Summary
Ici, nous présentons deux protocoles faciles à suivre étape par étape pour les paradigmes de préférence de lieu en utilisant l’optogénétique chez la souris. En utilisant ces deux configurations différentes, les comportements de préférence et d’évitement peuvent être solidement évalués au sein d’un même appareil avec une grande sélectivité spatiale et temporelle, et d’une manière simple.
Abstract
Comprendre comment l’activation neuronale conduit à une sortie comportementale spécifique est fondamental pour les neurosciences modernes. La combinaison de l’optogénétique chez les rongeurs avec des tests comportementaux dans des paradigmes validés permet de mesurer les conséquences comportementales lors de la stimulation de neurones distincts en temps réel avec une forte sélectivité spatiale et temporelle, et donc l’établissement de relations causales entre l’activation neuronale et le comportement. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour un paradigme de préférence de lieu en temps réel (RT-PP), une version modifiée du test classique de préférence de lieu conditionné (CPP). Le RT-PP est exécuté dans un appareil à trois compartiments et peut être utilisé pour répondre si la stimulation optogénétique d’une population neuronale spécifique est enrichissante ou aversive. Nous décrivons également une version alternative du protocole RT-PP, le protocole dit de préférence de compartiment neutre (NCP), qui peut être employé pour confirmer l’aversion. Les deux approches sont basées sur des extensions de la méthodologie classique provenant de la pharmacologie comportementale et de la mise en œuvre récente de l’optogénétique dans le domaine des neurosciences. En plus de mesurer la préférence de lieu en temps réel, ces configurations peuvent également donner des informations concernant le comportement conditionné. Nous fournissons des protocoles étape par étape faciles à suivre ainsi que des exemples de nos propres données et discutons des aspects importants à prendre en considération lors de l’application de ces types d’expériences.
Introduction
La mise en œuvre de l’optogénétique, un outil expérimental moderne de neurosciences dans lequel la lumière est utilisée pour contrôler l’activité neuronale, a conduit ces dernières années à des progrès majeurs dans la compréhension de la façon dont les populations neuronales spécifiques impact comportement1,2,3. La sélectivité spatiale et temporelle exceptionnelle de l’optogénétique permet l’établissement de relations causales entre l’excitation ou l’inhibition des groupes cellulaires d’intérêt et la sortie comportementale2,3. La sélectivité spatiale en optogénétique est généralement assurée par le système Cre-Lox dans lequel l’activité de Cre recombinase conduit à la recombinaison de toutes les séquences d’ADN présentes entre les sites Lox, appelés allèles floxed (flanqué s’agité de sites de lox)4. L’objectif avec l’utilisation du système Cre-Lox dans l’optogénétique est d’atteindre l’expression des allèles codant les opsines optogénétiques dans des neurones spécifiques d’intérêt tout en laissant les neurones environnants dépourvus d’expression. Les opsines sont des protéines sensibles à la lumière qui, à la lumière-stimulation de la longueur des ondes spécifiques permettent le flux d’ion qui affecte l’excitabilité neuronale ou influencent les fonctions cellulaires en modulant les voies effectrices en aval. De nouvelles variantes d’opsines qui diffèrent dans l’action (excitatrice, inhibitrice, modulatrice), mécanisme, activation par longueur d’onde de lumière et propriétés cinétique5 sont continuellement développées pour répondre aux besoins d’approches expérimentales spécifiques. En ce qui concerne l’excitabilité, l’utilisation d’une opsine dépolarisante ou hyperpolarisante dicte l’activité des neurones (excitation ou inhibition, respectivement) lors d’une stimulation lumineuse à une longueur d’onde spécifique administrée dans le cerveau3.
L’activité sélective de promoteur dirige l’expression de Cre recombinase aux neurones d’intérêt. En mettant en œuvre un allèle floxed de l’opsine d’intérêt, La recombinaison Cre-négociée assurera que l’opsine est sélectivement exprimée dans les neurones qui co-expriment Cre recombinase3,6. Cette utilisation de la double transgénique pour diriger la sélectivité spatiale s’est avérée très efficace en optogénétique. Ainsi, tandis que la stimulation lumineuse pour activer les opsines est largement fournie par une fibre optique intracérébralement implantée reliée à une source lumineuse (LED ou laser)3, seuls les neurones exprimant à la fois Cre recombinase et l’allèle d’opsine floxed répondra à cette stimulation. Le système Cre-Lox chez les rongeurs peut être réalisé de différentes manières en utilisant uniquement la transgénique (les deux Cre recombinase et la construction d’opsines floxed sont codées chez les animaux transgéniques), seulement les injections virales (constructions d’ADN pour Cre recombinase et l’opsine floxed sont tous deux livrés par l’intermédiaire d’un porteur viral), ou une combinaison des deux (par exemple, Cre recombinase est codé par un animal transgénique qui est injecté avec un virus porteur de la construction opsine floxed)5. La construction d’ADN d’opsine floxed est habituellement clonée dans le cadre avec un gène de journaliste pour permettre la visualisation de la recombinaison Cre-négociée dans des sections de tissu. Tandis que l’optogénétique peut également être exécutée chez les rats, les protocoles présentés ont été produits pour des souris. Par souci de simplicité, les souris porteuses de Cre recombinase et de l’opsine floxed seront appelées « souris optogénétiques ». Dans les protocoles décrits ci-dessous, les souris optogénétiques ont été générées par une approche transgénique mixte (Cre recombinase sous contrôle de deux promoteurs différents) et virale (en utilisant un virus adéno-associé, AAV, pour fournir la construction de l’ADN d’opsine floxed - dans notre cas ChR2/H134R) approche. L’obtention et le maintien de lignées de souris transgéniques sont une partie essentielle de la méthodologie. Les souris transgéniques de Cre-driver et floxed opsin peuvent être produites pour chaque but, ou achetées si disponibles commercialement, de même qu’une gamme de virus portant des séquences d’ADN codant Cre recombinase et des opsines floxed sous différentes formes.
