Summary
כאן אנו מציגים שני קל לבצע צעד אחר צעד פרוטוקולים עבור מקום העדפה תבניות באמצעות אלקטרואופטיקה בעכברים. שימוש אלה שתי כיוונונים, העדפה התנהגות הימנעות יכול להיות מוערך באופן יציב בתוך אותו מכשיר עם מרחבי המרחב הגבוה ובסלקטיביות הטמפורלית, ובצורה ישירה.
Abstract
הבנת האופן בו הפעלה עצבית מובילה לפלט התנהגותי מסוים מהווה יסוד למוח המדעי המודרני. שילוב אלקטרואופטיקה במכרסמים עם בדיקות התנהגותיות בתבניות מאומתות מאפשר את המדידה של השלכות התנהגותיות על גירוי של נוירונים ברורים בזמן אמת עם מרחבי המרחב הגבוה ובסלקטיביות הטמפורלית, ולכן הקמתה של יחסים סיבתיים בין הפעלה והתנהגות עצבית. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור העדפה מקום בזמן אמת (RT-PP) הפרדיגמה, גרסה משתנה של העדפה מקום ממוזג הקלאסי (CPP) מבחן. RT-PP מבוצע במנגנון שלושה תאים והוא יכול להיות מנוצל כדי לענות אם הגירוי אלקטרואופטיקה של אוכלוסיה עצבית ספציפית הוא מתגמל או מקבל. אנו מתארים גם גרסה חלופית של פרוטוקול RT-PP, העדפה כביכול תא נייטרלי (NCP) פרוטוקול, אשר ניתן להשתמש כדי לאשר סלידה. שתי הגישות מבוססות על הרחבות של מתודולוגיה קלאסית שמקורם פרמקולוגיה התנהגותית ויישום האחרונות של אלקטרואופטיקה בתוך שדה מדעי המוח. מלבד מדידת העדפה למקום בזמן אמת, כיוונונים אלה יכולים גם לספק מידע לגבי התנהגות ממוזגת. אנו מספקים הפרוטוקולים קל לבצע צעד אחר צעד לצד דוגמאות של הנתונים שלנו ולדון היבטים חשובים לשקול בעת החלת סוגים אלה של ניסויים.
Introduction
יישום אלקטרואופטיקה, כלי מדעי המוח המודרני שבו האור משמש כדי לשלוט בפעילות העצבית, יש בשנים האחרונות הוביל התפתחויות גדולות להבין כיצד אוכלוסיות נוירואליות ספציפיות ההשפעה התנהגות1,2,3. בסלקטיביות המרחבית והטמפורלית היוצאת דופן של אלקטרואופטיקה מאפשרת הקמת קשרים סיבתיים בין עירור או עיכוב של קבוצות תאים בעלי עניין ותפוקה התנהגותית2,3. סלקטיביות מרחבית באלקטרואופטיקה מובטחת בדרך כלל באמצעות מערכת היצור-לקס, בה הפעילות של הrecombinase מובילה לשילוב מחדש של כל רצפי DNA הקיימים בין אתרי לקס, כך שנקרא אלטלס (מוקף באתרי לקס)4. המטרה עם שימוש במערכת היצור-לקס ב אלקטרואופטיקה היא להשיג ביטוי של אלטלס קידוד אלקטרואופטיקה opsins בנוירונים ספציפיים של עניין תוך השארת הנוירונים המקיפים נטול הבעה. אופינים הם חלבונים רגישים לאור, כי על גירוי באור של זרימה ספציפית גל מאפשר זרימת יון המשפיעה על היכולות הנוירולוגיות או להשפיע על פונקציות הסלולר על ידי מודולים במורד הזרם מסלולים. הרומן גרסאות של opsins שונים בפעולה (ההתרגשות, מעכבות, מודולקקים), מנגנון, הפעלה על ידי גל אור ונכסים הקינטיקה5 מפותחים ברציפות כדי לענות על הצרכים של גישות ניסיוני ספציפיים. לגבי ההתרגשות, באמצעות הקיטוב או הפרקטליציה אופסין מכתיב את הפעילות של הנוירונים (עירור או עיכוב, בהתאמה) על גירוי באור באורך גל מסוים שנמסר למוח3.
פעילות מיזם סלקטיבי מכוונת את הביטוי של היצור recombinase על נוירונים הריבית. על-ידי יישום אלל מופפף של אופסין של עניין, שילוב מתווך של היצור-בתיווך יבטיח כי אופסין מתבטאת באופן סלקטיבי בנוירונים כי שיתוף מבטא היצורים recombinase3,6. שימוש זה של transgenics כפול כדי להפנות סלקטיביות מרחבית הוכיחה יעיל מאוד אלקטרואופטיקה. כך, בעוד אור גירוי כדי להפעיל את הopsins מועברת באופן כללי באמצעות סיבים אופטיים מושתל מתחת לפני מקור אור (LED או לייזר)3, רק נוירונים ביטוי הן היצורים הrecombinase ואת האופרים opsins אלל יגיב גירוי זה. מערכת היצור-לקס במכרסמים יכולה להיות מושגת בדרכים שונות על-ידי שימוש רק ב-transgenics (שני היצורים הrecombinase והמבנה המאופפף מקודד בבעלי חיים טרנסגניים), רק זריקות ויראליות (בנייה DNA עבור הrecombinase היצור ואת אופסין שניהם מועברים באמצעות מנשא ויראלי), או שילוב של שניים (למשל, היצור recombinase מקודד על ידי בעלי חיים טרנסגניים אשר הוזרק עם וירוס נושא את המבנה אופסין)5. בניית ה-DNA המנופטת משובטת בדרך כלל במסגרת עם גן עיתונאי כדי לאפשר ויזואליזציה של השילוב של היצור-תיווך מחדש במקטעי רקמות. בעוד אלקטרואופטיקה ניתן גם לבצע חולדות, הפרוטוקולים המוצגים נוצרו עבור עכברים. למען הפשטות, עכברים הנושאים הן את הrecombinase והאופסין הפלופסטית יהיו מכונים "עכברים אופגנטיקה". בפרוטוקולים המתוארים להלן, העכברים אלקטרואופטיקה נוצרו על ידי טרנסגניים מעורבים (recombinase היצורים תחת שליטה של שני היזמים שונים) ו ויראלי (באמצעות וירוס הקשורים adeno, aav, כדי לספק את אופסין בניית ה-DNA במקרה שלנו ChR2/H134R) הגישה. השגת ושמירה על קווי העכבר הטרנסגניים היא חלק חיוני של המתודולוגיה. יצור-מנהל התקן ומלא מראש עכברים טרנסגניים ניתן לייצר עבור כל מטרה, או לרכוש אם זמין מסחרית, כמו גם מגוון של וירוסים הנושאים רצפי DNA קידוד recombinase ומלא מופדרים בצורות שונות.
