueta | Vial extraído de | Volumen añadido |
| C0 | N/A | 0 L |
| C1 | Ref Std Mix df1000 | 5 l |
| C2 | Ref Std Mix df1000 | 10 l |
| C3 | Ref Std Mix df1000 | 20 l |
| C4 | Ref Std Mix df100 | 5 l |
| C5 | Ref Std Mix df100 | 10 l |
| C6 | Ref Std Mix df100 | 20 l |
| C7 | Ref Std Mix df10 | 5 l |
| C8 | Ref Std Mix df10 | 10 l |
| C9 | Ref Std Mix df10 | 20 l |
| C10 | Ref Std Mix df1 | 5 l |
| C11 | Ref Std Mix df1 | 10 l |
Cuadro 3. Cantidad de cada Ref Std Mix intermedio para añadir a los 12 puntos de calibración.
| Tiempo total (min) | Caudal (L/min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 450 | 95 | 5 |
| 0.3 | 450 | 95 | 5 |
| 2.3 | 450 | 0 | 100 |
| 5 | 550 | 0 | 100 |
| 11 | 550 | 0 | 100 |
| 11.1 | 550 | 95 | 5 |
| 13 | 450 | 95 | 5 |
| 16.75 | 450 | 95 | 5 |
Cuadro 4. El caudal y el gradiente de fase móvil utilizados para cada inyección.
| Punto de calibración | Concentración real de BDQ, CLF, ETH, EMB, PTH, PTM (ng/mg) | Concentración real de INH, LFX, LZD, MFX, PZA (ng/mg) |
| C0 | 0 | 0 |
| C1 | 0.005 | 0.05 |
| C2 | 0.01 | 0.1 |
| C3 | 0.02 | 0.2 |
| C4 | 0.05 | 0.5 |
| C5 | 0.1 | 1 |
| C6 | 0.2 | 2 |
| C7 | 0.5 | 5 |
| C8 | 1 | 10 |
| C9 | 2 | 20 |
| C10 | 5 | 50 |
| C11 | 10 | 100 |
Tabla 5. Concentración final de analitos en cada punto de calibración.
| Droga | Lod (ng/mg de pelo) |
LLOQ (ng/mg de pelo) |
ULOQ (ng/mg de pelo) |
Valores de la muestra (ng/mg de pelo) Muestras: UC-04, UC-08, UC-11, UC-16, UC-25, UC-36, UC-69, UC-83, UC-89, UC-90, UC-91, UC-104, UC-105, UC-108, UC-109 |
| Bedaquiline | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64 |
| Clofazimina | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01 |
| Etambutol | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76 |
| Etionamida | 0.01 | 0.01 | 10 | |
| Isoniazida | 0.05 | 0.5 | 100 | |
| Levofloxacina | 0.1 | 0.5 | 100 | 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96 |
| Linezolida | 0.1 | 0.5 | 100 | 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22 |
| Moxifloxacina | 0.05 | 0.5 | 100 | 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64 |
| Pretomanid | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.57 |
| Protionamida | 0.002 | 0.01 | 10 | |
| Pirazinamida | 0.05 | 1 | 100 | 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66 |
Cuadro 6. Niveles representativos de medicamentos medidos en 15 pacientes que toman medicamentos contra la tuberculosis retro bajo DOT. El límite de detección (LOD), el límite inferior de cuantificación (LLOQ) y el límite superior de cuantificación (ULOQ) del método para cada medicamento se dan para la comparación.
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Discussion
Aquí informamos del protocolo para el método que desarrollamos y validamos para cuantificar 11 medicamentos anti-TB utilizados en el tratamiento de la TB-DR en muestras de cabello pequeño utilizando LC-MS/MS. Ningún otro método para cuantificar estos 11 fármacos en el cabello ha sido previamente desarrollado, validado y publicado. Nuestro método puede cuantificar los niveles de subnanogramos de fármacos en sólo 20-30 hebras de cabello de aproximadamente 3 centímetros (cm) de longitud (2 mg) y ya ha sido validado22. El bajo peso del cabello analizado significa que los pacientes involucrados en el estudio pueden participar discretamente y potencialmente volver para repetir las pruebas sin temor a exponer el cuero cabelludo calvo. Hemos publicado previamente datos sobre la asociación entre los niveles de fármacos dr-TB en el cabello y los resultados del tratamiento dr23. Por lo tanto, el desarrollo y validación de este método de panel multianálisis representa un avance significativo en el campo de la monitorización de fármacos terapéuticos contra la DR-TB.
