Summary
Her presenterer vi to lett-å-følge trinnvise protokoller for stedpreferanseparadigmer ved hjelp av optogenetikk hos mus. Ved hjelp av disse to forskjellige oppsettene kan preferanse- og unngåelsesatferd vurderes solid i samme apparat med høy romlig og temporal selektivitet, og på en enkel måte.
Abstract
Forstå hvordan nevronal aktivering fører til spesifikk atferdsproduksjon er grunnleggende for moderne nevrovitenskap. Kombinere optogenetikk hos gnagere med atferdstesting i validerte paradigmer tillater måling av atferdsmessige konsekvenser ved stimulering av distinkte nevroner i sanntid med høy romlig og temporal selektivitet, og dermed etablering av årsakssammenhenger mellom nevronal aktivering og atferd. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for et sanntidsstedspreferanse (RT-PP) paradigme, en modifisert versjon av den klassiske kondisjonerte stedspreferansetesten (CPP). RT-PP utføres i et tredelt apparat og kan brukes til å svare på om optogenetisk stimulering av en bestemt nevronal populasjon er givende eller aversiv. Vi beskriver også en alternativ versjon av RT-PP-protokollen, den såkalte cp-protokollen (neutral compartment preference), som kan brukes til å bekrefte aversjon. De to tilnærmingene er basert på utvidelser av klassisk metodikk som stammer fra atferdsfarmakologi og nylig implementering av optogenetikk innenfor nevrovitenskapsfeltet. Bortsett fra å måle stedspreferanse i sanntid, kan disse oppsettene også gi informasjon om betinget atferd. Vi tilbyr trinnvise protokoller som er enkle å følge sammen med eksempler på egne data, og diskuterer viktige aspekter å vurdere når du bruker denne typen eksperimenter.
Introduction
Implementeringen av optogenetikk, et moderne nevrovitenskapseksperimentelt verktøy der lys brukes til å kontrollere nevronal aktivitet, har de siste årene ført til store fremskritt i å forstå hvordan spesifikke nevronale populasjoner påvirker atferd1,2,3. Den enestående romlige og temporale selektiviteten av optogenetikk gjør det mulig å etablere årsakssammenhenger mellom eksitasjon eller hemming av cellegrupper av interesse og atferdsutgang2,3. Romlig selektivitet i optogenetikk er ofte sikret gjennom Cre-Lox-systemet der aktiviteten til Cre recombinase fører til rekombinasjon av dna-sekvenser tilstede mellom Lox-nettsteder, såkalte floxed alleles (flankert av lox nettsteder)4. Målet med å bruke Cre-Lox-systemet i optogenetikk er å oppnå uttrykk for alleles koding optogenetiske opsiner i bestemte nevroner av interesse samtidig som omkringliggende nevroner blottet for uttrykk. Opsins er lysfølsomme proteiner som ved lysstimulering av spesifikk bølgelengde tillater ionstrømning som påvirker neural spenning eller påvirker cellulære funksjoner ved å modulere nedstrøms effektorveier. Nye varianter av opsiner som varierer i aksjon (eksitatoriske, hemmende, modulerende), mekanisme, aktivering av lysbølgelengde og kinetikkegenskaper5 utvikles kontinuerlig for å møte behovene til spesifikke eksperimentelle tilnærminger. Når det gjelder spenning, dikterer bruk av en depolariserende eller hyperpolariserende opsin nevronenes aktivitet (henholdsvis eksitasjon eller hemming) ved lysstimulering ved en bestemt bølgelengde levert inn i hjernen3.
Selektiv promoteraktivitet leder uttrykket cre recombinase til nevroner av interesse. Ved å implementere en floxed allele av opsin av interesse, Cre-mediert rekombinasjon vil sikre at opsin er selektivt uttrykt i nevroner som co-express Cre recombinase3,6. Denne bruken av dobbelttransgene for å lede romlig selektivitet har vist seg svært effektiv i optogenetikk. Dermed, mens lysstimulering for å aktivere opsinene er bredt levert gjennom en intracerebralt implantert optisk fiber koblet til en lyskilde (LED eller laser)3,vil bare nevroner som uttrykker både Cre rekombinase og floxed opsin allele reagere på denne stimuleringen. Cre-Lox-systemet hos gnagere kan oppnås på forskjellige måter ved å bruke bare transgenikk (både Cre recombinase og floxed opsin konstruksjon er kodet i transgene dyr), bare virale injeksjoner (DNA-konstruksjoner for Cre recombinase og floxed opsin leveres begge via en viral bærer), eller en kombinasjon av de to (for eksempel Cre recombinase er kodet av et transgent dyr som injiseres med et virus som bærer floxed opsin konstruksjon)5. Den floxed opsin DNA konstruksjon er vanligvis klonet i ramme med en reporter genet for å muliggjøre visualisering av Cre-mediert rekombinasjon i vev seksjoner. Mens optogenetikk også kan utføres hos rotter, har de presenterte protokollene blitt generert for mus. For enkelhet, mus som bærer både Cre recombinase og floxed opsin vil bli referert til som "optogenetics mus". I protokollene beskrevet nedenfor har optogenetikkmus blitt generert av en blandet transgen (Cre rekombinase under kontroll av to forskjellige arrangører) og viral (ved hjelp av et adeno-assosiert virus, AAV, for å levere floxed opsin DNA-konstruksjon - i vårt tilfelle ChR2 / H134R) tilnærming. Å skaffe og vedlikeholde transgene muselinjer er en viktig del av metodikken. Cre-driver og floxed opsin transgene mus kan produseres for hvert formål, eller kjøpes hvis kommersielt tilgjengelig, som kan en rekke virus bærer DNA sekvenser koding Cre recombinase og floxed opsins i forskjellige former.
