Summary
Här tillhandahåller vi protokoll för att utföra tre enkla skadeinducerade axondegeneration (axon död) analyser i Drosophila melanogaster att utvärdera morfologiska och funktionella bevarande av avhuggna axoner och deras synapser.
Abstract
Axon degeneration är en gemensam egenskap i neurodegenerativa sjukdomar och när nervsystemet utmanas av mekaniska eller kemiska krafter. Vår förståelse av de molekylära mekanismer som ligger till grund för axondegeneration är dock fortfarande begränsad. Skadeinducerad axondegeneration fungerar som en enkel modell för att studera hur avhuggna axoner utför sin egen demontering (axondöd). Under de senaste åren har en evolutionärt bevarad axon död signalering kaskad identifierats från flugor till däggdjur, vilket krävs för separerade axon att urarta efter skada. Omvänt resulterar försvagad axondödsignalering i morfologisk och funktionell konservering av avskurna axoner och deras synapser. Här presenterar vi tre enkla och nyligen utvecklade protokoll som möjliggör observation av axonal morfologi, eller axonal och synaptisk funktion av avhuggna axoner som har cut-off från neuronal cellkroppen, i fruktflugan Drosophila. Morfologi kan observeras i vingen, där en partiell skada resulterar i axon död sida vid sida av oskadade kontroll axoner inom samma nerv bunt. Alternativt kan axonal morfologi också observeras i hjärnan, där hela nervbunten genomgår axondöd som utlöses av antennal ablation. Funktionellt bevarande av avhuggna axoner och deras synapser kan bedömas genom en enkel optogenetisk strategi i kombination med en post-synaptisk grooming beteende. Vi presenterar exempel med hjälp av en highwire förlust-of-function mutation och genom att över-uttrycka dnmnat, båda kan fördröja axon död i veckor till månader. Viktigt är att dessa protokoll kan användas utöver skada. de underlättar karakterisering av neuronala underhållsfaktorer, axonal transport och axonal mitokondrierna.
Introduction
Den morfologiska integriteten hos nervceller är avgörande för ihållande nervsystemet funktion under hela livet. Den stora majoriteten av den neuronala volymen tas av axons1,2; därmed är livslångt underhåll av särskilt långa axoner en stor biologisk och bioenergisk utmaning för nervsystemet. Flera axonal-inneboende och glia-extrinsic stödmekanismer har identifierats, vilket garanterar livslång axonal överlevnad. Deras nedskrivning resulterar i axon degeneration3, vilket är ett vanligt inslag i nervsystemet utmanas i sjukdom, och av mekaniska eller kemiska krafter4,5. De underliggande molekylära mekanismerna för axondegeneration är dock fortfarande dåligt förstådda i alla sammanhang, vilket gör utvecklingen av effektiva behandlingar för att blockera axonförlust utmanande. Utvecklingen av effektiva terapier mot dessa neurologiska tillstånd är viktig, eftersom de skapar en enorm börda i vårt samhälle6.
Skadeinducerad axondegeneration fungerar som en enkel modell för att studera hur avhuggna axoner utför sin egen demontering. Upptäcktes av och uppkallad efter Augustus Waller 1850, Wallerian degeneration (WD) är ett paraply term som omfattar två distinkta, molekylärt separable processer7. Först, efter axonal skada, axons separeras från sina cellkroppar aktivt utföra sin egen självförstörelse (axon död) genom en evolutionärt bevarad axon död signalering kaskad inom en dag efter skada8. För det andra, kring glia och specialiserade fagocyter engagera och rensa den resulterande axonal skräp inom tre till fem dagar. Dämpningen av axon död signalering resulterar i avhuggna axoner som förblir bevarade i veckor9,10,11,12, medan dämpning av glial uppslukande kulminerar i axonal skräp som kvarstår i veckor in vivo13,14,15.
Forskning i flugor, möss, råttor och zebrafiskar visade flera evolutionärt bevarade och väsentliga medlare av axon död signalerar8. Axon död mutanter innehåller avhuggna axoner och synapser som misslyckas med att genomgå axon död; de förblir morfologiskt och funktionellt bevarade i veckor, i avsaknad av kroppsstöd9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23.23 Upptäckten och karakteriseringen av dessa medlare ledde till definitionen av en molekylär väg som verkställer axondöd. Viktigt är att axon död signalering aktiveras inte bara när axonen skärs, krossas eller sträcks24,25; Det verkar också vara en bidragsgivare i olika djurmodeller av neurologiska tillstånd (t.ex. där axoner urarta på ett skadeoberoende sätt4, men med en rad positiva resultat4,8). Därför kan förstå hur axon död utför axon degeneration efter skada erbjuda insikter utöver en enkel skademodell; Det skulle också kunna ge mål för terapeutisk intervention.
Fruktflugan Drosophila melanogaster (Drosophila) har visat sig vara ett ovärderligt system för axon död signalering. Forskning i farten visade fyra väsentliga evolutionärt bevarade axon död gener: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 och axundead (yxade)12. Ändringen av dessa medlare - förlust-of-function mutationer av hiw, dsarm och yxade, och över-uttryck för dnmnat - blockerar potent axon död under flyens livslängd. Medan avhuggna vilda typ axoner genomgår axon död inom 1 dag, avhuggna axoner och deras synapser saknas hiw, dsarm eller yxade förblir inte bara morfologiskt, men också funktionellt bevaras i veckor. Huruvida funktionell konservering också kan uppnås genom höga nivåer av dnmnat återstår att fastställa.