L’optogénétique couplée à des tests comportementaux s’est avérée être un outil précieux pour étudier le rôle des régions distinctes du cerveau, ou des populations neuronales discrètes, en particulier les types de comportement. Dans le contexte du comportement lié à la récompense, l’optogénétique a permis la vérification des résultats précédents dans les domaines de la pharmacologie comportementale et de la psychologie expérimentale, et a également permis un nouveau niveau de dissection pertinente spatio-temporellement dans la façon dont certains neurones affectent le comportement. Une méthode qui a été utilisée dans plusieurs études pour évaluer le comportement lié à la récompense est une version modifiée de la méthode classique connue sous le nom de Préférence de lieu conditionné (PpC). Le RPC classique a été utilisé pour évaluer les propriétés récompensantes ou aversives des drogues d’abus par leur capacité d’induire des associations pavloviennes avec des indices de l’environnement7,8. En termes pavloviennes, le médicament est un stimulus inconditionnel car il peut susciter l’approche ou le retrait si elle est gratifiante ou aversive, respectivement. L’appariement continu du médicament avec divers stimuli neutres, qui eux-mêmes ne suscitent aucune réponse, peut conduire à l’approche ou le retrait simplement sur la présentation de l’ancien neutre, mais après l’appariement, ce qu’on appelle les stimuli conditionnés 9. L’analyse du RPC est habituellement effectuée dans un appareil contenant deux compartiments de la même taille, mais où chaque compartiment est défini par des caractéristiques distinctes, telles que la texture du plancher, les motifs muraux et l’éclairage (stimuli neutres). Les deux compartiments sont reliés soit par un couloir, soit par une ouverture entre les compartiments. Pendant le conditionnement, le sujet, habituellement un petit rongeur, reçoit des injections passives d’un médicament tout en se limité à l’un des deux compartiments principaux et salin tandis que limité à l’autre compartiment. Les effets gratifiants de la drogue sont ensuite évalués dans une session sans drogue lorsque le sujet est autorisé à explorer librement l’ensemble de l’appareil. Le temps passé dans le compartiment précédemment apparié (la réponse conditionnée) est considéré comme reflétant les mécanismes d’apprentissage pavloviens négociés entre les effets gratifiants du médicament et les indices du compartiment associés à son administration (stimuliconditionnés). Si l’animal passe plus de temps dans le compartiment apparié, le médicament a induit une préférence de lieu conditionné qui signifie qu’il a des effets gratifiants sur le comportement. D’autre part, si le médicament est perçu comme aversif, l’animal évitera le compartiment apparié et passera plus de temps dans le compartiment salin apparié, indiquant l’aversion conditionnée de lieu (CPA)8,9,10,11.
Étant donné que l’optogénétique peut être mise en œuvre pour contrôler l’activité neuronale en « temps réel », l’utilisation d’un paradigme comportemental semblable, mais distinct de celui-ci, permet de mesurer la préférence de lieu lors de l’activation neuronale directe. L’analyse de la préférence de lieu axée sur l’optogénétique est donc souvent appelée paradigme d’analyse de préférence de lieu en temps réel (RT-PP). Dans le paradigme RT-PP, la stimulation optogénétique des neurones distincts par l’intermédiaire du système Cre-Lox remplace la livraison systémique d’un médicament exécuté dans le RPC classique, de sorte que le paradigme RT-PP mesure plutôt si la stimulation neuronale induite par l’optogénétique est perçucomme gratifiant ou aversif. La description actuelle se concentrera sur les souris optogénétiques, mais aussi les rats optogénétiques peuvent être testés en utilisant des protocoles similaires.
Au lieu de se conditionner à un compartiment à la fois comme dans le paradigme classique du RPC, la souris optogénétique dans le paradigme RT-PP est autorisée à se déplacer librement dans l’ensemble de l’appareil et le comportement est enregistré tout au long de la session. L’entrée dans l’un des compartiments est jumelée à une stimulation intracrânienne de la lumière. Selon les paramètres appropriés de stimulation de la lumière, les neurones qui expriment une opsine excitatrice seront ainsi activés. Si la stimulation lumineuse est perçue comme gratifiante, la souris optogénétique restera dans le compartiment jumelé à la lumière, tandis que si la stimulation lumineuse est perçue comme aversive, la souris sortira du compartiment pour échapper à la stimulation. Ce type d’analyse permet d’évaluer l’apprentissage contingent : le sujet peut déclencher la stimulation de la lumière et donc l’activation neuronale en entrant dans un compartiment, et arrêter la stimulation en sortant du compartiment, semblable au levier-pressage pendant une tâche instrumentale. En outre, les mécanismes d’apprentissage associatif peuvent être évalués au cours des sessions suivantes où le temps passé dans chaque compartiment est mesuré en l’absence de stimulation. De cette façon, le chercheur peut se dissocier entre les effets immédiatement gratifiants sur la stimulation des neurones d’intérêt et la formation de mémoire associative qui lui est liée12.
Dans la présente étude, nous décrivons deux protocoles d’configuration étape par étape pour le comportement de préférence de lieu oranggénétique des souris en mouvement libre. Le premier protocole décrit RT-PP dans un appareil à trois compartiments et a été décrit sur la base des protocoles récemment présentés par Root et ses collègues13 et d’autres auteurs12,14,15,16,17,18. L’expérience se compose de deux phases comprenant plusieurs sessions quotidiennes (indiquées dans la figure 1A). Chaque session est conçue à des fins différentes et les paramètres de stimulation d’accouplement avec un compartiment sont modifiés en conséquence. La première session, la "Prétest", est utilisée pour évaluer la préférence initiale du sujet à l’un ou l’autre des compartiments. Bien que connecté au cordon de correction, le sujet est autorisé à explorer librement l’appareil en l’absence de stimulation pendant 15 min. Si la préférence initiale à un compartiment est supérieure à 80 %, la souris est exclue de l’analyse, car le biais latéral initial peut fausser l’analyse. Après le "Prétest", "Phase 1" commence. La première partie se compose de deux sessions consécutives, quotidiennes, de 30 min de "RT-PP". Pendant la "Phase 1", la souris optogénétique est connectée à la source laser à travers le cordon patch et placée dans l’arène pour l’explorer librement. La souris reçoit une stimulation laser intracrânienne à l’entrée dans l’un des compartiments principaux. Des expériences pilotes peuvent être effectuées pour déterminer quel compartiment sera attribué comme laser-appariement et qui comme non apparié. Si la stimulation s’affiche enrichissante, le laser sera couplé au compartiment le moins préféré pendant le «Prétest» et au plus préféré si la stimulation est aversive. Ainsi, le protocole RT-PP présenté suit une conception biaisée en ce sens que la stimulation laser n’est pas aléatoirement assignée à l’un des deux compartiments principaux (conception impartiale), mais est choisie pour éviter toute préférence initiale de la souris. L’entrée dans l’autre compartiment principal ou le compartiment neutre reliant les deux compartiments principaux ne donne pas lieu à une stimulation de la lumière intracrânienne et n’est donc pas jumelée à la lumière. Ces séances permettent d’évaluer en temps réel les propriétés enrichissantes ou aversives de la stimulation de populations neuronales spécifiques. Le dernier jour de "Phase 1", une séance de 15 min sans aucune stimulation a lieu. Cette séance sert à aborder les réponses conditionnelles («CR») qui résultent de l’apprentissage associatif entre la stimulation et l’environnement où elle a été reçue. Au moins trois jours après "Phase 1", la "Phase d’inversion" a lieu qui suit la même structure que "Phase 1" mais le compartiment principal précédemment non jumelé est maintenant jumelé à une stimulation lumineuse. Comme dans le cas de "Phase 1", les deux séances de stimulation sont suivies d’une séance "CR". La «phase d’inversion» est utilisée pour confirmer que le comportement de la souris est subordonné à la stimulation optogénétique et n’est pas lié à des paramètres aléatoires. Chaque session de l’expérience RT-PP doit être programmée séparément dans le logiciel de suivi. Le protocole actuel décrit ces paramètres au sein d’un logiciel spécifique, mais tout autre logiciel de suivi capable d’envoyer des signaux de modulation transistor-transistorlogique (TTL) à la source lumineuse peut être utilisé.