אלקטרואופטיקה בשילוב עם בדיקות התנהגותיות הוכיחה להיות כלי רב ערך כדי ללמוד את התפקיד של אזורי המוח ברורים, או אוכלוסיות נוירואליות דיסקרטית, בסוגים מסוימים של התנהגות. בהקשר של התנהגות הקשורה לתגמול, אלקטרואופטיקה אפשרה אימות של ממצאים קודמים בתחומים של פרמקולוגיה התנהגותית ופסיכולוגיה ניסיוני, וגם מותר רמה חדשה של הניתוח הרלוונטי באופן זמני לתוך איך נוירונים מסוימים משפיעים על התנהגות. שיטה אחת שבה נעשה שימוש במספר מחקרים כדי להעריך התנהגות הקשורה לתגמול היא גרסה משתנה של השיטה הקלאסית המכונה העדפה מקום ממוזג (CPP). ה-CPP הקלאסית שימש להערכת המאפיינים המתגמלת או המזיקים של תרופות להתעללות באמצעות יכולתם לגרום לאסוציאציות פבלוביאן עם רמזים של הסביבה7,8. במונחים של פבלובי, הסם הוא גירוי ממוזג מאחר שהוא יכול לעורר גישה או נסיגה אם הוא מתגמל או מרוגש, בהתאמה. זיווג רציף של הסם עם גירויים ניטרליים שונים, שעצמם אינם מסוגלים לגרום לשום תגובה, יכול להוביל לגישה או לנסיגה רק בעת הצגת הנייטרלי הקודם, אך לאחר הזיווג, כך שנקרא גירוי ממוזג 9. ניתוח CPP מבוצע בדרך כלל במנגנון המכיל שני תאים באותו גודל, אך היכן שכל תא מוגדר על-ידי מאפיינים שונים, כגון מרקם הרצפה, דפוסי קיר ותאורה (גירויים ניטרליים). שני התאים מחוברים או באמצעות מסדרון או פתח בין התאים. במהלך המיזוג, הנושא, בדרך כלל מכרסם קטן, מקבל זריקות פסיבי של תרופה תוך הגבלת אחד משני התאים העיקריים ומלוחים תוך הגבלת התא השני. השפעות מתגמלת של הסם מוערך לאחר מכן בהפעלה ללא סמים כאשר הנושא מותר לחקור בחופשיות את המנגנון כולו. כמות הזמן שהושקע בחלקה הקודם של הסמים (התגובה הממוזגת) נחשבת למשקפים את מנגנוני הלמידה של פבלוביאן בתיווך בין ההשפעות המועלות של הסם לבין הרמזים של התא הקשור לניהולו (גירוייםממוזגים ). אם בעל החיים מבלה יותר זמן באגף התרופות, התרופה הפכה להעדפה מקום ממוזג, כלומר יש לה השפעות מתגמלת על התנהגות. מצד שני, אם התרופה נתפסת כאבן, החיה תמנע את תא התרופות, ותבלה יותר זמן בתוך תא מלוחים, המציין את המקום הממוזג שסלידה (רו"ח)8,9,10,11.
מאז ניתן ליישם אלקטרואופטיקה על מנת לשלוט בפעילות העצבית ב"זמן אמת", השימוש בפרדיגמה התנהגותית הדומה, אך בנפרד ממנה, הגדרת ה-CPP מאפשרת מדידה של העדפת מקום על הפעלה כפתלית ישירה. אלקטרואופטיקה-ניתוח מונחה של העדפה מקום הוא אפוא המכונה לעתים קרובות העדפה מקום בזמן אמת (RT-PP) הפרדיגמה ניתוח. ב הפרדיגמה RT-PP, הגירוי האלקטרואופטיקה של נוירונים ברורים באמצעות מערכת היצור-לקס מחליף את המסירה הסיסטמית של תרופה שבוצעה ב-CPP הקלאסית, כך הפרדיגמה RT-PP במקום מדדים אם אלקטרואופטיקה המושרה גירוי עצבי הוא נתפסת כתגמול או מתגמל. התיאור הנוכחי יתמקד בעכברים אלקטרואופטיקה, אבל גם עכברים אלקטרואופטיקה ניתן לבדוק באמצעות פרוטוקולים דומים.
במקום להיות ממוזג לתא אחד בכל פעם כמו בפרדיגמה הקלאסית של CPP, העכבר אלקטרואופטיקה בפרדיגמה RT-PP מותר לנוע בחופשיות במנגנון כולו והתנהגות נרשם במהלך המפגש. הכניסה לאחד התאים מזווג עם גירוי בתוך האור התוך-גולגולתי. תחת פרמטרים מתאימים של גירוי באור, הנוירונים המבטאים את ההתרגשות המתבטאים יהיו מופעלים. אם גירוי האור נתפס כמו מתגמל, העכבר אלקטרואופטיקה יישאר בתא לזווג אור, בעוד אם הגירוי האור נתפסת כמו הסחף, העכבר יהיה לצאת מהתא כדי להימלט גירוי. סוג זה של ניתוח מאפשר הערכת למידה מותנית: הנושא יכול לעורר גירוי באור ולכן הפעלה עצבית על-ידי הזנת תא, ולעצור את הגירוי על-ידי יציאה מהתא, בדומה להקשה במנוף במהלך משימה אינסטרומנטלית. יתרה מזאת, ניתן להעריך מנגנוני למידה אסוציאטיביים במהלך המפגשים הבאים, בהם הזמן המושקע בכל תא נמדד בהעדר גירוי. בדרך זו, החוקר יכול לנתק בין ההשפעות מתגמל מיד על גירוי הנוירונים של הריבית ואת היווצרות זיכרון אסוציאטיבית הקשור אליו12.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים שני ההתקנה צעד אחר צעד פרוטוקולים עבור אלקטרואופטיקה מונחה העדפה מקום התנהגות של עכברים נע בחופשיות. הפרוטוקול הראשון מתאר RT-PP בתוך מנגנון שלושה תאים והוא מתואר בהתבסס על הפרוטוקולים שהוצגו לאחרונה על ידי השורש ועמיתיו13 וסופרים אחרים12,14,15,16,17,18. הניסוי מורכב משני שלבים המהווים מספר מפגשים יומיים (המוצגים באיור 1A). כל מפגש מיועד למטרות שונות והפרמטרים של גירוי צימוד עם תא מוחלפים בהתאם. המפגש הראשון, "Pretest", משמש כדי להעריך את ההעדפה הראשונית של הנושא על אחד התאים. בעודו מחובר לכבל התיקון, הנושא רשאי לחקור באופן חופשי את המנגנון בהעדר גירוי במשך 15 דקות. אם ההעדפה הראשונית לכל תא אחד היא יותר מ-80%, העכבר לא נכלל בניתוח מאז הטיית הצד ההתחלתי עשויה להטות את הניתוח. לאחר "Pretest", "שלב 1" מתחיל. החלק הראשון מורכב משני רצופים, יומי, 30 דקות הפעלות של "RT-PP". במהלך "שלב 1", העכבר אלקטרואופטיקה מחובר למקור לייזר דרך כבל התיקון והניח בזירה כדי לחקור באופן חופשי. העכבר מקבל גירוי לייזר בתוך גולגולתי עם כניסה לתוך אחד התאים העיקריים. ניסויים פיילוט ניתן לבצע כדי לקבוע איזה תא יוקצה כמו לייזר לזווג ואשר בלתי מזווג. אם הגירוי מוצג להיות מתגמל, הלייזר יהיה משולב לתוך התא המועדף לפחות במהלך "Pretest" ואת המועדפת ביותר אם גירוי הוא מקבל. כך, את הפרוטוקול RT-PP הציג בעקבות עיצוב מוטה במובן זה גירוי לייזר אינו מוקצה באופן אקראי לכל אחד משני התאים העיקריים (עיצוב משוחדת), אבל הוא נבחר כדי למנוע כל העדפה הראשונית של העכבר. כניסה לתוך התא הראשי השני או תא נייטרלי חיבור שני התאים העיקריים אינו מעורר גירוי אור בתוך התוך התוך-גולגולתי ולכן הם לא מזווג אור. הפעלות אלה מאפשרות הערכה בזמן אמת של תכונות מתגמלת או מתגמל של גירוי של אוכלוסיות נוירואליות ספציפיות. ביום האחרון של "שלב 1", הפעלה של 15 דקות ללא גירוי מתרחש. מפגש זה משמש לטיפול בתגובות ממוזגות ("CR") הנובעות מלמידה אסוציאטיבית בין הגירוי לבין הסביבה שבה הוא התקבל. לפחות שלושה ימים לאחר "שלב 1", "שלב היפוך" מתרחש אשר מלווה באותו מבנה כמו "שלב 1", אבל התא הראשי בעבר לא לזווג משויך כעת עם גירוי באור. כמו במקרה של "שלב 1", שני הפעלות גירוי מלווה מפגש "CR". "שלב היפוך" משמש כדי לאשר את התנהגותו של העכבר מותנה על גירוי אלקטרואופטיקה ולא קשור פרמטרים אקראיים. כל מפגש של הניסוי RT-PP צריך להיות מתוכנת בנפרד בתוך תוכנת המעקב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הגדרות כאלה בתוך תוכנה מסוימת, אך ניתן להשתמש בכל תוכנת מעקב אחרת היכולה לשלוח אותות אפנון של טרנזיסטור-טרנזיסטור-לוגיקה (TTL) למקור האור.