Här kommer vi att presentera tre enkla och nyligen utvecklade protokoll för att studera axondöd (t.ex. morfologi och funktion av avhuggna axoner och deras synapser över tiden) i avsaknad av cellkroppsstöd. Vi visar hur försvagad axondöd resulterar i avhuggna axoner som morfologiskt bevaras med en hiw förlust-of-function mutation (hiw∆N)och hur försvagad axon död resulterar i avhuggna axoner och synapser som förblir funktionellt bevarade i minst 7 dagar med över-uttryck av dnmnat (dnmnatOE). Dessa protokoll möjliggör observation av enskilda axonal och synaptisk morfologi antingen i centrala, eller perifera nervsystemet (CNS och PNS, respektive)13,14, medan funktionellt bevarande av avhuggna axoner och deras synapser i CNS kan visualiseras med hjälp av en enkel optogenetisk setup i kombination med grooming som en beteendemässig urläsning12.
Protocol
1. Observation av Axon morfologi under Axon död i PNS
- Vinge skada: partiell skada av axon buntar
- Använd 5 jungfruhonor och 5 hanar från rätt genotyp(figur 4A, P0 generation) för att utföra kors vid rumstemperatur (RT). Passera P0 i nya flaskor var 3–4:e dag. Samla nyskande vuxenavkomma (F1 generation) dagligen och ålder dem i 7-14 dagar.
- Narkosflugor på CO2-kuddar. Använd mikrosax för att skära den främre vingvenen ungefär i mitten av vingen (figur 1A). Använd en vinge för skadan och den andra vingen som en åldersmatchad oskadd kontroll. Applicera en skada per vinge, och se till att få tillräckligt med vingar skadade (ca 15 vingar).
OBS: Hela vingen kan skäras igenom, men det är tillräckligt att skära endast den främre vingvenen. Detta är den starkaste delen av vingen. - Återvinn flugorna i mathaltiga flaskor.
- Vingdissekering och visualisering av axoner
- Sprid 10 μL halocarbon olja 27 med en pipett längs en hel glasbild (bild 1B).
- Stäng av de skadade, liksom den oskadade kontrollvingen vid önskad tidpunkt (t.ex. 1 eller 7 dagar efter skada). Använd mikrosax för att skära, och pincett för att ta tag i vingen. Montera maximalt 4 vingar i halocarbon olja 27(figur 1B)och täck dem med en täckrbild.
- Bild vingen omedelbart med hjälp av en snurrande disk mikroskop. Skaffa en serie optiska sektioner längs z-axeln med 0,33 μm stegstorlek och komprimera z-staplar i en enda fil för efterföljande analyser.
OBS: Ta inte tag i den främre vingvenen där cellkroppar och axoner är inrymda. Ta tag i vingen i mitten. Vävnaden i vingarna är inte fast; från att montera vingar na för att avbilda dessa under 8 min.
Figur 1: Observation av axonmorfologi under axondöd i vingen. (A)Schematisk flugvinge med två glest GFP-märkta sensoriska nervceller, som också är separat angivna nedan. Skadeplatsen och observationsfältet anges. (B)Schematisk inställning för vingavbildning. Skadade och oskadade kontrollvingar (grå) är monterade i halocarbon olja 27 (röd) på en glasbild (ljusblå) och täckt med en täckrbild (svart). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Observation av Axon och Synapse Morfologi under Axon death i CNS
- Antennal ablation: skada av hela axonbuntar
- Använd 5 jungfruhonor och 5 hanar från rätt genotyp(figur 5A, P0 generation) för att utföra kors på RT. Pass P0 i nya flaskor var 3–4:e dag. Samla nyligen sluten vuxen avkomma (F1 generation) dagligen och låt dem åldras i 7 upp till 14 dagar.
- Narkosflugor på CO2-kuddar. Använd pincett för att ablate rätt 3rd antenn segment för ensidig ablation; eller både vänster och höger3: e antennal segment för bilateral ablation (figur 2A-C). Detta kommer att ta bort GFP-märkta neuronala cellkroppar, medan deras axonal projektioner kvar i CNS.
OBS: Antennal ablation avtar hela axonbunten. Om ensidig ablation utförs fungerar axonbunten på den kontralaterala sidan (den oaberade antennen) som intern kontroll. Se till att utföra tillräckliga antennal ablations (cirka 15 djur). - Återvinn flugorna i mathaltiga flaskor.
- Hjärndissekering och visualisering av axoner
- Blanda silikonelastomerbas (9 ml) och härdningsmedlet (1 ml) i ett volymförhållande på 10:1. Överför varje 5 ml blandning till en 35 mm vävnadsodlingsplatta och minska luft som introduceras genom att blanda med mild agitation i rökhuven över natten. Blandningen stelnar inom 24 h.
OBS: Dissekeringsplattor na får endast beredas en gång och kan användas flera gånger. - Narkosflugor på CO2-kuddar och halshugger vuxna huvuden med två pincett vid önskade tidpunkter (t.ex. 1 eller 7 dagar efter antennal ablation). Använd en pincett för att ta tag i nacken, och den andra pincett för att fixa bröstkorgen. Dra försiktigt halsen och huvudet av bröstkorgen.
OBS: Lämna halshuggna huvuden2 på CO 2-dynan tills önskat nummer uppnås, men se till att gå vidare till nästa steg inom 30 min. - Överför alla huvuden till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller 1 ml fixeringslösning som innehåller 4% paraformaldehyd (PFA) och 0,1% Triton X-100 i fosfatbuffrad saline (PBS) med hjälp av pincett som har doppats i fixeringslösningen.