Le deuxième protocole décrit une nouvelle configuration appelée le paradigme de la préférence de compartiment neutre (NCP). Ce protocole modifié de la RT-PP tire parti de la petite taille et de la transparence du couloir de raccordement qui est naturellement évité par la souris en raison de sa composition étroite et transparente. En jumelant les deux compartiments principaux avec la lumière-stimulation et en laissant seulement le couloir exempt de lumière-stimulation, la configuration de NCP peut être employée pour tester si la stimulation optogénétique forcera la souris à passer plus de temps dans le couloir pour éviter de recevoir stimulation optogénétique. En comparant le temps passé dans les deux compartiments légers avec le temps passé dans le couloir, une vérification de l’aversion induite par l’optogénétique peut être faite. L’expérience NCP consiste en deux séances quotidiennes consécutives où les souris optogénétiques reçoivent une stimulation (30 min chacune) pour mesurer la préférence en temps réel, et une séance sans laser (15 min) pour évaluer les réponses conditionnées de la même manière que ceux de la RT-PP Protocole.
Les protocoles RT-PP et NCP fournis ci-dessous ont été récemment validés dans notre laboratoire dans l’étude de la façon dont différents types de neurones situés dans la zone tegmental ventrale (VTA) sont impliqués dans divers aspects du comportement lié à la récompense12. Ici, pour illustrer la mise en œuvre des protocoles RT-PP et NCP, transporteur de dopamine (DAT)-Cre19 et transporteur de glutamate vésiculaire 2 (VGLUT2)-Cre20 souris transgéniques ont été injectés stéréotaxiquement avec AAV portant un floxed channelrhodopsin2 (ChR2) ADN dans le VTA sur quoi une fibre optique a été implantée au-dessus de la VTA. Les réponses comportementales obtenues lors de l’analyse de ces souris à l’aide des protocoles RT-PP et NCP fournis montrent comment l’activation des neurones dopaminergiques et glutamatergiques au sein de la VTA conduit à différentes réponses comportementales (Figure 1).
Les protocoles étape par étape pour les paradigmes RT-PP et NCP sont fournis avec des informations allant du génotypage des souris transgéniques, injections virales stéréotaxiques et placement de fibre optique, à la programmation de logiciels de suivi pour le contrôle laser et comportemental Évaluation. En outre, des suggestions de modifications du protocole en termes de paramètres de stimulation et d’aspects expérimentaux qui peuvent affecter les résultats scientifiques sont discutées. Bien que les protocoles soient décrits dans le contexte de l’ATV, ils peuvent être appliqués à n’importe quelle zone du cerveau ou à la population neuronale, à condition que les outils d’optogénétique pertinents, tels que les opécandes cre-driver et les opsines floxed pertinents, soient disponibles.
Protocol
Cette étude a été réalisée à l’aide d’hétérozygotes DAT-Cre19 et VGLUT2-Cre20 souris des deux sexes, âgés de 'gt;8 semaines et pesant 'gt;20 g. Toutes les expériences ont été menées conformément à la législation suédoise (Animal Welfare Act SFS 1998:56) et à la législation de l’Union européenne (Convention ETS 123 et Directive 2010/63/EU) avec l’autorisation des comités locaux d’éthique animale.
1. Génotypage de souris
- Prenez des biopsies d’oreille utilisant un poinçonneur d’oreille pour employer pour le génotypage des souris transgéniques.
- Préparer les poinçons d’oreille pour effectuer une réaction en chaîne de polymérase (PCR) à l’aide d’amorces faites à cet effet.
REMARQUE : Dans ce protocole, des amorces dirigées par Cre ont été utilisées.- Ajouter 75 l de tampon de lyse (tampon de 1 : 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) dans chaque tube de 1,5 ml contenant un poinçon d’oreille.
- Incuber dans un bloc de chauffage à 96 oC pendant 30 min.
- Laisser refroidir les échantillons pendant 5 min, puis ajouter 75 l de la zone tampon de neutralisation (tampon 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
- Effectuer PCR selon les procédures standard12,21 en utilisant les amorces appropriées (ici: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGTTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3').
CAUTION : Travaillez sur la glace sous une hotte PCR et faites attention à ne pas contaminer les réactifs et les échantillons.- Préparer le mix PCR master. Multipliez les volumes suivants en fonction du nombre d’échantillons qui seront analysés, y compris les échantillons témoins appropriés. Mélanger les réactifs pour une seule réaction de volume final de 25 L dans l’ordre suivant : eau distillée (18,9 l), tampon 10x avec MgCl2 (2,5 l), mélange dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix 0,5 L), 10 'M amorce avant (1 'L), 10 'M amorce inversée (1 L), 5 U/L polymérase d’ADN (0,1 'L), et l’ADN du modèle (1 l; seront ajoutés dans les prochaines étapes).
REMARQUE : Ajoutez toujours un contrôle négatif, positif et vide (sans ADN modèle) pour assurer des résultats valides. - Ajouter 24 ll de mélange maître dans des tubes PCR.
- Ajouter 1 L d’ADN de modèle (provenant du poinçon d’oreille de chaque souris) dans chaque tube PCR.
- Centrifuger les tubes PCR brièvement pour s’assurer que l’ADN du modèle est à l’intérieur du mélange maître.
- Effectuez PCR avec un vélo thermique en utilisant le programme de cyclisme dans le tableau 1.
