Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הערכה מורפולוגית ופונקציונלית של Axons וסינפסות שלהם במהלך מוות Axons בדרוסופילה מלאנוסטר

Published: March 16, 2020 doi: 10.3791/60865
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Fundamental Neurosciences, University of Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים כדי לבצע שלושה המושרה הנגרמת לפציעה מניוון (אקסון מוות) בחני ילה melanogaster כדי להעריך את השימור מורפולוגית ופונקציונלית של אקסונים קטוע הסינפסות שלהם.

Abstract

הניוון axon היא תכונה משותפת במחלות ניווניות, כאשר מערכות העצבים מאותגרים על ידי כוחות מכניים או כימיים. עם זאת, הבנתנו את המנגנונים המולקולריים המשמשים כבסיס לניוון שרידי מוגבל. הנגרמת מפגיעת פציעה אקסון ניוון משמש מודל פשוט ללמוד איך אקסון מנותקים לבצע פירוק שלהם (אקסון מוות). במהלך השנים האחרונות התגלתה מדורגת בעלת שימור והשמדה אבולוציונית באמצעות מעופפים ליונקים, הנדרשים לצורך האקסון המופרד לאחר הפציעה. לעומת זאת, מחליש את התוצאות באמצעות איתות מוות מורפולוגיים ופונקציונלית של אקסונים קטועים והסינפסות שלהם. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים פשוטים ומפותחים לאחרונה אשר מאפשרים התבוננות של מורפולוגיה האקאליות, או תפקוד אקאליות ו סינפטית של אקסונים מנותקים שנותקו מהגוף הגוף העצבי, בזבוב הפרי בדרוזוהילה. מורפולוגיה ניתן לצפות באגף, שם פציעה חלקית התוצאה היא המוות בצד השני של האקסון של שליטה בלתי נפגעים בתוך אותו צרור עצבים. לחילופין, מורפולוגיה סיבי ניתן גם לצפות במוח, שם צרור העצבים כולו עובר סיבי מוות המופעל על ידי אבלציה אנטנה. שימור פונקציונלי של אקסונים קטוע הסינפסות שלהם ניתן להעריך על ידי גישה אלקטרואופטיקה פשוטה בשילוב עם התנהגות פוסט סינפטית לטפח. אנו מציגים דוגמאות באמצעות מוטציה אובדן הפונקציה highwire ועל ידי מבטא dnmnat, שניהם מסוגלים לעכב אקסון מוות במשך שבועות חודשים. וחשוב מכך, ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה מעבר לפציעה; הם מקדמים את האפיון של גורמי תחזוקה עצביים, תחבורה סיבי, ו המיטו, מיטוכונקסיום.

Introduction

השלמות המורורפולוגית של הנוירונים היא חיונית לתפקוד מערכת העצבים המתמשכת לאורך כל החיים. הרוב המכריע של הנפח העצבי נלקח על ידי אקסונים1,2; כך שמירה ארוכה של אקסונים ארוכים במיוחד הינה אתגר ביולוגי ואנרגטי מרכזי עבור מערכת העצבים. מנגנוני תמיכה מרובים סיבי ו-glial-חיצוניים זוהו, ומבטיחים הישרדות לאורך חיים. תוצאות ליקוי שלהם ב אקסון ניוון3, שהיא תכונה נפוצה של מערכות עצבים להיות מאותגרים במחלה, ועל ידי כוחות מכניים או כימיים4,5. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של ניוון אקסון להישאר מובנים למדי בכל הקשר, מה שהופך את הפיתוח של יעיל טיפולים כדי לחסום הפסד הרזיה מאתגרת. הפיתוח של טיפולים יעילים נגד התנאים הנוירולוגיים האלה הוא חשוב, כאשר הם יוצרים נטל עצום בחברה שלנו6.

הנגרמת מפגיעת פציעה אקסון ניוון משמש מודל פשוט ללמוד איך אקסון מנותקים לבצע פירוק שלהם. התגלה על-ידי ונקרא על-ידי אוגוסטוס וולר ב-1850, ניוון וולריאני (WD) הוא מונח מטריה המהווה שני תהליכים ספרתיים ברורים ונפרדים7. ראשית, לאחר פציעה סיבי, סיבי מופרדים גופי התא שלהם פעיל ביצוע ההרס העצמי שלהם (סיבי מוות) באמצעות סיבי שמרו מוות באופן שימור מדורגת בתוך יום אחד לאחר פציעה8. השני, מסביב גליה ומתמחה phagocytes לעסוק ולנקות את הפסולת סיבי שנוצר בתוך שלושה עד חמישה ימים. הנחתה של אקסון מוות איתות תוצאות באקסונים מנותקים שנותרו שמורים במשך שבועות9,10,11,12, בעוד החליש של גליה בשנת בשנת מסתיים בפסולת אקסון אשר נמשך שבועות ב vivo13,14,15.

מחקר בזבובים, עכברים, חולדות ו-דג זברה חשפו מספר מגשרים שמרו ומתווכים חיוניים של אקסון מוות איתות8. מוטציות המוות של אקסון מכילות אקסון וסינפסות מנותקים שאינם מצליחים לעבור אקסון מוות; הם נשארים מורפולוגית ופונקציונלית שנשמרו במשך שבועות, בהעדר תמיכת גוף התא9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23. הגילוי והאפיון של המגשרים הובילו להגדרה של מסלול מולקולרי המבצע אקסון על המוות. חשוב מאוד, מוות אקסון איתות מופעל לא רק כאשר האקסון נחתך, כתוש או נמתח24,25; זה גם נראה כמו משתתף במודלים בעלי חיים נפרדים של מצבים נוירולוגיים (למשל, כאשר אקסונים מנוונת באופן עצמאי פציעה4, עם זאת עם מגוון של תוצאות מועילות4,8). לכן, להבין כיצד אקסון המוות מבצע התנוונות ניוון לאחר הפציעה עשוי להציע תובנות מעבר למודל פציעה פשוטה; הוא יכול גם לספק מטרות להתערבות טיפולית.

זבוב הפרי מלאנוגסטר (דרוזוהילה) הוכיח שהוא מערכת לא יסולא בפז עבור איתות המוות של אקסון. מחקר בזבוב חשף ארבעה שמרו על הגנים האבולוצעיים החיוניים ובעלי מוות: הייתיל (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 ו- אקסון (מבוים)12. השינוי של המגשרים האלה – אובדן פונקציה של מוטציות של hiw, dsarm ו מבוים, ועלביטוי מחדש של dnmnat -בלוקים מרוב הגובה מוות לאורך החיים של הזבוב. בעוד אקסונים מסוג פראי לעבור אקסונים מוות בתוך יום אחד, אקסונים קטוע והסינונים שלהם חסר axed hiw, dsarm או מבחוץ להישאר לא רק מורפולוגית, אלא גם מבחינה פונקציונלית נשמר במשך שבועות. אם ניתן להשיג שימור פונקציונלי גם דרך רמות גבוהות של dnmnat שרידים להיקבע.

