Summary
Nuvarande metoder för att analysera patienternas anslutning till komplexa resistenta tuberkulos (DR-TB) regimer kan vara felaktiga och resurskrävande. Vår metod analyserar hår, en lättinsamlad och lagrad matris, för koncentrationer av 11 DR-TB mediciner. Med hjälp av LC-MS/MS, Vi kan bestämma sub-nanogram läkemedelsnivåer som kan användas för att bättre förstå läkemedelsuppföljsamhet.
Abstract
Läkemedelsresistent tuberkulos (DR-TB) är ett växande hot mot folkhälsan, och bedömning av terapeutiska läkemedelsnivåer kan ha viktiga kliniska fördelar. Plasma läkemedelsnivåer är den nuvarande guldmyntfoten bedömning, men kräver phlebotomy och en kall kedja, och fånga endast mycket nyligen följsamhet. Vår metod använder hår, en matris som är lätt samlas in och reflekterande av långsiktig följsamhet, för att testa för 11 anti-TB mediciner. Tidigare arbete av vår grupp visar att antiretrovirala läkemedelsnivåer i hår är förknippade med HIV-resultat. Vår metod för DR-TB läkemedel använder 2 mg hår (3 cm proximalt till roten), som pulveriseras och extraheras i metanol. Prover analyseras med en enda LC-MS/MS-metod, kvantifiera 11 läkemedel i en 16 min körning. Lägre kvantifieringsgränser (LLOQ) för de 11 läkemedlen varierar från 0,01 ng/mg till 1 ng/mg. Läkemedelsnärvaro bekräftas genom att jämföra förhållanden mellan två masspektrometriövergångar. Prover kvantifieras med hjälp av förhållandet mellan läkemedlet och dedematerade, 15N-, eller 13C-märkta läkemedel isotopolog. Vi använde en kalibreringskurva från 0.001-100 ng/mg. Tillämpning av metoden på ett bekvämlighetsprov av hårprover som samlats in från DR-TB-patienter på direkt observerad behandling (DOT) indikerade läkemedelsnivåer i hår inom det linjära dynamiska intervallet hos nio av de elva läkemedlen (isoniazid, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). Ingen patient var på protionionamid, och de uppmätta nivåerna för etionamid var nära dess LLOQ (med ytterligare arbete i stället undersöka lämpligheten av etionamid metabolit för övervakning exponering). Sammanfattningsvis beskriver vi utvecklingen av en multi-analyte panel för DR-TB läkemedel i hår som en teknik för terapeutiska läkemedelsövervakning under läkemedelsresistenta TB behandling.
Introduction
Under det tjugoförsta århundradet är läkemedelsresistent tuberkulos (DR-TB) en växande katastrof för redan svaga nationella tbc-kontrollprogram, med bekräftade fall som fördubblats bara under de senaste fem åren, och står för nästan en tredjedel av alla dödsfall relaterade till antimikrobiell resistens globalt1,2. Framgångsrik behandling av DR-TB har konventionellt krävs längre och mer giftiga andra linjens regimer än behandling för läkemedelskänsliga TB. Dessutom har patienter med DR-TB ofta betydande redan existerande utmaningar att följa, vilket bidrog till uppkomsten av resistens initialt3.
Till skillnad från HIV-infektion där virusbelastningar kan användas för att övervaka behandlingen, är surrogatslutpunkter för behandlingssvar i tbc fördröjd och otillförlitliga på individnivå4. Övervakning av patientens följsamhet, en viktig prediktor för subterapeutisk anti-TB läkemedelskoncentration och behandlingssvikt, är också utmanande. Självrapporterad följsamhet lider av återkallande partiskhet och önskan att behaga leverantörer5,6. Piller räknas och medicinering händelse övervakningssystem (MEMS) kan vara mer mål7 men inte mäta faktisk drogkonsumtion8,9,10. Läkemedelsnivåer i biomatrices kan ge både följsamhet och farmakokinetiska data. Därför används plasmaläkemedelsnivåer ofta i terapeutisk läkemedelsövervakning11,12. I samband med övervakning av läkemedelshämningen representerar dock plasmanivåer kortvarig exponering och begränsas av betydande variationer inom och mellan patienter vid fastställandet av lämpligt referensområde för följsamhet. "White coat" effekter, där följsamhet förbättras före kliniken eller studiebesök, ytterligare komplicerar förmågan hos plasmanivåer för att ge korrekt läkemedelshämning mönster13.
Hår är en alternativ biomatrix som kan mäta långvarig läkemedelsexponering14,15. Många läkemedel och endogena metaboliter införliva i håret protein matris från den systemiska cirkulationen som hår växer. Eftersom denna dynamiska process fortsätter under hårväxt, beror mängden läkemedel som deponeras i hårmatrisen på den kontinuerliga närvaron av läkemedlet i omlopp, vilket gör håret till en utmärkt tidsmässig avläsning av läkemedelsintag. Hår som biomatrix har den extra fördelen av att enkelt samlas in utan behov av kylkedja för förvaring och transport jämfört med blod. Dessutom är hår icke-biohazardous, vilket ger ytterligare genomförbarhetsfördelar på fältet.