הפרוטוקול השני מתאר הגדרת רומן הנקרא העדפה תא נייטרלי (NCP) הפרדיגמה. פרוטוקול זה שונה של RT-PP מנצל את הגודל הקטן והשקיפות של הפרוזדור המחבר אשר נמנע באופן טבעי על ידי העכבר בשל הרכב הצר שלה שקוף. על ידי זיווג שני התאים העיקריים עם גירוי באור רק עוזב את הפרוזדור ללא גירוי קל, ההתקנה NCP ניתן להשתמש כדי לבדוק אם גירוי אלקטרואופטיקה יאלץ את העכבר כדי לבלות יותר זמן במסדרון כדי למנוע קבלת גירוי מגנטי. על ידי השוואת הזמן שהושקע בשני התאים לזווג אור עם הזמן שהושקע בפרוזדור, אימות של שנאת אלקטרואופטיקה המושרה ניתן לעשות. הניסוי NCP מורכב משני מפגשים יומיים רצופים שבו עכברים אלקטרואופטיקה לקבל גירוי (30 דקות כל אחד) כדי למדוד העדפה בזמן אמת, ומושב אחד חינם לייזר (15 דקות) כדי להעריך תגובות ממוזגות בדומה לאלה ב-RT-PP פרוטוקול.
הפרוטוקולים RT-PP ו NCP שסופקו להלן אומתו לאחרונה במעבדה שלנו במחקר של איך סוגים שונים של נוירונים ממוקם באזור tegmental הגחוני (VTA) מעורבים בהיבטים שונים של התנהגות הקשורות תגמול12. כאן, כדי להדגים את היישום של ה-RT-PP ו NCP פרוטוקולים, דופמין טרנספורטר (DAT)-היצור19 ו-והוא גלוטמט המשלח 2 (VGLUT2)-היצור20 עכברים טרנסגניים היו סטריאוטקטית הוזרק באמצעות Aav CHANNELRHODOPSIN2 (ChR2) DNA לבנות לתוך vta ו סיבים אופטיים הושתל מעל vta. התגובות התנהגותיות התקבלו על ניתוח של עכברים אלה באמצעות RT-PP ופרוטוקולים NCP מראה כיצד הפעלה של הנוירונים הglutamatergic בתוך VTA מוביל תגובות התנהגותיות שונות (איור 1).
פרוטוקולים צעד-אחר-צעד עבור תבניות RT-PP ו NCP מסופקים עם מידע החל מגנוזה של עכברים טרנסגניים, זריקות נגיפי סטריאוטקליים מיקום, לתיכנות של תוכנות מעקב עבור בקרת לייזר והתנהגותיות ערכה. בנוסף, הצעות לשינויים בפרוטוקול במונחים של פרמטרים של גירוי והיבטים ניסיוניים שיכולים להשפיע על התוצאה המדעית נדונה. בעוד הפרוטוקולים מתוארים בהקשר של VTA, הם יכולים להיות מיושם על כל אזור המוח או אוכלוסיה עצבית, בתנאי הכלים הרלוונטיים אלקטרואופטיקה, כגון מנהל התקן של המין הרלוונטי, ו opsins מופלים, זמינים.
Protocol
מחקר זה בוצע באמצעות heterozygous DAT-היצור19 ו VGLUT2-היצורים20 עכברים של שני המינים, בגילאי > 8 שבועות ושקילה > 20 g. כל הניסויים נערכו על פי החוק השבדי (חוק הרווחה SFS 1998:56) והחקיקה של האיחוד האירופי (אמנת ETS 123 והוראה 2010/63/האיחוד האירופי) באישור הוועדות האתיות המקומיות לבעלי חיים.
1. הקלדת עכברים
- לקחת ביופסיות אוזניים באמצעות בניקוב אוזניים להשתמש כדי להקליד את העכברים הטרנסגניים.
- הכינו את האגרופים באוזן כדי לבצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) באמצעות התחל העשוי מטרה.
הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בצבעי היסוד המכוונים.- הוסף 75 μL של מאגר הליזה (מאגר 1:250 mM NaOH, 2 מ"מ EDTA) בכל שפופרת של 1.5 mL המכילה ניקוב אוזניים.
- דגירה בבלוק חימום ב 96 ° c עבור 30 דקות.
- תן את הדגימות להתקרר עבור 5 דקות ולאחר מכן להוסיף 75 μL של מאגר נטרול (מאגר 2:400 mM טריס-HCl pH 8.0).
- לבצע PCR על פי הנהלים הסטנדרטיים12,21 באמצעות התחל המתאים (כאן: היצורים FW 5 '-ACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA-3 ', היצור REV 5 '-accgacgatgagtttag-3 ').
התראה: העבודה על הקרח מתחת למכסה המנוע ולשים לב לא לזהם את הריאגנטים ואת הדגימות.- הכינו את המיקס הראשי של ה-PCR. הכפל את אמצעי האחסון הבאים בהתאם למספר הדגימות שאותן הולכים לנתח, כולל דגימות בקרה מתאימות. מערבבים את הריאגנטים עבור בודד 25 μL תגובה סופית בסדר הבא: מים מזוקקים (18.9 μL), מאגר 10x עם MgCl2 (2.5 μl), שילוב של 10 מילימטר dntp (0.5 μl), 10 μm קדימה פריימר (1 μl), 10 הפוכה μm פריימר (1 μl), 5 U/ΜL DNA פולימראז (0.1 μl), ו-dna תבנית (1 μl; יתווספו בשלבים הבאים).
הערה: הוסף תמיד שלילי, חיובי ושליטה ריקה (ללא תבנית DNA) כדי להבטיח תוצאות חוקיות. - הוסף 24 μL של ערבוב מאסטר בצינורות ה-PCR.
- הוסף 1 μL של ה-DNA תבנית (הנובע ממכת האוזן מכל עכבר) בכל צינור PCR.
- צנטריפוגה את צינורות ה-PCR לזמן קצר כדי להבטיח את ה-DNA תבנית היא בתוך תמהיל המאסטר.
- בצעו PCR עם ציקלנר תרמי באמצעות תוכנית הרכיבה על אופניים בטבלה 1.
- הכינו את המיקס הראשי של ה-PCR. הכפל את אמצעי האחסון הבאים בהתאם למספר הדגימות שאותן הולכים לנתח, כולל דגימות בקרה מתאימות. מערבבים את הריאגנטים עבור בודד 25 μL תגובה סופית בסדר הבא: מים מזוקקים (18.9 μL), מאגר 10x עם MgCl2 (2.5 μl), שילוב של 10 מילימטר dntp (0.5 μl), 10 μm קדימה פריימר (1 μl), 10 הפוכה μm פריימר (1 μl), 5 U/ΜL DNA פולימראז (0.1 μl), ו-dna תבנית (1 μl; יתווספו בשלבים הבאים).
- הכינו ג'ל להפעלת הדגימות בעזרת האלקטרופורזה.
הערה: הגודל יהיה תלוי במספר הדגימות שיש לנתח.- הוסף 1% w/v agarose אבקה ב-1x טריס-אצטט-EDTA (טה) מאגר בבקבוק זכוכית. חום במיקרוגל עד הצמח הוא התפרקה לחלוטין, בודק באופן קבוע כי הוא לא לרתוח.
התראה: נקוט אמצעי זהירות כדי להימנע מכוויות. - תנו הג להתקרר כ 50 ° c ולהוסיף כתם חומצה גרעין ג'ל (0.5 μL/50 mL של ג'ל).