כאן, אנו נציג שלושה פרוטוקולים פשוטים ומפותחים לאחרונה כדי ללמוד אקסון מוות (למשל, מורפולוגיה ותפקוד של אקסון מנותקים הסינונים שלהם לאורך זמן) בהעדר תמיכה גוף התא. אנו מדגימים כיצד אקסון מוות תוצאות המוות של אקסון קטוע אשר נשמרים באופן מורפולוגית עם hiw אובדן של פונקציה מוטציה (hiw∆ N) וכיצד אקסון החליש את תוצאות המוות באקסון והסינפסות שנותרו פונקציונלית שנשמרו לפחות 7 ימים עם מעל ביטוי של dnmnat (dnmnatOE). פרוטוקולים אלה מאפשרים התבוננות של מורפולוגיה הפרט הסינפטיות וסינפטית במרכז, או מערכת העצבים ההיקפית (cn ו היקפית, בהתאמה)13,14, בעוד שימור פונקציונלי של סיבי מנותקים הסינפסות שלהם ב-cn יכול להיות דמיינו על ידי שימוש של התקנה אלקטרואופטיקה פשוטה בשילוב עם טיפוח כבדיקה התנהגותית12.

Protocol

1. התבוננות במבנה האקסון במהלך מוות מהיקפית

  1. פגיעת כנף: פציעה חלקית של חבילות אקסון
    1. השתמש 5 נקבות הבתולה ו 5 זכרים מתוך גנוטיפ הנכון (איור 4A, P0 דור) כדי לבצע צלבים בטמפרטורת החדר (RT). להעביר P0 לתוך מבחנות חדש כל 3 – 4 ימים. לאסוף למבוגרים טריים צאצאי מבוגרים (F1 הדור) מדי יום וגילם אותם 7 – 14 ימים.
    2. . מתחת לריפוד2 השתמש מספריים מיקרו לחתוך את הווריד הכנף הקדמי בערך באמצע הכנף (איור 1א). השתמש בכנף אחת לפציעה ולכנף השנייה כשליטה לא נפגעת מגיל הגילאים. החלת פציעה אחת בכל כנף, והקפידו לקבל מספיק כנפיים שנפגעו (כ -15 כנפיים).
      הערה: הכנף כולה ניתן לחתוך, אבל זה מספיק כדי לחתוך רק את הווריד הכנף הקדמית. . זה החלק החזק ביותר בכנף
    3. לשחזר את הזבובים בתוך מזון המכיל בבקבוקונים.
  2. חיתוך כנף והדמיה של אקסונים
    1. מורחים 10 μL של שמן הלוקרבון 27 עם פיפטה לאורך שקופית זכוכית שלמה (איור 1B).
    2. לנתק את הפצועים, כמו גם, את האגף שליטה בלתי נפגעת בנקודות הזמן הרצוי (למשל, 1 או 7 ימים לאחר פציעה). השתמש מספריים מיקרו לגזור, מלקחיים לתפוס את הכנף. הר מקסימלי 4 כנפיים לתוך שמן הלוקרבון 27 (איור 1ב) ולכסות אותם עם שקופית כיסוי.
    3. התמונה הכנף מיד באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב. לרכוש סדרה של מקטעים אופטיים לאורך ציר z עם 0.33 יקרומטר בגודל צעד ו לדחוס z-ערימות לתוך קובץ יחיד עבור ניתוחים הבאים.
      הערה: לא לתפוס את הווריד הכנף הקדמי שבו גופים תא ו אקטונס שוכנו. . תפוס את הכנף במרכז הרקמה בכנפיים אינה קבועה; לשמור את הזמן מפני הרכבה כנפיים להדמיה אלה מתחת 8 דקות.

Figure 1
איור 1: התבוננות במבנה האקסון במהלך המוות בכנף. (א) סכימטימעופףעם שתי נוירונים סנסוריים בעלי תווית בדלילות, המצוינים גם בנפרד. אתר הפציעה ותחום ההתבוננות מצוינים. (ב) התקנה סכמטית עבור הדמיה כנף. כנפי שליטה פצועים ובלתי נפגעים (אפור) מורכבים בשמן הלוקרבון 27 (אדום) על שקופית זכוכית (כחול בהיר) ומכוסה בשקופית כיסוי (שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. תצפית על האקסון והסינפסה במהלך מוות האקסון במסגרת ה-CN