OBS: Fly huvuden fastnar bra på våta pincett. Det gör det möjligt att överföra alla huvuden lätt i mikrocentrifugröret. - Fäst huvuden i 20 min med mild agitation på RT. Sätt mikrocentrifugröret på is, huvuden kommer att dras till botten av mikrocentrifugröret. Ta bort supernatanten med en pipett och upprepa detta förfarande med fem 2 min tvättar med 1 ml tvättbuffert som innehåller 0,1% Triton X-100 i PBS med mild agitation på RT, för att ta bort kvarvarande fixeringslösning.
OBS: Videor om hur man dissekerar vuxna Drosophila hjärnor är lätt tillgängliga27. - Överför huvudena med en glaspipett till en dissektionsplatta fylld med tvättbuffert. Använd en pincett för att ta tag i och dra proboscis av huvudet, medan du håller huvudet med den andra pincett. Detta kommer att lämna ett hål där snabel var fäst vid exoskelettet.
- Använd två pincett för att ta bort exoskelettet mellan hålet och varje sammansatt öga. Detta kommer att göra det möjligt att öppna huvudet struktur med både pincett, och att försiktigt skrapa ut hjärnan inom.
- Rengör varje hjärna genom att ta bort luftstrupe eller fett som fastnat på den(figur 2D,överst). När hjärnan har rengjorts, lägg den i ett nytt mikrocentrifugrör som innehåller 1 ml tvättbuffert på is.
OBS: Skadade eller förlorade optiska lober påverkar inte luktloben i mitten av hjärnan(figur 2D, överst). - Byt ut tvättbufferten med 1 ml fixeringslösning när alla hjärnor samlas in och ackumuleras längst ner i mikrocentrifugröret. Fixa hjärnor i 10 min med gunga på RT, följt av fem 2 min tvättar i 1 ml tvättbuffert med gunga på RT.
- Applicera primära antikroppar (1:500) i tvättbuffert över natten med gungning vid 4 °C, följt av 10 tvättar över 2 timmar med 1 ml tvättbuffert med gungning på RT.
- Applicera sekundära antikroppar (1:500) i tvättbuffert 2 h med gungning på RT och linda mikrocentrifugröret i aluminiumfolie för att blockera ljus. Håll mikrocentrifugröret täckt med aluminiumfolie för resten av proceduren. Applicera tio tvättar med 1 ml tvättbuffert över 2 h med gungning på RT.
- Ta bort supernatanten och använd en enda droppe antifade reagens för att täcka hjärnan i mikrocentrifugröret. Inkubera hjärnor i minst 30 min vid 4 °C innan du förbereder dem för montering och avbildning.
- Förbered en omslagsbild, stick lab tejp på den, och skär ut en "T"-liknande form från bandet(Bild 2D, botten). Det resulterande utrymmet fungerar som område där hjärnan som innehåller antifade reagens28 kommer att pipetted i, helst i båda kamrarna.
OBS: Använd en 20-200 μL pipettspets där 3 mm av spetsen har avskurna för att vidga pipettens öppning. Detta kommer att göra det möjligt att pipette hjärnan-innehållande antifade reagens. Täck försiktigt hjärnan med en omslagsbild. - Använd lera för att förbereda två små jämna rullar. Se till att lerrullarna inte är högre än höjden på en glasrutschbana. Stick lerrullarna på glasbilden (figur 2D,botten). Placera hjärnan innehållande täcka glida smörgås på lerrullarna.
OBS: GFP-märkta axoner och deras synapser finns på framsidan av hjärnan. Det är därför lättare att avbilda dem framifrån. Men hjärnan kommer antingen att möta upp, eller nedåt på locket bild smörgås. Lerrullar fungerar som smörgåshållare, och under avbildning, kan smörgåsen vändas upp och ner. Detta kommer att göra det möjligt att förvärva bilder framifrån från varje hjärna. - Skaffa en serie optiska sektioner längs z-axeln med 1,0 μm stegstorlek med hjälp av ett confokalmikroskop och komprimera z-staplar i en enda fil för efterföljande analyser, för att bedöma hur många axonalprojektioner som förblir intakta.
- Blanda silikonelastomerbas (9 ml) och härdningsmedlet (1 ml) i ett volymförhållande på 10:1. Överför varje 5 ml blandning till en 35 mm vävnadsodlingsplatta och minska luft som introduceras genom att blanda med mild agitation i rökhuven över natten. Blandningen stelnar inom 24 h.