Hår narkotikanivåer har länge använts i kriminaltekniska tillämpningar16. Under det senaste årtiondet, hår antiretrovirala (ARV) nivåer har visat nytta vid bedömningen av läkemedelshämning i HIV behandling och förebyggande, som vår grupp bidragit. ARV nivåer i hår har visat sig vara den starkaste oberoende prediktorer för behandlingsresultat i HIV-infektion17,18,19,20,21. För att avgöra om hårnivåer av DR-TB patienter kommer att ha samma nytta för att förutsäga behandling resultatet, vi använde LC-MS/MS för att utveckla och validera en metod för att analysera 11 DR-TB mediciner i små hårprover. Som en första bedömning av analysens prestanda mätte vi DR-TB-läkemedelsnivåer i ett bekvämlighetsprov av patienter med DR-TB som fick direkt observerad behandling (DOT) i Västra Kapprovinsen, Sydafrika22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke före hårprovsamling. Vi fick Institutional Review Board godkännande från University of Cape Town och University of California, San Francisco.
1. Hårprovtagning
- Inhämta skriftligt informerat samtycke.
- Använd ren sax för att skära ca 20-30 hårbotten hårstrån från occipital regionen så nära hårbotten som möjligt.
- Placera tejp runt den distala sidan av håret för att indikera riktning. Vik hårprov i en aluminiumfolie kvadrat och förvara i rumstemperatur. Märk den distala änden av håret för att undvika eventuell kontaminering från ytterligare hantering av den proximala änden.
- Förutom patientprover, samla "tomt hår": en hårbotten hår prov från någon som inte har tagit TB medicinering. Samla in en stor mängd (>30 mg tomt hår för varje 20 patientprover).
2. Utvinning av läkemedel
- Etikett pärlrör. Varje patientprov kräver ett rör. Etikett 12 rör från "C0" till "C11", en för var och en av de 12 kalibreringspunkterna. Märk ett rör för låg kvalitetskontroll, ett rör för medelkvalitetskontroll och ett rör för hög kvalitetskontroll. Slutligen, märka ett rör för Matrix Blank.
- Öppna aluminiumfolie torget innehåller hårprov. Om hårprovet är längre än 3 cm, klipp håret 3 cm från den proximala änden och använd den proximala delen för analys.
- Väg 2 mg av hårprovet till ett pärlrör.
- Väg 2 mg tomt hår i ytterligare 16 pärlrör. Dessa kommer att användas som kalibreringspunkter, kvalitetskontroller och matrisämne. Rören kommer att följa samma extraktionsprocedur som patientproverna, förutom att spetsas med läkemedelsreferensstandarder på nivåer som anges i steg 2.8 och 2.9.
- Placera alla pärlrör i homogeniseraren. Kör homogenisator med hastighet 6,95 m/s. Kör i två cykler om 30 s vardera, med en 15-tals viloperiod mellan de två cyklerna.
- Gör intern standardmix och lägg till den i proverna.
- Tillsätt ~40 ml metanol till en 50 ml mätkolv.
- I gula glas flaskor, gör blandningar av de interna standarder som visas i tabell 1, med metanol som lösningsmedel.
OBS: Metanol är mycket flyktig. Lämna alla injektionsflaskar utjämnade under denna process för att förhindra förlust på grund av avdunstning. - Från dessa blandningar, tillsätt den volym som visas i tabell 1 till 50 ml volymetrisk kolv. Fyll sedan kolven till 50 ml med metanol.
- Kapa och blanda den volymetriska kolven. Tillsätt 500 μL av blandningen till var och en av de pulveriserade hårrören, med undantag för matrisens tomma rör. Tillsätt 500 μl metanol till matrisens tomma rör.
- Gör referensstandardblandningar.
- Utgör prydliga referensstandarder för följande läkemedel med metanol för att få den koncentration som visas i tabellen i steg 2.7.2. Endast 1 ml av följande koncentrationer är nödvändiga.
- Tillsätt 1768 μl metanol till en injektionsflaska och tillsätt sedan de referensstandardbelopp som anges i tabell 2 i samma injektionsflaska för att få 2 ml slutlig volym. Märk denna injektionsflaska "Ref Std Mix 1x". Vortex.
- Spike 100 μL från "Ref Std Mix 1x" till 900 μl metanol i en ny injektionsflaska. Märk denna injektionsflaska "Ref Std Mix 10x". Vortex.
- Spike 100 μL från "Ref Std Mix 10x" till 900 μl metanol i en ny injektionsflaska. Märk denna injektionsflaska "Ref Std Mix 100x". Vortex.
- Spike 100 μL från "Ref Std Mix 100x" till 900 μl metanol i en ny injektionsflaska. Märk denna injektionsflaska "Ref Std Mix 1000x". Vortex.
- Spika kalibreringskurvan genom att lägga till mängden Ref Std Mix som beskrivs i tabell 3.
- Skapa QC-mixar och spikkvalitetskontrollrör.
- Etikett 5 flaskor "QC-A" genom "QC-E".
