Summary
Her præsenterer vi to nemme at følge trin-for-trin protokoller for sted præference paradigmer ved hjælp af optogenetik i mus. Ved hjælp af disse to forskellige opsætninger, præference og undgåelse adfærd kan vurderes solidt inden for samme apparat med høj rumlig og tidsmæssige selektivitet, og i en enkel måde.
Abstract
Forstå, hvordan neuronal aktivering fører til specifikke adfærdsmæssige output er afgørende for moderne neurovidenskab. Kombinere optogenetik i gnavere med adfærdsmæssige test i validerede paradigmer giver mulighed for måling af adfærdsmæssige konsekvenser ved stimulering af forskellige neuroner i realtid med høj rumlig og tidsmæssige selektivitet, og dermed etablering af årsagssammenhænge mellem neuronal aktivering og adfærd. Her beskriver vi en trin-for-trin protokol for en real-time sted præference (RT-PP) paradigme, en modificeret version af den klassiske betinget sted præference (CPP) test. RT-PP udføres i et apparat med tre rum og kan anvendes til at svare, hvis optogenetisk stimulering af en bestemt neuronal population er givende eller aversive. Vi beskriver også en alternativ version af RT-PP-protokollen, den såkaldte neutrale rumpræferenceprotokol (NCP), som kan bruges til at bekræfte aversion. De to tilgange er baseret på udvidelser af klassisk metode, der stammer fra adfærdsmæssige farmakologi og nylige gennemførelse af optogenetik inden for neurovidenskab området. Bortset fra at måle sted præference i realtid, kan disse opsætninger også give oplysninger om konditioneret adfærd. Vi leverer protokoller, der er nemme at følge trin for trin sammen med eksempler på vores egne data, og diskuterer vigtige aspekter, der skal overvejes, når de anvender disse typer eksperimenter.
Introduction
Gennemførelsen af optogenetik, en moderne neurovidenskab eksperimentelle værktøj, hvor lyset bruges til at kontrollere neuronal aktivitet, har i de seneste år ført til store fremskridt i forståelsen af, hvordan specifikke neuronale populationer indvirkning adfærd1,2,3. Optogenetiks fremragende rumlige og tidsmæssige selektivitet gør det muligt at etablere årsagssammenhænge mellem excitation eller hæmning af cellegrupper af interesse og adfærdsmæssige output2,3. Rumlig selektivitet i optogenetik er almindeligt sikret gennem Cre-Lox system, hvor aktiviteten af Cre recombinase fører til en rekombination af eventuelle DNA-sekvenser til stede mellem Lox steder, såkaldte floxed alleler (flankeret af lox sites)4. Målet med at bruge Cre-Lox-systemet i optogenetik er at opnå udtryk for alleler, der koder optogenetiske opsins i specifikke neuroner af interesse, mens de omkringliggende neuroner er blottet for udtryk. Opsins er lysfølsomme proteiner, der ved lys-stimulation af specifikke bølge-længde tillade ion flow, der påvirker neurale ophidselse eller påvirke cellulære funktioner ved at modulere downstream effector veje. Nye varianter af opsins, der adskiller sig i aktion (excitatoriske, hæmmende, modulerende), mekanisme, aktivering af lys bølgelængde og kinetik egenskaber5 er løbende ved at blive udviklet for at opfylde behovene hos specifikke eksperimentelle tilgange. Med hensyn til ophidselse, ved hjælp af en depolariserende eller hyperpolariserende opsin dikterer aktiviteten af neuroner (excitation eller hæmning, henholdsvis) ved lys-stimulation på en bestemt bølgelængde leveret ind i hjernen3.
Selektiv promotoraktivitet dirigerer udtryk for Cre rekombinase til neuroner af interesse. Ved at gennemføre en floxed allel af opsin af interesse, vil Cre-medieret rekombination sikre, at opsin selektivt udtrykkes i neuroner, co-express Cre rekombinase3,6. Denne brug af dobbelt transgenics til direkte rumlig selektivitet har vist sig meget effektiv i optogenetik. Således, mens lys-stimulation til at aktivere opsins er bredt leveret gennem en intracerebralt implanteret optisk fiber forbundet til en lyskilde (LED eller laser)3,kun neuroner udtrykke både Cre rekombinase og floxed opsin allel vil reagere på denne stimulation. Cre-Lox-systemet i gnavere kan opnås på forskellige måder ved kun at anvende transgene (både Cre rekombinase og den floxed opsin konstruktion er kodet i transgene dyr), kun virale injektioner (DNA konstruktioner til Cre rekombinase og floxed opsin leveres begge via en viral luftfartsselskab), eller en kombination af de to (f.eks. Cre rekombinase er kodet af et transgent dyr, som injiceres med en virus, der bærer den floxed opsin konstruktion)5. Den floxed opsin DNA konstruktion er normalt klonet i ramme med en reporter gen for at muliggøre visualisering af Cre-medieret rekombination i væv sektioner. Mens optogenetik også kan udføres hos rotter, de præsenterede protokoller er blevet genereret for mus. For nemheds skyld vil mus, der bærer både Cre rekombinase og den floxed opsin, blive omtalt som "optogenetikmus". I de protokoller, der er beskrevet nedenfor, er optogenetik mus blevet genereret af en blandet transgenic (Cre rekombinase under kontrol af to forskellige initiativtagere) og viral (ved hjælp af en adeno-associeret virus, AAV, at levere floxed opsin DNA konstruktion - i vores tilfælde ChR2/H134R) tilgang. Opnåelse og vedligeholdelse af transgene muselinjer er en væsentlig del af metoden. Cre-driver og floxed opsin transgene mus kan produceres til hvert formål, eller købes, hvis kommercielt tilgængelige, som kan en række vira transporterer DNA-sekvenser kodning Cre rekombinase og floxed opsins i forskellige former.