  1. אבלציה אנטנה: פציעה של חבילות אקסון שלם
    1. השתמש 5 נקבות הבתולה 5 זכרים מתוך גנוטיפ הנכון (איור 5A, P0 דור) כדי לבצע צלבים על RT. להעביר P0 לתוך בבקבוקונים חדש כל 3 – 4 ימים. לאסוף למבוגרים טריים צאצאי מבוגרים (F1 דור) יומי ולתת להם גיל 7 עד 14 ימים.
    2. . מתחת לריפוד2 השתמש בפינצטה כדי להשתמש בחלק הימניהשלישי של מקטע אנטנה עבור אבלציה חד צדדית; או שמאלה וימינה 3 מקטעים אנטנהשלישית עבור אבלציה דו-צדדית (איור 2א-ג). הדבר יסיר גופי תאים עצביים המסומנים ב-GFP, בעוד שהתחזיות האקאליות שלהם נשארות ב-CN.
      הערה: האבלציה האנטנה מנתקת את הצרור כולו. אם מבוצע צריבה חד צדדית, צרור האקסון על הצד הנקרא (האנטנה הפנימית) משמש כפקד פנימי. הקפידו לבצע ביצוע מספיק של האוספים האנטנה (כ 15 בעלי חיים).
    3. לשחזר את הזבובים בתוך מזון המכיל בבקבוקונים.
  2. ניתוח מוחי והדמיה של אקסונים
    1. לערבב בסיס אלסטומר סיליקון (9 מ"ל) וריפוי סוכן (1 mL) ביחס נפח של 10:1. העבירו כל תערובת של 5 מ ל לתוך לוחית התרבות 35 מ"מ ברקמה, והפחת את האוויר שהוצג בערבוב עם עצבנות עדינה בתוך הלילה. התערובת מתקשה בתוך 24 שעות.
      הערה: לוחיות החיתוך חייבות להיות מוכנות רק פעם אחת וניתן להשתמש בהן מספר פעמים.
    2. כאשר משתמשים בשני מלקחיים בנקודות הזמן הרצויות (למשל, 1 או 7 ימים לאחר אבלציה).2 השתמש בטוויצר אחד כדי לתפוס את הצוואר, ואת הטוויצר השני כדי לתקן את החזה. משוך בעדינות את הצוואר והראש מחוץ לחזה.
      הערה: השאירו ראשים ערופי ראש על הלוח CO2 עד המספר הרצוי מושגת, אך הקפד להמשיך לשלב הבא בתוך 30 דקות.
    3. העבר את כל הראשים לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכילה 1 מ ל תיקון פתרון המכיל 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ו 0.1% טריטון X-100 ב מלוחים באגירה פוספט (PBS) באמצעות מלקחיים כי כבר טבל לתוך פתרון תיקון.
      הערה: ראשי הזבובים מקל היטב על מלקחיים רטובים. זה מאפשר להעביר את כל הראשים. בקלות לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה
    4. לתקן ראשי עבור 20 דקות עם עצבנות עדינה ב-RT. לשים את שפופרת מיקרוצנטריפוגה על הקרח, ראשים יהיה לפני התחתית של צינור מיקרוצנטריפוגה. הסר את supernatant עם פיפטה וחזור על הליך זה עם חמישה 2 דקות שוטף עם 1 mL של מאגר כביסה המכיל 0.1% טריטון X-100 ב PBS עם עצבנות עדינה ב RT, כדי להסיר פתרון שיורית תיקון.
      הערה: קטעי וידאו על כיצד לנתח מוחות Drosophila ילה מבוגרים זמינים27.
    5. להעביר את הראשים עם מכונת זכוכית לתוך לוחית ניתוח מלאה מאגר כביסה. השתמש פינצטה אחד כדי לתפוס ולמשוך את החוטם הוא מעל הראש, תוך החזקת הראש עם הטוויצר השני. זה ישאיר חור היה מחובר השלד החיצוני.
    6. השתמש בשתי מלקחיים כדי להסיר את השלד החיצוני בין החור לבין כל עין מורכבת. זה יעשה את זה אפשרי לפתוח את המבנה הראשי עם שתי הפינצטה, וכדי לשרוט את המוח בעדינות בתוך.
    7. נקה כל מוח על ידי הסרת קנה הנשימה או שומן נדבק אליו (איור 2D, למעלה). לאחר ניקוי המוח, לשים אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש המכיל 1 מ ל של מאגר כביסה על הקרח.
      הערה: האונות האופטיות שניזוקו או אבדו לא ישפיעו על האונה המצריח במרכז המוח (איור 2D, top).
    8. החלף מאגר כביסה עם 1 מ ל תיקון פתרון ברגע שכל המוחות נאספים ונצבר בתחתית הצינורית המיקרוצנטריפוגה. תקן את המוח עבור 10 דקות עם נדנדה ב RT, ואחריו 5 2 דקות שוטף ב 1 מ ל של מאגר כביסה עם נדנדה ב RT.
    9. החלת נוגדנים ראשוניים (1:500) בתוך מאגר כביסה לילה עם נדנדה ב 4 ° c, ואחריו 10 שוטף על 2 h באמצעות 1 mL של מאגר כביסה עם נדנדה ב RT.
    10. החלת נוגדנים משניים (1:500) במאגר כביסה 2 h עם נדנדה ב RT ו לעטוף מיקרוצנטריפוגה צינור רדיד אלומיניום כדי לחסום את האור. שמרו על צינורית המיקרוצנטריפוגה מכוסה ברדיד אלומיניום לשאר התהליך. החלת עשרה שוטף עם 1 mL של מאגר כביסה מעל 2 h עם נדנדה ב RT.
    11. הסר את הסופרנטאנט והשתמש בטיפה אחת של התרופה נגד התפוגגות כדי לכסות את המוחות בצינור המיקרו-צנטריפוגה. המוח מהדגירה לפחות 30 דקות ב 4 ° c לפני הכנת אותם להרכבה והדמיה.
    12. הכן שקופית כיסוי, הדבק את קלטת המעבדה, וגזור צורת "T" מתוך הקלטת (איור 2D, למטה). החלל שנוצר משמש כאזור שבו המוח מכיל את התרופה נגד התפוגגות28 יהיה לחדור, רצוי לתוך שני התאים.
      הערה: השתמש בעצת מ20-200 μL, כאשר 3 מ"מ מהקצה נחתך כדי להרחיב את פתיחת הפיפטה. זה יעשה את זה אפשרי לפיפטה את המוח המכיל את התרופה נגד עמעום. כסו בזהירות את המוח בעזרת מגלשת כיסוי.
    13. השתמש חימר כדי להכין שני לחמניות אפילו קטנות. ודא שגלילי החימר אינם גבוהים מגובהם של מגלשת זכוכית. הדבק את החימר לתוך שקופית הזכוכית (איור 2D, למטה). מניחים את המוח המכיל את כריך שקופית המכסה על לחמניות חימר.
      הערה: אקסונים המסומנים ב-gfp והסינפסות שלהם ממוקמים בקדמת המוח. לכן, קל יותר לדמות אותם מהחזית. עם זאת, המוחות יהיו עם הפנים כלפי מעלה, או הפנים למטה על כריך שקופית כיסוי. לחמניות חימר לשמש מחזיקי כריכים, ובמהלך הדמיה, הכריך יכול להיות התהפך. זה יעשה את זה אפשרי להשיג תמונות מהחזית מכל מוח.
    14. לרכוש סדרה של מקטעים אופטיים לאורך ציר z עם 1.0 יקרומטר צעד גודל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, ולדחוס z-ערימות לתוך קובץ יחיד עבור ניתוחים הבאים, כדי להעריך את מספר התחזיות סיבי נותר ללא פגע.