Optogenetics kombinert med atferdstesting har vist seg å være et verdifullt verktøy for å studere rollen som distinkte hjerneregioner, eller diskrete nevronale populasjoner, i bestemte typer atferd. I sammenheng med belønningsrelatert atferd har optogenetikk gjort det mulig å verifisere tidligere funn innen atferdsfarmakologi og eksperimentell psykologi, og også tillatt et nytt nivå av spatio-tempomessig relevant disseksjon i hvordan visse nevroner påvirker atferd. En metode som har blitt brukt i flere studier for å vurdere belønningsrelatert atferd er en modifisert versjon av den klassiske metoden kjent som Conditioned Place Preference (CPP). Klassisk CPP har blitt brukt til å vurdere de givende eller aversive egenskapene til rusmidler gjennom deres evne til å indusere Pavlovian assosiasjoner med signaler av miljøet7,8. I Pavlovian termer, stoffet er en ubetinget stimulans siden det kan fremkalle tilnærming eller tilbaketrekking hvis det er givende eller aversive, henholdsvis. Kontinuerlig sammenkobling av stoffet med ulike nøytrale stimuli, som selv ikke fremkaller noe svar, kan føre til tilnærming eller tilbaketrekking bare ved presentasjon av den tidligere nøytrale, men etter paring, såkalte betinget stimuli9. CPP-analyse utføres vanligvis i et apparat som inneholder to rom av samme størrelse, men hvor hvert rom er definert av forskjellige egenskaper, for eksempel gulvtekstur, veggmønstre og belysning (nøytrale stimuli). De to rommene er koblet enten av en korridor eller en åpning mellom rommene. Under kondisjonering mottar motivet, vanligvis en liten gnager, passive injeksjoner av et stoff mens det er begrenset til ett av de to hovedrommene og saltvannet mens det er begrenset til det andre rommet. De givende effektene av stoffet vurderes senere i en stofffri økt når motivet får lov til å fritt utforske hele apparatet. Hvor mye tid brukt i det tidligere legemiddelkoblede rommet (den betingede responsen) anses å gjenspeile Pavlovian læringsmekanismer mediert mellom de givende effektene av stoffet og signalene i rommet forbundet med administrasjonen (betinget stimuli). Hvis dyret tilbringer mer tid i det legemiddelparede rommet, har stoffet indusert en betinget stedpreferanse som betyr at det har givende effekter på atferd. På den annen side, hvis stoffet oppfattes som aversiv, vil dyret unngå stoffet-paret rommet og tilbringe mer tid i saltvannsparet, noe som indikerer betinget sted aversjon (CPA)8,9,10,11.
Siden optogenetikk kan implementeres for å kontrollere nevronal aktivitet i "sanntid", bruk av et atferdsparadigme som ligner på, men forskjellig fra, tillater CPP-oppsettet måling av stedspreferanse ved direkte nevronal aktivering. Optogenetics-drevet analyse av stedpreferanse er derfor ofte referert til som en sanntids stedpreferanse (RT-PP) analyseparadigme. I RT-PP paradigmet erstatter optogenetisk stimulering av forskjellige nevroner via Cre-Lox-systemet systemisk levering av et stoff som utføres i den klassiske CPP, slik at RT-PP-paradigmet i stedet måler hvis optogenetisk indusert nevronal stimulering er oppfattes som givende eller aversiv. Den nåværende beskrivelsen vil fokusere på optogenetikk mus, men også optogenetics rotter kan testes ved hjelp av lignende protokoller.
I stedet for å kondisjonere seg til ett rom om gangen som i det klassiske CPP-paradigmet, kan optogenetikkmusen i RT-PP-paradigmet bevege seg fritt i hele apparatet og atferd registreres gjennom hele økten. Inntreden i et av rommene er forbundet med intrakraniell lysstimulering. Under passende lysstimuleringparametere vil nevroner som uttrykker en eksitatoriv opsin, dermed aktiveres. Hvis lysstimuleringen oppfattes som givende, vil optogenetikkmusen forbli i det lysparede rommet, mens hvis lysstimuleringen oppfattes som aversiv, vil musen gå ut av rommet for å unnslippe stimuleringen. Denne typen analyse gjør det mulig å vurdere betinget læring: Motivet kan utløse lysstimulering og dermed nevronal aktivering ved å gå inn i et rom, og stoppe stimuleringen ved å gå ut av rommet, som ligner på spakpressing under en instrumentell oppgave. Videre kan assosiative læringsmekanismer vurderes under påfølgende økter hvor tid brukt i hvert rom måles i fravær av stimulering. På denne måten kan forskeren dissosiere mellom de umiddelbart givende effektene ved stimulering av nevronene av interesse og den assosiative minnedannelsen knyttet til den12.
I den nåværende studien beskriver vi to trinnvise oppsettprotokoller for optogenetikkdrevet stedpreferanseatferd av fritt bevegelige mus. Den første protokollen beskriver RT-PP i et tre-roms apparat og har blitt skissert basert på protokollene nylig presentert av Root og kolleger13 og andre forfattere12,14,15,16,17,18. Eksperimentet består av to faser bestående av flere daglige økter (vist i figur 1A). Hver økt er designet for forskjellige formål, og parametrene for koblingsstimulering med et rom endres tilsvarende. Den første økten, "Pretest", brukes til å vurdere innledende preferanse for emnet til en av rommene. Mens det er koblet til lappledningen, kan motivet fritt utforske apparatet i fravær av stimulering i 15 min. Hvis den første innstillingen til ett rom er mer enn 80%, er musen ekskludert fra analysen siden innledende sidebias kan forvrenge analysen. Etter "Pretest", "Fase 1" begynner. Den første delen består av to påfølgende, daglige, 30 min økter av "RT-PP". Under "Fase 1", optogenetics musen er koblet til laserkilden gjennom patch ledningen og plassert i arenaen for å fritt utforske den. Musen mottar intrakraniell laserstimulering ved inntreden i et av hovedrommene. Piloteksperimenter kan utføres for å avgjøre hvilket rom som skal tilordnes som laserparet og som ikke er paret. Hvis stimuleringen er vist å være givende, laseren vil bli koblet til minst foretrukket rom under "Pretest" og til den mest foretrukne hvis stimuleringen er aversiv. Dermed følger den presenterte RT-PP-protokollen en partisk design i den forstand at laserstimulering ikke er tilfeldig tildelt noen av de to hovedrommene (objektiv design), men er valgt for å unngå noen innledende preferanse for musen. Inntreden i det andre hovedrommet eller det nøytrale rommet som forbinder de to hovedrommene, gir ikke opphav til intrakraniell lysstimulering og er dermed ikke lysparet. Disse øktene gir mulighet for sanntidsvurdering av de givende eller aversive egenskapene til stimulering av spesifikke nevronale populasjoner. På den siste dagen av "Fase 1", en 15 min økt uten stimulering finner sted. Denne økten tjener til å adressere kondisjonerte svar ("CR") som følge av assosiativ læring mellom stimuleringen og miljøet der den ble mottatt. Minst tre dager etter "Fase 1", "Reversering Fase" finner sted som følger samme struktur som " Fase1" men den tidligere ikke-paret hovedrommet er nå forbundet med lysstimulering. Som i tilfelle av "Fase 1", de to stimulering økter etterfølges av en "CR" økt. Den "Reversering Fase" brukes til å bekrefte at oppførselen til musen er betinget av optogenetisk stimulering og ikke relatert til tilfeldige parametere. Hver økt i RT-PP-eksperimentet må programmeres separat i sporingsprogramvaren. Gjeldende protokoll beskriver slike innstillinger i en bestemt programvare, men annen sporingsprogramvare som kan sende transistor-transistor-logic (TTL) modulasjonssignaler til lyskilden, kan brukes.