Figur 2: Observation av axon och synapsmorfologi under axondöd i hjärnan. (A)Sidovy över ett schemaiskt flughuvud med GFP-märkta cellkroppar, axoner och synapser. (B)Hög förstoring framifrån av GPF-märkta luktreceptornervceller och deras axoner och synapser. Cellkroppar är inrymda idet tredje segmentet och deras axonsprojekt i CNS. Axoner bildar synapser i en glomerulus i den vänstra luktloben, korsar mittlinjen och bildar synapser i glomerulus på den kontralaterala luktloben. (C)Exempel på flughuvuden med ensidig ablation. Överst: Oskadd kontroll. Mitten: Ablation av3:e antennalsegmentet. Botten: Ablation av2:a (och därmed även3:a)antennalsegmentet. (D)Hjärnberedning. Överst: Schematisk dissekeras flughjärna med indikerade luktlober och axonalprojektioner inom synfältet. Botten: Schematisk inställning för hjärnavbildning. Två lerrullar (gröna) är monterade på en glasrutschbana (ljusblå), de bär en omslagsbild smörgås, som innehåller flughjärnor (grå). Hjärnor är monterade i antifade reagens (lila), omgiven av ett labbband (orange), och omfattas av två omslagsbilder (svart). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Grooming framkallas av Optogenetik som en avläsning för Axon och Synapse Funktion
- Optogenetisk installation
- Utför det optogenetiska experimentet i ett mörkt rum. Se till att installationen består av en 850 nm infraröd (IR) LED-strålkastare för att belysa flugor i mörkret(bild 3A),en blinkande 660 nm röd LED-strålkastare för att aktivera nervceller som uttrycker CsChrimson, och en monokrom kamera med ett 700 nm longpassfilter, vilket förhindrar inspelning av röda ljusblixtar.
- Använd en 3D-skrivare för att generera en liten cirkulär beteendekammare med en diameter på 1 cm, täck den med en täckbild och placera en 860 nm-sändare kopplad till den röda LED-strålkastaren bredvid kammaren (bild 3B).
OBS: Sändaren anger när den röda LED-strålkastaren är på, vilket aktiverar nervcellerna. - Montera LED-strålkastarna och kameran ovanpå kammaren (bild 3A, C).
- Aktivera nervceller med 10 Hz blinkar under 10 s. Aktiveringens varaktighet kan justeras enligt den experimentella designen.
- Förbereda flugor för optogenetik
- Smält flugmat i en mikrovågsugn. Efter att maten svalnat, innan stelning, tillsätt 1:100 av 20 mM alla trans-retinal i etanol (EtOH) till en slutlig koncentration på 200 μM. Blanda väl, och häll maten omedelbart i tomma injektionsflaskor.
OBS: Undvik att lägga till alla trans-retinal till varm mat, detta kan resultera i mindre effektiva optogenetik. - Täck flaskor som innehåller stelnade livsmedel med pluggar eller bomullstussar. Linda flaskor med aluminiumfolie. Förvara sedan de mathaltiga flaskorna i ett mörkt, kallt rum.
- Använd 5 jungfruhonor och 5 hanar(figur 6A, generation P0) från rätt genotyp för att utföra kors på RT. Pass P0 till nya flaskor var 3–4:e dag. Samla nyligen sluten vuxen avkomma (generation F1)på en daglig bas och låt dem åldras i 7 upp till 14 dagar i aluminiumtäckta flaskor som innehåller 200 μM alla trans-retinal i flugmat.
- Samla flugor genom att knacka dem från matinnehållande flaskor i en tom injektionsflaskan utan mat. Kyl flaskan ner i ishaltigt vatten i ca 30 s. Flugor kommer att somna. Sätt enskilda flugor snabbt i små kammare täckta med en täckbild (figur 3B).
OBS: Så fort flugorna värms upp vaknar de. Det är viktigt att snabbt sprida enskilda flugor till enstaka kammare vardera. Undvik CO2 kuddar för att söva flugor, detta kommer att påverka deras beteende. - Utför optogenetik för att framkalla antennal grooming. Här består protokollet av följande intervall: 30 s där den röda lampan saknas, följt av 10 s rödljusexponering vid 10 Hz. Upprepa detta förfarande tre gånger totalt, följt av ytterligare 30 s intervall där det röda ljuset saknas12,29,30.
OBS: Detta protokoll kan justeras enligt den experimentella preferensen. - Samla enskilda flugor från varje kammare på CO2 kuddar. Utsätta dem för skador. Ablate både vänster och höger2: a antennal segment(figur 2C). Detta kommer att ta bort cellkropparna av Johnstons organ (JO) nervceller, medan axonalprojektionerna finns kvar i CNS. Återvinn flugorna i aluminiumtäckta injektionsflaskor som innehåller 200 μM alla trans-retinal.
OBS: För antennal grooming framkallas av optogenetik, är sensoriska neuron cell organ inrymt i 2nd antennal segmentet(figur 2C). - Vid motsvarande tidpunkter (t.ex. 7 dagar efter antennal ablation), flyger föremål till en annan grooming analys (gå tillbaka till steg 3.2.4).
- Smält flugmat i en mikrovågsugn. Efter att maten svalnat, innan stelning, tillsätt 1:100 av 20 mM alla trans-retinal i etanol (EtOH) till en slutlig koncentration på 200 μM. Blanda väl, och häll maten omedelbart i tomma injektionsflaskor.