- יוצקים את הג במגש הליהוק המכיל היטב מסרקים ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר עד שהוא הופך להיות מתחזק לחלוטין. . הסר את המסרקים בעדינות
- ממלאים את מיכל האלקטרופורזה במאגר בגודל 1x ומניחים את הג במיכל.
- הוסף 2 μL של צבע ה-DNA של 1x בכל אחת מדגימות ה-DNA.
- טען 4 μL של סולם ה-DNA בבאר הראשונה של הג, ואז להמשיך לטעון את הנפח המלא של דגימות בבארות הנותרים.
- הגדר את מקור הכוח של האלקטרופורזה כדי 140 V ולרוץ 25-30 דקות.
- מניחים את הג מתחת למקור UV ומצלמים את התוצאות.
- הוסף 1% w/v agarose אבקה ב-1x טריס-אצטט-EDTA (טה) מאגר בבקבוק זכוכית. חום במיקרוגל עד הצמח הוא התפרקה לחלוטין, בודק באופן קבוע כי הוא לא לרתוח.
2. כירורגיה סטריאוטקאית
- לאחר הגנוטיפים, עכברים נפרדים לשמור את אלה חיובי עבור היצור. המתן עד שהם לפחות 8 שבועות בן שוקל > 20 g לבצע ניתוח.
- חיטוי הסביבה לחטא את הכלים כירורגי לבצע ניתוח בתנאים אספטי.
- הכנס את העכברים תת-עורי עם כאבים 30 דקות לפני הניתוח.
- השתיל את העכברים באמצעות isofלבנה (2-3% באוויר הרגיל עבור האינדוקציה ו-1.5 על 2.0% לתחזוקת ההרדמה). להבטיח רמת הרדמה נאותה מושגת על ידי בדיקת העדר רפלקסים כאב על ידי צובט בעדינות את הבוהן של העכבר. . כוונן את משלוח האיזו, בהתאם
- הניחו את העכבר על המנגנון הסטרטקאני. להוסיף סיכה העין כדי למנוע את העין עקב יובש ולגלח את השיער של החלק העליון של הגולגולת. השתמש במשטח חימום כדי לשמור על הטמפרטורה של העכבר יציב.
- הכנס 100 μL של הרדמה מקומית מתחת לעור הגולגולת ולאפשר 5 דקות לנקוט באפקט.
- הכן את אתר החתך על ידי שלושה יישומים מעגלית של אלכוהול או מלוחים סטרילי לסירוגין עם יוד. השתמשו בעצת כותנה סטרילית והתחל את היישום מתוך קו החיתוך, כלפי חוץ.
- בעדינות להרים את העור עם מלקחיים, ולעשות חתך של ~ 1.5 ס"מ לאורך ציר rostrocaudal עם מספריים כירורגי כדי לחשוף את פני השטח של הגולגולת.
- באמצעות מקל כותנה, להחיל H2O2 פתרון כדי להסיר את הקרום.
- לשטוף את הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילי יבש אותו באמצעות המוליך מכותנה סטרילית עצה.
- . אתר את הברגמה ואת למדא
- לוודא יישור גולגולת שטוח על ידי מיקום הקצה של מחט הזריקה, מותאם על המסגרת סטריאוטקאית, על bregma ו למדא. מדדו את נקודות הציון הגגדות עבור כל מיקום והשוואה. כאשר הגולגולת היא שטוחה הקואורדינטות הגושתי עבור הברגמה וגם למדא זהים. אם לא, כוונן את המיקום הראשי ולאחר מכן קח את המידות שוב.
- למצוא ולסמן את המיקום (AP:-3.45 mm, ML:-0.2 מ"מ מברגמה לפי פרנקלין ו Paxinos22) שבו הזרקה של וירוס תלוי היצור ההשתלה של סיבים אופטיים יתקיים ולעשות חור קטן באמצעות מיקרו מקדחה.
- טען 400 nL של וירוס 10 μL מזרק רכוב על מנגנון סטריאוטקאית באמצעות משאבת דיוק.
- הנמך את המחט (34 G, משופע) בזהירות והזרק 300 nL של הנגיף התלוי-אלקטרואופטיקה וירוס (AAV5-EF1a-DIO-ChR2 (H134)-eYFP [5.6x 10 vg /ML]) ב vta (AP:-3.45 מ"מ, mL:-0.2 מ"מ מ bregma ו-4.4 מ"מ מן המשטח של הגולגולת, על פי פרנקלין paxinos22) ב 100 nL/מינימום הזרקה באמצעות משאבת דיוק.
- לאחר ההזרקה, להשאיר את המחט במקום נוסף 10 דקות כדי לאפשר דיפוזיה של הווירוס (איור 2א).
- משכי את המחט לאט מאתר ההזרקה.
- לעשות חורים קטנים באמצעות מיקרו מקדחה להתאים ברגים עוגן שייצוב סיבים אופטיים ומורכבות מלט שיניים.
- קח את הקואורדינטות bregma שוב והשתל סיבים אופטיים (200 יקרומטר קוטר, 0.37 NA) ב: AP:-3.45 mm, ML:-0.2 מ"מ מברגמה ו-4.0 מ"מ מהמשטח של הגולגולת (איור 2B) לפי פרנקלין ו paxinos22.
- לאבטח את הסיבים על הגולגולת באמצעות מלט שיניים. להחיל מספיק מלט סביב סיבי סיבים אופטיים כדי לאבטח אותו לגולגולת אבל לשים לב לעזוב 3 על 4 מ"מ של החלק העליון של ferule חינם של מלט כדי לאפשר חיבור של כבל התיקון (איור 2ג).
הערה: שים לב לא למלא את החור עם מלט כמו זה יכול לגרום לנזק רקמת המוח. חומרים הומוסטטיים ניתן להוסיף בחור כדי למנוע את התרחשות. - השתמשו בדבק או בתפרים נספגים כדי לסגור כל פצע פתוח ולהשאיר את בעל החיים להתאושש לפחות שבועיים. תנו מנה נוספת של משכך כאבים 12 עד 24 שעות אחרי הניתוח.
3. הגדרת השליטה במקור הלייזר
- השתמש במיקרו-בקרי לוח בודד כדי לשלוט על מקור הלייזר. כתוב קובץ script באמצעות התוכנה המתאימה. טען את קובץ ה-script בלוח המיקרו-בקר באמצעות כבל החיבור המתאים למחשב.
הערה: קובץ ה-script אמור לכלול אפנון חיצוני (קלט) המגיע מתוכנת המעקב באמצעות תיבת TTL, ופלט ללייזר כדי לשלוט בפרמטרי הגירוי. עבור 10 ms רוחב הדופק ב 20 הרץ תדר, השתמש בקובץ ה-script שנמצא ב- קידוד משלים. - חבר את הלוח ללייזר ולתיבת TTL של חומרת המעקב.
- השתמש בכבל רשת כדי לחבר את התיבה TTL ללוח (pin 5 עבור הסקריפט שסופק) (איור 3a, C).
- ודא שהלייזר מוגדר לשליטה על-ידי אפנון חיצוני וחבר את הלייזר ללוח באמצעות כבל FC/PC (pin 13 עבור הסקריפט הנתון) (איור 3ב, ג).
- חבר את הפינים המתאימים לחלקים קרקעיים של הלוח.
- חבר את מקור הלייזר. לסיב האופטי
- חבר את מקור הלייזר למפרק רוטרי (איור 3ד).
- חבר כבל תיקון (איור 3E). למפרק הרוטרי
- ייצוב מפרק רוטרי מעל המנגנון אבל מחוץ לאזור ההקלטה. ודא את אורך כבל התיקון סיבים אופטיים מתאים כדי לאפשר לעכבר לנוע ללא קשיים בזירה (איור 3F).