Den andre protokollen beskriver et nytt oppsett kalt Neutral Compartment Preference (NCP) paradigme. Denne modifiserte protokollen til RT-PP utnytter den lille størrelsen og gjennomsiktigheten til tilkoblingskorridoren som naturlig unngås av musen på grunn av sin smale og gjennomsiktige sammensetning. Ved å parre begge hovedrommene med lysstimulering og bare forlate korridoren fri for lysstimulering, kan NCP-oppsettet brukes til å teste om optogenetisk stimulering vil tvinge musen til å tilbringe mer tid i korridoren for å unngå å motta optogenetisk stimulering. Ved å sammenligne tiden som brukes i de to lysparede rommene med tiden som brukes i korridoren, kan en verifisering av optogenetisk indusert aversjon gjøres. NCP-eksperimentet består av to påfølgende daglige økter hvor optogenetikkmus får stimulering (30 min hver) for å måle preferanse i sanntid, og en laserfri økt (15 min) for å vurdere betingede svar på samme måte som de i RT-PP Protokollen.
RT-PP- og NCP-protokollene nedenfor ble nylig validert i laboratoriet vårt i studien av hvordan ulike typer nevroner som ligger i ventraltegmentalområdet (VTA) er involvert i ulike aspekter av belønningsrelatert atferd12. Her, for å eksemplifisere gjennomføringen av RT-PP- og NCP-protokollene, ble dopamintransportør (DAT) -Cre19 og vesikulær glutamattransportør 2 (VGLUT2)-Cre20 transgene mus stereotaktisk injisert med AAV som bærer en floxed channelrhodopsin2 (ChR2) DNA-konstruksjon inn i VTA hvorpå en optisk fiber ble implantert over VTA. Atferdsresponser oppnådd ved analyse av disse musene ved hjelp av de medfølgende RT-PP- og NCP-protokollene viser hvordan aktivering av dopaminerge og glutamaterge nevroner i VTA fører til forskjellige atferdsresponser (figur 1).
Trinnvise protokoller for RT-PP- og NCP-paradigmer er utstyrt med informasjon som spenner fra genotyping av transgene mus, stereotaxic virale injeksjoner og fiberoptikk plassering, til programmering av sporingsprogramvare for laserkontroll og atferdsmessig Vurdering. I tillegg diskuteres forslag til endringer av protokollen når det gjelder stimuleringsparametere og eksperimentelle aspekter som kan påvirke det vitenskapelige resultatet. Mens protokoller er beskrevet i sammenheng med VTA, kan de brukes på ethvilket som helst hjerneområde eller nevronal populasjon, forutsatt at de relevante optogenetikkverktøyene, som relevante Cre-driver og floxed opsins, er tilgjengelige.
Protocol
Denne studien er utført ved hjelp av heterozygous DAT-Cre19 og VGLUT2-Cre20 mus av begge kjønn, alderen >8 uker og veiing > 20 g. Alle forsøkene ble utført i henhold til den svenske (Dyrevelferdsloven SFS 1998:56) og EU-lovgivningen (konvensjon ETS 123 og direktiv 2010/63/EU) med tillatelse fra de lokale dyreetiske komiteer.
1. Genotyping av mus
- Ta ørebiopsier ved hjelp av en ørepuncher som skal brukes til genotyping av de transgene musene.
- Forbered øreslagene til å utføre en polymerasekjedereaksjon (PCR) reaksjon ved hjelp av spesiallagde primere.
MERK: I denne protokollen ble Cre-regisserte primere brukt.- Tilsett 75 μL lysisbuffer (buffer 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) i hvert 1,5 ml rør som inneholder ørestans.
- Inkuber i en varmeblokk ved 96 °C i 30 min.
- La prøvene avkjøles i 5 min og legg deretter til 75 μL av nøytraliseringsbufferen (buffer 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
- Utfør PCR i henhold til standardprosedyrer12,21 ved hjelp av de riktige primere (her: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTTTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3').
FORSIKTIG: Arbeid på is under en PCR-hette og vær oppmerksom på ikke å forurense reagensene og prøvene.- Klargjør PCR-mesterblandingen. Multipliser følgende volumer i henhold til hvor mange prøver som skal analyseres, inkludert passende kontrollprøver. Bland reagensene for en enkelt 25 μL endelig volumreaksjon i følgende rekkefølge: destillert vann (18,9 μL), 10x buffer med MgCl2 (2,5 μL), 10 mM dNTP mix (0,5 μL), 10 μM fremover primer (1 μL), 10 μM revers primer (1 μL), 5 U/μL DNA polymerase (0,1 μL), og mal DNA (1 μL; vil bli lagt til i de neste trinnene).
MERK: Legg alltid til en negativ, positiv og en tom (uten mal DNA)-kontroll for å sikre gyldige resultater. - Tilsett 24 μL master mix i PCR-rør.
- Tilsett 1 μL mal DNA (kommer fra øret punch fra hver mus) i hvert PCR-rør.
- Sentrifuge PCR rørene kort for å sikre malen DNA er inne i master mix.
- Utfør PCR med en termisk syklusr ved hjelp av sykkelprogrammet i tabell 1.
- Klargjør PCR-mesterblandingen. Multipliser følgende volumer i henhold til hvor mange prøver som skal analyseres, inkludert passende kontrollprøver. Bland reagensene for en enkelt 25 μL endelig volumreaksjon i følgende rekkefølge: destillert vann (18,9 μL), 10x buffer med MgCl2 (2,5 μL), 10 mM dNTP mix (0,5 μL), 10 μM fremover primer (1 μL), 10 μM revers primer (1 μL), 5 U/μL DNA polymerase (0,1 μL), og mal DNA (1 μL; vil bli lagt til i de neste trinnene).
- Forbered en agarosegel for å kjøre prøvene ved hjelp av elektroforese.
MERK: Størrelsen avhenger av antall prøver som må analyseres.- Tilsett 1% w / v agarosepulver i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer i en glassflaske. Varm i mikrobølgeovn til agarose er fullstendig oppløst, sjekker regelmessig at det ikke koker over.
FORSIKTIG: Ta forholdsregler for å unngå brannskader. - La gelen avkjøles til ca. 50 °C og tilsett en nukleinsyregelflekk (0,5 μL/50 ml gel).
- Hell gelen i støpebrettet som inneholder brønnkammer og la den stå i romtemperatur til den blir helt størknet. Fjern kammene forsiktig.
- Fyll elektroforesetanken med 1x TAE-buffer og plasser gelen i tanken.
- Tilsett 2 μL dna-lastedye i hver av DNA-prøvene.
- Last 4 μL DNA-stigen i den første brønnen av gelen, og fortsett deretter å laste hele volumet av prøvene i de resterende brønnene.
- Sett elektroforeses strømkilde til 140 V og kjør i 25–30 min.
- Plasser gelen under en UV-kilde og ta et bilde av resultatene.
- Tilsett 1% w / v agarosepulver i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer i en glassflaske. Varm i mikrobølgeovn til agarose er fullstendig oppløst, sjekker regelmessig at det ikke koker over.