- Tillsätt följande mängder metanol i de fem märkta injektionsförarna:
QC-A: 990 μL
QC-B: 940 μL
QC-C: 950 μL
QC-D: 980 μL
QC-E: 950 μL
- Med hjälp av de 1 mg/ml-läkemedelslager som skapats i steg 2.7.1, tillsätt 10 μL till de specifika injektionsflaskarna nedan. För BDQ- och CLF-lagren, som ligger på 0,5 mg/ml, tillsätt 20 μL till de injektions flaskor som anges nedan.
QC-A: PTH
QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
QC-D: PTH, EMB
QC-E: CLF, BDQ, PTM
OBS: Vissa läkemedel finns i flera blandningar. - Märk en injektionsflaska som "QC-A df100". Späd 10 μl QC-A till 990 μl metanol.
- Märk en injektionsflaska som "Low QC stock". Tillsätt 1832 μl metanol till denna injektionsflaska. Lägg till de mängder QC-mixar som beskrivs nedan:
QC-A df100: 80 μL
QC-B: 8 μL
QC-C: 80 μL
- Märk en injektionsflaska som "Mid QC stock". Tillsätt 760 μl metanol till denna injektionsflaska. Lägg till de mängder QC-mixar som beskrivs nedan:
QC-A df100: 800 μL
QC-B: 40 μL
QC-C: 400 μL
- Märk en injektionsflaska som "High QC stock". Tillsätt 1376 μl metanol till denna injektionsflaska. Lägg till de mängder QC-mixar som beskrivs nedan:
QC-D: 160 μL
QC-E: 320 μL
MFX, 1 mg/ml-lager: 16 μL
INH, 1mg/ml lager: 32 μL
LFX, 1 mg/ml-lager: 32 μL
LZD, 1 mg/ml lager: 32 μL
PZA, 1 mg/ml lager: 32 μL
- Spike 10 μL Låg QC lager i low QC pärla röret.
- Spike 10 μL Mid QC lager i Mid QC pärla röret.
- Spike 10 μL Hög QC lager i High QC pärla röret.
- Placera alla rör i varmskakning i 2 h vid 37 °C. Skakningen bör vara tillräckligt långsam för att vattnet inte skaskar upp på rören.
- Ta bort rören från shaker. Överför vätska från pärlrör till nya mikrocentrifugrör. Märk dessa mikrocentrifugrör på samma sätt.
- Tillsätt 500 μl metanol till de gamla rören. Mössa och virvel.
- För andra gången, överför vätska från pärlrören till motsvarande mikrocentrifugrör. Det är okej att överföra pulveriserat hår. Detta kommer så småningom att centrifugeras ut.
- Centrifugera mikrocentrifugrören i 10 min vid 2 800 x g.
- Ta försiktigt bort vätskan och överför den till nya centrifugrör med motsvarande etiketter. Var försiktig så att du inte stör eller överför hårpelleten.
- Avdunsta vätskan i centrifugrören till torrhet vid 32 °C.
- Rekonstruera proverna genom att tillsätta 200 μl mobilt vatten i fas A (HPLC-vatten med 1 % myrsyra) till de torra rören. Vortex.
- Överför vätskan till bärnstensfärgade injektionsflaska med 250 μl skär.
3. LC-MS/MS förberedelse
- Gör en liter mobil fas A (HPLC-kvalitet vatten med 1% myrsyra) genom att lägga till några HPLC-grade vatten till en en-liters volymetrisk kolv. Tillsätt sedan 10 ml >95 % myrsyra till kolven och fyll sedan på i linje med HPLC-vatten.
- Gör en liter mobil fas B (acetonitril med 0,1% myrsyra) genom att lägga till lite acetonitril till en enliters volymetrisk kolv. Tillsätt sedan 1 ml >95 % myrsyra till kolven och fyll sedan på linjen med acetonitril.
- Installera en 2 x 100 mm kolonn med 2,5 μm partikelstorlek och 100 Å porstorlek med polär ändkappad, eterkopplade fenylpärlor helt tillverkade av porös kiseldioxid i kolonnfacket. Se till att kolumnen också har tillverkarens rekommenderade skyddspatron installerad.
- Öppna programvaran för datainsamling och dubbelklicka på maskinvarukonfiguration. Markera LCMS och klicka på Aktivera profil.
- Klicka på Nytt delprojekteller klicka på Kopiera delprojektom det redan finns andra delprojekt . Namnge delprojektet.
- Klicka på Nytt dokument. Dubbelklicka på Förvärvsmetod. Klicka på Massspecifikation i fönstret Förvärvsmetod.
- Ändra listrutan Avsöktyp till MRM (MRM). Se till att polariteten är inställd på Positiv.
- Klicka på Importera lista och välj CSV-filen MDR-TB LCMS-metoden transitions.csv som ingår i kompletterande material.
- Bläddra nedåt och ställ in Varaktigheten till 16.751 min. Lämplig cykeltid och antal cykler fylls i automatiskt.
- Klicka på Integrerad Valco-ventili vänster sidofält . Kontrollera att positionsnamnet för steg 0 är A. I kolumnen Total tid (min) skriver du in 0,4 i den första raden och 13 i den andra raden.
- I kolumnen Position anger du rad ett till B och rad två till A.
- Klicka på Binär pumpi vänster sidofält. Ställ in tabellen övertoning och flödeshastighet enligt tabell 4.