- Préparer le mix PCR master. Multipliez les volumes suivants en fonction du nombre d’échantillons qui seront analysés, y compris les échantillons témoins appropriés. Mélanger les réactifs pour une seule réaction de volume final de 25 L dans l’ordre suivant : eau distillée (18,9 l), tampon 10x avec MgCl2 (2,5 l), mélange dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix dNTP de 10 mM (mix 0,5 L), 10 'M amorce avant (1 'L), 10 'M amorce inversée (1 L), 5 U/L polymérase d’ADN (0,1 'L), et l’ADN du modèle (1 l; seront ajoutés dans les prochaines étapes).
- Préparer un gel d’agarose pour exécuter les échantillons à l’aide d’électrophoresis.
REMARQUE : La taille dépendra du nombre d’échantillons qui doivent être analysés.- Ajouter 1 % de poudre d’agarose w/v dans un tampon 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) dans une bouteille en verre. Chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute, en vérifiant régulièrement qu’elle ne déborde pas.
CAUTION: Prenez des précautions pour éviter les brûlures. - Laisser refroidir le gel jusqu’à environ 50 oC et ajouter une tache de gel d’acide nucléique (0,5 l/50 ml de gel).
- Verser le gel dans le plateau de coulée contenant des peignes bien et le laisser à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit complètement solidifié. Retirer délicatement les peignes.
- Remplissez le réservoir d’électrophorèse avec un tampon 1x TAE et placez le gel dans le réservoir.
- Ajouter 2 ll de colorant de chargement d’ADN 1x dans chacun des échantillons d’ADN.
- Chargez 4 ll d’échelle d’ADN dans le premier puits du gel, puis chargez le volume complet des échantillons dans les puits restants.
- Définir la source d’énergie de l’électrophorèse à 140 V et courir pendant 25 à 30 min.
- Placez le gel sous une source UV et prenez une photo des résultats.
- Ajouter 1 % de poudre d’agarose w/v dans un tampon 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) dans une bouteille en verre. Chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute, en vérifiant régulièrement qu’elle ne déborde pas.
2. Chirurgie stéréotaxique
- Après le génotypage, des souris séparées gardant ceux positifs pour Cre. Attendez qu’ils soient au moins 8 semaines et peser 20 g pour effectuer la chirurgie.
- Assainiz l’environnement et stérilisez les outils chirurgicaux pour effectuer la chirurgie dans des conditions aseptiques.
- Injecter les souris sous-cutanée avec analgésique 30 min avant la chirurgie.
- Anesthésiez les souris à l’isoflurane (2 à 3 % dans l’air normal pour l’induction et 1,5 à 2,0 % pour le maintien de l’anesthésie). Assurer un niveau d’anesthésie adéquat est atteint en testant l’absence de réflexes de douleur en pinçant doucement l’orteil de la souris. Ajuster la livraison d’isoflurane en conséquence.
- Placez la souris sur l’appareil stéréotaxique. Ajouter du lubrifiant pour les yeux pour prévenir les lésions oculaires dues à la sécheresse et raser les cheveux du haut du crâne. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température de l’écurie de la souris.
- Injecter 100 l d’anesthésique local sous la peau du crâne et laisser 5 min prendre effet.
- Préparer le site d’incision par trois applications circulaires d’alcool ou de salin stérile en alternance avec de l’iode. Utilisez une pointe de coton stérile et initier l’application de la ligne d’incision, vers l’extérieur.
- Soulevez doucement la peau avec des forceps, et faites une incision de 1,5 cm le long de l’axe rostrocaudal avec des ciseaux chirurgicaux pour révéler la surface du crâne.
- À l’aide d’un bâtonnet de coton, appliquer la solution H2O2 pour enlever le périosteum.
- Rincer le crâne avec du salin stérile et le sécher à l’aide d’applicateurs stériles à pointe de coton.
- Localiser le bregma et lambda.
- Vérifier l’alignement plat du crâne en positionnant la pointe de l’aiguille d’injection, ajustée sur le cadre stéréotaxique, sur le bregma et le lambda. Mesurer les coordonnées ventrales pour chaque position et comparer. Lorsque le crâne est plat, la coordonnées ventrales pour bregma et lambda sont identiques. Si ce n’est pas le cas, ajustez la position de la tête et reprenez les mesures.
- Trouver et marquer la position (AP: -3.45 mm, ML: -0.2 mm de bregma selon Franklin et Paxinos22) où l’injection du virus Cre-dépendant et l’implantation de la fibre optique aura lieu et faire un petit trou à l’aide d’une micro-perceuse.
- Chargez 400 nL de virus dans la seringue de 10 l montée sur l’appareil stéréotaxique à l’aide d’une pompe de précision.
- Abaissez soigneusement l’aiguille (34 G, biseautée) et injectez 300 nL de virus optogénétique dépendant de Cre(AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5,6 x10 12 vg/mL]) dans le VTA (AP: -3.45 mm, ML: -0,2 mm de bregma et -4,4 mm de la surface du crâne, selon Franklin et Paxinos22) à 100 nL/min taux d’injection à l’aide de la pompe de précision.
- Après l’injection, laisser l’aiguille en place pendant 10 min supplémentaires pour permettre la diffusion du virus (figure 2A).
- Retirez l’aiguille lentement du site d’injection.
- Faites de petits trous à l’aide d’un microdrill pour ajuster les vis d’ancrage qui stabiliseront la fibre optique et le complexe de ciment dentaire.
- Reprenez les coordonnées bregma et implantez la fibre optique (200 m de diamètre, 0,37 NA) à: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm de bregma et -4,0 mm de la surface du crâne (Figure 2B) selon Franklin et Paxinos22.
- Fixer la fibre sur le crâne à l’aide de ciment dentaire. Appliquer suffisamment de ciment autour de la fibre optique ferule pour le fixer au crâne, mais attention à laisser 3 -4 mm du haut de la ferule libre de ciment pour permettre la connexion du cordon patch (Figure 2C).
REMARQUE: Faites attention à ne pas remplir le trou avec du ciment car cela peut causer des lésions tissulaires du cerveau. Des matériaux hémostatiques peuvent être ajoutés dans le trou pour éviter que cela ne se produise. - Utilisez de la colle de tissu ou des sutures absorbables pour fermer toute plaie ouverte et laisser l’animal se rétablir pendant au moins deux semaines. Donnez une dose supplémentaire d’analgésiques de 12 à 24 h après la chirurgie.
3. Configuration du contrôle de la source laser
- Utilisez des microcontrôleurs à carte unique pour contrôler la source laser. Écrivez un script à l’aide du logiciel approprié. Chargez le script sur le tableau de microcontrôleur à l’aide du câble de connexion approprié à l’ordinateur.
REMARQUE : Le script doit inclure la modulation externe (entrée) provenant du logiciel de suivi à travers une boîte TTL, et une sortie au laser pour contrôler les paramètres de stimulation. Pour 10 ms largeur d’impulsion à la fréquence de 20 Hz, utilisez le script trouvé dans le fichier de codage supplémentaire. - Connectez la carte au laser et à la boîte TTL du matériel de suivi.
- Utilisez un câble réseau pour connecter la boîte TTL à la carte (épingle 5 pour le script fourni) (Figure 3A,C).
- Assurez-vous que le laser est réglé pour contrôler par modulation externe et connectez le laser à la carte à l’aide d’un câble FC/PC (pin 13 pour le script donné) (Figure 3B,C).
- Connectez les broches appropriées aux parties au sol de la planche.
- Connectez la source laser à la fibre optique.
- Connectez la source laser à un joint rotatif (Figure 3D).
- Connectez un cordon de correction (figure 3E) à l’articulation rotative.
- Stabiliser l’articulation rotative au-dessus de l’appareil, mais à l’extérieur de la zone d’enregistrement. Assurez-vous que la longueur du cordon de patch à fibre optique est appropriée pour permettre à la souris de se déplacer sans difficultés dans l’arène (Figure 3F).
4. Mise en place de l’expérience pour l’approche RT-PP dans le logiciel de suivi
- Calibrer la configuration de l’arène. Utilisez une règle pour mesurer une partie spécifique de l’appareil physique, tracez une ligne correspondant à la partie mesurée sur l’image dans le logiciel sous l’échelle de dessin pour calibrer l’onglet et entrez la valeur déjà connue (étape 1 de la figure 4).
- Concevoir l’arène. Dessiner la zone où le mouvement des souris sera enregistré (étape 2 de la figure 4).
- Créez les zones. Dessiner les zones qui seront éventuellement assignées comme laser-appariement, laser-nonappet "neutre" (étape 3 dans la figure 4).
- Valider la configuration pour confirmer qu’il n’y a pas de paramètres contradictoires, par exemple les zones à l’extérieur de l’arène (étape 4 à la figure 4)
- Définiz les paramètres expérimentaux sous les paramètres de contrôle d’essai de l’onglet (étape 5 de la figure 4).
- Définir le temps d’essai comme indiqué à l’étape 1 de la figure 5 pour une session RT-PP de 30 min.
- S’assurer que le « contrôle matériel » est activé, assignez un compartiment en tant que laser-apparié dans lequel l’entrée de la souris déclenchera un signal DeTL par le logiciel de suivi au conseil de microcontrôleur. Dans la figure 5 (étape 2), le compartiment couplé au laser est le compartiment A. Pour la phase d’inversion, changez les compartiments de sorte que le compartiment B sera couplé au laser et le compartiment A ne sera pas apparié. Faites-le en remplaçant A par B et B par A dans le logiciel.
5. Modification de la configuration pour tester les propriétés aversives de la stimulation à l’aide de l’approche NCP
- Suivez les étapes 4.1-4.4 comme décrit précédemment.
- Définir l’heure de l’expérience à 30 min à travers l’option "Repeat till" dans les paramètres de la boîte "Référence" (étape 1 de la figure 6).
- Attribuer les zones A et B en tant que laser apparié (étape 2 de la figure 6) en ajoutant « lorsque le point central se trouve dans l’une des zones A et zone B » pour la boîte d’état liée aux paramètres des compartiments A et B. Notez que le laser s’éteint lorsque l’animal est situé dans le compartiment neutre.
6. Effectuer une expérience à l’aide de stimulation laser
- Configurez les paramètres de détection.
- Utilisez un mannequin pour ressembler à la souris afin d’assurer des paramètres de détection appropriés.
- Placez le mannequin dans un compartiment de l’appareil et utilisez la configuration automatisée avec soustraction dynamique.
- Retirez le mannequin et placez-le dans le compartiment opposé. Assurez-vous que le mannequin est entièrement détecté et si non, ajuster les paramètres via le logiciel pour atteindre une détection appropriée.
- Au cours de cette étape également vérifier si la stimulation fonctionne comme il est censé. Commencez l’acquisition en utilisant les paramètres de contrôle d’essai précédemment configurés et placez le mannequin dans le compartiment couplé au laser et voyez si la stimulation est déclenchée comme il se doit. Placez ensuite le mannequin dans le compartiment non apparié et/ou neutre et voyez si la stimulation est arrêtée.
- Utilisez un compteur de puissance avec un capteur pour régler la puissance laser à 10 mW en utilisant le bouton sur le laser (Figure 3B). Effectuez cette étape chaque fois que la stimulation laser est utilisée.
CAUTION: Utilisez de l’équipement pour les yeux protecteurs comme exposition directe à la lumière laser peut causer des dommages oculaires permanents. - Placez la souris dans l’appareil.
- Sortez doucement la souris de sa cage et connectez l’implant à fibres optiques au cordon de patch de fibre optique à l’aide d’un manchon en céramique.
- Placez la souris doucement dans le compartiment neutre de l’appareil à trois compartiments.
- Attendez que la souris soit détectée par le logiciel.
- Retirez les portes coulissantes verticales qui empêcheront l’animal d’entrer dans les compartiments principaux.
- Permettre à l’animal d’explorer librement sans aucune perturbation.
REMARQUE: La même procédure est suivie lorsque l’animal ne reçoit pas de stimulation à l’exception que l’étape 6.2 n’est pas nécessaire et que le laser est éteint tout le temps.
Representative Results
L’appareil à trois compartiments (Figure 3F) est adapté pour traiter les effets gratifiants des médicaments et pour évaluer en temps réel les propriétés enrichissantes ou aversives de la stimulation directe des neurones à l’aide de l’optogénétique. Il se compose de deux compartiments principaux (20 cm [W] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) et d’un compartiment de raccordement plus petit (20 cm [W] x 7 cm [L] x 25 cm [H]). Les compartiments principaux ont la texture et les modèles distincts de mur et de plancher afin de faciliter l’apprentissage associatif, alors que le compartiment de raccordement/neutre est étroit et transparent ainsi les souris passent naturellement moins de temps dedans. Comme décrit ci-dessus, le logiciel de suivi peut être utilisé pour enregistrer plusieurs paramètres comportementaux des souris, y compris le mouvement et le temps passé dans chaque compartiment, et pour contrôler la stimulation laser. L’ensemble de l’expérience RT-PP se déroule tout au long de 8 sessions (figure 1A) et permet à la fois l’évaluation des propriétés enrichissantes ou aversives de la stimulation directe (jours 3, 4, 6 et 7) et la formation d’associations, positives ou négatives, en réponse à l’expérience précédente (jours 5 et 8, "CR").
Tout d’abord, nous avons testé des souris DAT-Cre injectées avec le virus AAV-ChR2-eYFP dans le VTA pour cibler les neurones dopaminergiques. Conformément à la littérature, nous avons observé que les souris préféraient passer du temps dans le compartiment jumelée à la stimulation(figure 1B, phase 1, jours 3 et 4, cercles bleus, mesures répétées bidirectionnelles [RM] analyse de la variance [ANOVA], effet du compartiment F(2,18) - 141, p lt; 0,001; effet de la session x compartiment F(12 108) Le test post hoc de Tukey jumelé à un p non apparié; 0,001). La phase d’inversion, où l’appariement des compartiments à la stimulation laser a été commuté, a confirmé ces observations(figure 1B, jours 6 et 7, cercles bleus, test post hoc de Tukey couplé par rapport au compartiment non apparié p 'lt; 0,001) excluant ainsi la possibilité que les résultats obtenus à partir de la phase 1 étaient liés à des biais latéraux ou des paramètres aléatoires. La moyenne du temps passé dans chaque compartiment pendant les quatre jours de RT-PP a confirmé que les souris passaient en moyenne environ 70 % de leur temps dans le compartiment couplé au laser, par opposition aux non-appariements (environ 20 %) et le neutre (10 %) compartiments(graphiqueà barres de la figure 1B, RM ANOVA à sens unique, effet de stimulation F(2,6) 139, p 'lt; 0,001, poste de Tukey comment jumelé vs compartiments non appariés et neutres p 'lt; 0,001). En outre, en l’absence de stimulation, les jours 5 et 8, les souris ont passé beaucoup plus de temps dans le compartiment précédemment jumelé à la stimulation laser (Tukey post hoc p 'lt; 0.001), indiquant que l’expérience précédente était suffisante pour induire des comportements d’apprentissage associatifs reflétés comme «recherche» de la stimulation. Ces données sont en conformité avec la littérature et démontrent que la méthode actuelle peut être utilisée de façon fiable pour étudier les effets enrichissants de la stimulation optogénétique de populations neuronales spécifiques dans le VTA.
Nous avons ensuite testé des souris VGLUT2-Cre injectées avec AAV-ChR2-eYFP dans le VTA comme ci-dessus, pour cibler les neurones glutamatergiques de la VTA. Dans cette expérience, nous avons observé un phénotype comportemental opposé de celui démontré par les souris DAT-Cre. Ainsi, les souris ont évité le compartiment apparié à la stimulation et ont passé plus de temps dans le non-appariement pendant tous les jours RT-PP(Figure 1C à gauche, bidirectionnelle RM ANOVA, effet du compartiment F(2,12) - 40,9, p lt; 0,001; effet de la session x compartiment F(12,72) - 16,1, p lt; 0,001; Le test post hoc de Tukey jumelé à un p non apparié; 0,001; Figure 1C droite, effet RM ANOVA à sens unique de la stimulation F(2,6) 162, p lt; 0,001, Tukey’s post hoc paired vs unpaired and neutral compartments p 'lt; 0.001). Fait intéressant, pendant les jours 5 et 8 du «CR», les souris n’ont pas montré d’évitement clair du compartiment précédemment apparié (aucune différence entre les compartiments appariés et les compartiments non appariés). Il est possible que l’absence de réponse conditionnée soit due à un temps insuffisant passé dans le compartiment couplé au laser, ce qui a empêché la formation d’associations entre l’activation du laser et l’environnement particulier où cela s’est produit. Pour explorer davantage ce phénotype d’évitement, nous avons utilisé un protocole modifié que nous avons appelé « préférence compartiment neutre », abrégé NCP. Dans cette expérience, les deux compartiments principaux ont été jumelés à la stimulation et le compartiment neutre est resté sans stimulation (figure 7A). Nous avons émis l’hypothèse que, si la stimulation a des propriétés aversives, alors la souris sera obligée de passer du temps dans le compartiment plus petit et neutre, pour l’éviter. En effet, dans les deux jours de stimulation (Stim1 et Stim2) les souris ont passé la majorité du temps dans le compartiment neutre (environ 80%) par rapport aux compartiments appariés(figure 7B,C;gauche : effet RM ANOVA bidirectionnel du compartiment F(2,8) à 70,9, p’lt; 0,001; effet de la session x compartiment F(4,16) - 6,9, p - 0,002, Tukey post hoc "Stimulation 1" compartiment neutre vs compartiment 1 et 2 p 'lt; 0.01, "Stimulation 2" compartiment neutre vs compartiment 1 et 2 p 'lt; à droite: à sens unique RM ANOVA, effet de stimulation F(2,2) 0.018, test post hoc de Tukey apparié 1 et 2 vs neutre p 'lt; 0.05). Comme dans le cas des jours de «CR» pendant le test RT-PP, les souris ne semblaient pas former d’associations négatives entre les compartiments et la stimulation ; c’est-à-dire qu’en l’absence de stimulation (CR), ils ont exploré tous les compartiments au même degré(figure 7B, aucune différence entre le temps passé dans les compartiments jumelés et le compartiment neutre). Les résultats de ces expériences ont confirmé le phénotype comportemental observé pendant la configuration rt-PP et soutiennent ainsi la mise en œuvre combinatoire des paradigmes RT-PP et NCP.