Optogenetik kombineret med adfærdsmæssige test har vist sig at være et værdifuldt redskab til at studere den rolle, forskellige hjerne regioner, eller diskrete neuronale populationer, i bestemte typer af adfærd. I forbindelse med belønning-relateret adfærd, optogenetics har gjort det muligt at kontrollere tidligere resultater inden for adfærdsmæssige farmakologi og eksperimentel psykologi, og også tilladt et nyt niveau af spatio-tidsmæssigt relevant dissektion i, hvordan visse neuroner påvirker adfærd. En metode, der er blevet brugt i flere undersøgelser til at vurdere belønning-relaterede adfærd er en modificeret version af den klassiske metode kendt som Conditioned Place Preference (CPP). Klassisk CPP er blevet brugt til at vurdere de givende eller aversive egenskaber af narkotika af misbrug gennem deres evne til at fremkalde Pavlovian foreninger med signaler af miljøet7,8. I Pavlovian vilkår, stoffet er en uinstrueret stimulus, da det kan fremkalde tilgang eller tilbagetrækning, hvis det er givende eller aversive, henholdsvis. Kontinuerlig parring af lægemidlet med forskellige neutrale stimuli, der selv ikke fremkalde nogen reaktion, kan føre til tilgang eller tilbagetrækning blot ved præsentationen af den tidligere neutrale, men efter parring, såkaldte konditionerede stimuli9. CPP-analyse udføres normalt i et apparat, der indeholder to rum af samme størrelse, men hvor hvert rum defineres ved forskellige egenskaber, såsom gulvtekstur, vægmønstre og belysning (neutrale stimuli). De to rum er forbundet enten af en korridor eller en åbning mellem rummene. Under konditionering, emnet, normalt en lille gnaver, modtager passive injektioner af et lægemiddel, mens begrænset til en af de to vigtigste rum og saltvand, mens begrænset til det andet rum. De givende virkninger af lægemidlet vurderes efterfølgende i en stoffri session, når emnet får lov til frit at udforske hele apparatet. Den tid, der blev brugt i det tidligere stofparrede rum (den konditionerede respons), anses for at afspejle pavloviske læringsmekanismer, der formidles mellem lægemidlets givende virkninger og de signaler i rummet, der er forbundet med dets administration (konditionerede stimuli). Hvis dyret tilbringer mere tid i det stof-parret rum, stoffet har induceret en betinget sted præference, hvilket betyder, at det har givende virkninger på adfærd. På den anden side, hvis stoffet opfattes som aversive, dyret vil undgå narkotika-parret rum og tilbringe mere tid i saltvand-parret rum, der angiver konditioneret sted aversion (CPA)8,9,10,11.
Da optogenetik kan gennemføres for at kontrollere neuronal aktivitet i "real-time", brugen af en adfærdsmæssig paradigme svarende til, men adskiller sig fra, CPP setup giver mulighed for måling af sted præference ved direkte neuronal aktivering. Optogenetik-drevet analyse af sted præference er derfor ofte omtales som en real-time sted præference (RT-PP) analyse paradigme. I RT-PP paradigme, optogenetisk stimulation af forskellige neuroner via Cre-Lox system erstatter den systemiske levering af et lægemiddel udført i den klassiske CPP, således at RT-PP paradigme i stedet foranstaltninger, hvis optogenetisk induceret neuronal stimulation er opfattes som givende eller aversive. Den nuværende beskrivelse vil fokusere på optogenetik mus, men også optogenetik rotter kan testes ved hjælp af lignende protokoller.
I stedet for konditionering til et rum ad gangen som i den klassiske CPP paradigme, optogenetics mus i RT-PP paradigme får lov til at bevæge sig frit i hele apparatet og adfærd registreres i hele sessionen. Adgang til et af rummene er parret med intrakraniel lys-stimulation. Under passende lys stimulation parametre, neuroner, der udtrykker en excitatoriske opsin vil dermed blive aktiveret. Hvis lysstimuleringen opfattes som givende, forbliver optogenetikmusen i det lysparrede rum, mens hvis lysstimuleringen opfattes som aversive, vil musen forlade rummet for at undslippe stimuleringen. Denne type analyse giver mulighed for at vurdere betinget læring: Motivet kan udløse lys-stimulation og dermed neuronal aktivering ved at komme ind i et rum, og stoppe stimulering ved at forlade rummet, svarende til løftestang-presning under en instrumental opgave. Desuden kan associative læringsmekanismer vurderes under efterfølgende sessioner, hvor den tid, der tilbringes i hvert rum, måles i mangel af stimulering. På denne måde, forskeren kan adskille mellem de umiddelbart givende virkninger ved stimulering af neuroner af interesse og associative hukommelse dannelse relateret til det12.
I den aktuelle undersøgelse beskriver vi to trin-for-trin setup protokoller for optogenetics-drevet sted præference adfærd frit bevægende mus. Den første protokol beskriver RT-PP inden for et apparat med tre segmenter og er blevet skitseret på grundlag af de protokoller , som Root og kollegerne 13 og andre forfattere har fremlagt12,14,15,16,17,18. Forsøget består af to faser, der omfatter flere daglige sessioner (vist i figur 1A). Hver session er designet til forskellige formål, og parametrene for koblingsstimulering med et rum ændres i overensstemmelse hermed. Den første session, "Pretest", bruges til at vurdere den første præference af emnet til en af rummene. Under forbindelsen til plasterledningen kan motivet frit udforske apparatet uden stimulering i 15 min. Hvis den oprindelige præference for et enkelt rum er mere end 80%, er musen udelukket fra analysen, da den oprindelige sidebias kan skævvride analysen. Efter "Pretest" begynder "fase 1". Den første del består af to på hinanden følgende, daglige, 30 min sessioner af "RT-PP". Under "Fase 1" er den optogenetiske mus forbundet til laserkilden gennem plasterledningen og placeret i arenaen for frit at udforske den. Musen modtager intrakraniel laserstimulation ved indgangen til et af de vigtigste rum. Piloteksperimenter kan udføres for at afgøre, hvilket rum der skal tildeles som laserparrede, og hvilke der som ikke-parrede. Hvis stimuleringen viser sig at være givende, kobles laseren til det mindst foretrukne rum under "Pretest" og til det mest foretrukne, hvis stimuleringen er aversive. Således følger den præsenterede RT-PP protokol et forudindtaget design i den forstand, at laser stimulation ikke er tilfældigt tildelt nogen af de to vigtigste rum (upartisk design), men er valgt for at undgå enhver indledende præference for musen. Adgang til det andet hovedrum eller det neutrale rum, der forbinder de to hovedrum, giver ikke anledning til intrakraniel lysstimulering og er derfor ikke lysparret. Disse sessioner giver mulighed for real-time vurdering af de givende eller aversive egenskaber stimulation af specifikke neuronale populationer. På den sidste dag i "Fase 1" finder en 15 min session uden stimulering sted. Denne session tjener til at løse betingede svar ("CR"),som skyldes associativ læring mellem stimulering og miljø, hvor den blev modtaget. Mindst tre dage efter "Fase 1" finder "Tilbageførselsfasen" sted, som følger samme struktur som "Fase 1", men det tidligere ikke-parrede hovedrum er nu parret med let stimulering. Som det er tilfældet med "Fase 1", efterfølges de to stimuleringssessioner af en " CR"-session. "Tilbageførselsfasen" bruges til at bekræfte, at musens adfærd er betinget af optogenetisk stimulation og ikke relateret til tilfældige parametre. Hver session af RT-PP eksperimentet skal programmeres separat i tracking-softwaren. Den aktuelle protokol beskriver sådanne indstillinger i en bestemt software, men enhver anden tracking software i stand til at sende transistor-transistor-logik (TTL) modulering signaler til lyskilden kan bruges.