4. הגדרת הניסוי לגישת RT-PP בתוך תוכנת המעקב
- כיול את הגדרת הזירה. השתמש בסרגל כדי למדוד חלק מסוים של המנגנון הפיזי, לצייר קו המתאים לחלק שנמדד בתמונה בתוך התוכנה תחת הכרטיסיה צייר קנה מידה לכיול והזן את הערך המוכר כבר (שלב 1 באיור 4).
- . תכנן את הזירה לצייר את האזור שבו התנועה של העכברים יירשמו (שלב 2 באיור 4).
- צור את האזורים. ציירו את האזורים שבסופו של דבר יוקצה כמו לייזר לזווג, לייזר לא מזווג ו "ניטרלי" (שלב 3 באיור 4).
- אמת את הכיוונון כדי לוודא שאין פרמטרים סותרים, לדוגמה אזורים מחוץ לזירה (שלב 4 באיור 4)
- הגדר את הפרמטרים הניסיוניים תחת הגדרות בקרת הניסיון של הכרטיסיה (שלב 5 באיור 4).
- הגדר את זמן הניסיון כמוצג בשלב 1 באיור 5 עבור הפעלה של 30 דקות RT-PP.
- לוודא "שליטה בחומרה" מופעלת, להקצות תא כמו לייזר לזווג שבו כניסה של העכבר יפעיל אות TTL דרך תוכנת המעקב ללוח מיקרו בקר. באיור 5 (שלב 2) התא לזווג לייזר הוא תא A. עבור שלב היפוך, להחליף את התאים תא B יהיה לייזר לזווג ו תא A יהיה unpaired. עשה זאת על-ידי החלפת A עם B ו-B עם A בתוכנה.
5. השינוי של הכיוונון כדי לבדוק את המאפיינים האברומים של גירוי באמצעות הגישה NCP
- בצע את השלבים 4.1-4.4 כמתואר קודם לכן.
- הגדר את זמן הניסוי ל -30 דקות באמצעות האפשרות "חזור על" בתיבת התיבה "הפניה" (שלב 1 באיור 6).
- הקצה אזורי A ו-B כלייזר (שלב 2 באיור 6) על-ידי הוספה "כאשר נקודת מרכז נמצאת בכל אזור a ו-zone b" עבור תיבת התנאי הקשורה להגדרות של תאי a ו-b. שים לב כי הלייזר יהיה לכבות כאשר החיה ממוקמת בתא נייטרלי.
6. ביצוע ניסוי באמצעות גירוי לייזר
- הגדר את הגדרות הזיהוי.
- השתמש בדמה כדי להידמות לעכבר על מנת להבטיח הגדרות זיהוי מתאימות.
- מניחים את דמה בתא אחד של המנגנון ולהשתמש בהתקנה אוטומטית עם חיסור דינמי.
- להסיר את הבובה ולמקם אותו בתא הנגדי. ודא שבובה זוהתה במלואה ואם לא, התאם את ההגדרות באמצעות התוכנה כדי להשיג זיהוי נאות.
- בשלב זה גם לבדוק אם הגירוי פועל כפי שהוא אמור. התחל רכישה באמצעות הגדרות בקרת הניסיון שהוגדרו בעבר ומניחים את דמה בתא לייזר לזווג ולראות אם הגירוי מופעלות כפי שצריך. ואז מניחים את הבובה בתא האטום ו/או הנייטרלי ונראה אם הגירוי נפסק.
- השתמש במד כוח עם חיישן להגדיר את כוח הלייזר ל 10 mW באמצעות כפתור על הלייזר (איור 3ב). לבצע שלב זה בכל פעם גירוי לייזר משמש.
התראה: השתמש בציוד העין המגן כחשיפה ישירה לאור לייזר יכול לגרום נזק העין הקבוע. - מניחים את העכבר בתוך המנגנון.
- בעדינות להוציא את העכבר מהכלוב שלו ולחבר את השתל סיבים אופטיים לכבל טלאי סיבים אופטיים באמצעות שרוול קרמי.
- הניחו את העכבר בעדינות בתא הנייטרלי של המנגנון בעל שלושת התאים.
- המתן עד שהעכבר יזוהה על-ידי התוכנה.
- הסר את דלתות ההזזה האנכיות המגבילות את החיה מלהיכנס לתאי הכניסה הראשיים.
- הניחו לבעל החיים לחקור בחופשיות ללא כל הפרעות.
הערה: הליך זה מלווה כאשר בעל החיים אינו מקבל גירוי עם היוצא מן הכלל ששלב 6.2 אינו נדרש וכי הלייזר הוא ביטול כל הזמן.
Representative Results
מנגנון שלושה תאים (איור 3F) מתאים לטפל בהשפעות מתגמלת של תרופות ולהעריך בזמן אמת את התכונות מתגמל או מתגמלת של גירוי ישיר של הנוירונים באמצעות אלקטרואופטיקה. הוא מורכב שני תאים עיקריים (20 ס"מ [W] x 18 ס"מ [L] x 25 ס"מ [H]) אחד קטן תא חיבור (20 ס"מ [W] x 7 ס"מ [L] x 25 ס"מ [H]). התאים העיקריים יש מרקם הקיר והרצפה ברורים כדי להקל על למידה אסוציאטיבית, בעוד תא חיבור/נייטרלי הוא צר ושקוף כך העכברים לבלות באופן טבעי פחות זמן בו. כפי שמתואר לעיל, ניתן להשתמש בתוכנת המעקב כדי להקליט מספר פרמטרים התנהגותיים של העכברים, כולל תנועה וזמן שהושקע בכל תא, ולשלוט בגירוי הלייזר. הניסוי RT-PP כולו מתרחש לאורך 8 הפעלות (איור 1א) ומאפשר הן את ההערכה של תכונות מתגמלת או מתגמל של גירוי ישיר (ימים 3, 4, 6, ו -7) ואת היווצרות של אסוציאציות, חיובי או שלילי, בתגובה לניסיון הקודם (ימים 5 ו 8, "CR").
ראשית, בחנו את העכברים DAT-מוזרק עם וירוס Aav-ChR2-eYFP ב vta כדי למקד את הנוירונים הדואמינייגיים. בהתאם לספרות, הבחנו כי העכברים העדיפו לבלות את הזמן בתא יחד עם גירוי (איור 1ב, שלב 1, ימים 3 ו-4, עיגולים כחולים, מדדים חוזרים ונשנים [RM] ניתוח של שונות [ANOVA], השפעת תא F(2, 18) = 141, p < 0.001; ההשפעה של הפעלה x תא F(12,108) = 42.1, p < 0.001; הבדיקה הפוסט-הוק של tukey זווג לעומת < 0.001 ). השלב היפוך, שבו הזיווג של התאים לגירוי לייזר הוחלף, אישר תצפיות אלה (איור 1B, ימים 6 ו -7, עיגולים כחולים, הבדיקה הפוסט הוק של tukey לזווג לעומת unpaired תא p < 0.001) ובכך להוציא את האפשרות כי התוצאות שהתקבלו משלב 1 היו קשורים טיות או פרמטרים אקראיים. ממוצע הזמן שהושקע בכל תא במהלך ארבעת הימים של RT-PP אישר כי עכברים בילו בממוצע על 70% הזמן שלהם בתא לייזר לזווג לעומת unpaired (~ 20%) והנייטרלי (~ 10%) תאים (איור 1B bar גרף, כיוון אחד RM ANOVA, אפקט של גירוי F(2, 6) = 139, p < 0.001, tukey של הודעה כיצד לזווג לעומת מוזווג תאים ניטרליים p < 0.001). יתר על כן, בהעדר גירוי, בימים 5 ו 8, העכברים בילו באופן משמעותי יותר זמן בתוך התא לזווג בעבר עם גירוי לייזר (הדואר הפוסט -הוק של tukey < 0.001), המציין כי הניסיון הקודם היה מספיק כדי לגרום להתנהגויות למידה אסוציאטיבית משתקף כמו "מחפשים" של גירוי. נתונים אלה הם בהתאם לספרות ולהדגים כי השיטה הנוכחית ניתן להשתמש מהימן לחקור את ההשפעות מתגמל של גירוי אלקטרואופטיקה של אוכלוסיות נוירואליות ספציפיות ב VTA.