Figure 1 : Tests comportementaux utilisant l’optogénétique dans le paradigme RT-PP. (A) Représentation schématique de la chronologie des expériences. (B,C) En haut à gauche : graphique représentant le pourcentage de temps passé dans chaque compartiment tout au long de l’expérience RT-PP pour les souris DAT-Cre (N - 10) et VGLUT2-Cre (N - 7) injectées avec Des souris AAV-ChR2-eYFP. Cercles bleus : compartiment couplé au laser; cercles blancs et noirs : compartiments principaux; cercles gris : compartiment neutre. En haut à droite : pourcentage moyen de temps passé dans chaque compartiment pendant les jours 3, 4, 6 et 7 (RT-PP). En bas : cartes thermiques représentatives du temps passé dans chaque compartiment pour une souris DAT-Cre et une souris VGLUT2-Cre. Toutes les données étaient normalement distribuées (test Shapiro-Wilk). Les résultats sont présentés comme étant la moyenne de la SEM. p 'lt; 0.05,'p 'lt; 0.01,'p 'lt; 0.001 paired vs compartiment neutre; p 'lt; 0.01,'p 'lt; 0.001 non appariement vs compartiment neutre. Ce chiffre a été modifié à partir de Bimpisidis et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Procédure chirurgicale pour les expériences optogénétiques. (A) Injection du vecteur viral Cre-dépendant dans le VTA. (B) Implantation de la fibre optique au-dessus du site d’injection. Notez les vis d’ancrage utilisées pour la stabilisation. (C) Ancrage permanent de la fibre sur le crâne à l’aide de ciment dentaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Équipement utilisé dans les expériences d’optogénétique. (A) La boîte TTL utilisée dans les études. Il reçoit l’entrée du logiciel de suivi et envoie des signaux TTL à la carte de microcontrôleur. (B) Vue avant (en haut) et arrière (en bas) de la source laser utilisée pour les expériences. (C) La carte de microcontrôleur utilisée pour contrôler la stimulation laser. Notez les connexions de la boîte TTL et à la source laser. (D) Joint du Rotary. (E) Accord de patch fibre optique utilisé dans les expériences. (F) L’appareil à trois compartiments utilisé pour les expériences RT-PP et NCP. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Concevoir l’arène et les zones dans le logiciel de suivi. Étape 1 : Calibration de la configuration. Étape 2 : Dessin de toute l’arène. Étape 3 : Dessiner des zones à l’intérieur de l’arène. Étape 4 : Validation de configuration. Étape 5 : Onglet Paramètres de contrôle d’essai pour configurer les paramètres de temps et de stimulation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Configuration des paramètres de temps et de stimulation d’une expérience RT-PP dans le logiciel de suivi. Ajout de règles spécifiques pour la durée (étape 1) et les conditions de stimulation de la lumière (étape 2). Les conditions peuvent être facilement modifiées pour s’adapter aux exigences de la phase d’inversion. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Configuration des paramètres de temps et de stimulation des expériences NCP dans le logiciel de suivi. La durée des séances de stimulation (étape 1) est similaire à celles de la RT-PP, mais les conditions d’activation de la stimulation lumineuse (étape 2) sont différentes. L’entrée dans l’un ou l’autre compartiment principal (ici nommé zone A et zone B) entraîne une stimulation optogénétique qui n’est terminée que lorsque la souris entre dans le compartiment neutre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Tests comportementaux utilisant l’optogénétique dans le paradigme NCP. (A) Représentation schématique de la configuration expérimentale. (B) Gauche : graphique représentant le pourcentage de temps passé dans chaque compartiment pendant les deux jours de stimulation (Stim1 et Stim 2) et pendant la séance de réponse conditionnée (CR) pour les souris VGLUT2-Cre injectées avec AAV-ChR2 dans le VTA (N - 5). Droite : pourcentage moyen de temps passé dans chaque compartiment pendant les deux jours de stimulation du PCN. (C) Carte thermique représentative du temps passé dans chaque compartiment pour une souris VGLUT2-Cre pendant l’un des jours de stimulation. Les données étaient normalement distribuées (test Shapiro-Wilk). Les résultats sont présentés comme étant la moyenne de la SEM. Ce chiffre a été modifié à partir de Bimpisidis et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Étape | Température | Durée | Cycles |
| 1. Dénaturation initiale | 95 oC | 4 min | 1 |
| 2. Dénaturation | 95 oC | 30 s | 30 |
| 3. Annealing | 55 oC | 30 s | |
| 4. Extension | 72 oC | 40 s | |
| 5. Extension finale | 72 oC | 6 min | 1 |
| 6. Tenir | 4 oC | Jusqu’à ce qu’il soit arrêté par l’expérimentateur | 1 |
Tableau 1 : Le programme de cyclisme PCR.
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Discussion
Dans la présente étude, nous présentons deux protocoles étape par étape de la façon d’effectuer différents types d’analyses de préférence de lieu utilisant l’optogénétique chez la souris. Les protocoles décrits ont été utilisés pour évaluer les phénotypes comportementaux récompensants ou aversifs des neurones VTA(figure 1 et figure 6)12, mais peuvent être utilisés pour explorer le rôle comportemental des neurones dans d’autres régions du cerveau ainsi.
Plusieurs études récentes ont décrit les paradigmes RT-PP dans les appareils à deux compartiments23,24 et trois compartiments13,14,15,16,17,18. Les protocoles actuels décrivent des configurations détaillées pour les protocoles RT-PP et NCP dans un appareil à trois compartiments ressemblant à ceux traditionnellement utilisés dans les expériences du RPC pour évaluer les effets comportementaux sur l’administration de drogues d’abus. Alors que les résultats ne sont présentés ici que comme le pourcentage de temps passé par la souris dans chaque compartiment, le logiciel de suivi permet d’analyser plusieurs autres paramètres comportementaux, tels que les transitions vers les zones, la vitesse, le temps passé immobile et plus encore. L’analyse de différents paramètres peut être importante pour l’interprétation des données.
Les protocoles RT-PP actuels sont flexibles et peuvent être modifiés pour vérifier si différents types de modèles de stimulation ont des effets gratifiants. Les paramètres de contrôle laser peuvent être facilement modifiés soit par le script de la carte de microcontrôleur ou dans le logiciel de suivi, démontrant la polyvalence de la configuration. Nous suggérons une fréquence de stimulation de 20 Hz qui est dans la gamme, et parfois plus bas, des fréquences appliquées dans les études précédentes utilisant la même variante d’opsine (ChR2/H134R) pour étudier les neurones dopaminergiques et glutamatergiques et leurs terminaux13,14,16,17,18,23,24,25,26,27. Des études récentes ont démontré que des fréquences de stimulation plus élevées peuvent avoir des effets opposés sur le comportement que les plus faibles, et que ces effets sont médiés par un bloc de dépolarisation causé par des fréquences plus élevées28. De même, des différences dans la sortie comportementale ont été montrées en stimulant les neurones glutamatergic et GABAergic dans la zone préoptique latérale15. Ces études ont examiné des neurones de différentes zones que le VTA et les plus grands effets ont été observés sur les hautes fréquences des neurones non-glutamatergiques15,28. Notre choix sur 20 Hz est basé sur des études précédentes de neurones VTA glutamatergiques et dopaminergiques démontrant que par des fréquences de stimulation variables, la production comportementale liée à la récompense n’est pas significativement modifiée24,26.