Den anden protokol beskriver en ny opsætning kaldes Neutral Compartment Preference (NCP) paradigme. Denne ændrede protokol for RT-PP udnytter den lille størrelse og gennemsigtighed i forbindelseskorridoren, som naturligvis undgås af musen på grund af dens smalle og gennemsigtige sammensætning. Ved at parre begge hovedrum med lysstimulering og kun lade korridoren være fri for lysstimulering kan NCP-opsætningen bruges til at teste, om den optogenetiske stimulation vil tvinge musen til at bruge mere tid i korridoren for at undgå at modtage optogenetisk stimulation. Ved at sammenligne den tid, der bruges i de to lysparrede rum, med den tid, der tilbringes i korridoren, kan der foretages en kontrol af optogenetisk induceret aversion. NCP-eksperimentet består af to på hinanden følgende daglige sessioner, hvor optogenetikmus får stimulering (30 min hver) til at måle præference i realtid, og en laserfri session (15 min) til at vurdere betingede reaktioner på samme måde som dem i RT-PP Protokollen.
RT-PP og NCP protokoller nedenfor blev for nylig valideret i vores laboratorium i studiet af, hvordan forskellige typer af neuroner placeret i ventrale tegmental område (VTA) er involveret i forskellige aspekter af belønning-relateret adfærd12. Her, for at eksemplificere gennemførelsen af RT-PP og NCP protokoller, dopamin transportør (DAT)-Cre19 og vesikulære glutamat transporter 2 (VGLUT2)-Cre20 transgene mus blev stereotaktisk injiceret med AAV transporterer en floxed channelrhodopsin2 (ChR2) DNA konstruere i VTA hvorefter en optisk fiber blev implanteret over VTA. Adfærdsmæssige reaktioner opnået ved analyse af disse mus ved hjælp af de medfølgende RT-PP og NCP protokoller viser, hvordan aktivering af dopaminerge og glutamaterge neuroner i VTA fører til forskellige adfærdsmæssige reaktioner(Figur 1).
Trin-for-trin protokoller for RT-PP og NCP paradigmer er forsynet med oplysninger lige fra genoyping af transgene mus, stereotaxiske virale injektioner og fiberoptiske placering, til programmering af tracking software til laser-kontrol og adfærdsmæssige Vurdering. Desuden drøftes forslag til ændringer af protokollen med hensyn til stimuleringsparametre og eksperimentelle aspekter, der kan påvirke det videnskabelige resultat. Mens protokoller er beskrevet i forbindelse med VTA, kan de anvendes på enhver hjerne område eller neuronal befolkning, forudsat de relevante optogenetics værktøjer, såsom relevante Cre-driver og floxed opsins, er tilgængelige.
Protocol
Denne undersøgelse er udført ved hjælp af heterozygous DAT-Cre19 og VGLUT2-Cre20 mus af begge køn, alderen >8 uger og vejer >20 g. Alle forsøgene blev udført i henhold til den svenske (Animal Welfare Act SFS 1998:56) og EU-lovgivning (konvention ETS 123 og direktiv 2010/63/EU) med tilladelse fra de lokale etiske komitéer for dyr.
1. Genoyping af mus
- Tag ørebiopsier ved hjælp af en ørepuncher til brug for genoyping af de transgene mus.
- Forbered øreslagtil at udføre en polymerase kædereaktion (PCR) reaktion ved hjælp af specialfremstillede primere.
BEMÆRK: I denne protokol blev der anvendt kre-instrueret primere.- Der tilsættes 75 μL lysisbuffer (buffer 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) i hvert 1,5 ml rør, der indeholder en ørepunch.
- Inkuber i en varmeblok ved 96 °C i 30 min.
- Prøverne må køle af i 5 min og tilsæt derefter 75 μL af neutraliseringsbufferen (buffer 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
- Udfør PCR i henhold til standardprocedurer12,21 ved hjælp af de relevante primere (her: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3').
FORSIGTIG: Arbejd på is under en PCR-hætte, og vær opmærksom på ikke at forurene reagenserne og prøverne.- Forbered PCR-mastermixet. Formere følgende mængder i henhold til, hvor mange prøver der skal analyseres, herunder passende kontrolprøver. Reagenserne blandes for en enkelt 25 μL slutvolumenreaktion i følgende rækkefølge: destilleret vand (18,9 μL), 10 x buffer med MgCl2 (2,5 μL), 10 mM dNTP-blanding (0,5 μL), 10 μM fremadprimer (1 μL), 10 μM omvendt primer (1 μL), 5 U/μL DNA-polymerase (0,1 μL) og a-skabelon 1 μL( 1 μL; vil blive tilføjet i de næste trin).
BEMÆRK: Tilføj altid et negativt, positivt og et tomt (uden skabelon-DNA) for at sikre gyldige resultater. - Der tilsættes 24 μL mastermix i PCR-rør.
- Tilføj 1 μL skabelon DNA (kommer fra øret punch fra hver mus) i hvert PCR rør.
- Centrifuge pcr rør kort for at sikre skabelonen DNA er inde i master mix.
- Udfør PCR med en termisk cycler ved hjælp af cykelprogrammet i tabel 1.
- Forbered PCR-mastermixet. Formere følgende mængder i henhold til, hvor mange prøver der skal analyseres, herunder passende kontrolprøver. Reagenserne blandes for en enkelt 25 μL slutvolumenreaktion i følgende rækkefølge: destilleret vand (18,9 μL), 10 x buffer med MgCl2 (2,5 μL), 10 mM dNTP-blanding (0,5 μL), 10 μM fremadprimer (1 μL), 10 μM omvendt primer (1 μL), 5 U/μL DNA-polymerase (0,1 μL) og a-skabelon 1 μL( 1 μL; vil blive tilføjet i de næste trin).
- Forbered en agarose gel til at køre prøverne ved hjælp af elektroforese.
BEMÆRK: Størrelsen afhænger af antallet af prøver, der skal analyseres.- Tilsæt 1% w/v agarosepulver i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer i en glasflaske. Varm i mikrobølgeovn, indtil agarose er helt opløst, kontrol regelmæssigt, at det ikke koger over.
FORSIGTIG: Tag forholdsregler for at undgå forbrændinger. - Gelen må køle af til ca. 50 °C og tilsættes en nukleinsyregelplet (0,5 μL/50 ml gel).
- Hæld gelen i støbebakken, der indeholder godt kamme, og lad den være i stuetemperatur, indtil den bliver fuldstændig størknet. Fjern kammene forsigtigt.
- Fyld elektroforesetanken med 1x TAE buffer, og læg gelen i tanken.
- Der tilsættes 2 μL 1x DNA-belastningsfarvestof i hver enkelt af DNA-prøverne.
- Læg 4 μL DNA-stigen i gelens første brønd, og fortsæt derefter med at indlæse hele mængden af prøverne i de resterende brønde.