El cabello requiere diferentes técnicas de homogeneización que las requeridas con las biomatrices líquidas. La pulverización de las hebras capilares permitió un acceso eficiente del disolvente de extracción a los analitos en la matriz capilar. Por lo tanto, una característica importante de nuestro método es el proceso de extracción rápida y fácil de fármacos del cabello utilizando las muestras pulverizadas. El tiempo de incubación durante el proceso de extracción es de sólo dos h, debido a la gran superficie accesible del cabello pulverizado, y no hay paso de limpieza, debido al pequeño tamaño de la muestra (2 mg). Sin embargo, se debe tener cuidado para limitar la degradación de los medicamentos durante el proceso de extracción. El protocolo utiliza una pulverización de dos ciclos, con un período de enfriamiento de 45 s entre los ciclos. Este proceso evita el sobrecalentamiento y potencialmente degradar los medicamentos en el cabello.
A diferencia de muchos análisis capilares de drogas de abuso, este método no utiliza un paso de lavado. Los medicamentos contra la tuberculosis antirretroparalación vienen en forma de cápsula o tableta, lo que limita las posibles fuentes de contaminación externa y la posterior necesidad de lavar el cabello antes del análisis. Estudios futuros podrían analizar el disolvente de lavado del cabello del paciente con TB-DR para evaluar la contaminación externa.
Aunque la pulverización capilar promueve la extracción eficiente de fármacos, tiene sus propias limitaciones. Nuestro laboratorio ha encontrado que si el cabello se pulveriza en el ruptor de cuentas y se deja a temperatura ambiente, la concentración de algunos de los 11 fármacos disminuye en semanas y meses. Esto puede deberse a la gran superficie del cabello pulverizado expuesto a la atmósfera que puede promover la oxidación y otras reacciones de degradación. Si se desea un estudio de estabilidad de los fármacos en el cabello, el cabello se puede cortar con tijeras en pequeños segmentos de <1 cm, homogeneizarse a mano, y luego dejara a temperatura ambiente durante semanas o meses durante el estudio de estabilidad. Cuando este cabello cortado se pulveriza el día del análisis, no hemos observado ninguna degradación significativa del fármaco con el tiempo. Por lo tanto, en la realización del protocolo descrito, recomendamos que el cabello sea pulverizado el día en que se extraiga. Del mismo modo, todas las mezclas de fármacos por debajo de las concentraciones de 10 g/ml deben prepararse el día de la extracción.
No se dispone de métodos publicados previamente para evaluar la idoneidad de los rangos dinámicos lineales (LLOQ-ULOQ) que establecimos para cada medicamento contra la tuberculosis en el método multianálisis. Sin embargo, la muestra de conveniencia de muestras de cabello de Western Cape, Sudáfrica, indica la idoneidad del rango dinámico lineal de este método. Con la excepción de etionamida, pretomanide y protionamida, más del 95% de los niveles de fármacos que medimos en estos pacientes están dentro del rango dinámico lineal de cada analito. Sólo un paciente estaba tomando pretomanide (que se detectó), y ningún paciente estaba tomando protionamida. Para la etionamida, hipotetizar que el medicamento no puede depositar en la matriz capilar bien, ya que nuestro LOD es 0.01 ng/mg de cabello (o 10 pg/mg de pelo) y sin embargo, sólo uno de los ocho pacientes que toman etionamida tiene niveles superiores a 0.02 ng/mg de cabello. Se justifica un examen adicional para determinar la farmacocinética de diferentes fármacos contra la tuberculosis en el cabello. Por ejemplo, una alternativa potencial para el monitoreo de drogas como la etionamida es desarrollar un método dirigido a sus metabolitos en su lugar. Hemos hecho una observación similar para delamanid, un nuevo medicamento DR-TB, que inicialmente era parte de este panel. Un método dirigido al metabolito de delamanid está actualmente en proceso de ser validado en nuestro laboratorio, porque el metabolito se encuentra en concentraciones más altas que el fármaco principal. Se puede realizar el mismo procedimiento para la etionamida. Las concentraciones de fármacos en la Tabla 6 se presentan como un grupo porque los resultados individuales y los resultados clínicos no son el foco de este documento de método. La evaluación individual de este grupo de pacientes se ha publicado en otroslugares 23.