Figure 2
איור 2: התבוננות במבנה האקסון והסינפסה בזמן המוות במוח. (א) מבט צדדי של ראש מעופף סכימטי עם התווית של גופי תא, אקטונס וסינפסות. (ב) הגדלה גבוהה התצוגה הקדמית של הנוירונים התווית של קולטן הריח של gpf ואת אקסונים שלהם ואת הסינפסות. גופי התא ממוקמים במקטעהאנטנה השלישי, ופרוייקט האקסונים שלהם לתוך ה-cn. Axons טופס סינפסות בתוך פקעית באונה הריח השמאלי, לחצות את קו האמצע ואת הסינפסות הטופס בתוך הפקעית על האונה ריח החוש הצלעות. (ג) דוגמאות של ראשי זבוב עם אבלציה חד צדדית. למעלה: שליטה בלתי נפגעת. אמצע: אבלציה שלקטע אנטנה 3 . בתחתית: אבלציה של השני(וכך גם 3rd) קטע אנטנה. (ד) הכנה למוח. למעלה: לגזור סכימטי המוח עם אונות הריח המצוין והתחזיות סיבי בתחום הראייה. תחתון: התקנה סכמטית לדימות מוחי. שני גלילי חימר (ירוק) מורכבים על שקופית זכוכית (כחול בהיר), הם נושאים כריך שקופית כיסוי, אשר מכיל מוחות לעוף (אפור). המוח מותקן בתרופה נגד עמעום (סגול), מוקפת בקלטת מעבדה (כתום), ומכוסה בשתי שקופיות כיסוי (שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. לטפח הנגרמת על ידי אלקטרואופטיקה כבדיקה עבור Axon ו סינפסה

  1. התקנה אלקטרואופטיקה
    1. בצעו את הניסוי האופגנטי. בחדר חשוך ודא כי ההתקנה מורכבת 850 ננומטר אינפרא אדום (IR) אור הזרקורים כדי להאיר זבובים בחושך (איור 3A), מהבהב 660 ננומטר אור אדום LED להפעיל נוירונים ביטוי CsChrimson, ומצלמה חד-צבעית עם 700 ננומטר לונגפאס מסנן, אשר מונע את ההקלטה של אור אדום הבזקים.
    2. השתמש במדפסת תלת-ממד כדי ליצור תא התנהגות מעגלי זעיר עם קוטר של 1 ס מ, לכסות אותו עם שקופית כיסוי, ולמקם פולט 860 ננומטר ביחד לזרקור אדום LED ליד החדר (איור 3ב).
      הערה: פולט מציין מתי הזרקור האדום מופעל ובכך מפעיל את הנוירונים.
    3. הר את הזרקורים LED ואת המצלמה על גבי החדר (איור 3A, C).
    4. הפעל נוירונים ב 10 הרץ הבזקים במהלך 10 s. ניתן לכוונן את משך ההפעלה בהתאם לתכנון הניסיוני.
  2. הכנת זבובים לאופגנטיקה
    1. . ממיסים מזון מעופף במיקרוגל אחרי המזון התקרר, לפני מיצוק, להוסיף 1:100 של 20 מ"מ כל טרנס-רשתית באתנול (אטוח) לריכוז הסופי של 200 μM. Mix היטב, ויוצקים את האוכל מיד לתוך בבקבוקונים ריקים.
      הערה: הימנע הוספת כל טרנס רשתית למזון חם, זה יכול לגרום אלקטרואופטיקה פחות יעיל.
    2. כיסוי מבחנות המכילות מזון מתחזק עם תקעים או כדורי צמר גפן. לעטוף מבחנות עם רדיד אלומיניום. לאחר מכן, אחסן את הבקבוקונים המכילים את המזון בחדר חשוך וקר.
    3. השתמש 5 נקבות הבתולה ו 5 גברים (איור 6A, דור P0) מתוך גנוטיפ הנכון לבצע צלבים ב RT. להעביר P0 לתוך מבחנות חדש כל 3 – 4 ימים. לאסוף למבוגרים טריים צאצאי מבוגרים (דור F1) על בסיס יומי ולתת להם גיל 7 עד 14 ימים בבקבוקונים מכוסה אלומיניום המכיל 200 μm כל טרנס-רשתית במזון לעוף.
    4. לאסוף זבובים על ידי הקשה עליהם מפני מזון המכיל מבחנות לתוך בקבוקון ריק בלי אוכל. מצננים את הבקבוקון במים המכילים קרח במשך כ -30 ס מ.. זבובים נרדמים מכניסים זבובים במהירות לחדרים קטנים מכוסים שקופית כיסוי (איור 3ב).
      הערה: ברגע שזבובים מתחממו, הם מתעוררים. זה חיוני להפיץ במהירות זבובים בודדים לתוך חדרי יחיד כל אחד. הימנע שיתוף2 רפידות להרדים זבובים, זה ישפיע על התנהגותם.
    5. בצע אלקטרואופטיקה כדי לעורר את הטיפוח האנטנה. כאן, הפרוטוקול מורכב ממרווחי הזמן הבאים: 30 s שבו האור האדום נעדר, ואחריו 10 s של חשיפה באור אדום ב 10 Hz. חזור על הליך זה שלוש פעמים בסך הכל, ואחריו מרווח של 30 מטרים נוספים שבהם האור האדום נעדר12,29,30.
      הערה: ניתן לכוונן פרוטוקול זה בהתאם להעדפה הניסיונית.
    6. לאסוף זבובים בודדים מכל חדר ב-CO2 רפידות. . כפופים להם לפציעה באנטנה בסוףשתי מקטעים אנטנה שמאל וימין (איור 2ג). זה יסיר את גופי התא של האיבר של ג'ונסטון (JO) נוירונים, בעוד התחזיות סיבי להישאר ב-cn. לשחזר את הזבובים בבקבוקונים מכוסה אלומיניום המכיל 200 μM כל טרנס רשתית.
      הערה: עבור הטיפוח האנטנה הנגרמת על ידי אלקטרואופטיקה, הגופים התא תא העצב החושי שוכנוקטע אנטנה 2 (איור 2ג).
    7. בנקודות בזמן המקביל (למשל, 7 ימים לאחר אבלציה הפוסט), הנושא טס לעוד שיטת טיפוח (לחזור לשלב 3.2.4).