2. Stereotaxic kirurgi
- Etter genotyping, separate mus holde de positive for Cre. Vent til de er minst 8 uker gamle og veie 20 g for å utføre kirurgi.
- Sanitize miljøet og sterilisere kirurgiske verktøy for å utføre kirurgi under aseptiske forhold.
- Injiser musene subkutant med smertestillende 30 min før operasjonen.
- Bedøve musene med isofluran (2–3 % i normal luft for induksjon og 1,5–2,0 % for vedlikehold av anestesi). Sørg for at tilstrekkelig anestesinivå oppnås ved å teste fraværet av smertereflekser ved å klemme forsiktig tåen på musen. Juster leveringen av isoflurane tilsvarende.
- Plasser musen på stereotaxic apparatet. Tilsett øyesmøremiddel for å forhindre øyelesjon på grunn av tørrhet og barber håret på toppen av skallen. Bruk en varmepute for å opprettholde temperaturen på musen stabil.
- Injiser 100 μL lokalbedøvelse under skallens hud og la 5 minutter tre i kraft.
- Forbered snittstedet ved tre sirkulære bruksområder av alkohol eller steril saltvannvekslende med jod. Bruk en steril bomullsspiss og start påføringen fra snittlinjen, utover.
- Løft forsiktig huden med tang, og lag et snitt på ~ 1,5 cm langs rostrocaudalaksen med kirurgisk saks for å avsløre overflaten av skallen.
- Bruk en bomullspinne til å påføre H2O2-oppløsning for å fjerne periosteum.
- Skyll skallen med steril saltvann og tørk den ved hjelp av sterile bomullstipsapplikatorer.
- Finn bregma og lambda.
- Fastslå flat hodeskallejustering ved å plassere spissen av injeksjonsnålen, justert på stereotaxicrammen, på bregma og lambda. Mål ventrale koordinatene for hver posisjon og sammenlign. Når skallen er flat ventral koordinaten for både bregma og lambda er identiske. Hvis ikke, juster hodeposisjonen og ta målingene igjen.
- Finn og posisjonen (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm fra bregma i henhold til Franklin og Paxinos22)hvor injeksjonen av det cre-avhengige viruset og implantasjonav optisk fiber vil finne sted og lage et lite hull ved hjelp av en mikrodrill.
- Legg 400 ml virus i 10 μL sprøyten montert på stereotaxic apparatet ved hjelp av en presisjonspumpe.
- Senk kanylen (34 G, skrå) forsiktig og injiser 300 ml cre-avhengig optogenetisk virus (AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5,6 x 1012 vg/ml]) i VTA (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm fra bregma og -4,4 mm fra overflaten av skallen, ifølge Franklin og Paxinos22) ved 100 nL/ min injeksjonshastighet ved hjelp av presisjonspumpen.
- Etter injeksjon, la nålen på plass i ytterligere 10 min for å tillate diffusjon av viruset (Figur 2A).
- Trekk nålen langsomt tilbake fra injeksjonsstedet.
- Lag små hull ved hjelp av en mikrodrill for å passe ankerskruer som vil stabilisere optisk fiber og tannsement kompleks.
- Ta bregma koordinatene igjen og implanter optisk fiber (200 μm diameter, 0,37 NA) på: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm fra bregma og -4,0 mm fra overflaten av skallen (Figur 2B) ifølge Franklin og Paxinos22.
- Fest fiberen på skallen ved hjelp av tannsement. Påfør nok sement rundt optisk fiber ferule for å feste den til skallen, men vær oppmerksom på å forlate 3-4 mm av toppen av ferule fri for sement for å tillate tilkobling av lappledningen (Figur 2C).
MERK: Vær oppmerksom på ikke å fylle hullet med sement, da dette kan forårsake hjerneskade i hjernevev. Hemostatiske materialer kan legges i hullet for å hindre at dette skjer. - Bruk vevlim eller absorberbare suturer for å lukke etåpent sår og la dyret komme seg i minst to uker. Gi en ekstra dose smertestillende 12-24 timer etter operasjonen.
3. Sette opp kontrollen av laserkilden
- Bruk mikrokontrollere med ett bord til å styre laserkilden. Skriv et skript ved hjelp av riktig programvare. Legg i skriptet på mikrokontrollerkortet ved hjelp av riktig tilkoblingskabel til datamaskinen.
MERK: Skriptet skal inneholde ekstern modulasjon (inngang) som kommer fra sporingsprogramvaren via en TTL-boks, og en utgang til laseren for å kontrollere stimuleringsparametere. For 10 ms pulsbredde ved 20 Hz frekvens, bruk skriptet som finnes i tilleggskodingsfilen. - Koble kortet til laseren og TTL-boksen på sporingsmaskinvaren.
- Bruk en nettverkskabel til å koble TTL-boksen til kortet (pin 5 for det medfølgende skriptet) (Figur 3A,C).
- Kontroller at laseren er satt til å styre ved ekstern modulasjon og koble laseren til kortet ved hjelp av en FC/PC-kabel (pin 13 for det angitte skriptet) (Figur 3B,C).
- Koble de riktige pinnene til jorddeler av brettet.
- Koble laserkilden til optisk fiber.
- Koble laserkilden til en roterende skjøt (Figur 3D).
- Koble en lappledning (figur 3E) til dreieleddet.
- Stabiliser dreieleddet over apparatet, men utenfor opptaksområdet. Kontroller at lengden på den fiberoptiske patchledningen er hensiktsmessig for å la musen bevege seg uten vanskeligheter i arenaen (Figur 3F).
4. Sette opp eksperimentet for RT-PP-tilnærmingen i sporingsprogramvaren
- Kalibrer arenaoppsettet. Bruk en linjal til å måle en bestemt del av det fysiske apparatet, tegn en linje som tilsvarer delen som er målt på bildet i programvaren under kategorien Tegnskala til kalibrer og angi den allerede kjente verdien (trinn 1 i figur 4).
- Design arenaen. Tegn området der bevegelsen av musene vil bli registrert (trinn 2 i figur 4).
- Opprett sonene. Tegn sonene som til slutt vil bli tildelt som laserparet, laser-unpaired og "nøytral" (trinn 3 i figur 4).
- Valider oppsettet for å bekrefte at det ikke finnes noen motstridende parametere, for eksempel soner utenfor arenaen (trinn 4 i figur 4)
- Angi eksperimentelle parametere under innstillingene for kategorien eprøvingskontroll (trinn 5 i figur 4).
- Angi prøvetiden som vist i trinn 1 i figur 5 for en 30 min RT-PP-økt.
- Kontroller at "maskinvarekontroll" er aktivert, tilordne et rom som laserparet der musens oppføring vil utløse et TTL-signal gjennom sporingsprogramvaren til mikrokontrollerkortet. I figur 5 (trinn 2) er det laserparede rommet rom A. For reverseringsfasen, bytt rommene slik at rom B vil bli laserparet og rom A vil bli koblet fra. Gjør det ved å erstatte A med B og B med A i programvaren.