לאחר מכן בחנו VGLUT2-יצורים שהוחדרו עם Aav-ChR2-eYFP ב vta כמו לעיל, כדי למקד את glutamatergic נוירונים של vta. בניסוי זה, הבחנו בפנוטיפ התנהגותי הפוך מהמוצג על ידי העכברים ה-DAT. כך, העכברים נמנעו מהתא לזווג את הגירוי ובילו זמן רב יותר במהלך כל הימים RT-PP (איור 1ג שמאל, שני כיוון RM ANOVA, ההשפעה של תא F(2, 12) = 40.9, p < 0.001; ההשפעה של הפעלה x תא F(12, 72) = 16.1, p < 0.001; הבדיקה הפוסט-הוק של tukey זווג לעומת < 0.001 ; איור 1ג הזכות, האפקט החד בכיוון RM ANOVA של גירוי F(2, 6) = 162, p < 0.001, tukey לזווג הודעה לעומת תאים ניטרליים ונייטרלי p < 0.001). מעניין, במהלך "CR" ימים 5 ו 8, העכברים לא הראו הימנעות ברור של התא הקודם לזווג (אין הבדלים בין לזווג תאים לא מזווג). ייתכן שחוסר התגובה הממוזג נובע מזמן בלתי מתאים שהושקע בתא הלייזר, שמנעה את היווצרות האסוציאציות בין הפעלת לייזר לבין הסביבה המסוימת שבה התרחש. כדי להמשיך לחקור את הימנעות האלה פנוטיפ, השתמשנו בפרוטוקול שונה שנקרא "העדפה תא נייטרלי", NCP מקוצר. בניסוי זה, שני התאים העיקריים היו משויכים לגירוי והתא הנייטרלי נותר ללא גירוי (איור 7א). אנו שיערו כי, אם הגירוי יש התכונות מאולצת, אז העכבר ייאלץ לבלות את הזמן בתוך הקטן, נייטרלי התא, כדי למנוע את זה. אכן, בשני ימי גירוי (Stim1 ו Stim2) העכברים בילו את רוב הזמן בתא נייטרלי (כ 80%) לעומת התאים לזווג (איור 7B, C; שמאל: האפקט השני כיוון ANOVA של תא F(2, 8) = 70.9, p < 0.001; ההשפעה של הפעלה x תא F(4, 16) = 6.9, p = 0.002, לפוסט הוק של tukey "גירוי 1" מתאים נייטרלי לעומת תא 1 ו-2 p < 0.01, "גירוי 2" נייטרלי לעומת תא 1 ו-2 p < 0.001; ימין: כיוון אחד RM ANOVA, אפקט של גירוי F(2, 2) = 54.2, 0.018, הבדיקה הפוסט-הוק של tukey לזווג 1 ו 2 vs ניטרלי p < 0.05). כמו במקרה של "CR" ימים במהלך הבדיקה RT-PP, העכברים לא נראה ליצור אסוציאציות שליליות בין התאים ואת הגירוי; כלומר, בהעדר גירוי (CR), הם חקרו את כל התאים באותה מידה (איור 7B, אין הבדלים בין הזמן שהושקע בתאים משויכים ובתא נייטרלי). התוצאות של ניסויים אלה אישרו את הפנוטיפים התנהגותיים שנצפו במהלך ההתקנה RT-PP ובכך לתמוך ביישום קומבינטורית של הן RT-PP ו-NCP תפיסות.
איור 1: בדיקות התנהגותיות באמצעות אלקטרואופטיקה ב הפרדיגמה RT-PP. (א) ייצוג סכמטי של ציר הזמן של הניסויים. (ב, ג) למעלה משמאל: גרף המייצג את אחוז הזמן המושקע בכל תא במהלך הניסוי RT-PP עבור ה-DAT-היצור (N = 10) ו VGLUT2-היצורים (N = 7) עכברים שהוחדרו עם Aav-ChR2-eYFP. עיגולים כחולים: לייזר לזווג תא; לבן, עיגולים שחורים: התאים העיקריים; עיגולים אפורים: מעגלים ניטרליים. למעלה מימין: אחוז הזמן הממוצע שהושקע בכל תא בימים 3, 4, 6 ו -7 (RT-PP). למטה: מפות החום של הנציגים של הזמן שהושקע בכל תא בשביל הVGLUT2-DAT ועכבר בעלי חיים. כל הנתונים הופצו בדרך כלל (מבחן שפירו-וילק). התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. * * *p < 0.001 מזווג vs לא מזווג; p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001 מזווג לעומת מחלקה נייטרלית; § §p < 0.01, § § < 0.001 בלתי מזווג לעומת תא נייטרלי. דמות זו השתנתה מתוך בימרו ואח '12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הליך כירורגי עבור ניסויים אלקטרואופטיקה. (א) הזרקה של וקטור ויראלי התלויביצורבתוך vta. (ב) השרשה של סיבי הראיה מעל לאתר ההזרקה. הערה בורגי העוגן המשמשים לייצוב. (ג) עיגון קבע של סיבים על הגולגולת באמצעות מלט שיניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ציוד המשמש בניסויים אלקטרואופטיקה. (א) ה-TTL box המשמש במחקרים. הוא מקבל קלט מתוכנת המעקב ושולח אותות TTL ללוח המיקרו-בקר. (ב) הקדמי (למעלה) והמבט האחורי (למטה) של מקור הלייזר המשמש את הניסויים. (ג) לוח המיקרו-בקר המשמש לשליטה בגירוי הלייזר. שים לב לחיבורים מהתיבה TTL ולמקור הלייזר. (ד) מפרק רוטרי. (ה) סיבים אופטיים האקורד המשמש ניסויים. (ו) מנגנון שלושת התאים המשמש לניסויים RT-PP ו ncp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: עיצוב הזירה והאזורים בתוך תוכנת המעקב. שלב 1: כיול הכיוונון. שלב 2: רישום כל הזירה. שלב 3: אזורי ציור בתוך הזירה. שלב 4: אימות ההתקנה. שלב 5: כרטיסיית ' הגדרות בקרת ניסיון ' להגדרת פרמטרים של זמן וגירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הגדרת פרמטרים של זמן וגירוי של ניסוי RT-PP בתוך תוכנת המעקב. הוספת כללים ספציפיים למשך (שלב 1) והתנאים לגירוי קל (שלב 2). ניתן לשנות את התנאים בקלות כדי להתאים לדרישות של שלב ההיפוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הגדרת הזמן והגירוי פרמטרים של ניסויים NCP בתוך תוכנת מעקב. משך ההפעלות הגירוי (שלב 1) דומה לאלה של RT-PP אך התנאים להפעלת גירוי באור (שלב 2) שונים. הכניסה אל התא הראשי (כאן אזור A ואזור B) תוצאות הגירוי אלקטרואופטיקה כי הוא הסתיים רק כאשר העכבר נכנס לתא נייטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: בדיקות התנהגותיות באמצעות אלקטרואופטיקה בפרדיגמת NCP. (א) ייצוג סכמטי של הכיוונון הניסיוני. (ב) משמאל: גרף המייצג את אחוז הזמן המושקע בכל תא במהלך שני ימי הגירוי (Stim1 ו-"גן 2") ובמהלך התגובה הממוזגת (CR) עבור עכברים VGLUT2-יצורים שהוחדרו עם Aav-CHR2 ב vta (N = 5). מימין: אחוז הזמן הממוצע שהושקע בכל תא במהלך שני ימי הגירוי של NCP. (ג) נציג החום של הזמן שהושקע בכל תא עבור עכבר VGLUT2-יצור במהלך אחד מימי הגירוי. הנתונים הופצו בדרך כלל (מבחן שפירו-וילק). תוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. *p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001 unpaired לעומת לזווג 1 ו לזווג 2 תאים. דמות זו השתנתה מתוך בימרו ואח '12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| צעד | טמפרטורה | משך | מחזורי |
| 1. דנטורציה ראשונית | 95 ° c | 4 דקות | 1 |
| 2. דנטורציה | 95 ° c | שלושים בנות | 30 |
| 3. חישול הריפוי | 55 ° c | שלושים בנות | |
| 4. הארכה | 72 ° c | 40 ס | |
| 5. הארכה סופית | 72 ° c | 6 דקות | 1 |
| 6. החזק את | 4 מעלות צלזיוס | עד שנעצר בידי הניסויים | 1 |
שולחן 1: תוכנית האופניים של ה-PCR.