Figur 3: Optogenetisk inställning för att inducera grooming som en avläsning för axon- och synapsfunktion. (A)Illustration av monterade komponenter som krävs för optogenetik. Infraröd (IR) LED-strålkastare, kamera och röd LED-strålkastare (från vänster till höger). Komponenterna inklusive en detaljerad beskrivning visas i tabellen över material. (B)Top view illustration av ett beteende kammare inklusive en IR-sändare för att ange röd LED spotlight aktivering. (C)Illustration av en enda monteringsinställning. Totalt tre monteringsinställningar krävs för de två LED-strålkastarna respektive kameran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representative Results
Ovan beskrev vi tre metoder för att studera morfologi och funktion av avskurna axoner och deras synapser. Den första metoden möjliggör högupplöst observation av enskilda axoner i PNS. Det kräver kloner som genereras av MARCM teknik14,31. Här utförde vi kors för att generera vild typ och highwire mutant MARCM kloner (Figur 4A). Ett enkelt snitt i mitten av vingen inducerar axonskada av nervceller inrymt distala (t.ex. på den yttre sidan av vingen), medan proximala nervceller (t.ex. mellan den skurna platsen och bröstkorgen) förblir oskadd. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att observera axondöd sida vid sida av oskadade kontrollaxoner i samma nervbunt (figur 1A, figur 4B). Här använde vi en genetisk bakgrund som resulterade i lågt antal GFP-märkta kloner (t.ex. två i varje experiment14). Vi presenterar exempel på 1 och 7 dagar efter skada av vild typ axoner, att ge exempel på kontroll axons, axons genomgår axon död och axonal fragment rensas av omgivande glia, respektive. Dessutom upprepade vi axonal skada i highwire mutanter där vi analyserade resultatet 7 dagar efter skada.
Oskadade kontrollvingar hyser två vildtypskloner, alltså två GFP-märkta vildliknande axoner (figur 4B, vild typ, oskadd kontroll). En dag efter att ha skurit mitten av vingen med hjälp av mikrosax, axon död induceras i GFP-märkta axoner där cellkroppar är distala till snittet platsen, medan axoner från proximally inrymt cell organ fungera som en intern kontroll inom samma nerv bunt(figur 4B, vild typ, 1 dag efter skada). Observera den axonalskräp spår i den övre delen anges av pilen. 7 dagar efter axonal skada, GFP-märkt axonal skräp rensas av omgivande glia, medan GFP märkt oskadd kontroll axoner kvar i nervbunten (Figur 4B, vild typ, 7 dagar efter skada, pil). Däremot är highwire mutanta axoner som har avbrutits i 7 dagar morfologiskt bevarade, överensstämmer med tidigare resultat11,14 (figur 4B, highwire, 7 dagar efter skada, pil). Dessa resultat visar den kraftfulla visuella upplösningen av Drosophila vingen. Axon död kan observeras sida vid sida av oskadade kontroller i samma nerv bunt. Medan vilda axoner genomgår axondöd inom 1 dag efter skada och det resulterande skräpet rensas inom 7 dagar, förblir axondödbristhighwiremutanter morfologiskt bevarade i 7 dagar.
Figur 4: Metod för att studera axon död GFP-märkta sensoriska neuron axons i vingen. (A)Schematiska kors för att generera vild typ och highwire kloner i vingen (P0 och F1 generation, respektive). Jungfruhonorna är till vänster, hanar till höger. Se Innehållsförteckning för genotypdetaljer. (B)Exempel på kontroll och skadade GFP-märkta axoner. Synfältet anges i (figur 1A). Från vänster till höger: oskadade vilda typ kontroll axons, vild typ axons 1-dagars efter skada, vild typ axons 7 dagar efter skada, highwire mutant axons 7 dagar efter skada, respektive. Pilar indikerar avhuggna axoner, Skala bar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den andra metoden beskriver hur man visualiserahela axonbuntar som projicerar i CNS där de bildar synapser, som tillhör nervceller inrymt i både vänster och höger antenner (figur 2A-C). Här utförde vi kors för att generera vild typ och highwire mutant MARCM kloner (Figur 5A). Oskadade, GFP-märkta axoner och deras synapser kan visualiseras under dagarna till veckorna, i avsaknad av skada (figur 5B, Wild typ, oskadd kontroll). Alternativt kan djur utsättas för3: e antennsegment ablation, och avhuggna GFP-märkta axoner och deras synapser kan observeras under en tid kurs över timmar till dagar. Vi fokuserade på 7 dagar efter den här tiden har axoner och deras synapser genomgått axondöd, och resulterande skräp rensas av omgivande glia. Om ensidig ablation av rätt antenn utförs, då den högra axon bunt en avskuren och kommer att demontera och den resulterande skräp är helt rensas 7 dagar efter skada(figur 5B, vild typ, ensidig ablation, 7 dagar efter skada, pilar), överensstämmer med tidigare resultat13. Alternativt kan både höger och vänster antenner ablated, som kommer att bryta både axon buntar, och 7 dagar efter skada, axons och deras synapser försvann(figur 5B, vild typ, bilaterala ablation, 7 dagar efter skada, pil). Däremot ensidig ampning av rätt antenner i highwire mutanter resulterar i avhuggna axoner som förblir bevarade 7 dagar efter skada, överensstämmer med tidigare resultat11,14 (Figur 5B, highwire, ensidig ablation, 7 dagar efter skada, pil). Dessa resultat visar att avhuggna vilda typ axoner genomgår axon död och den resulterande skräp rensas inom 7 dagar, medan axon död bristfällig highwire mutanter misslyckas med att genomgå axon död och förblir morfologiskt bevaras i 7 dagar.