Figure 3
איור 3: התקנה אלקטרואופטיקה כדי לגרום לטפח כבדיקה עבור אקסון ו-סינפסה. (א) איור של רכיבים המורכבים הדרושים לאופגנטיקה. אור אדום (IR) LED זרקור, מצלמה ואור אדום LED (משמאל לימין, בהתאמה). המרכיבים הכוללים תיאור מפורט מפורטים בטבלת החומרים. (ב) תצוגה מראש של תא התנהגות כולל פולט IR כדי לציין הפעלת זרקור אדום של LED. (ג) איור של הגדרת טעינה יחידה. סך של שלושה כיוונוני טעינה נדרשים עבור שני זרקורים LED והמצלמה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Representative Results

למעלה, תיארנו שלוש שיטות לחקר המבנה והתפקוד של האקטונים הקטועים והסינפסות שלהם. השיטה הראשונה מאפשרת צפייה ברזולוציה גבוהה של אקטונים בודדים ב-היקפית. זה דורש שיבוטים שנוצרו על ידי טכניקת marcm14,31. כאן, אנחנו ביצעו צלבים כדי ליצור סוג פראי ו- מוטציה מוטנטים marcm שיבוטים (איור 4א). חתך פשוט באמצע הכנף גורם לפציעה בנוירונים השוכנים במרכז (למשל, בצד החיצוני של הכנף), ואילו הנוירונים האבודיים (למשל, בין האתר החתוך לבית החזה) נותרים פצועים. גישה זו מאפשרת להתבונן אקסון מוות זה לצד של אקסון שליטה בלתי נפגע באותו צרור עצבים (איור 1א, איור 4ב). כאן, השתמשנו ברקע גנטי וכתוצאה מכך מספר נמוך של שיבוטים המסומנים ב-GFP (למשל, שניים בכל ניסוי14). אנו מציגים דוגמאות של 1 ו -7 ימים לאחר הפציעה של אקסונים סוג פראי, כדי לספק דוגמאות של אקסונים שליטה, אקסונים שעברו אקסונים מוות, ושברים אקסונים להיות מנוקה על ידי גליה מסביב, בהתאמה. בנוסף, חזרנו על פציעה סיבי ב מוטציות הייתיל שבו ניתחנו את התוצאה 7 ימים לאחר הפציעה.

כנפי שליטה בלתי נפגעים הנמל שני שיבוטים פראי, ולכן שני מתויג מסוג GFP בעלי שם פראי (איור 4B, פראי סוג, שליטה לא נפגע). יום אחד לאחר חיתוך באמצע האגף על ידי שימוש במספריים מיקרו, אקסון מוות הוא המושרה אקסון מתויג הגוף שבו גופים התא הם ממרכז לחתוך את האתר, בעוד אקסון גופי תאים שוכנו בתור שליטה פנימית בתוך צרור העצבים אותו (איור 4B, פראי סוג, 1 יום פציעה הפוסט). שים לב לסימן הפסולת הסיבי בחלק העליון המצוין על-ידי החץ. 7 ימים לאחר הפגיעה סיבי, פסולת gfp התווית מסומנת מנוקה על ידי המקיפים glia, בעוד gfp התווית שליטה ציווית בקרת להישאר צרור העצבים (איור 4B, פראי סוג, 7 ימים לאחר פציעה, חץ). לעומת זאת, מוטציות הייתיל שנותקו במשך 7 ימים נותרו מורפולוגית שנשמרו, עקבי עם הממצאים הקודמים11,14 (איור 4ב, הייתיל, 7 ימים פוסט פציעה, חץ). תוצאות אלו מדגימות את הרזולוציה החזותית רבת-העוצמה של אגף דרוזוהילה . מוות axon ניתן לצפות זה לצד זה של שליטה לא נפגע באותו צרור עצבים. בעוד האקטונס סוג פראי לעבור אקסונים מוות בתוך 1 יום לאחר הפציעה ואת הפסולת שהתקבל מנוקה בתוך 7 ימים, אקסונים מוטציות מוות לקויה המוטנטים נשארים מורפולוגית שנשמרו במשך 7 ימים.

Figure 4
איור 4: הגישה לחקר אקסון מוות של האקסונים חושי החושים הסנסוריים בכנף. (א) סכמטי חוצה כדי ליצור סוג פראי והמשובטים הייתיל בכנף (P0 ו-F דור1 , בהתאמה). , נקבות בתולות משמאל. זכרים מימין ראה טבלת חומרים עבור פרטי הגנוטיפ. (ב) דוגמאות לשליטה ולפציעות של אקסונים בעלי תווית gfp. שדה התצוגה מצוין ב (איור 1א). משמאל לימין: בקרת שליטה מסוג פראי בלתי נפגעים, מסוג פראי לאחר פציעה ביום 1, מסוג פראי של שבעה ימים לאחר פציעה, מוטציה הייתיל שבעה ימים לאחר פציעה, בהתאמה. חיצים מציינים axons מנותקים, סרגל קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה.

השיטה השנייה מתארת כיצד לדמיין צרורות שלמים של חבילות מקרינים לתוך ה-CN, שם הם יוצרים סינפסות, השייכים לנוירונים השוכנים באנטנה שמאל וימין (איור 2א-ג). כאן, אנחנו ביצעו צלבים כדי ליצור סוג פראי ו- מוטציה מוטנטים marcm שיבוטים (איור 5א). בלתי נפגעים, אקסונים התווית והסינפסות שלהם יכול להיות דמיינו במהלך הימים עד שבועות, בהעדר פציעה (איור 5B, פראי סוג, שליטה לא נפגע). לחילופין, בעלי חיים יכולים להיות נתוןל 3 אבלציה מקטע אנטנה, ו אקסונים מופרדים התווית והסינפסות שלהם ניתן לצפות במהלך זמן במהלך שעות לימים. אנו מתמקדים 7 ימים לאחר אבלציה בשלב זה, כי בנקודת זמן זו, אקסונים והסינפסות שלהם עברו אקסונים מוות, וכתוצאה מכך פסולת מנוקה על ידי המקיפים glia. אם המסה החד של האנטנה הנכונה מבוצעת, אז הצרור הימני החבילה מנותקים ויהיה לפרק את הפסולת המתקבלת הוא נוקה לחלוטין 7 ימים לאחר פציעה (איור 5B, פראי סוג, אבלציה חד צדדית, 7 ימים לאחר פגיעה, חיצים), עקבי עם ממצאים קודמים13. לחילופין, גם את הזכות ואת האנטנה השמאלית יכול להיות מסונן, אשר ינתק שתי חבילות אקסון, ו -7 ימים לאחר הפציעה, אקסון והסינפסות שלהם נעלם (איור 5ב, פראי סוג, אבלציה הדו, 7 ימים לאחר פציעה, חץ). לעומת זאת, אבלציה חד צדדית של האנטנה הימנית במוטציות המוטתיל תוצאות אקסונים קטוע כי נשארים שהשתמרו 7 ימים לאחר פציעה, עקבי עם הממצאים הקודמים11,14 (איור 5B, highwire, אבלציה חד-צדדית, 7 ימים לאחר פציעה, חץ). תוצאות אלה מדגימים כי מנותקים האקסון סוג פראי לעבור אקסונים המוות ואת הפסולת שנוצר מנוקה בתוך 7 ימים, בעוד אקסונים מוטציות מוטנטים highwire לקויה לא לעבור אקסונים מוות ולהישאר מורפולוגית נשמר במשך 7 ימים.