- Klicka på Autosampleri vänster sidofält . Ändra injektionsvolymen till 10 μL. Klicka på Temperaturkontroll aktiverad och inställd på 4 °C.
- Klicka på Kolumnfack ivänster sidofält . Ställ in både höger och vänster temperatur på 50 °C.
- Stäng och spara metod.
- Skapa batch genom att klicka på Nytt dokument och välja Förvärvsbatch. Skriv in ett anfallsnamn och välj den nyskapade metoden i listrutan.
- Skapa i ett kalkylblad ett parti som följer denna ordning: kalibreringskurva, kvalitetskontroller, patientprover, kalibreringskurva, kvalitetskontroller, patientprover, kalibreringskurva, kvalitetskontroller. Tillsätt lösande blankinjektioner i början och slutet av körningen, liksom före och efter kalibreringskurvan, kvalitetskontroller och patientprover. Sätt minst åtta lösande blanka injektioner efter injektioner av kalibreringskurvan och hög kvalitet kontroll injektionsflaska för att minska analyte överföring.
OBS: Fler injektioner av lösningsmedelsinjicering kan behöva tillsättas beroende på kolonns ålder. - I kolumnen intill exempelnamnen skriver du i lämplig autosamplerposition för motsvarande injektionsflaska.
- Klicka på Lägg till uppsättning. Skriv in antalet samplingar i batchen i popup-fönstret.
- Kopiera och klistra in exempelnamn och injektionsflaskaplatser från kalkylbladet till den nyskapade batchen.
- Gå till fliken Skicka. Klicka på Skicka.
- Skapa i ett kalkylblad ett parti som följer denna ordning: kalibreringskurva, kvalitetskontroller, patientprover, kalibreringskurva, kvalitetskontroller, patientprover, kalibreringskurva, kvalitetskontroller. Tillsätt lösande blankinjektioner i början och slutet av körningen, liksom före och efter kalibreringskurvan, kvalitetskontroller och patientprover. Sätt minst åtta lösande blanka injektioner efter injektioner av kalibreringskurvan och hög kvalitet kontroll injektionsflaska för att minska analyte överföring.
- Equilibrate system genom att sätta in lösningsmedelsledning A i mobil fas A och lösningsmedelsledning B i mobil fas B. Öppna reningsventilen på den binära pumpen.
- Ställ in lösningsmedelssammansättningen till 50% B vid 4 ml/minflöde. Slå på den binära pumpen.
- Efter 5 min, minska flödet till 0,3 ml/min. Stäng reningsventilen. Kontrollera om det finns läckor.
- Tryck på Equilibrate i det övre verktygsfältet i programvaran. Ställ in tid på >5 min, tryck på OK.
- När instrumentet har ekvilibrerat kommer modulerna längst ned till höger i fönstret att se gröna ut. Kontrollera att trycket har stabiliserats och starta sedan batchen genom att klicka på Starta exempel.
4. Dataanalys
- När batchen är klar öppnar du kvantationsprogrammet. Klicka på trollstavsikonen om du vill skapa en ny resultattabell.
- Klicka på Bläddra för att navigera till rätt mapp och markera sedan datafilen och klicka på högerpilen för att flytta data till det markerade området. Klicka på Nästa.
- Välj Skapa ny metod och klicka på Ny. Ange namnet på den nya kvantationsmetoden och tryck på Spara och sedan nästa.
- Välj den första injektionen av den mellersta kalibreringspunkten. Tryck på Nästa.
- Markera alla övergångar av de interna standarderna i KOLUMNEN IS.
- För kvantifierareövergångarna för referensstandarderna väljer du motsvarande IS i kolumnen IS-namn. Klicka på Nästa.
- Bläddra igenom övergångarna för att säkerställa att den automatiskt valda kvarhållningstiden är korrekt. Se till att Gaussian Smoothing är inställt på 1,5. Alla andra standardinställningar kan förbli som de är (t.ex. brusprocent 100 %, Baslinjeunderläge. Fönster 2,00 min, Peak Split 2 poäng).
Obs: Om du vill kan du ändra automatiska integrationsparametrar just nu. Eftersom dessa parametrar ändras baserat på instrumentinställningar har vi inte inkluderat vår här. - Klicka på Slutför om du vill använda kvantationsmetoden på batchen.
- Klicka på det övre vänstra knappen Visar knappen toppgranskning för att visa kromatogram. Navigera genom övergångarna med hjälp av det vänstra sidofältet. Bläddra igenom varje injektion av varje kvantifierare övergång och manuellt integrera rätt topp om det behövs.
- Om du vill integrera en topp manuellt klickar du på knappen Aktivera manuellt integrationsläge, zoomar in i kromatogrammet genom att klicka och dra längs x- eller y-axeln och rita sedan en linje från en baslinje till den andra baslinjen och definiera toppen. Figur 3 visar två kromatogram: ett som har INH och därför har integrerats manuellt och ett annat som inte har INH.
OBS: Alla injektioner måste integreras med samma parametrar. Toppbredd kan ge en riktlinje för att följa dessa parametrar, men ibland kommer toppbredden att skilja sig åt. För att kvantifiera en topp måste retentionstiden ligga inom ±0,15 minuter från den förväntade retentionstiden för den analyten (enligt definitionen i referensstandardtopparna), som kvalitativt bekräftas ha det förväntade förhållandet mellan kvantifierare och kvalificerare (enligt figur 2)och ha ett signal-brusförhållande på mer än 10.