- Indstil elektroforeis en effektkilde til 140 V, og kør i 25−30 min.
- Placer gelen under en UV-kilde og tag et billede af resultaterne.
- Tilsæt 1% w/v agarosepulver i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer i en glasflaske. Varm i mikrobølgeovn, indtil agarose er helt opløst, kontrol regelmæssigt, at det ikke koger over.
2. Stereotaxic kirurgi
- Efter genoyping, separate mus holde dem positive for Cre. Vent, indtil de er mindst 8 uger gamle og vejer 0,20 g for at udføre kirurgi.
- Desinficere miljøet og sterilisere de kirurgiske værktøjer til at udføre kirurgi under aseptiske forhold.
- Injicer musene subkutant med smertestillende 30 min før operationen.
- Bedøve musene med isofluran (2−3% i normal luft til induktion og 1,5−2,0% til vedligeholdelse af anæstesi). Sørg for tilstrækkelig anæstesi niveau opnås ved at teste fraværet af smerte reflekser ved forsigtigt at klemme tåen af musen. Juster isofluranleveringen i overensstemmelse hermed.
- Anbring musen på det stereoskattemæssige apparat. Tilsæt øjensmøremiddel for at forhindre øjenlæsioner på grund af tørhed og barberhåret i toppen af kraniet. Brug en varmepude til at opretholde temperaturen af musen stabil.
- Injicer 100 μL lokalbedøvelse under huden på kraniet og lad 5 min træde i kraft.
- Forbered indsnitsstedet med tre cirkulære anvendelser af alkohol eller steril saltvand skiftevis med jod. Brug en steril bomuldsspids, og start applikationen fra indsnitslinjen udad.
- Løft forsigtigt huden med pincet, og lav et snit på ~ 1,5 cm langs rostrocaudalaksen med kirurgisk saks for at afsløre kraniets overflade.
- Brug en vatpind, anvende H2O2 opløsning til at fjerne periosteum.
- Skyl kraniet med steril saltvand og tør det ved hjælp af sterile vaterseapplikatorer.
- Find bregma og lambda.
- Fastslå flad kraniet justering ved at placere spidsen af injektionnålen, justeret på den stereoskattemæssige ramme, på bregma og lambda. Mål ventralkoordinaterne for hver position og sammenlign. Når kraniet er fladt ventralkoordinat for både bregma og lambda er identiske. Hvis ikke, justeres hovedets position, og målingerne skal foretages igen.
- Find og markér positionen (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm fra bregma ifølge Franklin og Paxinos22), hvor injektionen af cre-afhængig virus og implantation af optisk fiber vil finde sted og lave et lille hul ved hjælp af en mikroboremaskine.
- Der indlæses 400 nL virus i den 10 μL sprøjte, der er monteret på det stereoskattemæssige apparat ved hjælp af en præcisionspumpe.
- Sænk nålen (34 G, skrå) omhyggeligt og tilsprøjt 300 nL cre-afhængig optogenetisk virus (AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5,6 x 1012 vg/ml]) i VTA (AP: -3,45 mm ML: -0,2 mm fra bregma og -4,4 mm fra kraniets overflade, ifølge Franklin og Paxinos22) ved 100 nL/min injektionshastighed ved hjælp af præcisionspumpen.
- Efter injektionen skal nålen være på plads i yderligere 10 minutter for at gøre det muligt at diffusion af virusset (figur 2A).
- Træk nålen langsomt tilbage fra injektionsstedet.
- Lav små huller ved hjælp af en mikroboremaskine til at passe anker skruer, der vil stabilisere den optiske fiber og dental cement kompleks.
- Tag bregma koordinaterne igen og implanter optiskfiber (200 μm diameter, 0,37 NA) på: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm fra bregma og -4,0 mm fra overfladen af kraniet (Figur 2B) ifølge Franklin og Paxinos22.
- Fastgør fiberen på kraniet ved hjælp af dental cement. Påfør nok cement omkring den optiske fiber ferule at sikre det til kraniet, men vær opmærksom på at forlade 3−4 mm af toppen af ferule fri for cement til at tillade tilslutning af plasterledningen(figur 2C).
BEMÆRK: Vær opmærksom på ikke at fylde hullet med cement, da dette kan forårsage hjerneskade. Hæmostatiske materialer kan tilføjes i hullet for at forhindre dette i at ske. - Brug vævlim eller absorberbare suturer til at lukke ethvert åbent sår og lad dyret komme sig i mindst to uger. Giv en ekstra dosis smertestillende 12−24 timer efter operationen.
3. Opsætning af styring af laserkilden
- Brug enkeltbordsmikrocontrollere til at styre laserkilden. Skriv et script ved hjælp af den relevante software. Læg scriptet på mikrocontrollerkortet ved hjælp af det relevante forbindelseskabel til computeren.
BEMÆRK: Scriptet skal omfatte ekstern graduering (input), der kommer fra sporingssoftwaren via en TTL-boks, og en udgang til laseren for at styre stimuleringsparametre. For 10 ms pulsbredde ved 20 Hz-frekvens skal du bruge scriptet i den supplerende kodningsfil. - brættet til laseren og TTL-boksen for sporingshardwaren.
- Brug et netværkskabel til at forbinde TTL-boksen til brættet (pin 5 for det medfølgende script) (Figur 3A,C).
- Sørg for, at laseren er indstillet til at styre ved ekstern graduering og tilslutte laseren til brættet ved hjælp af et FC/PC-kabel (pin 13 for det givne script)(figur 3B,C).
- Tilslut de relevante stifter til jorddele af brættet.
- Tilslut laserkilden til den optiske fiber.
- Tilslut laserkilden til en roterende samling (Figur 3D).
- Tilslut en plasterledning(figur 3E) til drejeleddet.
- Stabilisere drejeleddet over apparatet, men uden for optageområdet. Sørg for, at længden af den fiberoptiske patchledning er passende, så musen kan bevæge sig uden problemer i arenaen (figur 3F).
4. Opsætning af eksperimentet for RT-PP tilgang inden for tracking software
- Kalibrer opsætningen af arenaen. Brug en lineal til at måle en bestemt del af det fysiske apparat, tegne en streg, der svarer til den del, der måles på billedet i softwaren under fanen Tegneskala for at kalibrere, og angiv den allerede kendte værdi (trin 1 i figur 4).
- Design arenaen. Tegn det område, hvor musenes bevægelse registreres (trin 2 i figur 4).
- Opret zonerne. Tegn de zoner, der i sidste ende vil blive tildelt som laser-parret, laser-unpaired og "neutral" (trin 3 i figur 4).
- Valider opsætningen for at bekræfte, at der ikke er nogen modstridende parametre, f.eks.
- Indstil de eksperimentelle parametre under indstillingerne for prøvekørsel under fanen (trin 5 i figur 4).