Figure 5
איור 5: הגישה לחקר אקסון מוות של האקסונים חושי החושים הסנסוריים במוח. (א) סכמטי חוצה כדי ליצור סוג פראי והמשובטים הייתיל במוח (P0 ו-F דור1 , בהתאמה). , נקבות בתולות משמאל. זכרים מימין ראה טבלת חומרים עבור פרטי הגנוטיפ. (ב) דוגמאות לשליטה ולפציעות של אקסונים בעלי תווית gfp. משמאל לימין: שולטת סוג פראי ללא פגע, סוג פראי 7 ימים פוסט לאחר אבלציה האנטנה, סוג פראי 7 ימים לאחר אבלציה בכתב, ו המוטתיל המוטנטים 7 ימים פוסט בהתאמה אנטנה חד-צדדית, בהתאם. חיצים מציינים חבילות אקסון מנותקים, סרגל קנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

השיטה השלישית מאפשרת התבוננות של שימור פונקציונלי של אקסונים קטועים וסינפסות שלהם ב-CN. הוא מסתמך על מניפולציה של תת-קבוצה של הנוירונים JO שוכנוקטע אנטנה 2 אשר מספיקים כדי לגרום לטפח אנטנה. ביטוי של המתקשר אדום הזזה (CsChrimson) ב-JO נוירונים, בשילוב עם תוספי תזונה של כל טרנס-רשתית, מספיק כדי לעורר התנהגות פשוטה פוסט סינפטית לטפח על חשיפה אור אדום12,30. כאן, אנו ביצעו צלבים כדי ליצור פראי מסוג ג ' ו נוירונים, ו ג ' ו נוירונים מעל המבטא dnmnat (dnmnatOE) (איור 6א). מסוג פראי זבובים או זבובים המכיל את הנוירונים JO עם אקסון החליש מוות (dnmnatOE), שני הנמל התנהגות חזקה לטפח לפני הפציעה. עם זאת, 7 ימים לאחר פגיעה (למשל, האבלציה הדו שלקטע אנטנה 2 ), הטיפוח נכשל להיות הפיק על ידי אלקטרואופטיקה בזבובים סוג פראי בשל הפגיעה הנגרמת אקסון ו סינפסה, בעוד בעלי חיים עם אקסון החליש את המוות להמשיך לחתן (איור 6B, סרט 1, 2). אקסון מחליש מוות הוא ולכן מסוגל לשמר מבחינה פונקציונלית אקסון והסינפסות שלהם במשך 7 ימים.

Figure 6
איור 6: הגישה לפונקציות הדמיה סיבי ו סינפטיות לאחר פתיחת האקסון. (א) סכמטי חוצה כדי ליצור סוג פראי ו dnmnat over-המבטא הנוירונים החושים JO (P0 ו-F דור1 , בהתאמה). , נקבות בתולות משמאל. זכרים מימין ראה טבלת חומרים עבור פרטי הגנוטיפ. (ב) איתוגרמות בודדות של התנהגות המטפח הנגרמת על ידי אלקטרואופטיקה. Top: ethograms בודדים של זבובים סוג פראי לפני ו 7 ימים לאחר הפציעה (כחול). למטה: ethograms הפרט של זבובים מעל-הבעה dnmnat (dnmnatOE) ב-JO נוירונים לפני ו 7 ימים לאחר הפציעה (אדום). כל סל מציין לפחות 1 התנהגות מטפח בתוך 1 s. הקו השחור מציין את הסכום של כל הסלים. (ג) קוונפיקציה של התנהגות המטפח. הנתונים מוצגים כסטיית ממוצע של ± standard, p > 0.001 (ANOVA בכיוון אחד, השוואה מרובה עם הבדיקה הפוסט-הוק של tukey). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט 1: הנציג מסוג פראי לטפח התנהגות מעורר על ידי אלקטרואופטיקה לפני ו -7 ימים לאחר אבלציה האנטנה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

סרט 2: התנהגות נציג המטפח המעורר על ידי אלקטרואופטיקה ב זבובים מעל ביטוי dnmnat ב הנוירונים JO לפני ו 7 ימים לאחר אבלציה האנטנה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים התבוננות איתנה ומיועלת של מורפולוגיה, כמו גם תפקוד של אקסונים וסינפסות שלהם מופרדים מגופם התאים בדרוסופילה. שיטת הכנף מקלה על התבוננות של אקסון מוות זה לצד של אקסון שליטה לא פצועים ב היקפית14, בעוד הקבוע האנטנה מקלה על התבוננות של צרורות עצבים שלמים של אקסון המסומנים התווית ו הסינפסות שלהם, כדי להעריך הן מורפולוגיה ותפקוד במוח (cn)12. ישנם שלבים קריטיים ויתרונות מסוימים עבור כל גישה מורפולוגיה ללמוד כי יש לקחת בחשבון בעת עיצוב ניסויים.

כדי לצפות בהיקפית האקסון בכנף, ניתן לבצע ניסויים בקלות, בשל שקיפות הכנף: היא מאפשרת לעקוף את הניתוח והאימונוהיסטוכימיה. עם זאת, בשל חוסר קיבעון, הכנפיים צריך להיות התמונה מיד לאחר הרכבה14. כיום, שני מנהלי Gal4 נפרדים משמשים לעתים קרובות, או ok371Gal4 או dpr1Gal4, ושני ההפניות מציעות גישות שונות לכמת ניוון14,26. תיוג דליל של מספר נוירונים הוא מומלץ, באמצעות "ניתוח פסיפס עם מרקר תא (marcm)"14,31, כמו הרזולוציה של מורפולוגיה סיבי היא חסרת תקדים. לעומת זאת, התבוננות בסינפסות אינה אפשרית בכנפיים, הן ממוקמות בחוט העצב הגוחוני בתוך בית החזה של הזבובים. יתר על כן, סמנים סיבי נוספים לא יכולים להיות מדמיינו על ידי אימונוהיסטוכימיה: הקוטיקולה שעווה עושה את זה בלתי אפשרי עבור דיפוזיה של תיקונים ונוגדנים לתוך הרקמה הבסיסית.

כדי לצפות במבנה האקסון והסינפסה. יש לבצע ניתוח מוח הם מציעים את היתרון של המחשה של סמנים סיבי נוספים על ידי השימוש של אימונוהיסטוכימיה, ו הסינפסות ניתן לצפות לצד סיבי באותו שדה של השקפה10,13. אוסף גדול של עצב הריח מאופיין תא (ORN) Gal4 מנהלי התקנים זמינים בקלות32, ולעתים קרובות, OR22aGal4 הוא הנהג של הבחירה. עבור אבלציה אנטנה, גופי תא של OR22a נוירונים שוכנוקטע 3 (איור 2ב). הקוונפיקציה המבוססת על עוצמה פלואורסצנטית משמש לכמת את הניוון של האקסונים או הסינפסות13. לעומת זאת, ניסויים הם זמן רב עקב ניתוח המוח וכתמים נוגדן.