- Om du vill integrera en topp manuellt klickar du på knappen Aktivera manuellt integrationsläge, zoomar in i kromatogrammet genom att klicka och dra längs x- eller y-axeln och rita sedan en linje från en baslinje till den andra baslinjen och definiera toppen. Figur 3 visar två kromatogram: ett som har INH och därför har integrerats manuellt och ett annat som inte har INH.
- I kolumnen Provtyp ställer du in kalibreringskurvan (med undantag för insprutningar av tom kalibreringskurvan) på Standard. Ställ in kvalitetskontrollen på kvalitetskontroll. Lämna de återstående injektionerna som okända.
Detta kommer att ställas in över alla övergångar. - I kolumnen Faktisk koncentration skriver du in de koncentrationer som finns i tabell 5 för alla kalibreringskurva och kvalitetskontrollinjektioner.
- Klicka på den andra uppifrån vänster Visar knappen för kalibreringskurvan. Klicka på knappen Regression.
- Ställ in viktningstypen Type på 1/x och tryck på OK.
- Validera kalibreringskurvan och kvalitetskontrollprover för att säkerställa att batchen kördes.
- För varje kvantifierarreferensövergång (inte interna standardövergångar) tittar du på varje kalibreringskurvasinsprutningsnoggrannhet (i kolumnen Noggrannhet). Minst två tredjedelar av kalibreringspunkterna skall ha en noggrannhet inom 80-120 %.
- För kalibreringspunkter långt utanför den förväntade noggrannheten kan injektionen vara en avvikare. Uteslut extremvärden om deras beräknade koncentration är mer än två standardavvikelser från de två andra injektionerna av injektionsflaskan. Klicka på "et peak till 'inte hittat knappen ovanför varje kromatogram.
- Kontrollera att R-värdet ovanför kalibreringskurvan är >0,975.
- Kontrollera att alla kvalitetsstyrjektioner har en noggrannhet inom 80-120%.
- Om alla ovanstående villkor är uppfyllda har partiet passerat och proverna kan kvantifieras. Klicka på Redigera i verktygsfältet och sedan på Kopiera hela tabellen. Klistra in tabellen i ett kalkylblad.
- Ta medelvärdet av den beräknade koncentrationen av de två provinjektionerna för att bestämma den rapporterade koncentrationen av varje prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En illustration av ett kromatogram med bekräftade nivåer av alla 11 DR-TB-läkemedel visas i figur 1. Lagringstiden för varje analyt kan ändras när du använder olika instrument och kolumner, så den exakta kvarhållningstiden bör bestämmas individuellt.
De extraherade jonkromatogrammen (EIC) för ett visst läkemedel (isoniazid, INH) i en av kalibratorerna (blanka hårprov spetsade med DR-TB läkemedelsreferensstandarder) visas i figur 2. Kvantifieren och kvalificerare övergångar används för att kvalitativt bekräfta förekomsten av läkemedlet, eftersom förhållandet mellan området för kvantifierare och område av kvalificerare förblir konstant över prover. Den interna standarden övervakas också för att säkerställa att varje provinjektion normaliseras.
För demonstration, analyserade vi en bekvämlighet prov av 15 hårprover bland en total studie population av 96 patienter som tar DR-TB läkemedel under DOT villkor från Western Cape, Sydafrika. Tabell 6 presenterar representativa nivåer av DR-TB-läkemedel över de lägsta och högsta nivåerna som uppmätts för varje analyt. Även om data för 15 patientprover presenteras, hade varje analyt inte 15 nivåer rapporterade eftersom varje patient är på en annan kombination av DR-TB mediciner. Ingen av patienterna var på prothionamide, och endast en enda patient tog pretomanid.
Bild 1. En illustration av ett representativt kromatogram som visar toppar på 11 analyter i DR-TB-metoden (EMB= ethambutol; INH= isoniazid; PZA= pyrazinamid; ETH= etionamid; PTH= prothionamid; LFX= levofloxacin; MFX= moxifloxacin; LZD= linezolid; PTM= pretomanid; BDQ= bedaquiline; CLF= clofazimine). Eftersom känsligheten hos metoden för varje analyt är olika, VAR INH, LZD, LFX, MFX och LZD spetsade på 20 ng/mg hår medan BDQ, CLF, EMB, ETH, PTH och PTM var spetsade på 2 ng/mg hår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Två extraherade jonkromatogram (EIC) från en injektion av kalibreringspunkt 9 (C9), isoniazid (INH) vid 20 ng/mg. Den översta EIC visar både INH kvantifierare övergången (blå, märkt INH-2) och INH kval övergång (röd, märkt INH-3). Den nedre EIC visar svar på INH-d4, den interna standarden (IS) som används för att kvantifiera INH. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. Skärmdumpar av processen för kvantitet. Den övre delen är en ofullständig provlista som visar injektionsdata för en analyt (INH, isoniazid) över 12 kalibreringspunkter (märkt C0-C11), tre QC-nivåer och sex prover. Nedre vänstra delen är kalibreringskurvan, från 0,5 ng/mg –100 ng/mg. Ogenomskinliga blå prickar är kalibreringspunkter. Genomskinliga blå rutor är kvalitetskontrollpunkter. R-värdet visas längst upp till vänster (0,99722) med viktning 1/x. De två kromatogrammen längst ned till höger illustrerar ett prov med INH (övre kromatogram) och ett prov utan INH (nedre kromatogram). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Droger i varje blandning | Koncentration av varje läkemedel i mix | Blandningsvolym tillsats i 50 ml vol. kolv |
| Blandning 1: CLF-d7, EMB-d4 | 10 μg/ml | 40 μl |
| Mix 2: LFX-d8, PTH-d5 | 10 μg/ml | 10 μl |
| Mix 3: BDQ-d6, LZD-d3, MFX 13C-d3, OPC (IS för PTM) | 10 μg/ml | 20 μl |
| Mix 4: PZA 15N-d3 | 10 μg/ml | 200 μl |
| Blandning 5: INH-d4 | 10 μg/ml | 100 μl |
Tabell 1. Koncentration och mängd av varje intern standard för att lägga till en 50 ml volymetrisk kolv.