- Indstil prøvetiden som vist i trin 1 i figur 5 for en 30 min RT-PP-session.
- Sørg for, at "hardwarestyring" er aktiveret, skal du tildele et rum som laserparret, hvor indtastning af musen vil udløse et TTL-signal via sporingssoftwaren til mikrocontrollerkortet. I figur 5 (trin 2) er det laserparrede rum rum A. For tilbageførselsfasen skal du skifte rummene, så rum B vil blive laserparret, og rum A vil være uparret. Gør dette ved at erstatte A med B og B med A i softwaren.
5. Ændring af opsætningen for at teste stimuleringens aversive egenskaber ved hjælp af NCP-indflyvningen
- Følg trin 4.1−4.4 som beskrevet tidligere.
- Indstil eksperimentets tid til 30 min gennem indstillingen "Gentag til" i indstillingerne for feltet "Reference" (trin 1 i figur 6).
- Tildel både A- og B-zoner som laserparrede (trin 2 i figur 6) ved at tilføje "når midtpunktet er i et af zone A- og zone B-zoner" for betingelsesboksen, der er relateret til indstillingerne for A- og B-rum. Bemærk, at laseren slukker, når dyret er placeret i det neutrale rum.
6. Udførelse af et eksperiment ved hjælp af laserstimulation
- Konfigurer registreringsindstillingerne.
- Brug en dukke til at ligne musen for at sikre passende registreringsindstillinger.
- Anbring dukken i et rum i apparatet, og brug automatiseret opsætning med dynamisk subtraktion.
- Fjern dukken, og placer den i det modsatte rum. Sørg for, at dukken er fuldt opdaget, og hvis ikke, justere indstillingerne via softwaren for at opnå korrekt registrering.
- I løbet af dette trin også kontrollere, om stimuleringvirker som det formodes at. Start erhvervelse nitaftag ved hjælp af de tidligere konfigurerede prøvekontrolindstillinger, og placer dukken i det laserparrede rum, og se, om stimuleringen udløses, som den skal. Anbring derefter dukken i det uparrede og/eller det neutrale rum, og se, om stimuleringen stoppes.
- Brug en effektmåler med en sensor til at indstille lasereffekten til 10 mW ved hjælp af knappen på laseren (Figur 3B). Udfør dette trin, hver gang laserstimulering bruges.
FORSIGTIG: Brug beskyttelsesøjeudstyr, da direkte udsættelse for laserlys kan forårsage permanent øjenskade. - Anbring musen i apparatet.
- Tag forsigtigt musen ud af buret og tilslut det fiberoptiske implantat til den fiberoptiske plasterledning ved hjælp af et keramisk ærme.
- Anbring musen forsigtigt i det neutrale rum i trerumsapparatet.
- Vent, indtil musen registreres af softwaren.
- Fjern de lodrette skydedøre, der begrænser dyret sat i at trænge ind i hovedrummene.
- Lad dyret udforske frit uden forstyrrelser.
BEMÆRK: Den samme procedure følges, når dyret ikke modtager stimulering med undtagelse af, at trin 6.2 ikke er nødvendigt, og at laseren er slukket hele tiden.
Representative Results
Apparatet med tre segmenter (figur 3F) er egnet til at håndtere de givende virkninger af lægemidler og i realtid vurdere de givende eller aversive egenskaber ved direkte stimulering af neuroner ved hjælp af optogenetik. Den består af to hovedrum (20 cm [W] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) og et mindre forbindelsesrum (20 cm [W] x 7 cm [L] x 25 cm [H]). De vigtigste rum har forskellige væg og gulv tekstur og mønstre for at lette associative læring, mens den forbinder / neutrale rum er smal og gennemsigtig, så musene bruger naturligt mindre tid i det. Som beskrevet ovenfor, tracking software kan bruges til at registrere flere adfærdsmæssige parametre af mus, herunder bevægelse og tid tilbragt i hvert rum, og til at styre laser stimulation. Hele RT-PP-eksperimentet finder sted i 8 sessioner(figur 1A) og giver mulighed for både vurdering af den direkte stimulerings givende eller aversive egenskaber (dag 3, 4, 6 og 7) og dannelsen af foreninger, positive eller negative, som reaktion på tidligere erfaringer (dag 5 og 8, "CR"). ").
For det første testede vi DAT-Cre mus injiceret med AAV-ChR2-eYFP virus i VTA at målrette dopaminerge neuroner. I overensstemmelse med litteraturen vi bemærkede, at musene foretrak at tilbringe tid i rummet parret med stimulering(figur 1B,fase 1, dag 3 og 4, blå cirkler, to-vejs gentagne foranstaltninger [RM] analyse af varians [ANOVA], effekten af rum F(2,18) = 141, p < 0,001; effekt af session x rum F(12,108) = 42,1, p < 0,001; Tukey's post hoc test parret vs ikke parret p < 0,001). Tilbageførselsfasen, hvor parringen af rum til laserstimulering blev skiftet, bekræftede disse observationer(figur 1B,dag 6 og 7, blå cirkler, Tukey's post hoc-test parret vs uparret rum p < 0,001) og udelukkede således muligheden for, at resultaterne fra fase 1 var relateret til sidebias eller tilfældige parametre. I gennemsnit den tid, der tilbringes i hvert rum i løbet af de fire dage af RT-PP bekræftet, at musene brugt i gennemsnit omkring 70% af deres tid i laser parret rum i modsætning til den uparrede (~ 20%) og den neutrale (~10%) rum(Figur 1B bar graf, envejs RM ANOVA, effekt af stimulation F(2,6) = 139, p < 0,001, Tukey's indlæg, hvordan parret vs uparrede og neutrale rum p < 0,001). Desuden brugte musene i mangel af stimulering på dag 5 og 8 betydeligt mere tid i rummet, der tidligere var parret med laserstimulation (Tukey's post hoc p < 0,001), hvilket indikerer, at den tidligere erfaring var tilstrækkelig til at fremkalde associativ læringsadfærd, der afspejles som "søger" af stimuleringen. Disse data er i overensstemmelse med litteraturen og viser, at den nuværende metode kan anvendes pålideligt til at undersøge de givende virkninger af optogenetisk stimulation af specifikke neuronale populationer i VTA.