Figur 5: Metod för att studera axon död GFP-märkta sensoriska neuron axons i hjärnan. (A)Schematiska kors för att generera vild typ och highwire kloner i hjärnan (P0 och F1 generation, respektive). Jungfruhonorna är till vänster, hanar till höger. Se Innehållsförteckning för genotypdetaljer. (B)Exempel på kontroll och skadade GFP-märkta axoner. Från vänster till höger: oskadade vilda typ kontroller, vild typ 7 dagar efter ensidigantennal ablation, vild typ 7 dagar efter bilaterala antennal ablation, och highwire mutanter 7 dagar efter ensidiga antenn ablation, respektive. Pilar indikerar avhuggna axonbuntar, Skala bar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den tredje metoden gör det möjligt att observera funktionellt bevarande av avhuggna axoner och deras synapser i CNS. Den bygger på manipulering av en delmängd av JO nervceller inrymt i 2nd antennal segmentet som är tillräckliga för att inducera antennal grooming. Uttryck för en röd-skiftade channelrhodopsin (CsChrimson) i JO nervceller, i kombination med kosttillskott av alla trans-retinal, är tillräckligt för att framkalla en enkel post-synaptisk grooming beteende vid rött ljus exponering12,30. Här utförde vi kors för att generera vilda typ JO nervceller, och JO nervceller över-uttrycka dnmnat (dnmnatOE) (Figur 6A). Vild typ flugor eller flugor som innehåller JO nervceller med försvagad axon död (dnmnatOE), båda hyser en potent grooming beteende före skada. Men 7 dagar efter skada (t.ex. bilateral ablation av 2nd antennal segmentet), grooming inte framkallas av optogenetik i vild typ flugor på grund av skada-inducerad axon och synapse degeneration, medan djur med försvagad axon död fortsätter att brudgummen(figur 6B, Film 1,2). Försvagad axondöd kan därför funktionellt bevara avhuggna axoner och deras synapser i 7 dagar.
Bild 6: Metod för att visualisera axonal och synaptisk funktion efter axotomy. (A) Schematiska kors för att generera vild typ och dnmnat över-uttrycker JO sensoriska nervceller (P0 och F1 generation, respektive). Jungfruhonorna är till vänster, hanar till höger. Se Innehållsförteckning för genotypdetaljer. (B)Individuella etogram av grooming beteende framkallas av optogenetik. Topp: enskilda etogram av vild typ flyger före och 7 dagar efter skada (blå). Botten: enskilda etogram flugor över-uttrycker dnmnat (dnmnatOE) i JO nervceller före och 7 dagar efter skada (röd). Varje lagerplats anger minst 1 grooming beteende inom 1 s. Den svarta linjen anger summan av alla lagerplatser. (C)Kvantifiering av grooming beteende. Data visas som genomsnittlig ± standardavvikelse, p > 0,001 (enkelriktad ANOVA, flera jämförelser med Tukeys efter hoc-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Representativt vilttypgroomingbeteende som framkallats av optogenetik före och 7 dagar efter den andra styggelsen. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Film 2: Representativt groomingbeteende framkallat av optogenetik i flugor över-uttrycker dnmnat i JO nervceller före och 7 dagar efter antennal ablation. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
De protokoll som beskrivs här möjliggör robust och reproducerbar observation av morfologi samt funktion av axoner och deras synapser separerade från sina cellkroppar i Drosophila. Vinganalysen underlättar observationen av axondöd sida vid sida av oskadade kontrollaxoner i PNS14, medan den antennala analysen underlättar observationav hela nervbuntar av GFP-märkta axoner och deras synapser, för att bedöma både morfologi och funktion i hjärnan (CNS)12. Det finns kritiska steg och vissa fördelar för varje metod för att studera morfologi som måste beaktas vid utformningen av experiment.
För att observera axonmorfologi i PNS i vingen, experiment kan lätt utföras, på grund av insynen i vingen: det gör det möjligt att kringgå dissekering och immunohistochemistry. Men på grund av bristen på fixering måste vingarna avvisas omedelbart efter montering14. För närvarande är två distinkta Gal4 förare används ofta, antingen ok371Gal4 eller dpr1Gal4, och båda referenserna erbjuder olika metoder för att kvantifiera degeneration14,26. Gles märkning av några nervceller rekommenderas, med hjälp av "Mosaic Analys med en förtrycklig cell Markör (MARCM)"14,31, som upplösningen av axonal morfologi saknar motstycke. Däremot är observation av synapser inte möjligt i vingar, de ligger i den ventrala nervsladden inuti flugornas bröstkorg. Dessutom kan ytterligare axonalmarkörer inte visualiseras genom immunohistokemi: den vaxartade nagelbanden gör det omöjligt för spridning av fixativ och antikroppar i den underliggande vävnaden.
För att observera axon och synapsmorfologi i CNS måste hjärndissektioner utföras. De erbjuder fördelen att visualisera ytterligare axonal och synaptiska markörer med hjälp av immunohistochemistry, och synapser kan observeras tillsammans axoner i samma synfält10,13. En stor samling av kännetecknas luktreceptorn (ORN) Gal4 drivrutiner är lätt tillgängliga32, och ofta, OR22aGal4 är föraren val. För antennal ablation, cellkroppar av OR22a nervceller är inrymt i3: e segmentet (figur 2B). En fluorescensintensitetsbaserad kvantifiering används för att kvantifiera degeneration av antingen axoner eller synapser13. Omvänt, experiment är tidskrävande på grund av hjärnan dissekering och antikroppar färgning.