כדי להמחיש את הפונקציה סיבי ו סינפטיות לאחר האקסון, אלקטרואופטיקה משמש כדי להפעיל לטפח אנטנה: הוא משמש כבדיקה עבור שימור פונקציונלי של סיבי קטוע הסינפסות שלהם12. מעגל הטיפוח והחושים המתאימים, הבין-מוטורי Gal4 מנהלי התקנים מתוארים ביסודיות29,30. GMR60E02Gal4 מתייג קבוצת משנה של העוגב של ג'ונסטון (JO) חושי נוירונים, הנדרשים ומספיקים לטיפוח29,30. עבוראבלציה אנטנה, גופי תאים של הנוירונים JO שוכנו קטע אנטנה 2 (איור 2ב). ניתן לבנות התקנה אלקטרואופטיקה בקלות מאפס, או הגדרה קיימת מותאמת. וחשוב מכך, יש לבצע ניסויים בחדר חשוך, והזבובים מבכך דמיינו עם אור אדום (IR) LED. בעת שימוש CsChrimson כערוץ, זה חיוני לספק את המזון עם כל טרנס ברשתית וזרקור אדום LED להפעיל את הנוירונים JO29. לחילופין, ערוצים כחולים רגישים לאור וזרקור כחול מוביל, או ערוץ TrpA1 וטמפרטורה יכול לשמש להפעלה עצבית29,33. הקוונפיקציה של התנהגות הטיפוח כבר תוארה12,29.

כאשר משתמשים אלה משמשים כדי ללמוד אקסון מוות במיוחד, חשוב לציין כי הפנוטיפ של שימור מורפולוגית או פונקציונלי צריך להיות חזק לאורך זמן. ישנם מקרים שבהם אקסון המוות מוביל הפנוטיפים עקביים עדיין פחות מבוטא ב שימור מורפולוגית34,35, והאם כגון פנוטיפ מתרגמת לשימור פונקציונלי נשאר להיקבע.

Axon המוות סוגי פנוטיפים נצפו גם בנוירונים במהלך פיתוח של הזחלים drosophila ילה , שם העצבים התרסקו ולא נפצע11,23. כאן, אנו מתמקדים באופן מפורש בדרוזוהילה נוירונים בוגרים שהשלים את התפתחותו. בהקשר זה, השימוש ב-RNA הפרעות36, או ברקמות ספציפיות CRISPR/Cas937 יכול להיות מיושם בקלות. וחשוב מכך, הטכניקות הנ ל ניתן להשתמש בהקשר של אקסון מוות עצמאי: הם להקל על האפיון של גורמי תחזוקה עצביים38, התחבורה אקסון39, גיל תלוי המיטו, השינויים40, ו מורפולוגיה של המיטו, מונאליות41.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם מה לגלות.

Acknowledgments

אנחנו רוצים להודות לכל מעבדת הנוקוממ לתרומות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע בשוויץ (SNSF) מסייע פרופסור (גרנט 176855), הקרן הבינלאומית למחקר בפרפיזיקה (IRP, גרנט P180), SNSF ספארק (גרנט 190919) ועל ידי תמיכה מאוניברסיטת לוזאן ו המחלקה לנוירומדעי היסוד (État דה ווז) ל-LJN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tweezers (high precision, ultra fine) EMS 78520-5 Antennal ablation
MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) EMS 72933-04 Wing injury
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 30120086.0000
35mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific™ BB02400600A113MNT0
Superfrost Microscope Slides Thermo Scientific™ AA00008032E00MNT10
High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter Thorlabs DCC1240M Camera setup
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts Thorlabs SM1RR
25mm 1/1.2" C mount Lens Tamron M112FM25
Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads Thorlabs SM1A36
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm Thorlabs ACL2520U-B
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm Thorlabs FELH0700
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long Thorlabs SM1T2
SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included Thorlabs SM1M10
850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA Thorlabs M850L3 IR LED spotlight
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long Thorlabs SM1T2
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included Thorlabs SM1M20
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm Thorlabs ACL2520U-B
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm Thorlabs FELH0850
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts Thorlabs SM1RR
660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA Thorlabs M660L4 Red LED spotlight
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm Thorlabs ACL2520U-B
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long Thorlabs SM1T2
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included Thorlabs SM1M20
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube Thorlabs KPS101 LED control
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current Thorlabs LEDD1B
150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps Thorlabs MB1530/M Mount base
Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm Thorlabs UPH75/M Mount, 3x (IR LED, red LED, cam)
Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap Thorlabs SM1RC/M
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm Thorlabs TR150/M
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm Thorlabs TR40/M
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex Thorlabs RA90/M
M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 Thorlabs SH6MS16 screws for mount onto base
USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx National Instruments 782604-01 Red LED spotlight controller
20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer TT Electronics/BI P230-2EC22BR20K fintuner for indicator
IR (860nm) emitter, 100 mA radial Osram 475-1365-ND Red light indicator
cable - - Misc
All-trans retinal Sigma R2625
Ethanol absolute Vwr 20821.296
Halocarbon Oil 27 Sigma H8773
Mowiol Merk 81381
Paraformaldehyde Sigma F8775
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P5493
Sylgard 184 silicone elastomer base Dow Corning Corp 4019862
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent Dow Corning Corp 4019862
Triton X-100 Sigma T8787
Chicken anti-GFP antibodies Rockland 600-901-215 Antibodies
Goat Dylight anti-Chicken Abcam ab96947
FM7a, B BDSC RRID:BDSC_785 X chromosome
FRT19A[hs-neo] BDSC RRID:BDSC_1709
hiw[ΔN] BDSC RRID:BDSC_51637
hs-FLP[12] BDSC RRID:BDSC_1929
tub-Gal80[LL1] BDSC RRID:BDSC_5132
w[1118] BDSC RRID:BDSC_3605
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus BDSC RRID:BDSC_55135 2nd chromosome
5xUAS-Gal4[12B] Kyoto RRID:Kyoto_108492
5xUAS-HA::dnmnat BDSC RRID:BDSC_39702
5xUAS-mCD8::GFP[LL5] BDSC RRID:BDSC_5134
ase-FLP[2d] Freeman laboratory Neukomm et al., 2014 (PNAS)
CyO BDSC RRID:BDSC_2555
dpr1-Gal4 BDSC RRID:BDSC_25083
OR22a-Gal4 BDSC RRID:BDSC_9952
ey-FLP[6] BDSC RRID:BDSC_5577 3rd chromosome
GMR60E02-Gal4 BDSC RRID:BDSC_39250
TM3,Sb,e BDSC RRID:BDSC_3644