Vi testede derefter VGLUT2-Cre mus injiceret med AAV-ChR2-eYFP i VTA som ovenfor, at målrette glutamatergic neuroner i VTA. I dette eksperiment observerede vi en modsat adfærdsmæssig fænotype fra den, der blev demonstreret af DAT-Cre-musene. Musene undgik således rumparret med stimuleringen og brugte mere tid i de uparrede dage(figur 1C til venstre, tovejs RM ANOVA, effekten af rum F(2,12) = 40,9, p < 0,001; effekten af session x rum F(12,72) = 16,1, p < 0,001; Tukey's post hoc test parret vs ikke parret p < 0,001; Figur 1C højre, envejs RM ANOVA effekt af stimulation F(2,6) = 162, p < 0,001, Tukey's post hoc parret vs uparrede og neutrale rum p < 0,001). Interessant nok viste musene i"CR"dag 5 og 8 ikke en klar undgåelse af det tidligere parrede rum (ingen forskelle mellem parrede og uparrede rum). Det er muligt, at manglen på betinget respons skyldes utilstrækkelig tid brugt i laser parret rum, som forhindrede dannelsen af forbindelser mellem laser aktivering og det særlige miljø, hvor det fandt sted. For yderligere at udforske denne undgåelse fænotype, brugte vi en modificeret protokol, som vi kaldte "neutral rum præference", forkortet NCP. I dette eksperiment blev begge hovedrum parret med stimulering, og det neutrale rum forblev stimuleringsfrit (figur 7A). Vi hypotese, at hvis stimuleringen har aversive egenskaber, så musen vil blive tvunget til at tilbringe tid i de mindre, neutrale rum, for at undgå det. I begge dage med stimulering (Stim1 og Stim2) tilbragte musene størstedelen af tiden i det neutrale rum (ca. 80 %) sammenlignet med de parrede rum (figur 7B,C; venstre: tovejs RM ANOVA effekt af rum F(2,8) = 70,9, p < 0,001; effekt af session x rum F(4,16) = 6,9, p = 0,002, Tukey's post hoc "Stimulation 1" neutralt rum vs rum 1 og 2 p < 0,01, "Stimulation 2" neutralt rum vs rum 1 og 2 p < 0,001; højre: envejs RM ANOVA, effekt af stimulation F(2,2) = 54,2, p = 0.018, Tukey's post hoc test parret 1 og 2 vs neutral p < 0,05). Som det var tilfældet med "CR" dage under RT-PP-testen, syntes musene ikke at danne negative forbindelser mellem rummene og stimuleringen. det vil sig være, at de i mangel af stimulering (CR) undersøgte alle rum i samme grad(figur 7B, ingen forskelle mellem den tid, der tilbringes i parrede rum og neutralt rum). Resultaterne af disse eksperimenter bekræftede adfærdsmæssige fænotype observeret under RT-PP setup og dermed støtte den kombinerende gennemførelse af både RT-PP og NCP paradigmer.
Figur 1: Adfærdstest ved hjælp af optogenetik i RT-PP paradigme. A) Skematisk repræsentation af tidsplanen for forsøgene. (B,C) Øverst til venstre: graf, der repræsenterer den procentdel af den tid, der tilbringes i hvert rum i hele RT-PP-eksperimentet for DAT-Cre (N = 10) og VGLUT2-Cre (N = 7) mus injiceret med AAV-ChR2-eYFP. Blå cirkler: laser-parret rum; hvide, sorte cirkler: hovedrum; grå cirkler: neutralt rum. Øverst til højre: gennemsnitlig procentdel af den tid, der tilbringes i hvert rum i løbet af dag 3, 4, 6 og 7 (RT-PP). Bund: repræsentative heatmaps af tid tilbragt i hvert rum for en DAT-Cre og en VGLUT2-Cre mus. Alle data blev normalt distribueret (Shapiro-Wilk test). Resultaterne præsenteres som middel ± SEM. ***p < 0,001 parret vs ikke parret; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 parret vs neutralt rum; §§p < 0,01, §§§p < 0,001 uparret vs neutralt rum. Dette tal er blevet ændret fra Bimpisidis et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kirurgisk procedure for optogenetiske eksperimenter. (A) Injektion af Cre-afhængig viral vektor i VTA. (B) Implantation af optisk fiber over injektionsstedet. Bemærk de ankerskruer, der bruges til stabilisering. (C) Permanent forankring af fiberen på kraniet ved hjælp af dental cement. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Udstyr, der anvendes i optogenetikforsøg. (A) Den TTL-boks, der blev anvendt i undersøgelserne. Den modtager input fra sporingssoftwaren og sender TTL-signaler til microcontroller-kortet. (B) Front (top) og bagvisning (nederst) af den laserkilde, der anvendes til forsøgene. (C) Det mikrocontrollerbræt, der anvendes til at styre laserstimuleringen. Bemærk forbindelserne fra TTL-boksen og til laserkilden. (D) Roterende fælles. (E) Fiberoptisk patch akkord anvendes i forsøgene. F) Det apparat med tre segmenter, der anvendes til RT-PP- og NCP-forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Design af arena og zoner i sporingssoftwaren. Trin 1: Kalibrering af opsætningen. Trin 2: Tegning af hele arenaen. Trin 3: Tegnezoner i arenaen. Trin 4: Validering af installation. Trin 5: Fanen Indstillinger for prøvestyring til opsætning af tids- og stimuleringsparametre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Opsætning af tids- og stimuleringsparametre for et RT-PP-eksperiment i sporingssoftwaren. Tilføjelse af specifikke regler for varigheden (trin 1) og betingelserne for lysstimulering (trin 2). Betingelserne kan let ændres, så de passer til kravene til tilbageførselsfasen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Opsætning af tids- og stimuleringsparametre for NCP-eksperimenter i sporingssoftwaren. Varigheden af stimuleringssessioner (trin 1) svarer til dem for RT-PP, men betingelserne for lysstimulationaktivering (trin 2) er forskellige. Adgang til enten hovedrum (her med navnet zone A og zone B) resulterer i optogenetisk stimulation, der kun afsluttes, når musen kommer ind i det neutrale rum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Adfærdstest ved hjælp af optogenetik i NCP paradigme. (A) Skematisk repræsentation af den eksperimentelle setup. (B) Venstre: graf, der repræsenterer den procentdel af den tid, der tilbringes i hvert rum i løbet af de to dages stimulation (Stim1 og Stim 2) og under den konditionerede responssession (CR) for VGLUT2-Cre-mus, der injiceres med AAV-ChR2 i VTA (N = 5). Højre: gennemsnitlig procentdel af den tid, der tilbringes i hvert rum i løbet af de to dage af stimulering af NCP. C) Repræsentativheatmap for tid tilbragt i hvert rum for en VGLUT2-Cre mus i løbet af en af stimuleringsdagene. Data blev normalt distribueret (Shapiro-Wilk test). Resultaterne præsenteres som middel ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 uparret vs parret 1 og parret 2 rum. Dette tal er blevet ændret fra Bimpisidis et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Trin | Temperatur | Varighed | Cykler |
| 1. Indledende denaturering | 95 °C | 4 min. | 1 |
| 2. Denaturering | 95 °C | 30 s. | 30 |
| 3. | 55 °C | 30 s. | |
| 4. Forlængelse | 72 °C | 40 s | |
| 5. Endelig forlængelse | 72 °C | 6 min. | 1 |
| 6. Hold | 4 °C | Indtil stoppet af eksperimentatoren | 1 |
Tabel 1: PCR-cykelprogrammet.