För att visualisera axonal och synaptisk funktion efter axotomy, optogenetik används för att utlösa antennal grooming: det fungerar som en avläsning för funktionellt bevarande av avhuggna axoner och deras synapser12. Groomingkretsen och motsvarande sensoriska, inter- och motoreuron Gal4-förare har beskrivits noggrant29,30. GMR60E02Gal4 etiketter en delmängd av Johnston's organ (JO) sensoriska nervceller, som krävs och tillräckligt för grooming29,30. För antennal ablation, cellkroppar av JO nervceller är inrymt i 2antennal segmentet (Figur 2B). En optogenetisk inställning kan lätt byggas från grunden, eller en befintlig inställning justeras. Viktigt, experiment måste utföras i ett mörkt rum, och flyger därmed visualiseras med en infraröd (IR) LED spotlight. När du använder CsChrimson som kanal är det viktigt att förse maten med all trans-retinal och en röd LED-strålkastare för att aktivera JO nervceller29. Alternativt kan blå ljuskänsliga kanaler och en blå LED-strålkastare, eller TrpA1-kanalen och temperaturen användas för neuronal aktivering29,33. Kvantifieringen av grooming beteende har redan beskrivits12,29.
När dessa analyser används för att specifikt studera axon död, är det viktigt att notera att fenotyp av morfologisk eller funktionell bevarande bör vara robust över tiden. Det finns fall där axon död leder till en konsekvent men mindre uttalad fenotyp i morfologisk bevarande34,35, och om en sådan fenotyp översätter till funktionellt bevarande återstår att bestämma.
Axon död fenotyper har också observerats i nervceller under utvecklingen av Drosophila larver, där nerver krossades snarare än skadade11,23. Här fokuserade vi specifikt på vuxna Drosophila nervceller som avslutade utvecklingen. I detta sammanhang kan användningen av RNA-störningar36, eller vävnadsspecifik CRISPR/Cas937 lätt genomföras. Viktigt, ovanstående tekniker kan användas i en axon död oberoende sammanhang: de underlättar karakterisering av neuronala underhållsfaktorer38, axonal transport39, åldersberoende axonal mitokondrierna förändringar40, och morfologi av axonal mitokondri41.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka hela Neukomm labbet för bidrag. Detta arbete stöddes av en Swiss National Science Foundation (SNSF) biträdande professor utmärkelse (bidrag 176855), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP, grant P180), SNSF Spark (bidrag 190919) och genom stöd från universitetet i Lausanne och institutionen för grundläggande neurovetenskaper (État de Vaud) till LJN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers (high precision, ultra fine) | EMS | 78520-5 | Antennal ablation |
| MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) | EMS | 72933-04 | Wing injury |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086.0000 | |
| 35mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900 | |
| Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific™ | BB02400600A113MNT0 | |
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientific™ | AA00008032E00MNT10 | |
| High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter | Thorlabs | DCC1240M | Camera setup |
| SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
| 25mm 1/1.2" C mount Lens | Tamron | M112FM25 | |
| Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A36 | |
| Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
| Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm | Thorlabs | FELH0700 | |
| SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
| SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M10 | |
| 850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M850L3 | IR LED spotlight |
| SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
| SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
| Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
| Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm | Thorlabs | FELH0850 | |
| SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
| 660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M660L4 | Red LED spotlight |
| Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
| SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
| SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube | Thorlabs | KPS101 | LED control |
| T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | Thorlabs | LEDD1B | |
| 150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps | Thorlabs | MB1530/M | Mount base |
| Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm | Thorlabs | UPH75/M | Mount, 3x (IR LED, red LED, cam) |
| Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap | Thorlabs | SM1RC/M | |
| Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm | Thorlabs | TR150/M | |
| Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm | Thorlabs | TR40/M | |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex | Thorlabs | RA90/M | |
| M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 | Thorlabs | SH6MS16 | screws for mount onto base |
| USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx | National Instruments | 782604-01 | Red LED spotlight controller |
| 20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer | TT Electronics/BI | P230-2EC22BR20K | fintuner for indicator |
| IR (860nm) emitter, 100 mA radial | Osram | 475-1365-ND | Red light indicator |
| cable | - | - | Misc |
| All-trans retinal | Sigma | R2625 | |
| Ethanol absolute | Vwr | 20821.296 | |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Mowiol | Merk | 81381 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | F8775 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning Corp | 4019862 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning Corp | 4019862 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Chicken anti-GFP antibodies | Rockland | 600-901-215 | Antibodies |
| Goat Dylight anti-Chicken | Abcam | ab96947 | |
| FM7a, B | BDSC | RRID:BDSC_785 | X chromosome |
| FRT19A[hs-neo] | BDSC | RRID:BDSC_1709 | |
| hiw[ΔN] | BDSC | RRID:BDSC_51637 | |
| hs-FLP[12] | BDSC | RRID:BDSC_1929 | |
| tub-Gal80[LL1] | BDSC | RRID:BDSC_5132 | |
| w[1118] | BDSC | RRID:BDSC_3605 | |
| 20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus | BDSC | RRID:BDSC_55135 | 2nd chromosome |
| 5xUAS-Gal4[12B] | Kyoto | RRID:Kyoto_108492 | |
| 5xUAS-HA::dnmnat | BDSC | RRID:BDSC_39702 | |
| 5xUAS-mCD8::GFP[LL5] | BDSC | RRID:BDSC_5134 | |
| ase-FLP[2d] | Freeman laboratory | Neukomm et al., 2014 (PNAS) | |
| CyO | BDSC | RRID:BDSC_2555 | |
| dpr1-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_25083 | |
| OR22a-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_9952 | |
| ey-FLP[6] | BDSC | RRID:BDSC_5577 | 3rd chromosome |
| GMR60E02-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_39250 | |
| TM3,Sb,e | BDSC | RRID:BDSC_3644 |
References
- Matsuda, W., et al. Single Nigrostriatal Dopaminergic Neurons Form Widely Spread and Highly Dense Axonal Arborizations in the Neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Wedel, M. J. A Monument of Inefficiency: The Presumed Course of the Recurrent Laryngeal Nerve in Sauropod Dinosaurs. Acta Palaeontologica Polonica. 57 (2), 251-256 (2012).