5. Endring av oppsettet for å teste de aversive egenskapene til stimuleringen ved hjelp av NCP-tilnærmingen
- Følg trinn 4.1−4.4 som beskrevet tidligere.
- Angi tidspunktet for eksperimentet til 30 min gjennom alternativet "Gjenta til" i "Referanse" -boksen innstillinger (trinn 1 i figur 6).
- Tilordne både A- og B-soner som laserparet (trinn 2 i figur 6) ved å legge til "når midtpunktet er i en hvilken som helst av sone A og sone B" for betingelsesboksen som er knyttet til innstillingene for A- og B-rom. Vær oppmerksom på at laseren slås av når dyret er plassert i det nøytrale rommet.
6. Utføre et eksperiment ved hjelp av laserstimulering
- Konfigurer registreringsinnstillingene.
- Bruk en dummy til å ligne musen for å sikre passende deteksjonsinnstillinger.
- Plasser dummyen i ett rom i apparatet og bruk automatisert oppsett med dynamisk subtraksjon.
- Fjern dummy og plasser den til motsatt rom. Kontroller at dummyen er fullstendig oppdaget, og juster innstillingene via programvaren for å oppnå riktig gjenkjenning.
- I løpet av dette trinnet også sjekke om stimuleringen fungerer som det er ment å. Start oppkjøpet ved hjelp av de tidligere konfigurerte prøvekontrollinnstillingene og plasser dummyen i laserparet rom og se om stimuleringen utløses som den skal. Plasser deretter dummyen i det uparede og/eller det nøytrale rommet og se om stimuleringen stoppes.
- Bruk en kraftmåler med en sensor til å sette laserkraften til 10 mW ved hjelp av knotten på laseren (figur 3B). Utfør dette trinnet hver gang laserstimulering brukes.
FORSIKTIG: Bruk verneutstyr som direkte eksponering for laserlys kan forårsake permanent øyeskade. - Plasser musen i apparatet.
- Ta musen forsiktig ut av buret og koble det fiberoptiske implantatet til den fiberoptiske patchledningen ved hjelp av en keramisk hylse.
- Plasser musen forsiktig i det nøytrale rommet i tre-roms apparatet.
- Vent til musen oppdages av programvaren.
- Fjern de vertikale skyvedørene som begrenser dyret fra å komme inn i hovedrommene.
- La dyret utforske fritt uten forstyrrelser.
MERK: Den samme prosedyren følges når dyret ikke mottar stimulering med unntak av at trinn 6.2 ikke er nødvendig, og at laseren er av hele tiden.
Representative Results
Det tredelte apparatet (figur 3F) er egnet til å håndtere de givende effektene av narkotika og å vurdere i sanntid de givende eller aversive egenskapene til direkte stimulering av nevroner ved hjelp av optogenetikk. Den består av to hovedrom (20 cm [W] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) og ett mindre tilkoblingsrom (20 cm [B] x 7 cm [L] x 25 cm [H]). Hovedrommene har distinkt vegg- og gulvtekstur og mønstre for å lette assosiativ læring, mens det sammenkoblede/nøytrale rommet er smalt og gjennomsiktig slik at musene tilbringer naturlig mindre tid i den. Som beskrevet ovenfor, kan sporingsprogramvaren brukes til å registrere flere atferdsparametere av musene, inkludert bevegelse og tid brukt i hvert rom, og for å kontrollere laserstimuleringen. Hele RT-PP-eksperimentet finner sted gjennom 8 økter (Figur 1A) og tillater både vurdering av de givende eller aversive egenskapene til direkte stimulering (dag 3, 4, 6 og 7) og dannelsen av assosiasjoner, positiv eller negativ, som svar på tidligere erfaring (dag 5 og 8, "CR").
For det første testet vi DAT-Cre-mus injisert med AAV-ChR2-eYFP-virus i VTA for å målrette dopaminerge nevroner. I samsvar med litteraturen, Vi observerte at musene foretrakk å tilbringe tid i rommet sammen med stimuleringen (Figur 1B, fase 1, dag 3 og 4, blå sirkler, toveis gjentatte tiltak [RM] analyse av varians [ANOVA], effekt av rom F(2,18) = 141, p < 0,001; effekt av økt x rom F (12 108) = 42,1, p & lt; 0,001; effekt av økt x rom F (12 108) = 42,1, p & lt; 0,001; effekt av økt x rom F (12 108) = 42,1, p & lt; 0,001; effekt av økt x rom F (12 108) = 42,1, p & lt; 0,001; effekt av økt x rom F (12 108) = 42,1, p & lt; 0,001; effekt av økt x rom F (12 108) = 42,1, p & lt; 0,001; effekt av økt x rom F (12 108) = 42,1, p & lt; 0,001; effekt av økt x rom F(12 108) = 42,1, p & lt; 0,0 Tukeys post hoc-test paret vs ikke-paret p < 0,001). Reverseringsfasen, hvor paringen av rommene til laserstimulering ble byttet, bekreftet disse observasjonene(Figur 1B, dag 6 og 7, blå sirkler, Tukeys post hoc-test paret vs uparet rom p < 0,001) og dermed utelukke muligheten for at resultatene fra fase 1 var relatert til sideskjevheter eller tilfeldige parametere. I snitt tiden brukt i hvert rom i løpet av de fire dagene av RT-PP bekreftet at musene brukte i gjennomsnitt ca 70% av sin tid i laser paret rommet i motsetning til de uparede (~ 20%) og nøytrale (~10%) rom (Figur 1B bar graf, enveis RM ANOVA, effekten av stimulering F(2,6) = 139, p < 0,001, Tukey innlegg hvordan paret vs unpaired og nøytrale rom p < 0,001). Videre, i fravær av stimulering, på dag 5 og 8, musene tilbrakte betydelig mer tid i rommet tidligere sammen med laserstimulering (Tukeys post hoc p < 0.001), noe som indikerer at den forrige opplevelsen var tilstrekkelig til å indusere assosiativ læringsatferd reflektert som "søker" av stimuleringen. Disse dataene er i samsvar med litteraturen og viser at den nåværende metoden kan brukes pålitelig for å undersøke de givende effektene av optogenetisk stimulering av spesifikke nevronale populasjoner i VTA.