A los pacientes que aportaron muestras de cabello pequeño para el estudio de demostración se les administró una variedad de regímenes farmacológicos a través del DOT en un entorno hospitalario, y todos los regímenes se documentaron de acuerdo con los registros de enfermería durante el período de hospitalización. Sin embargo, como es común entre los pacientes con TB-DR, también se habían administrado regímenes de medicamentos anteriores y mal documentados antes de su estancia en el hospital. Esto condujo a la detección de medicamentos en el cabello del paciente que no se notaron en sus registros hospitalarios. Por lo tanto, no podíamos usar estas muestras para determinar la especificidad del método, ya que no podíamos determinar si estas muestras eran realmente falsos positivos. En su lugar, probamos el cabello de pacientes que no estaban tomando medicamentos contra la tuberculosis antirretropara desastres. No se detectaron fármacos contra la TUBERCULOSIS en estas muestras, lo que indica que el método es específico.
Aunque nuestro método demuestra la utilidad del uso del cabello en la medición de fármacos contra la tuberculosis antirretrométricas, el análisis del cabello tiene su propio conjunto de limitaciones. Debido a que el cabello es una matriz sólida, el pico de las normas de referencia de fármacos durante la validación del método no permite la integración completa de las normas en la matriz como con la orina y la sangre. Por lo tanto, la evaluación de la recuperación se limita a la detección de fármacos después de pisar la matriz sólida, y no a la recuperación real de la matriz. Del mismo modo, debido a que el cabello es una matriz alternativa que todavía se está explorando para las pruebas, no hay rangos de referencia disponibles para los medicamentos están disponibles para evaluar la idoneidad del método. Más estudios farmacocinéticos sobre la incorporación de fármacos en el cabello será útil para entender mejor la utilidad de los niveles de drogas capilares en el control de adherencia. Por último, la colección adecuada de muestras de cabello en los sitios de campo tiene sus propios desafíos únicos. Mientras que la recolección y el almacenamiento de muestras de cabello requieren menos recursos que otras biomatrices, se debe tener cuidado de identificar los extremos distales y proximales de cualquier hebra de cabello de más de 2 cm. Las hebras de cabello más largas pueden tener diferentes concentraciones de fármacos a lo largo de la hebra, dependiendo del uso de medicamentos con el tiempo. El etiquetado adecuado permite el análisis de segmentos específicos de las hebras; en el caso de nuestro método, los tres centímetros de pelo más cercanos al cuero cabelludo se utilizaron para determinar los datos más recientes sobre la adherencia a los medicamentos. El etiquetado adecuado requiere procedimientos de capacitación y garantía de calidad en los sitios.
En resumen, hemos desarrollado el primer panel multianálisis para analizar los medicamentos contra la tuberculosis utilizados para la TB-DR a través de LC-MS/MS en muestras de cabello pequeño. Dada la viabilidad de recolectar y almacenar el cabello en entornos con recursos limitados, nuestro método representa un avance potencialmente significativo en el campo de la monitorización terapéutica de la tuberculosis. Las medidas objetivas de exposición a medicamentos que tienen en cuenta tanto la adherencia como la variabilidad farmacocinética individual pueden proporcionar una indicación temprana de regímenes de tratamiento ineficaces, ayudando así tanto al tratamiento individual como limitando la transmisión comunitaria de la TB-DR24.
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Disclosures
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe y Monica Gandhi).
Acknowledgments
Los autores quisieran dar las gracias al profesor Keertan Dheda, al Dr. Ali Esmail y Marietjie Pretorius en el Instituto de Pulmón de la Universidad de Ciudad del Cabo, quien facilitó la recolección de muestras de cabello para el estudio. Los autores agradecen además las contribuciones de los participantes de este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, Suppl 1 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