קובץ קידוד משלים. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Discussion
במחקר הנוכחי, אנו מציגים שני הפרוטוקולים צעד אחר צעד של איך לבצע סוגים שונים של העדפת מקום ניתוח באמצעות אלקטרואופטיקה בעכברים. הפרוטוקולים המתוארים שימשו כדי להעריך את הפנוטיפים התנהגותיים מתגמלת או מתגמל של נוירונים VTA (איור 1 ואיור 6)12, אבל יכול להיות מנוצל כדי לחקור את התפקיד התנהגותי של נוירונים באזורי מוח אחרים, כמו גם.
מספר מחקרים שנעשו לאחרונה תיארו RT-PP תבניות בשני תא23,24 ו-3-תא מכשירים13,14,15,16,17,18. הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים כיוונונים מפורטים עבור פרוטוקולי RT-PP ו-NCP במנגנון שלושה תאים הדומה לאלו המשמשים באופן מסורתי בניסויים של CPP כדי להעריך את השפעות ההתנהגות על מינהל הסמים של התעללות. בעוד התוצאות מוצגות כאן רק כאחוז הזמן שהעכבר בילה בכל תא, תוכנת המעקב מאפשרת ניתוח של מספר פרמטרים התנהגותיים אחרים, כגון מעברים לאזורים, מהירות, זמן שהושקע משותק ועוד. ניתוח פרמטרים שונים יכול להיות בעל חשיבות לפרשנות הנתונים.
הפרוטוקולים RT-PP הנוכחי הם גמישים ניתן לשנות כדי לבדוק אם סוגים שונים של דפוסי גירוי יש אפקטים מתגמלת. הפרמטרים של שליטה בלייזר ניתן לשנות בקלות בין הסקריפט של הלוח מיקרובקר או בתוך תוכנת המעקב, הוכחת צדדיות של ההתקנה. אנו ממליצים על 20 התדירות גירוי הרץ אשר נמצא בתוך הטווח, ולפעמים נמוך, של תדרים החלים במחקרים קודמים באמצעות אותו משתנה אופסין (ChR2/H134R) כדי ללמוד דואמנררגיות וglutamatergic נוירונים ומסופים שלהם13,14,16,17,18,23,24,25,26,27. מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו כי תדירויות גירוי גבוהות יותר יכולות להיות השפעות הפוכות על התנהגות מאשר אלה התחתון, וכי תופעות אלה מתווכת באמצעות בלוק depolarization הנגרמת על ידי תדרים גבוהים יותר28. באופן דומה, הבדלים בפלט התנהגותי הוכחו כאשר מגרה glutamatergic ו-GABAergic נוירונים באזור האופטי לרוחב15. מחקרים אלה בחנו נוירונים באזורים שונים מאשר vta ואת ההשפעות הגדולות נצפו על תדרים גבוהים של נוירונים שאינם glutamatergic15,28. הבחירה שלנו על 20 הרץ מבוסס על המחקרים הקודמים של glutamatergic ו הנוירונים והנירדואמירגיות vta מדגימים כי על ידי משתנים מסוגים שונים של גירוי, פלט התנהגותי הקשורות תגמול לא השתנה באופן משמעותי24,26.
פרמטר נוסף שניתן לכוונן והוא עשוי להשפיע על התוצאה הניסיונית הוא הכוח של מקור האור. כוח לייזר גבוה יותר יכול להגדיל את הגודל של אזור מגורה אור, אשר עשוי להועיל בסוגים מסוימים של ניסויים, אך עם החיסרון של עלייה בטמפרטורה5. אכן, מחקר שנערך לאחרונה הוכיחה כי עליות בלייזר בטמפרטורה יכול לשנות את הפיזיולוגיה המוחית ולהשפיע על מדידות התנהגותיות29. התצפיות הללו מדגישות את החשיבות של כולל שליטה באמצעות opsin-שלילית בתכנון הניסיוני. בפרוטוקול הנוכחי, השתמשנו 10 mW כוח לייזר הדומה והוכח בעבר להיות יעיל בגירוי דואמנרכולינרגיות ו glutamatergic נוירונים ב vta16,24,26. בעת הקמת ניסויים, חשוב לשים לב לגודל האזור שבו תאי העניין ממוקמים ומאפייני סיבים אופטיים ושטח טלאי (מיפתח מספרי, קוטר ליבה). פרמטרים אלה חיוניים לקחת בחשבון בעת ביצוע חישובים הקשורים לכוח לייזר. לפרטים, ניתן להשתמש במחשבון שפותח על-ידי המעבדה של קרל דיאיסררות (http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php).
אימות היסטולוגית של שילוב מחדש של היצור-לקס הוא היבט קריטי אחר בעת החלת ניסויים אלקטרואופטיקה. האימות של היעילות המשולבת צריך תמיד להתרחש בתוך מקבץ הפיילוט לפני החניכה של כל ניסוי התנהגותי בקבוצה גדולה של בעלי חיים. זה חשוב מסיבות אתיות, אלא גם עבור פלט ניסיוני אופטימיזציה. כל מבנה ויראלי עשוי להראות ספציפיות משתנה לסוגי עצבים ברורים ובאזורים שונים5, פרמטר אשר יכול להשפיע על הניסויים בדרכים בלתי צפויות ואף מטעה. למשל, בעבר הצלחנו לאמת את התבנית המשולבת של היצור-לקס שילוב מחדש של וירוסים AAV5 ב vta של העכברים של היצורים האלה ומצא כי זריקות חד צדדיות היו מספיקים כדי למקד את רוב אזור הריבית. כאשר לאחר מכן למדנו לאחר מכן אוכלוסיות מוגבלות בתוך VTA, כגון אחד מאופיין על ידי ביטוי NeuroD6, הבחנו כי זריקות ויראלי דו היו יעילים יותר ליעד מספר גדול יותר של נוירונים נותן השפעות התנהגותיות יותר בולטת על אלקטרואופטיקה אור הגירוי12. יתרה מזאת, הזמן מניתוח לחניכה של ניסויים התנהגותיים צריך להיות ממוען בזהירות. שבועיים זה מספיק זמן עבור בניית ה-DNA ChR2 להיות ביטוי גופי התא כפי שאנו מראים כאן, אבל זמן המתנה ארוך (~ 8 שבועות) ייתכן שיהיה צורך אם החוקר בוחן את ההשפעה של גירוי באזורים הקרנה13,14,15,17.
זה שווה לציין כי נפח של וירוס הזריק (במקרה שלנו 300 nL) עשוי להיות מתאים כאשר לימוד נוירונים ב vta, אבל נפח ו-סיכוייו חייב להיות מותאם בהתאם ליעילות של התמרה ואת גודל המבנה למד. בנוסף, עבור מבנים דו-צדדיים הממוקם במרחק מן הציר מדיה הצלעות, ייתכן שיהיה צורך לבצע זריקות דו צדדיות, וגם השתל פיבראופטית בקיעים כדי להבטיח הפעלה/עיכוב בשתי האונות.