Vi testet deretter VGLUT2-Cre mus injisert med AAV-ChR2-eYFP i VTA som ovenfor, for å målrette glutamatergiske nevroner av VTA. I dette eksperimentet observerte vi en motsatt atferdsfenotype fra den som ble demonstrert av DAT-Cre-musene. Dermed unngikk musene rommet sammen koblet til stimuleringen og tilbrakte mer tid i de uparede i løpet av alle RT-PP-dager(figur 1C igjen, toveis RM ANOVA, effekt av rom F(2,12) = 40,9, p < 0,001; effekt av økt x rom F(12,72) = 16,1, p < 0,001; Tukeys post hoc-test paret vs ikke-paret p < 0,001; Figur 1C høyre, enveis RM ANOVA effekt av stimulering F(2,6) = 162, p < 0,001, Tukeys post hoc paret vs uparede og nøytrale rom p < 0,001). Interessant, i løpet av "CR" dager 5 og 8, viste musene ikke en klar unngåelse av det tidligere sammenkoblede rommet (ingen forskjeller mellom sammenkoblede og uparede rom). Det er mulig at mangelen på betinget respons skyldes utilstrekkelig tid brukt i laserparet, noe som forhindret dannelsen av assosiasjoner mellom laseraktivering og det bestemte miljøet der det fant sted. For ytterligere å utforske denne unngåelsefenotypen brukte vi en modifisert protokoll som vi kalte "nøytral kupépreferanse", forkortet NCP. I dette eksperimentet ble begge hovedrommene parret til stimulering og det nøytrale rommet forble stimuleringsfritt (figur 7A). Vi hypotetisk at hvis stimuleringen har aversive egenskaper, vil musen bli tvunget til å tilbringe tid i det mindre, nøytrale rommet, for å unngå det. Faktisk, i begge dager med stimulering (Stim1 og Stim2) tilbrakte musene mesteparten av tiden i det nøytrale rommet (ca 80%) sammenlignet med de sammenkoblede rommene (Figur 7B,C; venstre: toveis RM ANOVA effekt av rom F(2,8) = 70,9, p < 0,001; effekt av økt x rom F(4,16) = 6,9, p = 0,002, Tukeys post hoc "Stimulering 1" nøytralt rom vs rom 1 og 2 p < 0,01, "Stimulering 2" nøytralt rom vs rom 1 og 2 p < 0,001; høyre: enveis RM ANOVA, effekten av stimulering F(2,2) = 54,2, p = 0.018, Tukeys post hoc-test paret 1 og 2 vs nøytral p < 0,05). Som i tilfelle av "CR" dager under RT-PP-testen, syntes musene ikke å danne negative assosiasjoner mellom rommene og stimuleringen; det vil si i fravær av stimulering (CR), utforsket de alle rommene i samme grad (Figur 7B, ingen forskjeller mellom tid brukt i sammenkoblede rom og nøytralt rom). Resultatene av disse eksperimentene bekreftet atferdsfenotypen som ble observert under RT-PP-oppsettet, og støtter dermed kombinatoriske implementeringen av både RT-PP- og NCP-paradigmene.
Figur 1: Atferdstesting ved hjelp av optogenetikk i RT-PP-paradigmet. (A) Skjematisk representasjon av tidslinjen for forsøkene. - Jeg har ikke noe åsi. Øverst til venstre: graf som representerer prosentandelen av tid brukt i hvert rom gjennom RT-PP-eksperimentet for DAT-Cre (N = 10) og VGLUT2-Cre (N = 7) mus injisert med AAV-ChR2-eYFP. Blå sirkler: laserparet rom; hvite, svarte sirkler: hovedrom; grå sirkler: nøytralt rom. Øverst til høyre: gjennomsnittlig prosentandel av tid brukt i hvert rom i løpet av dag 3, 4, 6 og 7 (RT-PP). Bunn: representative varmekart over tid brukt i hvert rom for en DAT-Cre og en VGLUT2-Cre mus. Alle data ble normalt distribuert (Shapiro-Wilk test). Resultatene presenteres som gjennomsnitt ± SEM. ***p < 0,001 paret vs ikke paret; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 paret vs nøytralt rom; §§p < 0,01, §§§p < 0,001 uparet vs nøytralt rom. Dette tallet er endret fra Bimpisidis et al.12. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kirurgisk prosedyre for optogenetiske eksperimenter. (A) Injeksjon av cre-avhengig viral vektor i VTA. (B) Implantering av optisk fiber over injeksjonsstedet. Legg merke til ankerskruene som brukes til stabilisering. (C) Permanent forankring av fiberen på skallen ved hjelp av tannsement. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Utstyr som brukes i optogenetikkforsøkene. (A) TTL-boksen som brukes i studiene. Den mottar innspill fra sporingsprogramvaren og sender TTL-signaler til mikrokontrollerkortet. (B) Foran (øverst) og bakfra (nederst) av laserkilden som brukes til forsøkene. (C) Mikrokontrollerkortet som brukes til å kontrollere laserstimuleringen. Legg merke til tilkoblingene fra TTL-boksen og laserkilden. (D) Roterende ledd. (E) Fiberoptisk patch akkord som brukes i forsøkene. (F) Apparatet med tre rom som brukes for RT-PP- og NCP-eksperimenter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Utforme arena og soner i sporingsprogramvaren. Trinn 1: Kalibrering av oppsettet. Trinn 2: Tegning av hele arenaen. Trinn 3: Tegnesoner innenfor arenaen. Trinn 4: Oppsettvalidering. Trinn 5: Kategorien Innstillinger for prøvekontroll for å konfigurere parametere for tid og stimulering. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Definere tids- og stimuleringsparametere for et RT-PP-eksperiment i sporingsprogramvaren. Legge til bestemte regler for varigheten (trinn 1) og betingelsene for lysstimulering (trinn 2). Betingelsene kan enkelt endres slik at kravene til reverseringsfasen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Definere tids- og stimuleringsparametere for NCP-eksperimenter i sporingsprogramvaren. Varigheten av stimuleringsøktene (trinn 1) ligner på de for RT-PP, men betingelsene for lysstimuleringsaktivering (trinn 2) er forskjellige. Inngang til enten hovedrommet (her kalt sone A og sone B) resulterer i optogenetisk stimulering som avsluttes bare når musen kommer inn i det nøytrale rommet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Atferdstesting ved hjelp av optogenetikk i NCP-paradigmet. (A) Skjematisk representasjon av det eksperimentelle oppsettet. (B) Venstre: graf som representerer prosentandelen av tid brukt i hvert rom i løpet av de to dagene med stimulering (Stim1 og Stim 2) og under den betingede responsøkten (CR) for VGLUT2-Cre-mus injisert med AAV-ChR2 i VTA (N = 5). Høyre: gjennomsnittlig prosentandel av tid brukt i hvert rom i løpet av de to dagene med stimulering av NCP. (C)Representativt varmekart over tid brukt i hvert rom for en VGLUT2-Cre mus i løpet av en av stimuleringsdagene. Data ble normalt distribuert (Shapiro-Wilk test). Resultatene presenteres som gjennomsnitt ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 unpaired vs paret 1 og paret 2 rom. Dette tallet er endret fra Bimpisidis et al.12. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Temperatur | Varighet | Sykluser |
| 1. Innledende denaturering | 95 °C | 4 min. | 1 |
| 2. Denaturering | 95 °C | 30 s | 30 |
| 3. Annealing (andre) | 55 °C | 30 s | |
| 4. Forlengelse | 72 °C | 40 s | |
| 5. Endelig forlengelse | 72 °C | 6 min. | 1 |
| 6. Hold | 4 °C (andre) | Inntil stoppet av eksperimentereren | 1 |
Tabell 1: PCR-sykkelprogrammet.