- Mariano, V., Domínguez-Iturza, N., Neukomm, L. J., Bagni, C. Maintenance mechanisms of circuit-integrated axons. Current Opinion in Neurobiology. 53, 162-173 (2018).
- Conforti, L., Gilley, J., Coleman, M. P. Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease. Nature reviews Neuroscience. 15 (6), 394-409 (2014).
- Neukomm, L. J., Freeman, M. R. Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration. Trends in Cell Biology. 24 (9), 515-523 (2014).
- Gustavsson, A., et al. Cost of disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology: The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 21 (10), 718-779 (2011).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 (1850).
- Rosell, A. L., Neukomm, L. J. Axon death signalling in Wallerian degeneration among species and in disease. Open Biology. 9 (8), 190118 (2019).
- Mack, T. G., et al. Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene. Nature Neuroscience. 4 (12), 1199-1206 (2001).
- Osterloh, J. M., et al. dSarm/Sarm1 is required for activation of an injury-induced axon death pathway. Science. 337 (6093), New York, NY. 481-484 (2012).
- Xiong, X., et al. The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein. PLoS Biology. 10 (12), 1001440 (2012).
- Neukomm, L. J., et al. Axon Death Pathways Converge on Axundead to Promote Functional and Structural Axon Disassembly. Neuron. 95 (1), 78-91 (2017).
- MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
- Neukomm, L. J., Burdett, T. C., Gonzalez, M. A., Zuchner, S., Freeman, M. R. Rapid in vivo forward genetic approach for identifying axon death genes in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (27), 9965-9970 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nature Communications. 8, 14355 (2017).
- Lunn, E. R., Perry, V. H., Brown, M. C., Rosen, H., Gordon, S. Absence of Wallerian Degeneration does not Hinder Regeneration in Peripheral Nerve. The European Journal of Neuroscience. 1 (1), 27-33 (1989).
- Adalbert, R., et al. A rat model of slow Wallerian degeneration (Wld(S)) with improved preservation of neuromuscular synapses. The European Journal of Neuroscience. 21 (1), 271-277 (2005).
- Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137 (23), Cambridge, England. 3985-3994 (2010).
- Feng, Y., et al. Overexpression of Wld(S) or Nmnat2 in Mauthner Cells by Single-Cell Electroporation Delays Axon Degeneration in Live Zebrafish. Journal of Neuroscience Research. 88 (15), 3319-3327 (2010).
- Gilley, J., Coleman, M. P. Endogenous Nmnat2 is an essential survival factor for maintenance of healthy axons. PLoS Biology. 8 (1), 1000300 (2010).
- Babetto, E., Beirowski, B., Russler, E. V., Milbrandt, J., DiAntonio, A. The Phr1 ubiquitin ligase promotes injury-induced axon self-destruction. Cell Reports. 3 (5), 1422-1429 (2013).
- Gerdts, J., Summers, D. W., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. Sarm1-mediated axon degeneration requires both SAM and TIR interactions. The Journal of Neuroscience. 33 (33), 13569-13580 (2013).
- Gerdts, J., Brace, E. J., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction. Science. 348 (6233), New York, NY. 453-457 (2015).
- Bridge, P. M., et al. Nerve crush injuries--a model for axonotmesis. Experimental Neurology. 127 (2), 284-290 (1994).
- Maxwell, W. L., Bartlett, E., Morgan, H. Wallerian Degeneration in the Optic Nerve Stretch-Injury Model of Traumatic Brain Injury: A Stereological Analysis. Journal of Neurotrauma. 32 (11), 780-790 (2015).
- Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity. Current Biology. 22 (7), 590-595 (2012).
- Janelia Farm Adult Drosophila Brain Dissection. , Available from: https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols (2015).
- Cold Spring Harbor. Mowiol mounting medium. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. eLife. 3, 02951 (2014).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. eLife. 4, 08758 (2015).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102 (2), 147-159 (2000).
- Hampel, S., McKellar, C. E., Simpson, J. H., Seeds, A. M. Simultaneous activation of parallel sensory pathways promotes a grooming sequence in Drosophila. eLife. 6, (2017).
- Farley, J. E., et al. Transcription factor Pebbled/RREB1 regulates injury-induced axon degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 23 (6), (2018).
- Wang, H., et al. Rapid depletion of ESCRT protein Vps4 underlies injury-induced autophagic impediment and Wallerian degeneration. Science Advances. 5 (2), 4971 (2019).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. bioRxiv. 102, 636076 (2019).
- Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. Journal of Cell Science. 129 (1), 178-190 (2016).
- Vagnoni, A., Bullock, S. L. A cAMP/PKA/Kinesin-1 Axis Promotes the Axonal Transport of Mitochondria in Aging Drosophila Neurons. Current Biology. 28 (8), 1265-1272 (2018).
- Cao, X., et al. In vivo imaging reveals mitophagy independence in the maintenance of axonal mitochondria during normal aging. Aging Cell. 16 (5), 1180-1190 (2017).
- Smith, G. A., et al. Glutathione S-Transferase Regulates Mitochondrial Populations in Axons through Increased Glutathione Oxidation. Neuron. 103 (1), 52-65 (2019).