Supplerende kodningsfil. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).
Discussion
I den aktuelle undersøgelse præsenterer vi to trin-for trin protokoller om, hvordan man udfører forskellige typer af sted præference analyser ved hjælp af optogenetik i mus. De skitserede protokoller blev brugt til at vurdere den givende eller aversive adfærdsmæssige fænotyper af VTA neuroner(Figur 1 og figur 6)12, men kan udnyttes til at udforske den adfærdsmæssige rolle neuroner i andre hjerne regioner samt.
Flere nylige undersøgelser har beskrevet RT-PP paradigmer i to-rum23,24 og tre-rum apparater13,14,15,16,17,18. De nuværende protokoller beskriver detaljerede opsætninger for RT-PP og NCP protokoller i en tre-rum apparat ligner dem, der traditionelt anvendes i CPP eksperimenter til at vurdere adfærdsmæssige virkninger på administration af narkotika af misbrug. Mens resultaterne kun præsenteres her som den procentdel af tid musen brugt i hvert rum, tracking software gør det muligt for analyse af flere andre adfærdsmæssige parametre, såsom overgange til zoner, hastighed, tid brugt immobile og meget mere. Analyse af forskellige parametre kan være af betydning for fortolkningen af data.
De nuværende RT-PP protokoller er fleksible og kan ændres for at teste, om forskellige typer af stimulation mønstre har givende effekter. Parametrene for laserkontrol kan nemt ændres enten gennem scriptet på microcontroller bord eller inden for tracking software, der viser alsidigheden i opsætningen. Vi foreslår en 20 Hz stimulation frekvens, som er inden for området, og undertiden lavere, af frekvenser anvendes i tidligere undersøgelser ved hjælp af samme opsin variant (ChR2/H134R) til at studere dopaminerge og glutamatergic neuroner og deres terminaler13,14,16,17,18,23,24,25,26,27. Nylige undersøgelser har vist, at højere stimulation frekvenser kan have den modsatte effekt på adfærd end lavere, og at disse virkninger er medieret gennem en depolarisering blok forårsaget af højere frekvenser28. Tilsvarende, forskelle i adfærdsmæssige output er blevet vist, når stimulere glutamatergic og GABAergic neuroner i den laterale præoptiske område15. Disse undersøgelser undersøgte neuroner i forskellige områder end VTA og de største virkninger blev observeret på høje frekvenser af ikke-glutamatergic neuroner15,28. Vores valg på 20 Hz er baseret på tidligere undersøgelser af glutamatergic og dopaminerge VTA neuroner viser, at ved varierende stimulation frekvenser, belønning-relaterede adfærdsmæssige output er ikke væsentligt ændret24,26.
En yderligere parameter, der kan justeres, og som kan påvirke det eksperimentelle resultat, er lyskildens kraft. Højere lasereffekt kan øge størrelsen af det lysstimulerede område, hvilket kan være gavnligt i nogle typer eksperimenter, men med ulempen ved en stigning i temperatur5. Faktisk, en nylig undersøgelse har vist, at laser-induceret stigninger i temperaturen kan ændre hjernens fysiologi og påvirke adfærdsmæssige målinger29. Disse observationer understreger betydningen af at medtage opsinnegative kontroller i forsøgsdesignet. I den nuværende protokol, Vi brugte 10 mW laser magt, der er ens og har tidligere vist sig at være effektiv til at stimulere dopaminerge og glutamatergic neuroner i VTA16,24,26. Ved opsætning af eksperimenter, er det vigtigt at være opmærksom på størrelsen af det område, hvor cellerne af interesse er placeret, og fiber-optik og patch ledning egenskaber (numerisk blænde, kerne diameter). Disse parametre er afgørende for at tage hensyn til, når du udfører beregninger relateret til lasereffekt. For detaljer, kan regnemaskinen udviklet af Karl Deisseroth's lab (http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php) bruges.
Histologisk verifikation af Cre-Lox rekombination er et andet kritisk aspekt, når du anvender optogenetics eksperimenter. Validering af rekombinationseffektiviteten bør altid finde sted i en pilotkohorte, før der iværksættes adfærdseksperimenter hos en stor gruppe dyr. Dette er vigtigt af etiske årsager, men også for optimeret eksperimentel output. Hver viral konstruktion kan vise variabel specificitet for forskellige neuronal typer og i forskellige regioner5, en parameter, der kan påvirke eksperimenter i uforudsigelige og endda vildledende måder. For eksempel har vi tidligere valideret Cre-Lox-rekombinationsmønstret for AAV5-vira i VTA af DAT-Cre-mus og konstateret, at ensidige injektioner var tilstrækkelige til at målrette størstedelen af interesseområdet. Da vi derefter studerede rumligt begrænsede underpopulationer inden for VTA, såsom en karakteriseret ved NeuroD6 udtryk, bemærkede vi, at bilaterale virale injektioner var mere effektive til at målrette større antal neuroner giver mere udtalt adfærdsmæssige virkninger på optogenetiske lys-stimulation12. Desuden skal tiden fra operation til indledning af adfærdseksperimenter behandles omhyggeligt. To uger er nok tid til en ChR2 DNA konstruktion, der skal udtrykkes i celle organer, som vi viser her, men længere ventetider (~ 8 uger) kan være nødvendig, hvis investigator tester effekten af stimulation i projektion områder13,14,15,17.
Det er værd at bemærke, at mængden af virus injiceres (i vores tilfælde 300 nL) kan være egnet, når de studerer neuroner i VTA, men volumen og titer skal justeres afhængigt af effektiviteten af transduktion og størrelsen af den undersøgte struktur. For bilaterale strukturer, der er placeret i en afstand fra den mediolaterale akse, kan det desuden være nødvendigt at foretage bilaterale injektioner og også implantere fibertikere bilateralt for at sikre aktivering/hæmning på begge halvkugler.
Endelig er det altid nødvendigt at udføre post-mortem histologisk analyse for at validere og bekræfte effektiviteten af Cre-Lox rekombination og for at kontrollere den korrekte implantation site af den optiske fiber på det tilsigtede sted. Uventet, overbegrænset eller overdreven Cre-Lox-rekombination kan forekomme på grund af ukendt fordeling af neuroner, der udtrykker Cre uden for det tilsigtede områdes grænser, eller på grund af forskelle i virusserotypen, dårlig håndtering af virus, tilstopning af sprøjte til viruslevering eller andre operationsrelaterede problemer. Verifikation af tilfredsstillende Cre-Lox-rekombination og korrekt fiberoptisk implantation skal udføres for at bekræfte eventuelle statistiske resultater af adfærdsvurderingerne for at drage sikre konklusioner.