Tilleggskodefil. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Discussion
I den nåværende studien presenterer vi to trinnvise protokoller for hvordan du utfører ulike typer stedpreferanseanalyser ved hjelp av optogenetikk hos mus. Protokollene skissert ble brukt til å vurdere den givende eller aversive atferdsfenotypene til VTA nevroner (Figur 1 og Figur 6)12, men kan også brukes til å utforske nevronenes atferdsrolle i andre hjerneregioner.
Flere nyere studier har beskrevet RT-PP paradigmer i to-kupé23,24 og tre-kupé apparater13,14,15,16,17,18. De nåværende protokollene beskriver detaljerte oppsett for RT-PP- og NCP-protokollene i et tredelt apparat som ligner de som tradisjonelt brukes i CPP-eksperimenter for å vurdere atferdseffekter ved administrering av misbruksstoffer. Mens resultatene bare presenteres her som prosentandelen av tiden musen tilbrakte i hvert rom, tillater sporingsprogramvaren for analyse av flere andre atferdsparametere, for eksempel overganger til soner, hastighet, tid brukt immobile og mer. Analyse av ulike parametere kan være av betydning for tolkningen av data.
De nåværende RT-PP-protokollene er fleksible og kan endres for å teste om ulike typer stimuleringsmønstre har givende effekter. Parametrene for laserkontroll kan enkelt endres enten gjennom skriptet til mikrokontrollerkortet eller i sporingsprogramvaren, noe som viser allsidigheten til oppsettet. Vi foreslår en 20 Hz stimuleringsfrekvens som er innenfor området, og noen ganger lavere, av frekvenser som brukes i tidligere studier ved hjelp av samme opsin-variant (ChR2/H134R) for å studere dopaminerge og glutamatergiske nevroner og deres terminaler13,14,16,17,18,23,24,25,26,27. Nyere studier har vist at høyere stimuleringsfrekvenser kan ha motsatteffekter på atferd enn lavere, og at disse effektene er mediert gjennom en depolariseringsblokk forårsaket av høyere frekvenser28. Tilsvarende har forskjeller i atferdsutgang blitt vist når stimulerende glutamatergic og GABAergic nevroner i det laterale preoptiske området15. Disse studiene undersøkte nevroner av forskjellige områder enn VTA og de største effektene ble observert på høye frekvenser av ikke-glutamatergiske nevroner15,28. Vårt valg på 20 Hz er basert på tidligere studier av glutamatergic og dopaminerge VTA nevroner som viser at ved varierende stimuleringfrekvenser, belønningsrelatert atferdsproduksjon er ikke signifikant endret24,26.
En ekstra parameter som kan justeres og som kan påvirke det eksperimentelle resultatet, er lyskildens kraft. Høyere laserkraft kan øke størrelsen på det lysstimulerte området, noe som kan være gunstig i enkelte typer eksperimenter, men med ulempen med en økning i temperatur5. Faktisk har en nylig studie vist at laserinduserte økninger i temperaturen kan endre hjernefysiologi og påvirke atferdsmålinger29. Disse observasjonene understreker viktigheten av å inkludere opsin-negative kontroller i eksperimentell design. I den nåværende protokollen brukte vi 10 mW laserkraft som er lik og har tidligere vist seg å være effektive i å stimulere dopaminerge og glutamaterge nevroner i VTA16,24,26. Når du setter opp eksperimenter, er det viktig å ta hensyn til størrelsen på området der cellene av interesse er plassert og fiberoptikk og patch ledning egenskaper (numerisk blenderåpning, kjernediameter). Disse parametrene er avgjørende for å ta hensyn til når du utfører beregninger knyttet til laserkraft. For detaljer kan kalkulatoren utviklet av Karl Deisseroths laboratorium (http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php) brukes.
Histologisk verifisering av Cre-Lox recombination er et annet kritisk aspekt når du bruker optogenetics eksperimenter. Validering av rekombinasjonseffektiviteten bør alltid foregå i en pilotkohort før initieringen av atferdseksperimenter hos en stor gruppe dyr. Dette er viktig av etiske grunner, men også for optimalisert eksperimentell produksjon. Hver viral konstruksjon kan vise variabel spesifisitet for forskjellige nevronale typer og i forskjellige regioner5, en parameter som kan påvirke eksperimentene på uforutsigbare og til og med villedende måter. For eksempel har vi tidligere validert Cre-Lox rekombinasjonsmønsteret til AAV5-virus i VTA av DAT-Cre-mus og funnet at ensidige injeksjoner var tilstrekkelige til å målrette mesteparten av interesseområdet. Da vi deretter studerte romlig begrensede underpopulasjoner i VTA, for eksempel en preget av NeuroD6-uttrykk, observerte vi at bilaterale virale injeksjoner var mer effektive for å målrette større antall nevroner som gir mer uttalt atferdseffekter på optogenetisk lysstimulering12. Videre må tiden fra kirurgi til initiering av atferdseksperimenter tas opp nøye. To uker er nok tid for en ChR2 DNA konstruksjon til å bli uttrykt i cellelegemer som vi viser her, men lengre ventetider (~ 8 uker) kan være nødvendig hvis etterforskeren tester effekten av stimulering i projeksjon ser ut til å bli uttrykt i projeksjonsområder13,14,15,17.
Det er verdt å merke seg at volumet av virus injisert (i vårt tilfelle 300 nL) kan være egnet når du studerer nevroner i VTA, men volum og titer må justeres avhengig av effektiviteten av transduksjon og størrelsen på strukturen studert. I tillegg, for bilaterale strukturer som ligger i en avstand fra mediolateral akse, kan det være nødvendig å utføre bilaterale injeksjoner, og å også implantere fiberoptikk bilateralt for å sikre aktivering / hemming i begge halvkuler.
Til slutt er det alltid nødvendig å utføre post-mortem histologisk analyse for å validere og bekrefte effektiviteten av Cre-Lox-rekombinasjonen og for å verifisere riktig implantasjonssted for optisk fiber på det tiltenkte stedet. Uventet, overbegrenset eller overdreven Cre-Lox-rekombinasjon kan oppstå på grunn av ukjent distribusjon av nevroner som uttrykker Cre utenfor grensene til det tiltenkte området, eller på grunn av forskjeller i virusserotypen, dårlig håndtering av viruset, tilstopping av sprøyte for viruslevering eller andre operasjonsrelaterte problemer. Verifisering av tilfredsstillende Cre-Lox rekombinasjon og korrekt fiberoptikk-implantasjon må utføres for å bekrefte eventuelle statistiske resultater av atferdsvurderinger for å trekke sikre konklusjoner.