| Läkemedel | Lagerkoncentration | Tillagd volym |
| BDQ (BDQ) | 0,5 mg/ml | 8 μl |
| Clf | 0,5 mg/ml | 8 μl |
| Emb | 1 mg/ml | 4 μl |
| Pth | 1 mg/ml | 4 μl |
| PTM (på andra) | 1 mg/ml | 4 μl |
| Inh | 1 mg/ml | 40 μl |
| LFX (av detta) | 1 mg/ml | 40 μl |
| LZD (på andra) | 1 mg/ml | 40 μl |
| MFX (på andra sätt) | 1 mg/ml | 40 μl |
| Pza | 1 mg/ml | 40 μl |
Tabell 2. Mängd av varje läkemedelsreferensstandard att lägga till "Ref Std Mix 1" injektionsflaska.
| Etikettnamn | Injektionsflaska från | Tillagd volym |
| C0 (på andra sätt) | Ej mycket | 0 μl |
| C1 (på andra) sätt | Referens Std Mix df1000 | 5 μl |
| C2 (på andra sätt) | Referens Std Mix df1000 | 10 μl |
| C3 (på andra sätt) | Referens Std Mix df1000 | 20 μl |
| C4 (på andra sätt) | Referens Std Mix df100 | 5 μl |
| C5 (på andra sätt) | Referens Std Mix df100 | 10 μl |
| C6 (på andra sätt) | Referens Std Mix df100 | 20 μl |
| C7 (på andra sätt) | Referens Std Mix df10 | 5 μl |
| C8 (på andra sätt) | Referens Std Mix df10 | 10 μl |
| C9 (på andra sätt) | Referens Std Mix df10 | 20 μl |
| C10 (på sätt och vis) | Referens Std Mix df1 | 5 μl |
| C11 (på andra sätt) | Referens Std Mix df1 | 10 μl |
Tabell 3. Mängd av varje Ref Std Mix mellanliggande att lägga till de 12 kalibreringspunkterna.
| Total tid (min) | Flöde (μl/min) | A (%) | B (%) |
| 0 | 450 | 95 | 5 |
| 0.3 | 450 | 95 | 5 |
| 2.3 | 450 | 0 | 100 |
| 5 | 550 | 0 | 100 |
| 11 | 550 | 0 | 100 |
| 11.1 | 550 | 95 | 5 |
| 13 | 450 | 95 | 5 |
| 16.75 | 450 | 95 | 5 |
Tabell 4. Flödet och den mobila fasgradienten som används för varje injektion.
| Kalibreringspunkt | Faktisk koncentration av BDQ, CLF, ETH, EMB, PTH, PTM (ng/mg) | Faktisk koncentration av INH, LFX, LZD, MFX, PZA (ng/mg) |
| C0 (på andra sätt) | 0 | 0 |
| C1 (på andra) sätt | 0.005 | 0.05 |
| C2 (på andra sätt) | 0.01 | 0.1 |
| C3 (på andra sätt) | 0.02 | 0.2 |
| C4 (på andra sätt) | 0.05 | 0.5 |
| C5 (på andra sätt) | 0.1 | 1 |
| C6 (på andra sätt) | 0.2 | 2 |
| C7 (på andra sätt) | 0.5 | 5 |
| C8 (på andra sätt) | 1 | 10 |
| C9 (på andra sätt) | 2 | 20 |
| C10 (på sätt och vis) | 5 | 50 |
| C11 (på andra sätt) | 10 | 100 |
Tabell 5. Slutlig koncentration av analyter i varje kalibreringspunkt.