Med hensyn til de data, der leveres her som eksempler på, hvordan de to adfærdsmæssige paradigmer kan anvendes, den betydelige præference for den lys-parret side opnået ved optogenetisk stimulation af dopaminerge neuroner i VTA ved at analysere DAT-Cre mus i RT-PP paradigme var forventet baseret på tidligere resultater23,24,25,26,27, mens undgåelse af denne side vist af VGLUT2-Cre mus var ikke forventet. VGLUT2 neuroner af VTA og deres fremskrivninger har vist sig at være involveret i både belønning og aversion16,17,24,30,31, og vi har derfor udført NCP analyse for at vurdere den tilsyneladende undgåelse adfærd observeret i den nuværende RT-PP setup mere detaljeret. Ved at bruge den smalle, gennemsigtige korridor som den eneste ikke-lys parret rum for at bekræfte de aversive egenskaber stimulation af VTA glutamatergic neuroner, er det indlysende, at i denne særlige tre-rum setup, optogenetisk aktivering af disse neuroner forårsager en aversive reaktion. Disse forsøg, som her blev vist for at eksemplificere situationer, der kunne drage fordel af at bruge både RT-PP- og NCP-protokollerne, var en del af en nyligt offentliggjort undersøgelse, og det fuldstændige datasæt samt drøftelserne om disse resultater kan findes i denne publikation12.
Ud over NCP, alternative måder at bekræfte aversion omfatter den stærke belysning af et område inden for et åbent felt område, mens parring resten af arenaen til laser aktivering, eller udføre en aktiv undgåelse opgave, hvor musen er nødt til at udføre et bestemt mønster af adfærd til at opsige laser stimulation15.
For at opsummere, de beskrevne protokoller give kritiske oplysninger om, hvordan man med succes udføre RT-PP og NCP analyse på den mest effektive måde med henblik på at optrævle den rolle, neuronal aktivering i belønning og aversion. Afhængigt af den videnskabelige hypotese, en række parametre kan analyseres ved hjælp af disse protokoller, og hver protokol kan også kombineres med andre validerede paradigmer for optimerede adfærdsmæssige analyser gennemføre optogenetik til at løse specifikke hjerne områder og neuroner af interesse.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vores finansieringskilder anerkendes taknemmeligt: Uppsala Universitet, Vetenskapsrådet (Sveriges Forskningsråd), Hjärnfonden, Parkinsonfonden, Forskningsfonden for Bertil Hållsten, OE&Edla Johansson, Zoologisk Forskningsog Åhlén. Dyr blev holdt på Uppsala University og eksperimenter blev udført på Uppsala University Behavioral Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | - | a great variety of viruses to suit any project's needs |
| Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
| Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
| Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
| Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
| DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
| DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
| Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
| Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
| Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
| Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
| Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
| Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
| Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
| Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
| Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
| Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
| Nucleic Acid gel stain - GelRed | Biotium | 41003-T | |
| PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | |
| Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
| Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
| Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
| Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
| Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
| Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
| TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
| Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
| Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
| UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |
References
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The Development and Application of Optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34 (1), 389-412 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Pupe, S., Wallén-Mackenzie, Å Cre-driven optogenetics in the heterogeneous genetic panorama of the VTA. Trends in Neurosciences. 38 (6), 375-386 (2015).
- Spanagel, R. Animal models of addiction. Dialogues in Clinical Neuroscience. 19 (3), 247-258 (2017).
- Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), 227 (2007).
- Hoffman, D. C. The use of place conditioning in studying the neuropharmacology of drug reinforcement. Brain Research Bulletin. 23 (4-5), 373-387 (1989).
- Huston, J. P., Silva, M. A. D. S., Topic, B., Müller, C. P. What's conditioned in conditioned place preference? Trends in Pharmacological Sciences. 34 (3), 162-166 (2013).
- Bardo, M. T., Bevins, R. A. Conditioned place preference: What does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153 (1), 31-43 (2000).
- Bimpisidis, Z., et al. The NeuroD6 subtype of VTA neurons contributes to psychostimulant sensitization and behavioral reinforcement. eNeuro. 6 (3), e0066 (2019).
- Root, D. H., Mejias-Aponte, C. A., Qi, J., Morales, M. Role of Glutamatergic Projections from Ventral Tegmental Area to Lateral Habenula in Aversive Conditioning. Journal of Neuroscience. 34 (42), 13906-13910 (2014).
- Steidl, S., Wang, H., Ordonez, M., Zhang, S., Morales, M. Optogenetic excitation in the ventral tegmental area of glutamatergic or cholinergic inputs from the laterodorsal tegmental area drives reward. European Journal of Neuroscience. 45 (4), 559-571 (2017).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Wang, H. L., Qi, J., Zhang, S., Wang, H., Morales, M. Rewarding Effects of Optical Stimulation of Ventral Tegmental Area Glutamatergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 35 (48), 15948-15954 (2015).
- Qi, J., et al. VTA glutamatergic inputs to nucleus accumbens drive aversion by acting on GABAergic interneurons. Nature Neuroscience. 19, 725-733 (2016).
- Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nature Communications. 5, 5390 (2014).
- Ekstrand, M. I., et al. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (4), 1325-1330 (2007).
- Borgius, L., Restrepo, C. E., Leao, R. N., Saleh, N., Kiehn, O. A transgenic mouse line for molecular genetic analysis of excitatory glutamatergic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 45 (3), 245-257 (2010).
- Papathanou, M., et al. Targeting VGLUT2 in Mature Dopamine Neurons Decreases Mesoaccumbal Glutamatergic Transmission and Identifies a Role for Glutamate Co-release in Synaptic Plasticity by Increasing Baseline AMPA/NMDA Ratio. Frontiers in Neural Circuits. 12, 64 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Boston, MA. (2008).
- Tsai, H. C., et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Pascoli, V., Terrier, J., Hiver, A., Lüscher, C. Sufficiency of Mesolimbic Dopamine Neuron Stimulation for the Progression to Addiction. Neuron. 88 (5), 1054-1066 (2015).
- Ilango, A., Kesner, A. J., Broker, C. J., Wang, D. V., Ikemoto, S. Phasic excitation of ventral tegmental dopamine neurons potentiates the initiation of conditioned approach behavior: parametric and reinforcement-schedule analyses. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 155 (2014).
- Kim, K. M., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PLoS ONE. 7 (4), 1-8 (2012).
- Kroeger, D., et al. Galanin neurons in the ventrolateral preoptic area promote sleep and heat loss in mice. Nature Communications. 9, 4129 (2018).
- Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22 (7), 1061-1065 (2019).
- Root, D. H., Estrin, D. J., Morales, M. Aversion or Salience Signaling by Ventral Tegmental Area Glutamate Neurons. iScience. 2, 51-62 (2018).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