Når det gjelder dataene som er gitt her som eksempler på hvordan de to atferdsparadigmene kan brukes, var den betydelige preferansen til den lysparede siden oppnådd ved optogenetisk stimulering av dopaminerge nevroner i VTA ved å analysere DAT-Cre-mus i RT-PP-paradigmet forventet basert på tidligere funn23,24,25,26,27 mens unngåelse av denne siden vist av VGLUT2-Cre-musene ikke var forventet. VGLUT2 nevroner av VTA og deres anslag har vist seg å være involvert i både belønning og aversjon16,17,24,30,31, og vi derfor utført NCP analyse for å vurdere den tilsynelatende unngåelse atferd observert i dagens RT-PP oppsett i mer detalj. Ved å bruke den smale, gjennomsiktige korridoren som det eneste ikke-lette paret rommet for å bekrefte de aversive egenskapene til stimulering av VTA glutamatergic nevroner, er det tydelig at i denne spesielle tre-kupé oppsett, optogenetisk aktivering av disse nevronene forårsaker en aversiv respons. Disse eksperimentene, som ble vist her for å eksemplifisere situasjoner som kan ha nytte av å bruke både RT-PP- og NCP-protokollene, var en del av en nylig publisert studie, og det fullstendige datasettet samt diskusjoner om disse funnene finnes i denne publikasjonen12.
I tillegg til NCP, alternative måter å bekrefte aversjon inkluderer sterk belysning av et område innenfor et åpent feltområde mens du parer resten av arenaen til laseraktivering, eller utføre en aktiv unngåelse oppgave der musen må utføre et bestemt mønster av atferd for å avslutte laserstimulering15.
For å oppsummere, protokollene beskrevet gi kritisk informasjon om hvordan du klarer å utføre RT-PP og NCP analyse på den mest effektive måten for å løse rollen som nevronal aktivering i belønning og aversjon. Avhengig av den vitenskapelige hypotesen kan en rekke parametere analyseres ved hjelp av disse protokollene, og hver protokoll kan også kombineres med andre validerte paradigmer for optimaliserte atferdsanalyser som implementerer optogenetikk for å adressere spesifikk hjerne områder og nevroner av interesse.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Våre finansieringskilder er takknemlige: Uppsala universitet, Vetenskapsrådet,Hjärnfonden, Parkinsonfonden, Forskningsstiftelsene i Bertil Hållsten, OE&Edla Johansson, Zoologisk Forskning og Åhlén. Dyr ble holdt ved Uppsala universitet og eksperimenter ble utført ved Uppsala Universitet Atferdsanlegg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | - | a great variety of viruses to suit any project's needs |
| Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
| Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
| Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
| Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
| DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
| DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
| Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
| Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
| Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
| Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
| Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
| Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
| Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
| Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
| Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
| Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
| Nucleic Acid gel stain - GelRed | Biotium | 41003-T | |
| PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | |
| Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
| Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
| Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
| Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
| Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
| Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
| TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
| Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
| Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
| UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |
References
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The Development and Application of Optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34 (1), 389-412 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Pupe, S., Wallén-Mackenzie, Å Cre-driven optogenetics in the heterogeneous genetic panorama of the VTA. Trends in Neurosciences. 38 (6), 375-386 (2015).
- Spanagel, R. Animal models of addiction. Dialogues in Clinical Neuroscience. 19 (3), 247-258 (2017).
- Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), 227 (2007).
- Hoffman, D. C. The use of place conditioning in studying the neuropharmacology of drug reinforcement. Brain Research Bulletin. 23 (4-5), 373-387 (1989).
- Huston, J. P., Silva, M. A. D. S., Topic, B., Müller, C. P. What's conditioned in conditioned place preference? Trends in Pharmacological Sciences. 34 (3), 162-166 (2013).
- Bardo, M. T., Bevins, R. A. Conditioned place preference: What does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153 (1), 31-43 (2000).
- Bimpisidis, Z., et al. The NeuroD6 subtype of VTA neurons contributes to psychostimulant sensitization and behavioral reinforcement. eNeuro. 6 (3), e0066 (2019).
- Root, D. H., Mejias-Aponte, C. A., Qi, J., Morales, M. Role of Glutamatergic Projections from Ventral Tegmental Area to Lateral Habenula in Aversive Conditioning. Journal of Neuroscience. 34 (42), 13906-13910 (2014).
- Steidl, S., Wang, H., Ordonez, M., Zhang, S., Morales, M. Optogenetic excitation in the ventral tegmental area of glutamatergic or cholinergic inputs from the laterodorsal tegmental area drives reward. European Journal of Neuroscience. 45 (4), 559-571 (2017).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Wang, H. L., Qi, J., Zhang, S., Wang, H., Morales, M. Rewarding Effects of Optical Stimulation of Ventral Tegmental Area Glutamatergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 35 (48), 15948-15954 (2015).
- Qi, J., et al. VTA glutamatergic inputs to nucleus accumbens drive aversion by acting on GABAergic interneurons. Nature Neuroscience. 19, 725-733 (2016).
- Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nature Communications. 5, 5390 (2014).
- Ekstrand, M. I., et al. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (4), 1325-1330 (2007).
- Borgius, L., Restrepo, C. E., Leao, R. N., Saleh, N., Kiehn, O. A transgenic mouse line for molecular genetic analysis of excitatory glutamatergic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 45 (3), 245-257 (2010).
- Papathanou, M., et al. Targeting VGLUT2 in Mature Dopamine Neurons Decreases Mesoaccumbal Glutamatergic Transmission and Identifies a Role for Glutamate Co-release in Synaptic Plasticity by Increasing Baseline AMPA/NMDA Ratio. Frontiers in Neural Circuits. 12, 64 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Boston, MA. (2008).
- Tsai, H. C., et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Pascoli, V., Terrier, J., Hiver, A., Lüscher, C. Sufficiency of Mesolimbic Dopamine Neuron Stimulation for the Progression to Addiction. Neuron. 88 (5), 1054-1066 (2015).
- Ilango, A., Kesner, A. J., Broker, C. J., Wang, D. V., Ikemoto, S. Phasic excitation of ventral tegmental dopamine neurons potentiates the initiation of conditioned approach behavior: parametric and reinforcement-schedule analyses. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 155 (2014).
- Kim, K. M., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PLoS ONE. 7 (4), 1-8 (2012).
- Kroeger, D., et al. Galanin neurons in the ventrolateral preoptic area promote sleep and heat loss in mice. Nature Communications. 9, 4129 (2018).
- Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22 (7), 1061-1065 (2019).
- Root, D. H., Estrin, D. J., Morales, M. Aversion or Salience Signaling by Ventral Tegmental Area Glutamate Neurons. iScience. 2, 51-62 (2018).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