| Läkemedel | Lod (ng/mg hår) |
LLOQ (PÅ ANDRA) (ng/mg hår) |
ULOQ (på andra) (ng/mg hår) |
Provvärden (ng/mg hår) Prover: UC-04, UC-08, UC-11, UC-16, UC-25, UC-36, UC-69, UC-83, UC-89, UC-90, UC-91, UC-104, UC-105, UC-108, UC-109 |
| Bedaquiline (bedaquilin) | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.21, 0.38, 0.56, 0.86, 0.90, 1.04, 1.29, 2.15, 2.29, 5.64 |
| Clofazimine (kloak) | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.37, 0.61, 1.84, 2.20, 2.90, 3.41, 3.90, 6.03, 8.25, 10.66, 11.01 |
| Ethambutol (Ethambutol) | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.04, 0.05, 0.25, 0.42, 0.43, 0.5, 0.68, 0.92, 0.95, 1.01, 1.53, 1.54, 9.76 |
| Etionamid | 0.01 | 0.01 | 10 | |
| Isoniazid | 0.05 | 0.5 | 100 | |
| Levofloxacin | 0.1 | 0.5 | 100 | 8.01, 8.42, 15.37, 24.41, 39.45, 42.12, 56.15, 75.58, 119.96 |
| Linezolid (radzolid) | 0.1 | 0.5 | 100 | 0.87, 1.09, 3.51, 5.51, 7.80, 9.21, 15.68, 18.32, 19.13, 21.22 |
| Moxifloxacin (olikartade) | 0.05 | 0.5 | 100 | 0.35, 0.49, 1.58, 1.59, 6.23, 7.06, 13.14, 17.37, 21.72, 55.88, 86.64 |
| Pretomanid (pretomanid) | 0.005 | 0.05 | 10 | 0.57 |
| Prothionamid | 0.002 | 0.01 | 10 | |
| Pyrazinamid | 0.05 | 1 | 100 | 1.14, 1.74, 1.86, 3.21, 5.94, 11.39, 12.36, 12.71, 12.85, 14.38, 16.13, 44.17, 69.66 |
Tabell 6. Representativa nivåer av läkemedel mätt i 15 patienter som tar DR-TB mediciner under DOT. Detektionsgränsen (LOD), den nedre kvantifieringsgränsen (LLOQ) och den övre kvantifieringsgränsen (ULOQ) för varje läkemedel anges för jämförelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapportera här protokollet för den metod vi utvecklat och validerat för att kvantifiera 11 anti-TB mediciner som används vid behandling av DR-TB i små hårprover med LC-MS/MS. Ingen annan metod för att kvantifiera dessa 11 läkemedel i hår har tidigare utvecklats, validerats och publicerats. Vår metod kan kvantifiera subnanogram nivåer av läkemedel i endast 20-30 hårstrån på cirka 3 centimeter (cm) i längd (~ 2 mg) och har redan validerats22. Den låga vikten av hårt analyseras innebär att patienter som deltar i studien kan delta diskret och potentiellt återvända för upprepade tester utan rädsla för att exponera skallig hårbotten. Vi har tidigare publicerat data om sambandet mellan DR-TB läkemedelsnivåer i hår och DR-behandling resultat23. Därför utgör utvecklingen och valideringen av denna multialytpanelmetod ett betydande framsteg när det gäller övervakning av dr-tb terapeutiska läkemedel.
Hår kräver olika homogenisering tekniker än de som krävs med flytande biomatrices. Pulverisering av hårstrån gav effektiv tillgång till extraktionsmedel till analyter i hårmatrisen. Således är ett viktigt inslag i vår metod den snabba och enkla extraktionsprocessen av läkemedel från hår med hjälp av de pulveriserade proverna. Inkubationstiden under extraktionsprocessen är bara två h, på grund av den stora tillgängliga ytan av pulveriserat hår, och det finns ingen saneringssteg, på grund av den lilla provstorleken (2 mg). Försiktighet måste dock iakttas för att begränsa läkemedelsnedbrytningen under utvinningsprocessen. Protokollet använder en två-cykel pulverisering, med en 45 s kylningsperiod i mellan cyklerna. Denna process undviker överhettning och potentiellt förnedrande droger i håret.
Till skillnad från många håranalyser för droger av missbruk använder denna metod inte ett tvättsteg. DR-TB läkemedel kommer i kapsel eller tablettform, begränsa möjliga källor till yttre kontaminering och det efterföljande behovet av att tvätta håret före analys. Framtida studier kan analysera tvättmedel från DR-TB patientens hår för att bedöma yttre kontaminering.
Även hår pulverisering främjar effektiv läkemedelsutvinning, den har sina egna begränsningar. Vårt laboratorium har funnit att om håret pulveriseras i pärla ruptor och lämnas i rumstemperatur, koncentrationen av några av de 11 läkemedel minskar under veckor och månader. Detta kan bero på den stora ytan av det pulveriserade håret utsätts för atmosfären som kan främja oxidation och andra nedbrytningsreaktioner. Om en stabilitetsstudie av läkemedlen i håret önskas, kan håret klippas med sax i små segment av <1 cm, homogeniseras för hand och sedan lämnas vid rumstemperatur i veckor eller månader under stabilitetsstudien. När detta klippta hår pulveriseras på analysdagen har vi inte observerat någon signifikant läkemedelsnedbrytning över tiden. Därför, i utförandet av det beskrivna protokollet, rekommenderar vi att håret pulveriseras den dag det extraheras. På samma sätt bör alla läkemedelsblandningar under 10 μg/ml-koncentrationer beredas på extraktionsdagen.
Det finns inga tidigare publicerade metoder för att bedöma lämpligheten hos de linjära dynamiska omfång (LLOQ-ULOQ) som vi fastställde för varje TB-läkemedel i multialytmetoden. Men bekvämligheten provet av hårprover från Western Cape, Sydafrika, visar lämpligheten av det linjära dynamiska omfånget av denna metod. Med undantag för etionamid, pretomanid och protionionamid, mer än 95% av de läkemedelsnivåer vi mätt i dessa patienter är inom det linjära dynamiska intervallet för varje analyt. Endast en patient tog pretomanid (som upptäcktes), och inga patienter tog prothionamid. För etionamid, vi tställa att läkemedlet inte kan deponera till hår matrisen väl, som vår LOD är 0.01 ng/mg hår (eller 10 pg/mg hår) och ändå bara en av de åtta patienter som tar etionamid har nivåer högre än 0,02 ng/mg hår. Ytterligare undersökning är berättigad att bestämma farmakokinetiken för olika tbc-läkemedel i håret. Till exempel, ett potentiellt alternativ för övervakning av läkemedel som etionamid är att utveckla en metod som riktar sig till deras metabolit (er) istället. Vi har gjort en liknande iakttagelse för delamanid, en ny DR-TB medicinering, som ursprungligen var en del av denna panel. En metod som riktar sig till delamanids metabolit håller för närvarande på att valideras i vårt laboratorium, eftersom metaboliten finns i högre koncentrationer än moderläkemedlet. Samma förfarande kan utföras för etionamid. Läkemedelskoncentrationerna i tabell 6 presenteras som en grupp eftersom de enskilda resultaten och kliniska resultat inte är i fokus för detta metodpapper. Individuell bedömning av denna patientgrupp har publicerats på annat håll23.
De patienter som bidrog med små hårprover för demonstrationsstudien administrerades en mängd olika läkemedelsregimer via DOT i en inpatientmiljö, och alla regimer dokumenterades enligt omvårdnadsjournaler under slutperioden. Som är vanligt bland DR-TB-patienter hade dock tidigare dåligt dokumenterade läkemedelsregimer också administrerats före slutenvården. Detta ledde till upptäckt av läkemedel i patientens hår som inte noterades på deras slutenvård register. Därför kunde vi inte använda dessa prover för att fastställa metodens specificitet, eftersom vi inte kunde avgöra om dessa prover verkligen var falska positiva. Istället testade vi hår från patienter som inte tog DR-TB droger. Inga DR-TB läkemedel upptäcktes i dessa prover, vilket tyder på att metoden är specifik.
Även om vår metod visar nyttan av att använda hår för att mäta DR-TB droger, har håranalys sin egen uppsättning begränsningar. Eftersom hår är en solid matris, tillsatta av läkemedel referensstandarder under metod validering tillåter inte standardernas fullständig integration i matrisen som med urin och blod. Således är återvinning bedömning begränsad till detektion av läkemedel efter tillsatta på den fasta matrisen, och inte faktiska hämtning från matrisen. Likaså, eftersom hår är en alternativ matris som fortfarande undersöks för testning, inga lättillgängliga referensintervall för läkemedel finns tillgängliga för att bedöma metodens lämplighet. Mer farmakokinetiska studier om införlivandet av läkemedel i håret kommer att vara användbart för att ytterligare förstå nyttan av hår läkemedelsnivåer i följsamhet övervakning. Slutligen har korrekt samling av hårprover på fältplatser sina egna unika utmaningar. Medan insamling och lagring av hårprover kräver mindre resurser än andra biomatrices, måste man vara noga med att identifiera de distala och proximala ändarna av alla hårstrån längre än 2 cm. Längre hårstrån kan ha olika läkemedelskoncentrationer längs strängen, beroende på medicinering användning över tiden. Korrekt märkning möjliggör analys av specifika segment av trådarna; När det gäller vår metod, de tre centimeter av hår närmast hårbotten användes för att bestämma de senaste uppgifterna om medicinering följsamhet. Korrekt märkning kräver utbildnings- och kvalitetssäkringsförfaranden på platserna.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat den första multialytpanelen för analys av tbc-läkemedel som används för DR-TB via LC-MS/MS i små hårprover. Med tanke på möjligheten att samla in och lagra hår i resursbegränsade inställningar, utgör vår metod ett potentiellt betydande framsteg inom tb terapeutisk läkemedelsövervakning. Objektiva åtgärder för läkemedelsexponering som tar hänsyn till både följsamhet och individuella farmakokinetiska variationer kan ge tidig indikation på ineffektiva behandlingsregimer, vilket bidrar till både individuell behandling och begränsning av gemenskapens överföring av DR-TB24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöddes av National Institute of Allergy and Infectious Diseases RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe och Monica Gandhi).
Acknowledgments
Författarna vill tacka professor Keertan Dheda, Dr Ali Esmail, och Marietjie Pretorius vid University of Cape Town Lung Institute som underlättade insamling av hårprover för studien. Författarna erkänner vidare tacksamt bidragen från deltagarna i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- WHO. Global Tuberculosis Control 2017. , Geneva. Available from: www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2017).
- WHO. Tuberculosis. , Geneva. Available from: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ (2017).
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, Suppl 1 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. "White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