Un paramètre supplémentaire qui peut être ajusté et qui peut influencer le résultat expérimental est la puissance de la source de lumière. Une puissance laser plus élevée peut augmenter la taille de la zone stimulée par la lumière, ce qui peut être bénéfique dans certains types d’expériences, mais avec l’inconvénient d’une augmentation de la température5. En effet, une étude récente a démontré que les augmentations induites par le laser de la température peuvent modifier la physiologie du cerveau et affecter les mesures comportementales29. Ces observations soulignent l’importance d’inclure des contrôles opsin-négatifs dans la conception expérimentale. Dans le protocole actuel, nous avons utilisé 10 mW puissance laser qui est similaire et a été précédemment montré pour être efficace dans la stimulation des neurones dopaminergiques et glutamatergiques dans le VTA16,24,26. Lors de la mise en place d’expériences, il est important de prêter attention à la taille de la zone dans laquelle les cellules d’intérêt sont situées et les propriétés de la fibre optique et du cordon patch (ouverture numérique, diamètre du noyau). Ces paramètres sont essentiels à prendre en considération lors de l’exécution de calculs liés à la puissance laser. Pour plus de détails, la calculatrice développée par le laboratoire de Karl Deisseroth(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)peut être utilisée.
La vérification histologique de la recombinaison Cre-Lox est un autre aspect critique lors de l’application d’expériences d’optogénétique. La validation de l’efficacité de la recombinaison doit toujours avoir lieu dans une cohorte pilote avant le début de toute expérience comportementale chez un grand groupe d’animaux. Ceci est important pour des raisons éthiques mais aussi pour une production expérimentale optimisée. Chaque construction virale peut montrer une spécificité variable pour les types neuronaux distincts et dans différentes régions5, un paramètre qui peut affecter les expériences de manière imprévisible et même trompeuse. Par exemple, nous avons déjà validé le modèle de recombinaison Cre-Lox des virus AAV5 dans la VTA des souris DAT-Cre et constaté que les injections unilatérales étaient suffisantes pour cibler la majorité de la zone d’intérêt. Lorsque nous avons ensuite étudié les sous-populations spatialement restreintes au sein de la VTA, comme celle caractérisée par l’expression NeuroD6, nous avons observé que les injections virales bilatérales étaient plus efficaces pour cibler un plus grand nombre de neurones donnant des effets comportementaux plus prononcés sur la stimulation de la lumière optogénétique12. En outre, le temps de la chirurgie à l’initiation des expériences comportementales doit être abordé avec soin. Deux semaines est assez de temps pour une construction d’ADN ChR2 à exprimer dans les corps cellulaires que nous montrons ici, mais des temps d’attente plus longs (environ 8 semaines) pourraient être nécessaires si l’enquêteur teste l’effet de la stimulation dans les zones de projection13,14,15,17.
Il convient de noter que le volume de virus injecté (dans notre cas 300 nL) pourrait être approprié lors de l’étude des neurones dans le VTA, mais le volume et le taquet doivent être ajustés en fonction de l’efficacité de la transduction et la taille de la structure étudiée. En outre, pour les structures bilatérales situées à une distance de l’axe médiolatéral, il pourrait être nécessaire d’effectuer des injections bilatérales, et d’implanter la fibre optique bilatéralement pour assurer l’activation/inhibition dans les deux hémisphères.
Enfin, il est toujours nécessaire d’effectuer une analyse histologique post-mortem pour valider et confirmer l’efficacité de la recombinaison Cre-Lox et vérifier le bon site d’implantation de la fibre optique à l’emplacement prévu. Une recombinaison Cre-Lox inattendue, trop restreinte ou excessive peut se produire en raison de la distribution inconnue de neurones exprimant Cre en dehors des frontières de la zone prévue, ou en raison de différences dans le sérotype du virus, mauvaise manipulation du virus, colmatage de la pour l’administration du virus ou d’autres problèmes liés à la chirurgie. La vérification de la recombinaison satisfaisante de Cre-Lox et de la fibre optique-implantation correcte doit être exécutée pour confirmer n’importe quel résultat statistique des évaluations comportementales afin de tirer des conclusions sûres.
En termes de données fournies ici comme exemples de la façon dont les deux paradigmes comportementaux peuvent être utilisés, la préférence significative pour le côté léger apparié obtenu par stimulation optogénétique des neurones dopaminergiques dans le VTA en analysant les souris DAT-Cre dans le paradigme RT-PP a été prévu sur la base des résultats précédents23,24,25,26,27 alors que l’évitement de ce côté montré par les souris VGLUT2-Cre n’était pas prévu. VGLUT2 neurones de la VTA et leurs projections ont été montrés pour être impliqués à la fois dans la récompense et l’aversion16,17,24,30,31, et nous avons donc effectué l’analyse NCP pour évaluer le comportement d’évitement apparent observé dans la configuration actuelle RT-PP plus en détail. En utilisant le couloir étroit et transparent comme seul compartiment couplé non léger pour confirmer les propriétés aversives de la stimulation des neurones glutamatergiques VTA, il est évident que dans cette configuration particulière de trois compartiments, l’activation optogénétique de ces neurones provoque une réponse aversive. Ces expériences, qui ont été montrées ici pour illustrer des situations qui pourraient bénéficier de l’utilisation des protocoles RT-PP et NCP, faisaient partie d’une étude récemment publiée, et l’ensemble complet de données ainsi que les discussions concernant ces résultats peuvent être trouvés dans cette publication12.
En plus du PCN, d’autres moyens de confirmer l’aversion incluent l’éclairage fort d’une zone dans une zone de champ ouvert tout en jumelant le reste de l’arène à l’activation de laser, ou exécutent une tâche active d’évitement dans laquelle la souris doit exécuter un modèle spécifique de comportement pour mettre fin à la stimulation de laser15.
Pour résumer, les protocoles décrits fournissent des informations critiques sur la façon d’effectuer avec succès l’analyse RT-PP et NCP de la manière la plus efficace afin de démêler le rôle de l’activation neuronale dans la récompense et l’aversion. Selon l’hypothèse scientifique, une gamme de paramètres peut être analysée à l’aide de ces protocoles, et chaque protocole peut également être combiné avec d’autres paradigmes validés pour des analyses comportementales optimisées mettant en œuvre l’optogénétique pour traiter le cerveau spécifique zones et les neurones d’intérêt.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nos sources de financement sont reconnues avec reconnaissance : l’Université d’Uppsala, Vetenskapsràdet (Conseil suédois de la recherche), Hjunnfonden, Parkinsonfonden, les Fondations de recherche de Bertil Hillsten, OE et Edla Johansson, Zoologisk Forskning et 'hlén. Les animaux ont été gardés à l’Université d’Uppsala et des expériences ont été réalisées à l’établissement comportemental de l’Université d’Uppsala.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | - | a great variety of viruses to suit any project's needs |
| Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
| Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
| Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
| Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
| DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
| DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
| Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
| Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
| Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
| Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
| Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
| Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
| Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
| Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
| Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
| Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
| Nucleic Acid gel stain - GelRed | Biotium | 41003-T | |
| PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | |
| Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
| Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
| Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
| Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
| Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
| Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
| TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
| Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
| Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
| UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |
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