לבסוף, תמיד יש צורך לבצע ניתוח היסטולוגית לאחר המוות כדי לאמת ולאשר את היעילות של השילוב החוזר של היצור-לקס ולאמת את אתר ההשתלה הנכון של סיבי הראיה במיקום המיועד. שילוב מחדש בלתי צפוי, מוגבל או מוגזם של היצור-לקס עשוי להתרחש עקב התפלגות לא ידועה של נוירונים ביטוי היצור מחוץ לגבולות האזור המיועד, או בשל הבדלים בסוג הווירוס וירוס, הטיפול המסכן של הנגיף, סתימת ה מזרק למסירה וירוסים או בעיות אחרות הקשורות לניתוחים. אימות של שילוב משביע רצון של היצור-לקס מספק מחדש, השרשה הנכונה לבצע כדי לאשר את כל התוצאות הסטטיסטיות של הערכות התנהגותיות כדי למשוך מסקנות בטוחות.
מבחינת הנתונים המסופקים כאן כדוגמאות לאופן שבו ניתן להשתמש בשתי תבניות ההתנהגות, העדפה משמעותית בצד לזווג אור שהושג על ידי הגירוי אלקטרואופטיקה של הנוירונים הדואמינרגיים בתוך vta על ידי ניתוח עכברים היצורים האלה בפרדיגמה RT-PP צפוי מבוסס על ממצאים קודמים23,24,25,26,27 בעוד הימנעות בצד זה מוצג על ידי עכברים VGLUT2-היצורים לא צפויות. VGLUT2 נוירונים של vta והתחזיות שלהם הוכחו להיות מעורב הן גמול וסלידה16,17,24,30,31, ולכן ביצעו ניתוח ncp כדי להעריך את התנהגות הימנעות לכאורה נצפתה בהתקנה RT-PP הנוכחי בפירוט רב יותר. באמצעות צר, מסדרון שקוף כמו התא היחיד שאינו אור לזווג כדי לאשר את המאפיינים האברומים של גירוי VTA glutamatergic נוירונים, זה ניכר כי בהתקנה זו שלושה תא מסוים, הפעלה אלקטרואופטיקה של הנוירונים האלה גורמת תגובה מעוררת. ניסויים אלה, אשר הוצגו כאן כדי להדגים מצבים שעשויים להפיק תועלת משימוש הן בפרוטוקולים RT-PP ו NCP, היו חלק ממחקר שפורסם לאחרונה, ואת ערכת הנתונים המלאה, כמו גם דיונים לגבי ממצאים אלה ניתן למצוא בפרסום זה12.
בנוסף NCP, דרכים חלופיות לאשר סלידה כוללים התאורה חזקה של אזור בתוך שטח שדה פתוח תוך שיוך שאר הזירה להפעלת לייזר, או לבצע משימה הימנעות פעילה שבה העכבר צריך לבצע דפוס מסוים של התנהגות כדי לסיים את גירוי לייזר15.
לסיכום, הפרוטוקולים תיאר לספק מידע קריטי של איך לבצע בהצלחה את הניתוח RT-PP ו NCP בדרך היעילה ביותר כדי לפענח את התפקיד של הפעלה עצבית בגמול וסלידה. בהתאם להשערה המדעית, ניתן לנתח מגוון של פרמטרים באמצעות פרוטוקולים אלה, וכל פרוטוקול יכול גם להיות משולב עם תבניות אימות אחרות עבור מנתח התנהגותי אופטימיזציה ליישם אלקטרואופטיקה כדי לטפל במוח מסוים אזורים ונוירונים בעלי עניין.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מקורות המימון שלנו הם בהכרת תודה: אוניברסיטת אופסלה, Vetenskapsrådet (המועצה למחקר שוודי), היירפונדן, Parkinsonfonden, יסודות המחקר של Bertil Hllsten, OE & Edla יוהנסון, זואולוגיסק פורסנינג ו Åhlen. בעלי חיים הוחזקו באוניברסיטת אופסלה וניסויים נערכו במכון התנהגותי של אוניברסיטת אופסלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | - | a great variety of viruses to suit any project's needs |
| Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
| Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
| Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
| Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
| DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
| DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
| Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
| Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
| Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
| Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
| Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
| Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
| Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
| Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
| Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
| Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
| Nucleic Acid gel stain - GelRed | Biotium | 41003-T | |
| PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | |
| Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
| Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
| Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
| Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
| Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
| Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
| TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
| Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
| Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
| UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |
References
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The Development and Application of Optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34 (1), 389-412 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Pupe, S., Wallén-Mackenzie, Å Cre-driven optogenetics in the heterogeneous genetic panorama of the VTA. Trends in Neurosciences. 38 (6), 375-386 (2015).
- Spanagel, R. Animal models of addiction. Dialogues in Clinical Neuroscience. 19 (3), 247-258 (2017).
- Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), 227 (2007).
- Hoffman, D. C. The use of place conditioning in studying the neuropharmacology of drug reinforcement. Brain Research Bulletin. 23 (4-5), 373-387 (1989).
- Huston, J. P., Silva, M. A. D. S., Topic, B., Müller, C. P. What's conditioned in conditioned place preference? Trends in Pharmacological Sciences. 34 (3), 162-166 (2013).
- Bardo, M. T., Bevins, R. A. Conditioned place preference: What does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153 (1), 31-43 (2000).
- Bimpisidis, Z., et al. The NeuroD6 subtype of VTA neurons contributes to psychostimulant sensitization and behavioral reinforcement. eNeuro. 6 (3), e0066 (2019).
- Root, D. H., Mejias-Aponte, C. A., Qi, J., Morales, M. Role of Glutamatergic Projections from Ventral Tegmental Area to Lateral Habenula in Aversive Conditioning. Journal of Neuroscience. 34 (42), 13906-13910 (2014).
- Steidl, S., Wang, H., Ordonez, M., Zhang, S., Morales, M. Optogenetic excitation in the ventral tegmental area of glutamatergic or cholinergic inputs from the laterodorsal tegmental area drives reward. European Journal of Neuroscience. 45 (4), 559-571 (2017).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Wang, H. L., Qi, J., Zhang, S., Wang, H., Morales, M. Rewarding Effects of Optical Stimulation of Ventral Tegmental Area Glutamatergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 35 (48), 15948-15954 (2015).
- Qi, J., et al. VTA glutamatergic inputs to nucleus accumbens drive aversion by acting on GABAergic interneurons. Nature Neuroscience. 19, 725-733 (2016).
- Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nature Communications. 5, 5390 (2014).
- Ekstrand, M. I., et al. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (4), 1325-1330 (2007).
- Borgius, L., Restrepo, C. E., Leao, R. N., Saleh, N., Kiehn, O. A transgenic mouse line for molecular genetic analysis of excitatory glutamatergic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 45 (3), 245-257 (2010).
- Papathanou, M., et al. Targeting VGLUT2 in Mature Dopamine Neurons Decreases Mesoaccumbal Glutamatergic Transmission and Identifies a Role for Glutamate Co-release in Synaptic Plasticity by Increasing Baseline AMPA/NMDA Ratio. Frontiers in Neural Circuits. 12, 64 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Boston, MA. (2008).
- Tsai, H. C., et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Pascoli, V., Terrier, J., Hiver, A., Lüscher, C. Sufficiency of Mesolimbic Dopamine Neuron Stimulation for the Progression to Addiction. Neuron. 88 (5), 1054-1066 (2015).
- Ilango, A., Kesner, A. J., Broker, C. J., Wang, D. V., Ikemoto, S. Phasic excitation of ventral tegmental dopamine neurons potentiates the initiation of conditioned approach behavior: parametric and reinforcement-schedule analyses. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 155 (2014).
- Kim, K. M., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PLoS ONE. 7 (4), 1-8 (2012).
- Kroeger, D., et al. Galanin neurons in the ventrolateral preoptic area promote sleep and heat loss in mice. Nature Communications. 9, 4129 (2018).
- Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22 (7), 1061-1065 (2019).
- Root, D. H., Estrin, D. J., Morales, M. Aversion or Salience Signaling by Ventral Tegmental Area Glutamate Neurons. iScience. 2, 51-62 (2018).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