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matsuda, W., et al. Single Nigrostriatal Dopaminergic Neurons Form Widely Spread and Highly Dense Axonal Arborizations in the Neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
  2. Wedel, M. J. A Monument of Inefficiency: The Presumed Course of the Recurrent Laryngeal Nerve in Sauropod Dinosaurs. Acta Palaeontologica Polonica. 57 (2), 251-256 (2012).
  3. Mariano, V., Domínguez-Iturza, N., Neukomm, L. J., Bagni, C. Maintenance mechanisms of circuit-integrated axons. Current Opinion in Neurobiology. 53, 162-173 (2018).
  4. Conforti, L., Gilley, J., Coleman, M. P. Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease. Nature reviews Neuroscience. 15 (6), 394-409 (2014).
  5. Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends in Cell Biology. 24 (9), 515-523 (2014).
  6. Gustavsson, A., et al. Cost of disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology: The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 21 (10), 718-779 (2011).
  7. Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 (1850).
  8. Rosell, A. L., Neukomm, L. J. Axon death signalling in Wallerian degeneration among species and in disease. Open Biology. 9 (8), 190118 (2019).
  9. Mack, T. G., et al. Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene. Nature Neuroscience. 4 (12), 1199-1206 (2001).
  10. Osterloh, J. M., et al. dSarm/Sarm1 is required for activation of an injury-induced axon death pathway. Science. 337 (6093), New York, NY. 481-484 (2012).
  11. Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biology. 10 (12), 1001440 (2012).
  12. Neukomm, L. J., et al. Axon Death Pathways Converge on Axundead to Promote Functional and Structural Axon Disassembly. Neuron. 95 (1), 78-91 (2017).
  13. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
  14. Neukomm, L. J., Burdett, T. C., Gonzalez, M. A., Zuchner, S., Freeman, M. R. Rapid in vivo forward genetic approach for identifying axon death genes in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (27), 9965-9970 (2014).
  15. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nature Communications. 8, 14355 (2017).
  16. Lunn, E. R., Perry, V. H., Brown, M. C., Rosen, H., Gordon, S. Absence of Wallerian Degeneration does not Hinder Regeneration in Peripheral Nerve. The European Journal of Neuroscience. 1 (1), 27-33 (1989).
  17. Adalbert, R., et al. A rat model of slow Wallerian degeneration (Wld(S)) with improved preservation of neuromuscular synapses. The European Journal of Neuroscience. 21 (1), 271-277 (2005).
  18. Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137 (23), Cambridge, England. 3985-3994 (2010).
  19. Feng, Y., et al. Overexpression of Wld(S) or Nmnat2 in Mauthner Cells by Single-Cell Electroporation Delays Axon Degeneration in Live Zebrafish. Journal of Neuroscience Research. 88 (15), 3319-3327 (2010).
  20. Gilley, J., Coleman, M. P. Endogenous Nmnat2 is an essential survival factor for maintenance of healthy axons. PLoS Biology. 8 (1), 1000300 (2010).
  21. Babetto, E., Beirowski, B., Russler, E. V., Milbrandt, J., DiAntonio, A. The Phr1 ubiquitin ligase promotes injury-induced axon self-destruction. Cell Reports. 3 (5), 1422-1429 (2013).
  22. Gerdts, J., Summers, D. W., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. Sarm1-mediated axon degeneration requires both SAM and TIR interactions. The Journal of Neuroscience. 33 (33), 13569-13580 (2013).
  23. Gerdts, J., Brace, E. J., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction. Science. 348 (6233), New York, NY. 453-457 (2015).
  24. Bridge, P. M., et al. Nerve crush injuries--a model for axonotmesis. Experimental Neurology. 127 (2), 284-290 (1994).
  25. Maxwell, W. L., Bartlett, E., Morgan, H. Wallerian Degeneration in the Optic Nerve Stretch-Injury Model of Traumatic Brain Injury: A Stereological Analysis. Journal of Neurotrauma. 32 (11), 780-790 (2015).
  26. Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Current Biology. 22 (7), 590-595 (2012).
  27. Janelia Farm Adult Drosophila Brain Dissection. , Available from: https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols (2015).
  28. Cold Spring Harbor. Mowiol mounting medium. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  29. Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. eLife. 3, 02951 (2014).
  30. Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. eLife. 4, 08758 (2015).
  31. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  32. Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102 (2), 147-159 (2000).
  33. Hampel, S., McKellar, C. E., Simpson, J. H., Seeds, A. M. Simultaneous activation of parallel sensory pathways promotes a grooming sequence in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  34. Farley, J. E., et al. Transcription factor Pebbled/RREB1 regulates injury-induced axon degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 23 (6), (2018).
  35. Wang, H., et al. Rapid depletion of ESCRT protein Vps4 underlies injury-induced autophagic impediment and Wallerian degeneration. Science Advances. 5 (2), 4971 (2019).
  36. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  37. Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. bioRxiv. 102, 636076 (2019).
  38. Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. Journal of Cell Science. 129 (1), 178-190 (2016).
  39. Vagnoni, A., Bullock, S. L. A cAMP/PKA/Kinesin-1 Axis Promotes the Axonal Transport of Mitochondria in Aging Drosophila Neurons. Current Biology. 28 (8), 1265-1272 (2018).
  40. Cao, X., et al. In vivo imaging reveals mitophagy independence in the maintenance of axonal mitochondria during normal aging. Aging Cell. 16 (5), 1180-1190 (2017).
  41. Smith, G. A., et al. Glutathione S-Transferase Regulates Mitochondrial Populations in Axons through Increased Glutathione Oxidation. Neuron. 103 (1), 52-65 (2019).

Tags

מדעי המוח סוגיה 157 Drosophila ילה נוירוביולוגיה ניוון וולריאני הנגרמת על ידי פציעה בניוון אקעל מוות גנטיקה אלקטרואופטיקה התנהגות מיקרוסקופ זריחה
הערכה מורפולוגית ופונקציונלית של Axons וסינפסות שלהם במהלך מוות Axons <em>בדרוסופילה מלאנוסטר</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paglione, M., Rosell, A. L.,… More

Paglione, M., Rosell, A. L., Chatton, J. Y., Neukomm, L. J. Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (157), e60865, doi:10.3791/60865 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter