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Behavior

माउस के वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र के भीतर ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करके दो अलग-अलग रियल-टाइम प्लेस वरीयता प्रतिमान

Published: February 12, 2020 doi: 10.3791/60867
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Organismal Biology, Unit of Comparative Physiology, Uppsala University

Summary

यहां हम चूहों में ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करके जगह वरीयता प्रतिमान के लिए दो आसान-से-टू-स्टेप प्रोटोकॉल पेश करते हैं। इन दो अलग-अलग सेटअप का उपयोग करना, वरीयता और परिहार व्यवहार को उच्च स्थानिक और लौकिक चयनात्मकता के साथ एक ही उपकरण के भीतर और सीधे तरीके से ठोस रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है।

Abstract

यह समझना कि न्यूरोनल सक्रियण विशिष्ट व्यवहार उत्पादन की ओर कैसे जाता है, आधुनिक तंत्रिका विज्ञान के लिए मौलिक है। मान्य प्रतिमान में व्यवहार परीक्षण के साथ कृंतक में ऑप्टोजेनेटिक्स का संयोजन उच्च स्थानिक और लौकिक चयनात्मकता के साथ वास्तविक समय में अलग न्यूरॉन्स की उत्तेजना पर व्यवहार परिणामों की माप की अनुमति देता है, और इस प्रकार की स्थापना न्यूरोनल सक्रियण और व्यवहार के बीच कारण संबंध। यहां, हम एक वास्तविक समय स्थान वरीयता (आरटी-पीपी) प्रतिमान, शास्त्रीय वातानुकूलित स्थान वरीयता (सीपीपी) परीक्षण का एक संशोधित संस्करण के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। आरटी-पीपी एक तीन डिब्बे तंत्र में किया जाता है और अगर एक विशिष्ट तंत्रिका आबादी के ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना पुरस्कृत या प्रतिकूल है जवाब देने के लिए उपयोग किया जा सकता है । हम आरटी-पीपी प्रोटोकॉल के एक वैकल्पिक संस्करण, तथाकथित तटस्थ कंपार्टमेंट वरीयता (एनसीपी) प्रोटोकॉल का भी वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग घृणा की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। दो दृष्टिकोण व्यवहार फार्माकोलॉजी से उत्पन्न शास्त्रीय पद्धति के विस्तार और तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र के भीतर ऑप्टोजेनेटिक्स के हालिया कार्यान्वयन पर आधारित हैं। वास्तविक समय में जगह वरीयता को मापने के अलावा, ये सेटअप वातानुकूलित व्यवहार के बारे में भी जानकारी दे सकते हैं। हम अपने डेटा के उदाहरणों के साथ आसानी से अनुवर्ती कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और इस प्रकार के प्रयोगों को लागू करते समय विचार करने के लिए महत्वपूर्ण पहलुओं पर चर्चा करते हैं।

Introduction

ऑप्टोजेनेटिक्स का कार्यान्वयन, एक आधुनिक तंत्रिका विज्ञान प्रयोगात्मक उपकरण जिसमें तंत्रिका गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश का उपयोग किया जाता है, ने हाल के वर्षों में यह समझने में प्रमुख प्रगति की है कि विशिष्ट न्यूरोनल आबादी व्यवहार1,2,3को कैसे प्रभावित करती है। ऑप्टोजेनेटिक्स की उत्कृष्ट स्थानिक और लौकिक चयनात्मकता ब्याज और व्यवहार उत्पादन2,3के कोशिका समूहों के उत्तेजना या अवरोध के बीच कारण संबंधों की स्थापना की अनुमति देती है । ऑप्टोजेनेटिक्स में स्थानिक चयनात्मकता आमतौर पर क्रे-लोक्स सिस्टम के माध्यम से सुनिश्चित की जाती है जिसमें क्रे रीकॉम्बिनेज की गतिविधि लोक्स साइटों के बीच मौजूद किसी भी डीएनए दृश्यों का पुनर्संयोजन करती है, जिसे फ्लोक्सेड एलील्स (लोक्स साइटों द्वारा flanked)4कहा जाता है। ऑप्टोजेनेटिक्स में क्रे-लोक्स सिस्टम का उपयोग करने के साथ लक्ष्य अभिव्यक्ति से रहित आसपास के न्यूरॉन्स को छोड़ते हुए ब्याज के विशिष्ट न्यूरॉन्स में ऑप्टोजेनेटिक ऑप्सिन एन्कोडिंग एलोडिंग एलोडिंग की अभिव्यक्ति प्राप्त करना है। ऑप्सिन हल्के-संवेदनशील प्रोटीन होते हैं जो विशिष्ट तरंग-लंबाई के प्रकाश-उत्तेजना पर आयन प्रवाह की अनुमति देते हैं जो तंत्रिका उत्तेजना को प्रभावित करता है या डाउनस्ट्रीम प्रभावक रास्तों को मॉड्यूल करके सेलुलर कार्यों को प्रभावित करता है। ऑप्सिन के उपन्यास वेरिएंट जो कार्रवाई (उत्तेजक, निरोधात्मक, मॉड्यूलरी), तंत्र, प्रकाश तरंगदैर्ध्य और गतिज गुणों द्वारा सक्रियता में भिन्न होतेहैं, 5 को विशिष्ट प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की जरूरतों को पूरा करने के लिए लगातार विकसित किया जा रहा है। उत्तेजना के बारे में, एक ध्रुवीकरण या हाइपरपोलारीकरण ऑप्सिन का उपयोग मस्तिष्क3में वितरित एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश उत्तेजना पर न्यूरॉन्स (क्रमशः उत्तेजना या अवरोध) की गतिविधि तय करता है।

चयनात्मक प्रमोटर गतिविधि क्रे की अभिव्यक्ति को ब्याज के न्यूरॉन्स को पुनः संयोजन का निर्देश देती है। ब्याज के ऑप्सिन के एक floxed एलील को लागू करके, क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन यह सुनिश्चित करेगा कि ऑप्सिन को चुनिंदा न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाए जो सह-एक्सप्रेस क्रे रिकॉम्बिनेज़3,6। स्थानिक चयनात्मकता के लिए डबल ट्रांसजेनिक्स का यह उपयोग ऑप्टोजेनेटिक्स में बहुत कुशल साबित हुआ है। इस प्रकार, जबकि ऑप्टिन को सक्रिय करने के लिए प्रकाश-उत्तेजना मोटे तौर पर एक प्रकाश स्रोत (एलईडी या लेजर)3से जुड़े एक इंट्राट्रेब्रोरैली प्रत्यारोपित ऑप्टिक फाइबर के माध्यम से वितरित की जाती है, केवल न्यूरॉन्स क्रे रिकॉम्बिनेज़ और फ्लोक्सेड ऑप्सिन एलील दोनों को व्यक्त करते हैं, इस उत्तेजना का जवाब देंगे। कृंतक में क्रे-लोक्स सिस्टम को केवल ट्रांसजेनिक्स (क्रे रिकॉम्बिनेज और फ्लोक्सेड ऑप्सिन बिल्डिंग दोनों ट्रांसजेनिक जानवरों में इनकोडेड हैं) का उपयोग करके विभिन्न तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है, केवल वायरल इंजेक्शन (क्रे रिकॉम्बिनेज और फ्लोक्सेड ऑप्सिन के लिए डीएनए निर्माण दोनों वायरल वाहक के माध्यम से वितरित किए जाते हैं), या दोनों का संयोजन (उदाहरण के लिए, क्रे रीकॉम्बिनेज को ट्रांसजेनिक जानवर द्वारा एन्कोड किया जाता है जिसे फ्लोक्स्ड ऑप्सिन निर्माण ले जाने वाले वायरस के साथ इंजेक्ट किया जाता है)5। floxed ऑप्सिन डीएनए निर्माण आमतौर पर एक रिपोर्टर जीन के साथ फ्रेम में क्लोन किया जाता है ताकि ऊतक वर्गों में क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन के दृश्य को सक्षम किया जा सके। जबकि चूहों में ऑप्टोजेनेटिक्स भी किया जा सकता है, चूहों के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल उत्पन्न किए गए हैं। सादगी के लिए, क्रे रिकॉम्बिनेज़ और फ्लोक्सेड ऑप्सिन दोनों को ले जाने वाले चूहों को "ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों" के रूप में जाना जाएगा। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल में, ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों को मिश्रित ट्रांसजेनिक (क्रे दो अलग-अलग प्रमोटरों के नियंत्रण में क्रे पुनर्संयोजन) और वायरल (एक एडेनो-संबद्ध वायरस, एएवी का उपयोग करके, फ्लोक्सेड ऑप्सिन डीएनए निर्माण देने के लिए उत्पन्न किया गया है - हमारे मामले में ChR2/H134R) दृष्टिकोण। ट्रांसजेनिक माउस लाइनों को प्राप्त करना और बनाए रखना कार्यप्रणाली का एक अनिवार्य हिस्सा है। क्रे-ड्राइवर और फ्लोक्स्ड ऑप्सिन ट्रांसजेनिक चूहों को प्रत्येक उद्देश्य के लिए उत्पादित किया जा सकता है, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होने पर खरीदा जा सकता है, जैसा कि डीएनए दृश्यों को ले जाने वाले वायरस की एक श्रृंखला क्रे रिकॉम्बिनेज़ और फ्लोक्सेड ऑप्सिन को विभिन्न रूपों में एन्कोडिंग कर सकती है।

व्यवहार परीक्षण के साथ मिलकर ऑप्टोजेनेटिक्स विशेष प्रकार के व्यवहार में विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों, या असतत न्यूरोनल आबादी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण साबित हुआ है। इनाम से संबंधित व्यवहार के संदर्भ में, ऑप्टोजेनेटिक्स ने व्यवहार फार्माकोलॉजी और प्रायोगिक मनोविज्ञान के क्षेत्र में पिछले निष्कर्षों के सत्यापन को सक्षम किया है, और कुछ न्यूरॉन्स व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं, इसमें स्थानिक-अस्थायी प्रासंगिक विच्छेदन के एक नए स्तर की अनुमति भी दी है। एक विधि जिसका उपयोग इनाम से संबंधित व्यवहार का आकलन करने के लिए कई अध्ययनों में किया गया है, शास्त्रीय विधि का एक संशोधित संस्करण है जिसे वातानुकूलित प्लेस प्रिफरेंस (सीपीपी) के रूप में जाना जाता है। शास्त्रीय सीपीपी का उपयोग7,8 पर्यावरण के संकेतों के साथ पावलोवियन संघों को प्रेरित करने की क्षमता के माध्यम से दुर्व्यवहार की दवाओं के पुरस्कृत या प्रतिकूल गुणों का आकलन करने के लिए किया गयाहै। पावलोवियन शब्दों में, दवा एक अशर्त उत्तेजना है क्योंकि यह क्रमशः पुरस्कृत या प्रतिकूल होने पर दृष्टिकोण या वापसी प्राप्त कर सकती है। विभिन्न तटस्थ उत्तेजनाओं के साथ दवा की निरंतर बांधना, कि खुद को किसी भी प्रतिक्रिया प्रकाश में नहीं आती है, केवल पहले तटस्थ की प्रस्तुति पर दृष्टिकोण या वापसी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन बांधना के बाद, इसलिए वातानुकूलित उत्तेजनाओं 9कहा जाता है । सीपीपी विश्लेषण आमतौर पर एक ही आकार के दो डिब्बों वाले उपकरण में किया जाता है, लेकिन जहां प्रत्येक डिब्बे को अलग विशेषताओं द्वारा परिभाषित किया जाता है, जैसे फर्श बनावट, दीवार पैटर्न और रोशनी (तटस्थ उत्तेजनाएं)। दोनों डिब्बे या तो गलियारे से जुड़े होते हैं या डिब्बों के बीच खुलने से । कंडीशनिंग के दौरान, विषय, आमतौर पर एक छोटा कृंतक, एक दवा के निष्क्रिय इंजेक्शन प्राप्त करता है, जबकि दो मुख्य डिब्बों में से एक तक ही सीमित है और खारा जबकि दूसरे डिब्बे तक ही सीमित है । दवा के पुरस्कृत प्रभावों को बाद में दवा मुक्त सत्र में मूल्यांकन किया जाता है जब विषय को स्वतंत्र रूप से पूरे उपकरण का पता लगाने की अनुमति दी जाती है। पहले दवा-बनती डिब्बे (वातानुकूलित प्रतिक्रिया) में बिताए गए समय की मात्रा को दवा के पुरस्कृत प्रभावों और इसके प्रशासन(वातानुकूलित उत्तेजनाओं) से जुड़े डिब्बे के संकेतों के बीच मध्यस्थता करने वाले पावलोवियन सीखने के तंत्र को प्रतिबिंबित करने के लिए माना जाता है। यदि जानवर दवा-जोड़ी डिब्बे में अधिक समय बिताता है, तो दवा ने एक वातानुकूलित स्थान वरीयता को प्रेरित किया है जिसका अर्थ है कि इसका व्यवहार पर पुरस्कृत प्रभाव पड़ता है। दूसरी ओर, यदि दवा को प्रतिकूल माना जाता है, तो जानवर दवा-जोड़ी वाले डिब्बे से बच जाएगा और खारा-जोड़ी वाले डिब्बे में अधिक समय बिताएगा, जो वातानुकूलित स्थान घृणा (सीपीए)8,9,10,11का संकेत देगा।

चूंकि ऑप्टोजेनेटिक्स को "वास्तविक समय" में न्यूरोनल गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए लागू किया जा सकता है, इसलिए समान व्यवहार प्रतिमान का उपयोग, लेकिन अलग से, सीपीपी सेटअप प्रत्यक्ष न्यूरोनल सक्रियण पर जगह वरीयता की माप के लिए अनुमति देता है। इसलिए स्थान वरीयता के ऑप्टोजेनेटिक्स-संचालित विश्लेषण को अक्सर वास्तविक समय की जगह वरीयता (आरटी-पीपी) विश्लेषण प्रतिमान के रूप में जाना जाता है। आरटी-पीपी प्रतिमान में, क्रे-लोक्स प्रणाली के माध्यम से अलग न्यूरॉन्स की ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना शास्त्रीय सीपीपी में प्रदर्शन की गई दवा की प्रणालीगत डिलीवरी की जगह ले जाती है, ताकि आरटी-पीपी प्रतिमान के बजाय उपाय करें यदि ऑप्टोजेनेटिकली प्रेरित न्यूरोनल उत्तेजना है पुरस्कृत या प्रतिकूल के रूप में माना जाता है। वर्तमान विवरण ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों पर ध्यान केंद्रित करेगा, लेकिन समान प्रोटोकॉल का उपयोग करके ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों का परीक्षण भी किया जा सकता है।

शास्त्रीय सीपीपी प्रतिमान के रूप में एक समय में एक डिब्बे में कंडीशनिंग के बजाय, आरटी-पीपी प्रतिमान में ऑप्टोजेनेटिक्स माउस को पूरे तंत्र में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति है और व्यवहार पूरे सत्र में दर्ज किया जाता है। डिब्बों में से एक में प्रवेश इंट्राक्रैनियल प्रकाश उत्तेजना के साथ जोड़ा जाता है। उचित प्रकाश उत्तेजना मापदंडों के तहत, न्यूरॉन्स जो एक उत्तेजक ऑप्सिन को व्यक्त करते हैं, इस तरह सक्रिय हो जाएंगे। यदि प्रकाश-उत्तेजना को पुरस्कृत माना जाता है, तो ऑप्टोजेनेटिक्स माउस प्रकाश-जोड़ी वाले डिब्बे में रहेगा, जबकि यदि प्रकाश-उत्तेजना को प्रतिकूल माना जाता है, तो माउस उत्तेजना से बचने के लिए डिब्बे से बाहर निकल जाएगा। विश्लेषण के इस प्रकार आकस्मिक सीखने का आकलन करने के लिए अनुमति देता है: विषय प्रकाश उत्तेजना और इसलिए एक डिब्बे में प्रवेश करके तंत्रिका सक्रियण ट्रिगर कर सकते हैं, और एक वाद्य कार्य के दौरान लीवर दबाने के समान डिब्बे से बाहर निकलकर उत्तेजना को रोकते हैं । इसके अलावा, साहचर्य सीखने के तंत्र का मूल्यांकन बाद के सत्रों के दौरान किया जा सकता है जहां उत्तेजना के अभाव में प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए समय को मापा जाता है। इस तरह, शोधकर्ता ब्याज के न्यूरॉन्स की उत्तेजना और12से संबंधित साहचर्य स्मृति गठन पर तुरंत पुरस्कृत प्रभावों के बीच अलग कर सकते हैं ।

वर्तमान अध्ययन में, हम स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों के ऑप्टोजेनेटिक्स-संचालित जगह वरीयता व्यवहार के लिए दो कदम-दर-कदम सेटअप प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। पहला प्रोटोकॉल तीन डिब्बे वाले उपकरण के भीतर आरटी-पीपी का वर्णन करता है और हाल ही में रूट और सहयोगियों द्वारा प्रस्तुत प्रोटोकॉल के आधार पर रेखांकित किया गया है 13 और अन्य लेखकों12, 14,15,16,17,18। प्रयोग में दो चरण होते हैं जिनमें कई दैनिक सत्र (चित्रा 1Aमें दिखाए गए) शामिल हैं। प्रत्येक सत्र को विभिन्न उद्देश्यों के लिए डिज़ाइन किया गया है और एक डिब्बे के साथ युग्मन उत्तेजना के मापदंडों को तदनुसार बदल दिया जाता है। पहला सत्र,प्रीटेस्ट,विषय की प्रारंभिक वरीयता का आकलन करने के लिए या तो एक डिब्बे के लिए उपयोग किया जाता है। पैच कॉर्ड से कनेक्ट करते समय, विषय को 15 मिन के लिए उत्तेजना के अभाव में स्वतंत्र रूप से उपकरण का पता लगाने की अनुमति है। यदि किसी भी एक डिब्बे के लिए प्रारंभिक वरीयता 80% से अधिक है, माउस विश्लेषण से बाहर रखा गया है क्योंकि प्रारंभिक पक्ष पूर्वाग्रह विश्लेषण तिरछा हो सकता है। 'प्रीटेस्ट'के बाद'फेज 1'शुरू होता है। पहले भाग में लगातार दो, दैनिक, 30 मिन सत्र"आरटी-पीपी"होते हैं । "चरण1"के दौरान, ऑप्टोजेनेटिक्स माउस पैच कॉर्ड के माध्यम से लेजर स्रोत से जुड़ा हुआ है और इसे स्वतंत्र रूप से तलाशने के लिए क्षेत्र में रखा जाता है। माउस मुख्य डिब्बों में से एक में प्रवेश पर इंट्राक्रैनियल लेजर उत्तेजना प्राप्त करता है। पायलट प्रयोगों को यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि कौन सा डिब्बे लेजर-जोड़ी के रूप में सौंपा जाएगा और जो अपेयर के रूप में। यदि उत्तेजना को पुरस्कृत दिखाया गया है, तो लेजर को"प्रीटेस्ट"के दौरान सबसे कम पसंदीदा डिब्बे में जोड़ा जाएगा और यदि उत्तेजना प्रतिकूल है तो सबसे पसंदीदा होगा। इस प्रकार, प्रस्तुत आरटी-पीपी प्रोटोकॉल इस अर्थ में एक पक्षपातपूर्ण डिजाइन का पालन करता है कि लेजर उत्तेजना बेतरतीब ढंग से दो मुख्य डिब्बों (निष्पक्ष डिजाइन) में से किसी को नहीं सौंपा जाता है, लेकिन माउस की किसी भी प्रारंभिक वरीयता से बचने के लिए चुना जाता है। दो मुख्य डिब्बों को जोड़ने वाले अन्य मुख्य डिब्बे या तटस्थ डिब्बे में प्रवेश इंट्राक्रैनियल प्रकाश उत्तेजना को जन्म नहीं देता है और इस प्रकार हल्के-जोड़े नहीं होते हैं। ये सत्र विशिष्ट न्यूरोनल आबादी की उत्तेजना के पुरस्कृत या प्रतिकूल गुणों के वास्तविक समय के आकलन के लिए अनुमति देते हैं। 'फेज1'के आखिरी दिन बिना किसी उत्तेजना के 15 सीन सेशन होता है। यह सत्र वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं("सीआर")को संबोधित करने का कार्य करता है जो उत्तेजना और पर्यावरण के बीच साहचर्य सीखने से परिणाम देता है जहां यह प्राप्त हुआ था। 'चरण1'के कम से कम तीन दिन बाद'रिवर्सल फेज'होता है जो चरण1के समान संरचना का अनुसरण करता है लेकिन पहले गैर-जोड़ी वाले मुख्य डिब्बे को अब हल्की उत्तेजना के साथ जोड़ा जाता है। 'फेज1'के मामले में भीदोउत्तेजना सत्र ों के बाद सीआर सेशन होता है। "रिवर्सल चरण"का उपयोग इस बात की पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि माउस का व्यवहार ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना पर आकस्मिक है और यादृच्छिक मापदंडों से संबंधित नहीं है। आरटी-पीपी प्रयोग के प्रत्येक सत्र को ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के भीतर अलग से प्रोग्राम करना होगा। वर्तमान प्रोटोकॉल एक विशिष्ट सॉफ़्टवेयर के भीतर ऐसी सेटिंग्स का वर्णन करता है, लेकिन प्रकाश स्रोत पर ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर-लॉजिक (टीटीएल) मॉड्यूलेशन सिग्नल भेजने में सक्षम कोई अन्य ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर उपयोग किया जा सकता है।

दूसरा प्रोटोकॉल न्यूट्रल कंपार्टमेंट प्रिफरेंस (एनसीपी) प्रतिमान करार देने वाले उपन्यास सेटअप का वर्णन करता है। आरटी-पीपी का यह संशोधित प्रोटोकॉल कनेक्टिंग कॉरिडोर के छोटे आकार और पारदर्शिता का लाभ उठाता है जो स्वाभाविक रूप से अपनी संकीर्ण और पारदर्शी संरचना के कारण माउस द्वारा बचा जाता है। दोनों मुख्य डिब्बों को हल्की उत्तेजना के साथ बांधना और केवल हल्के-उत्तेजना से मुक्त गलियारा छोड़कर, एनसीपी सेटअप का उपयोग यह परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है कि क्या ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना माउस को प्राप्त करने से बचने के लिए गलियारे में अधिक समय बिताने के लिए मजबूर करेगी ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना। गलियारे में बिताए गए समय के साथ दो प्रकाश-जोड़ी वाले डिब्बों में बिताए गए समय की तुलना करके, ऑप्टोजेनेटिकली-प्रेरित घृणा का सत्यापन किया जा सकता है। एनसीपी प्रयोग लगातार दो दैनिक सत्रों के होते हैं, जहां ऑप्टोजेनेटिक्स चूहों उत्तेजना (30 min प्रत्येक) प्राप्त करने के लिए वास्तविक समय में वरीयता को मापने, और एक लेजर मुक्त सत्र (15 min) आरटी-पीपी में लोगों के लिए इसी तरह वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल.

नीचे दिए गए आरटी-पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल को हाल ही में हमारी प्रयोगशाला में इस अध्ययन में मान्य किया गया था कि वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र (वीटीए) में स्थित विभिन्न प्रकार के न्यूरॉन्स इनाम से संबंधित व्यवहार12के विभिन्न पहलुओं में कैसे शामिल हैं । यहां आरटी-पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल के क्रियान्वयन की मिसाल बनाने के लिए डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (DAT-Cre19 और वेसिकुलर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 2 (VGLUT2)- Cre20 ट्रांसजेनिक चूहों को वीटीए में फ्लोक्स्ड चैनलोडोप्सिन 2 (ChR2) डीएनए निर्माण करने वाले एएवी के साथ स्टीरियोप्लााइज किया गया था, जिस पर वीटीए के ऊपर एक ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपित किया गया था । प्रदान किए गए आरटी-पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन चूहों के विश्लेषण पर प्राप्त व्यवहार प्रतिक्रियाओं से पता चलता है कि वीटीए के भीतर डोपमिनेर्गिक और ग्लूटामिग्शियल न्यूरॉन्स की सक्रियता विभिन्न व्यवहार प्रतिक्रियाओं(चित्रा 1)की ओर जाती है।

आरटी-पीपी और एनसीपी प्रतिमान के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक चूहों, स्टीरियोटैक्सिक वायरल इंजेक्शन और फाइबरऑप्टिक्स प्लेसमेंट के जीनोटीपिंग से लेकर लेजर-कंट्रोल और व्यवहार के लिए ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की प्रोग्रामिंग तक की जानकारी प्रदान की जाती है । मूल्यांकन. इसके अलावा, उत्तेजना मापदंडों और प्रयोगात्मक पहलुओं के संदर्भ में प्रोटोकॉल के संशोधनों के लिए सुझावों पर चर्चा की जाती है जो वैज्ञानिक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं । जबकि प्रोटोकॉल वीटीए के संदर्भ में वर्णित हैं, उन्हें किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र या न्यूरोनल आबादी पर लागू किया जा सकता है, बशर्ते प्रासंगिक क्रे-ड्राइवर और फ्लोक्सेड ऑप्सिन जैसे प्रासंगिक ऑप्टोजेनेटिक्स टूल उपलब्ध हों।

Protocol

यह अध्ययन दोनों लिंगों के विषमगोअस डैट-क्रे19 और VGLUT2-Cre20 चूहों, आयु वर्ग >8 सप्ताह और वजन >20 ग्राम का उपयोग करके किया गया है । सभी प्रयोगों स्वीडिश (पशु कल्याण अधिनियम एसएफएस 1998:56) और यूरोपीय संघ के कानून (कन्वेंशन ईटीएस १२३ और निर्देश 2010/63/ईयू) के अनुसार स्थानीय पशु नैतिक समितियों से अनुमति के साथ आयोजित किए गए थे ।

1. चूहों का गेनोटीपिंग

  1. ट्रांसजेनिक चूहों के जीनोनोटिंग के लिए उपयोग करने के लिए कान छिद्रक का उपयोग करके कान बायोप्सी लें।
  2. कान घूंसे तैयार करने के लिए एक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) उद्देश्य से बनाया प्राइमर का उपयोग कर प्रतिक्रिया प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, क्रे निर्देशित प्राइमर का उपयोग किया गया था।
    1. प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब में एक कान पंच युक्त लिसिस बफर (बफर 1: 250 एमएम नाओएच, 2 एमएम ईटीए) के 75 माइक्रोन जोड़ें।
    2. 30 मिन के लिए 96 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक में इनक्यूबेट।
    3. नमूनों को 5 मिन के लिए ठंडा होने दें और फिर बेअसर बफर (बफर 2: 400 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0) के 75 माइक्रोन जोड़ें।
  3. उपयुक्त प्राइमर (यहां: क्रे एफडब्ल्यू 5'-ACGAGTGATGTGTGCAAGA-3', क्रे रेव 5'-ACCGACGATGACATGTTTAG-3') का उपयोग करके मानक प्रक्रियाओं12,21 के अनुसार पीसीआर प्रदर्शन करें।
    सावधानी: एक पीसीआर हुड के तहत बर्फ पर काम करते हैं और अभिकर्मकों और नमूनों को दूषित करने के लिए ध्यान देना नहीं है।
    1. पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें। उचित नियंत्रण नमूनों सहित कितने नमूनों का विश्लेषण किया जा रहा है, के अनुसार निम्नलिखित मात्रा गुणा करें। निम्नलिखित क्रम में एक एकल 25 माइक्रोन अंतिम मात्रा प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्ताओं को मिलाएं: आसुत पानी (18.9 माइक्रोन), एमजीसीएल2 (2.5 माइक्रोन), 10 एमएम डीएनटीपी मिश्रण (0) के साथ 10x बफर.5 माइक्रोन), 10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर (1 माइक्रोन), 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर (1 माइक्रोन), 5 यू/माइक्रोन डीएनए पॉलीमरेज (0.1 माइक्रोन), और टेम्पलेट डीएनए (1 माइक्रोन; अगले चरणों में जोड़ा जाएगा) ।
      नोट: हमेशा वैध परिणाम सुनिश्चित करने के लिए एक नकारात्मक, एक सकारात्मक और एक खाली (टेम्पलेट डीएनए के बिना) नियंत्रण जोड़ें।
    2. पीसीआर ट्यूबमें मास्टर मिक्स के 24 माइक्रोन जोड़ें।
    3. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में टेम्पलेट डीएनए (प्रत्येक माउस से कान पंच से आ रहा है) के 1 μL जोड़ें।
    4. पीसीआर ट्यूबों को संक्षेप में यह सुनिश्चित करने के लिए सेंट्रलाइज करें कि टेम्पलेट डीएनए मास्टर मिक्स के अंदर है।
    5. टेबल 1में साइकिलिंयूज प्रोग्राम का उपयोग करके थर्मल साइकिलर के साथ पीसीआर करें।
  4. इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके नमूनों को चलाने के लिए एक अगारोज जेल तैयार करें।
    नोट: आकार नमूनों की संख्या पर निर्भर करेगा जिसका विश्लेषण करने की आवश्यकता है।
    1. कांच की बोतल में 1x ट्रिस-एसीटेट-ईटीए (टीएई) बफर में 1% w/v अगारोज पाउडर जोड़ें। माइक्रोवेव में गर्मी जब तक अगारोज पूरी तरह से भंग हो जाता है, नियमित रूप से जांच है कि यह खत्म नहीं करता है ।
      सावधानी- जलने से बचने के लिए सावधानी बरतें।
    2. जेल को लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें और एक न्यूक्लिक एसिड जेल दाग (0.5 माइक्रोन/50 मीटर जेल) जोड़ें।
    3. अच्छी तरह से कंघी युक्त कास्टिंग ट्रे में जेल डालो और यह कमरे के तापमान में छोड़ जब तक यह पूरी तरह से जम जाता है । कंघी को धीरे से हटा दें।
    4. इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक को 1x टीएई बफर से भरें और जेल को टैंक में रखें।
    5. डीएनए नमूनों में से प्रत्येक में 1x डीएनए लोडिंग रंग के 2 μL जोड़ें।
    6. जेल के पहले कुएं में डीएनए सीढ़ी का लोड 4 माइक्रोन, फिर शेष कुओं में नमूनों की पूरी मात्रा लोड करने के लिए आगे बढ़ें।
    7. इलेक्ट्रोफोरेसिस का पावर सोर्स 140 वी पर सेट करें और 25−30 मिन के लिए चलाएं।
    8. जेल को यूवी स्रोत के नीचे रखें और परिणामों की तस्वीर लें।

2. स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी

  1. genotyping के बाद, अलग चूहों क्रे के लिए सकारात्मक लोगों को रखते हुए । तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि वे कम से कम 8 सप्ताह पुराने न हों और सर्जरी करने के लिए > 20 ग्राम वजन करें।
    1. पर्यावरण को साफ करें और एसेप्टिक परिस्थितियों में सर्जरी करने के लिए सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें।
    2. सर्जरी से पहले एनाल्जेसिक 30 मिन के साथ चूहों को नीचे इंजेक्ट करें।
    3. आइसोफ्लोरीन के साथ चूहों को एनेस्थेटइज़ करें (शामिल होने के लिए सामान्य हवा में 2−3%और एनेस्थीसिया के रखरखाव के लिए 1.5−2.0%)। सुनिश्चित करें कि माउस के अंगूठे को धीरे से चुटकी देकर दर्द सजगता की अनुपस्थिति का परीक्षण करके पर्याप्त संज्ञाहरण स्तर हासिल किया जाता है। आइसोफ्लोरीन डिलीवरी को तदनुसार समायोजित कर लें।
    4. माउस को स्टीरियोकरिक उपकरण पर रखें। सूखापन के कारण आंखों के घाव को रोकने के लिए आंख ों का स्नेहक जोड़ें और खोपड़ी के ऊपर के बालों को शेव करें। माउस के तापमान को स्थिर बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड का उपयोग करें।
    5. खोपड़ी की त्वचा के नीचे स्थानीय संवेदनाकारियों के 100 माइक्रोन इंजेक्ट करें और 5 मिन को प्रभावी होने दें।
    6. आयोडीन के साथ बारी-बारी से शराब या बाँझ खारा के तीन परिपत्र अनुप्रयोगों द्वारा चीरा साइट तैयार करें। एक बाँझ कपास टिप का प्रयोग करें और चीरा लाइन, जावक से आवेदन शुरू करते हैं।
    7. धीरे-धीरे त्वचा को संदंश के साथ उठाएं, और खोपड़ी की सतह को प्रकट करने के लिए सर्जिकल कैंची के साथ रोस्ट्रोकौडल धुरी के साथ ~ 1.5 सेमी का चीरा बनाएं।
    8. कॉटन स्टिक का इस्तेमाल करते हुए पेरिओस्टेम को हटाने के लिए एच2ओ2 सॉल्यूशन लगाएं।
    9. बाँझ खारा के साथ खोपड़ी कुल्ला और बाँझ कपास टिप applicators का उपयोग कर इसे सुखाने।
    10. ब्रेग्मा और लैम्ब्डा का पता लगाएं।
    11. इंजेक्शन सुई की नोक को पोजिशनिंग करके फ्लैट खोपड़ी संरेखण का पता लगाएं, जो स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर समायोजित होकर, ब्रेग्मा और लैम्ब्डा पर। प्रत्येक स्थिति के लिए वेंट्रल निर्देशांक को मापें और तुलना करें। जब खोपड़ी फ्लैट है तो ब्रेग्मा और लैम्ब्डा दोनों के लिए वेंट्रल समन्वय समान है। यदि नहीं, तो सिर की स्थिति को समायोजित करें और माप को फिर से लें।
    12. खोजें और स्थिति को चिह्नित करें (एपी: -3.45 मिमी, एमएल: -फ्रैंकलिन और पैक्सिनोस22के अनुसार ब्रेग्मा से 0.2 मिमी) जहां क्रे-निर्भर वायरस का इंजेक्शन और ऑप्टिक फाइबर का प्रत्यारोपण होगा और माइक्रो ड्रिल का उपयोग करके एक छोटा छेद बनाएगा।
    13. एक सटीक पंप का उपयोग कर स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर चढ़कर 10 μL सिरिंज में वायरस के 400 nL लोड करें।
    14. वीटीए (एपी: -3.45 मिमी) में सुई (34 ग्राम, बेवल्ड) को सावधानी से कम करें और क्रे-निर्भर ऑप्टोजेनेटिक वायरस(AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134) के 300 nL इंजेक्ट करें। एमएल: -0.2 मिमी ब्रेग्मा से और खोपड़ी की सतह से -4.4 मिमी, फ्रैंकलिन और पैक्सिनोस22के अनुसार) सटीक पंप का उपयोग करके 100 nL/मिन इंजेक्शन दर पर।
    15. इंजेक्शन के बाद, वायरस के प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए एक अतिरिक्त 10 टिन के लिए सुई को छोड़ दें(चित्रा 2ए)।
    16. इंजेक्शन साइट से धीरे-धीरे सुई को वापस लें।
    17. एंकर शिकंजा को फिट करने के लिए माइक्रोड्रिल का उपयोग करके छोटे छेद बनाएं जो ऑप्टिक फाइबर और दंत सीमेंट परिसर को स्थिर करेगा।
    18. ब्रेग्मा फिर से निर्देशांक लें और ऑप्टिक फाइबर (200 माइक्रोन व्यास, 0.37 एनए) को प्रत्यारोपित करें: एपी: -3.45 मिमी, एमएल: -ब्रेग्मा से -0.2 मिमी और फ्रैंकलिन और पैक्सिनोस22के अनुसार खोपड़ी की सतह से -4.0 मिमी(चित्रा 2बी)।
    19. दंत सीमेंट का उपयोग कर खोपड़ी पर फाइबर सुरक्षित। खोपड़ी को सुरक्षित करने के लिए ऑप्टिक फाइबर फेरूल के चारों ओर पर्याप्त सीमेंट लागू करें लेकिन पैच कॉर्ड(चित्रा 2सी)के कनेक्शन की अनुमति देने के लिए सीमेंट से मुक्त फेरूल के शीर्ष के 3−4 मिमी छोड़ने पर ध्यान दें।
      नोट: सीमेंट के साथ छेद को भरने के लिए ध्यान दें क्योंकि यह मस्तिष्क ऊतक क्षति का कारण बन सकता है। ऐसा होने से रोकने के लिए छेद में हीमोस्टैटिक सामग्री जोड़ी जा सकती है।
    20. किसी भी खुले घाव को बंद करने के लिए ऊतक गोंद या अवशोषक टांके का उपयोग करें और जानवर को कम से कम दो सप्ताह तक ठीक होने के लिए छोड़ दें। सर्जरी के बाद एनाल्जेसिक 12−24 घंटे की अतिरिक्त खुराक दें।

3. लेजर स्रोत के नियंत्रण की स्थापना

  1. लेजर स्रोत को नियंत्रित करने के लिए एकल बोर्ड माइक्रोकंट्रोलर का उपयोग करें। उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक स्क्रिप्ट लिखें। कंप्यूटर के लिए उपयुक्त कनेक्शन केबल का उपयोग कर माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड पर स्क्रिप्ट लोड।
    नोट: स्क्रिप्ट में टीटीएल बॉक्स के माध्यम से ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर से आने वाले बाहरी मॉड्यूलेशन (इनपुट) और उत्तेजना मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए लेजर के लिए आउटपुट शामिल होना चाहिए। 20 हर्ट्ज आवृत्ति पर 10 एमएस पल्स चौड़ाई के लिए, पूरक कोडिंग फ़ाइलमें पाए जाने वाले स्क्रिप्ट का उपयोग करें।
  2. ट्रैकिंग हार्डवेयर के लेजर और टीटीएल बॉक्स से बोर्ड कनेक्ट करें।
    1. टीटीएल बॉक्स को बोर्ड से जोड़ने के लिए नेटवर्क केबल का उपयोग करें (प्रदान की गई स्क्रिप्ट के लिए पिन 5)(चित्रा 3ए, सी)।
    2. सुनिश्चित करें कि लेजर बाहरी मॉड्यूलेशन द्वारा नियंत्रित करने के लिए और एक एफसी/पीसी केबल (दिए गए स्क्रिप्ट के लिए पिन 13)(चित्रा 3बी, सी)का उपयोग कर बोर्ड के लिए लेजर कनेक्ट करने के लिए सेट है ।
    3. बोर्ड के जमीनी हिस्सों में उपयुक्त पिन कनेक्ट करें।
  3. ऑप्टिक फाइबर के लिए लेजर स्रोत कनेक्ट करें।
    1. लेजर स्रोत को रोटरी संयुक्त(चित्रा 3डी)से कनेक्ट करें।
    2. रोटरी संयुक्त करने के लिए एक पैच कॉर्ड(चित्रा 3ई)कनेक्ट करें।
    3. उपकरण के ऊपर रोटरी संयुक्त को स्थिर करें लेकिन रिकॉर्डिंग क्षेत्र के बाहर। सुनिश्चित करें कि फाइबर ऑप्टिक पैच कॉर्ड की लंबाई माउस को क्षेत्र में कठिनाइयों के बिना स्थानांतरित करने की अनुमति देने के लिए उपयुक्त है(चित्रा 3एफ)।

4. ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के भीतर आरटी-पीपी दृष्टिकोण के लिए प्रयोग की स्थापना

  1. अखाड़ा सेटअप को कैलिब्रेट करें। भौतिक तंत्र के एक विशिष्ट भाग को मापने के लिए एक शासक का उपयोग करें, टैब को कैलिब्रेट करने और पहले से ज्ञात मूल्य (चरण4 में चरण 1) दर्ज करने के लिए ड्रा स्केल के तहत सॉफ्टवेयर के भीतर छवि पर मापी गई भाग के अनुरूप एक रेखा बनाएं।
  2. अखाड़ा डिजाइन करें। उस क्षेत्र को ड्रा करें जहां चूहों की आवाजाही रिकॉर्ड की जाएगी (चरण 2 में चित्रा 4)।
  3. जोन बनाएं। उन क्षेत्रों को ड्रा करें जिन्हें अंततः लेजर-पेयर, लेजर-अनपेयर और "तटस्थ" (चित्रा 4में चरण 3) के रूप में सौंपा जाएगा।
  4. सेटअप को इस बात की पुष्टि करने के लिए मान्य करें कि कोई परस्पर विरोधी पैरामीटर नहीं हैं, उदाहरण के लिए एरिना के बाहर के क्षेत्र (चरण 4 में चित्रा 4)
  5. टैब परीक्षण नियंत्रण सेटिंग्स (चरण 5 में चित्रा 4)के तहत प्रयोगात्मक मापदंडनिर्धारित करें।
    1. 30 मिन आरटी-पीपी सत्र के लिए चित्रा 5 में चरण 1 में दिखाया गया परीक्षण समय निर्धारित करें।
    2. सुनिश्चित करें कि "हार्डवेयर नियंत्रण" सक्षम है, लेजर-जोड़ी के रूप में एक डिब्बे आवंटित करें जिसमें माउस का प्रवेश माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड को ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से टीटीएल सिग्नल को ट्रिगर करेगा। चित्रा 5 (चरण 2) में लेजर-जोड़ी डिब्बे डिब्बे ए है। उलटचरण के लिए, डिब्बों को स्विच करें तो डिब्बे बी लेजर बनती होगी और डिब्बे ए को अनपेयर किया जाएगा। ऐसा सॉफ्टवेयर में ए के साथ बी और बी के साथ ए की जगह करके करें।

5. एनसीपी दृष्टिकोण का उपयोग कर उत्तेजना के प्रतिकूल गुणों का परीक्षण करने के लिए सेटअप का संशोधन

  1. चरणों का पालन करें 4.1−4.4 जैसा कि पहले वर्णित है।
  2. "संदर्भ" बॉक्स सेटिंग्स (चरण 1 इन एक्सफिड 6)में "दोहराएं तक" विकल्प के माध्यम से प्रयोग का समय 30 m तक सेट करें।
  3. ए और बी डिब्बों के लिए सेटिंग्स से संबंधित स्थिति बॉक्स के लिए "जब केंद्र बिंदु जोन ए और जोन बी में से किसी में है" जोड़कर लेजर बनती (चित्रा 6में चरण 2) के रूप में ए और बी दोनों क्षेत्रों को असाइन करें । ध्यान दें कि जब जानवर तटस्थ डिब्बे में स्थित होगा तो लेजर बंद हो जाएगा।

6. लेजर उत्तेजना का उपयोग कर के एक प्रयोग प्रदर्शन

  1. डिटेक्शन सेटिंग्स सेट करें।
    1. उचित पता लगाने सेटिंग्स सुनिश्चित करने के लिए माउस के समान करने के लिए एक डमी का उपयोग करें।
    2. डमी को उपकरण के एक डिब्बे में रखें और गतिशील घटाव के साथ स्वचालित सेटअप का उपयोग करें।
    3. डमी निकालकर विपरीत डिब्बे में रखें। सुनिश्चित करें कि डमी पूरी तरह से पता लगाया है और यदि नहीं, तो उचित पता लगाने को प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर के माध्यम से सेटिंग्स को समायोजित करें।
      1. इस चरण के दौरान यह भी जांचें कि उत्तेजना के रूप में यह माना जाता है काम करता है। पहले कॉन्फ़िगर किए गए परीक्षण नियंत्रण सेटिंग्स का उपयोग करके अधिग्रहण शुरू करें और डमी को लेजर युग्मित डिब्बे में रखें और देखें कि क्या उत्तेजना शुरू हो गई है। इसके बाद डमी को अनपेयर और/या न्यूट्रल डिब्बे में रखें और देखें कि उत्तेजना बंद हो गई है या नहीं ।
  2. लेजर(चित्रा 3बी)पर घुंडी का उपयोग कर के लेजर पावर को 10 मीटर तक सेट करने के लिए एक सेंसर के साथ एक बिजली मीटर का उपयोग करें। हर बार लेजर उत्तेजना का उपयोग किया जाता है इस कदम को करें।
    सावधानी: लेजर प्रकाश के लिए प्रत्यक्ष जोखिम के रूप में सुरक्षात्मक नेत्र उपकरणों का उपयोग स्थायी आंख क्षति का कारण बन सकता है।
  3. माउस को उपकरण में रखें।
    1. माउस को धीरे-धीरे अपने पिंजरे से बाहर निकालें और सिरेमिक आस्तीन का उपयोग करके फाइबर-ऑप्टिक पैच कॉर्ड से फाइबर-ऑप्टिक इंप्लांट कनेक्ट करें।
    2. माउस को धीरे-धीरे तीन डिब्बे वाले उपकरण के तटस्थ डिब्बे में रखें।
    3. सॉफ्टवेयर द्वारा माउस का पता नहीं चला जब तक रुको।
    4. जानवर को मुख्य डिब्बों में प्रवेश करने से प्रतिबंधित करने वाले ऊर्ध्वाधर स्लाइडिंग दरवाजे निकालें।
    5. जानवर को बिना किसी गड़बड़ी के स्वतंत्र रूप से तलाशने की अनुमति दें।
      नोट: एक ही प्रक्रिया का पालन किया जाता है जब जानवर अपवाद है कि कदम ६.२ की जरूरत नहीं है और है कि लेजर पूरे समय से दूर है के साथ उत्तेजना प्राप्त नहीं है ।

Representative Results

तीन डिब्बे तंत्र(चित्रा 3एफ)दवाओं के पुरस्कृत प्रभावों को संबोधित करने और वास्तविक समय में ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग कर न्यूरॉन्स के प्रत्यक्ष उत्तेजना के पुरस्कृत या प्रतिकूल गुणों का आकलन करने के लिए उपयुक्त है। इसमें दो मुख्य डिब्बे (20 सेमी [डब्ल्यू] x 18 सेमी [एल] x 25 सेमी [एच]) और एक छोटे कनेक्टिंग कंपार्टमेंट (20 सेमी [डब्ल्यू] x 7 सेमी [एल] x 25 सेमी [एच]) होते हैं। मुख्य डिब्बों में अलग दीवार और फर्श बनावट और पैटर्न है ताकि साहचर्य सीखने की सुविधा के लिए, जबकि जोड़ने/तटस्थ डिब्बे संकीर्ण और पारदर्शी है तो चूहों में स्वाभाविक रूप से कम समय बिताते हैं । जैसा कि ऊपर वर्णित है, ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग चूहों के कई व्यवहार मापदंडों को रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है जिसमें प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए आंदोलन और समय शामिल हैं, और लेजर उत्तेजना को नियंत्रित करने के लिए। पूरे आरटी-पीपी प्रयोग 8 सत्रों में जगह लेता है(चित्रा 1ए)और प्रत्यक्ष उत्तेजना (दिन 3, 4, 6, और 7) के पुरस्कृत या प्रतिकूल गुणों के दोनों मूल्यांकन और संघों के गठन, सकारात्मक या नकारात्मक, पिछले अनुभव (दिन 5 और 8,"सीआर"के जवाब में अनुमति देता है ।

सबसे पहले, हमने डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स को लक्षित करने के लिए वीटीए में एवी-ChR2-eYFP वायरस के साथ इंजेक्शन DAT-Cre चूहों का परीक्षण किया। साहित्य के अनुसार, हमने देखा कि चूहों ने उत्तेजना के साथ जोड़े गए डिब्बे में समय बिताना पसंद किया(चित्र 1बी,चरण 1, दिन 3 और 4, नीले घेरे, दो तरह के दोहराया उपाय [आरएम] विचरण के विश्लेषण [ANOVA], डिब्बे एफ(२,१८) = १४१, पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.००१; सत्र एक्स कंपार्टमेंट एफ(१२,१०८) = ४२.१, पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.००१ का प्रभाव; तुकी का पोस्ट हॉक टेस्ट बनाम अनपेयर्ड पी एंड एलटी; ०.००१) जोड़ा गया । उलटचरण, जहां डिब्बों की बांधना लेजर उत्तेजना को बंद कर दिया गया था, इन टिप्पणियों की पुष्टि की(चित्रा 1बी,दिन 6 और 7, नीले घेरे, Tukey के बाद तदर्थ परीक्षण बनाम अपेयर डिब्बे पी एंड एलटी; ०.००१) इस प्रकार संभावना है कि 1 चरण से प्राप्त परिणाम पक्ष पूर्वाग्रहों या यादृच्छिक मापदंडों से संबंधित थे छोड़कर । आरटी-पीपी के चार दिनों के दौरान प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए समय के औसत ने पुष्टि की कि चूहों ने लेजर युग्मित डिब्बे में अपने समय का औसतन लगभग 70% खर्च किया क्योंकि अपेयद (~ 20%) और तटस्थ (~ 10%) डिब्बों(चित्रा 1बी बार ग्राफ, एक तरह से आरएम ANOVA, उत्तेजना एफ(2,6) = 139, पी एंड एलटी; 0.001 का प्रभाव, तुकी की पोस्ट कैसे बनती बनाम अनपेयर और तटस्थ डिब्बों पी एंड एलटी; 0.001)। इसके अलावा, उत्तेजना के अभाव में, 5 और 8 दिनों में, चूहों ने पहले लेजर उत्तेजना (तुकी के पोस्ट हॉक पी एंड एलटी; 0.001) के साथ जोड़े गए डिब्बे में काफी अधिक समय बिताया, यह दर्शाता है कि पिछला अनुभव उत्तेजना के "मांग" के रूप में परिलक्षित साहचर्य सीखने के व्यवहार को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था। ये डेटा साहित्य के अनुसार हैं और यह प्रदर्शित करते हैं कि वर्तमान विधि का उपयोग वीटीए में विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के पुरस्कृत प्रभावों की जांच करने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है।

इसके बाद हमने वीटीए के ग्लूटाएजर न्यूरॉन्स को निशाना बनाने के लिए वीटीए में एएवी-ChR2-eYFP के साथ इंजेक्शन वाले VGLUT2-Cre चूहों का परीक्षण किया। इस प्रयोग में, हमने डैट-क्रे चूहों द्वारा प्रदर्शित एक से एक विपरीत व्यवहार फेनोटाइप देखा। इस प्रकार, चूहों उत्तेजना के लिए बनती डिब्बे से बचा और सभी आरटी पीपी दिनों के दौरान unpaired में अधिक समय बिताया(चित्रा 1सी छोड़ दिया, दो तरह से आरएम ANOVA, डिब्बे एफ(२,१२) = ४०.९, पी एंड एलटी; ०.००१; सत्र एक्स कंपार्टमेंट एफ(१२,७२) का प्रभाव = १६.१, पी & एलटी; ०.००१; तुकी का पोस्ट हॉक टेस्ट बनाम अनपेयर्ड पी एंड एलटी; 0.001 जोड़ा गया; चित्रा 1सी सही, एक तरह से आरएम ANOVA प्रभाव उत्तेजना एफ(2,6) = 162, पी एंड एलटी; 0.001, तुकी के बाद तदर्थ बनती बनाम अनपेयर और न्यूट्रल डिब्बों पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.001)। दिलचस्प बात यह है कि'सीआर'डेज 5 और 8 के दौरान चूहों ने पहले से जोड़े गए डिब्बे (जोड़ी और अनपेयर डिब्बों के बीच कोई मतभेद नहीं) का स्पष्ट परिहार नहीं दिखाया था। यह संभव है कि वातानुकूलित प्रतिक्रिया की कमी लेजर युग्मित डिब्बे में बिताए गए अपर्याप्त समय के कारण है, जिसने लेजर सक्रियण और विशेष वातावरण के बीच संघों के गठन को रोका जहां यह हुआ था। इस परिहार फेनोटाइप का और पता लगाने के लिए, हमने एक संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग किया जिसे हमने "तटस्थ डिब्बे वरीयता" नाम दिया, संक्षिप्त एनसीपी। इस प्रयोग में, दोनों मुख्य डिब्बों को उत्तेजना के लिए जोड़ा गया था और तटस्थ डिब्बे उत्तेजना मुक्त बने रहे(चित्रा 7ए)। हमने परिकल्पना की है कि, यदि उत्तेजना में प्रतिकूल गुण हैं, तो माउस को इससे बचने के लिए छोटे, तटस्थ डिब्बे में समय बिताने के लिए मजबूर किया जाएगा। दरअसल, उत्तेजना के दोनों दिनों में (Stim1 और Stim2) चूहों तटस्थ डिब्बे में समय के बहुमत बिताया (के बारे में ८०%) बनती डिब्बों की तुलना में(चित्रा 7बी, सी;बाएं: दो तरह से आरएम ANOVA प्रभाव डिब्बे एफ(2,8) = 70.9, पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.001; सत्र एक्स कंपार्टमेंट एफ(4,16) = 6.9, पी = 0.002, तुकी का पोस्ट हॉक "उत्तेजना 1" तटस्थ डिब्बे बनाम कंपार्टमेंट 1 और 2 पी एंड एलटी; 0.01, "उत्तेजना 2" तटस्थ डिब्बे बनाम डिब्बे 1 और 2 पी एंड एलटी; 0.001; दाएं: वन-वे आरएम एनोवा, उत्तेजना एफ(2,2) का प्रभाव = 54.2, 0.018, तुकी के पोस्ट हॉक टेस्ट ने 1 और 2 बनाम न्यूट्रल पी एंड एलटी; 0.05 को जोड़ा। जैसा कि आरटी-पीपी परीक्षण के दौरान'सीआर'दिनों के मामले में, चूहों ने डिब्बों और उत्तेजना के बीच नकारात्मक संघ ों का गठन नहीं किया; यानी उत्तेजना (सीआर) के अभाव में उन्होंने सभी डिब्बों को एक ही डिग्री(चित्रा 7बी,युग्मित डिब्बों और तटस्थ डिब्बे में बिताए गए समय के बीच कोई अंतर नहीं) का पता लगाया। इन प्रयोगों के परिणामों ने आरटी-पीपी सेटअप के दौरान देखे गए व्यवहार फेनोटाइप की पुष्टि की और इस तरह आरटी-पीपी और एनसीपी दोनों प्रतिमानों के संयोजन कार्यान्वयन का समर्थन किया।

Figure 1
चित्रा 1: आरटी-पीपी प्रतिमान में ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करव्यवहार परीक्षण। (क)प्रयोगों की समयरेखा का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी, सी) शीर्ष बाएं: डैट-क्रे (एन = 10) और VGLUT2-Cre (N = 7) चूहों के लिए आरटी-पीपी प्रयोग में प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए समय के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करने वाला ग्राफ एएवी-ChR2-eYFPके साथ इंजेक्शन चूहों । नीले घेरे: लेजर-जोड़ी डिब्बे; सफेद, काले घेरे: मुख्य डिब्बों; ग्रे सर्कल: तटस्थ डिब्बे। शीर्ष अधिकार: 3, 4, 6, और 7 (आरटी-पीपी) दिनों के दौरान प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए समय का औसत प्रतिशत। नीचे: एक DAT-Cre और एक VGLUT2-Cre माउस के लिए प्रत्येक डिब्बे में बिताए समय के प्रतिनिधि हीटमैप्स । सभी डेटा सामान्य रूप से वितरित किए गए (शापिरो-विल्क परीक्षण)। परिणाम मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं । ***पी एंड एलटी; ०.००१ बनती बनाम अनपेयर; #पी एंड एलटी; ०.०५, ##पी एंड लेफ्टिनेंट; ०.०१, ###पी एंड एलटी; ०.००१ बनती बनाम न्यूट्रल कंपार्टमेंट; §§पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.01, §§§पी एंड एलटी; 0.001 अनपेयर बनाम न्यूट्रल कंपार्टमेंट। इस आंकड़े को बिम्पिडिस एट अल12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए सर्जिकल प्रक्रिया। }वीटीए में क्रे-डिपेंडेंट वायरल वेक्टर का इंजेक्शन । (ख)इंजेक्शन साइट के ऊपर ऑप्टिक फाइबर का प्रत्यारोपण। स्थिरीकरण के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले लंगर शिकंजा पर ध्यान दें। (ग)दंत सीमेंट का उपयोग कर खोपड़ी पर फाइबर का स्थायी लंगर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ऑप्टोजेनेटिक्स प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले उपकरण। }पढ़ाई में इस्तेमाल होने वाला टीटीएल बॉक्स। यह ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर से इनपुट प्राप्त करता है और माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड को टीटीएल सिग्नल भेजता है। (ख)प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले लेजर स्रोत के फ्रंट (टॉप) और रियर व्यू (नीचे) । (ग)माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड लेजर उत्तेजना को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया। टीटीएल बॉक्स से और लेजर स्रोत के लिए कनेक्शन नोट करें। }रोटरी ज्वाइंट। (ई)प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले फाइबर-ऑप्टिक पैच तार। }आरटी-पीपीऔर एनसीपी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला तीन डिब्बों वाला उपकरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के भीतर डिजाइनिंग एरिना और ज़ोन। चरण 1: सेटअप का अंशांकन। चरण 2: पूरे क्षेत्र की ड्राइंग। चरण 3: क्षेत्र के भीतर ड्राइंग जोन। चरण 4: सेटअप सत्यापन। चरण 5: समय और उत्तेजना मापदंडों की स्थापना के लिए परीक्षण नियंत्रण सेटिंग टैब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के भीतर आरटी-पीपी प्रयोग के समय और उत्तेजना मापदंडों की स्थापना। अवधि (चरण 1) और प्रकाश उत्तेजना (चरण 2) के लिए शर्तों के लिए विशिष्ट नियमों को जोड़ना। रिवर्सल चरण के लिए आवश्यकताओं को फिट करने के लिए स्थितियों को आसानी से बदला जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के भीतर एनसीपी प्रयोगों के समय और उत्तेजना मापदंडों की स्थापना। उत्तेजना सत्र (चरण 1) की अवधि आरटी-पीपी के लिए लोगों के समान है लेकिन प्रकाश उत्तेजना सक्रियण (चरण 2) के लिए स्थितियां अलग-अलग हैं। या तो मुख्य डिब्बे में प्रवेश (यहां जोन ए और जोन बी नाम) ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना में परिणाम है कि केवल जब माउस तटस्थ डिब्बे में प्रवेश करती है समाप्त हो जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: राकांपा प्रतिमान में ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करव्यवहार परीक्षण। (क)प्रायोगिक सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ख)बाएं: उत्तेजना के दो दिनों के दौरान प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए समय के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करने वाला ग्राफ (स्टिम 1 और स्टिम 2) और VGLUT2-क्रे चूहों के लिए वातानुकूलित प्रतिक्रिया (सीआर) सत्र के दौरान वीटीए (एन = 5) में एएवी-ChR2 के साथ इंजेक्शन दिया गया । सही: एनसीपी की उत्तेजना के दो दिनों के दौरान प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए समय का औसत प्रतिशत । (ग)उत्तेजना के दिनों में से एक के दौरान एक VGLUT2-Cre माउस के लिए प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए समय का प्रतिनिधि हीटमैप । डेटा आम तौर पर वितरित किया गया (Shapiro-Wilk परीक्षण) । परिणाम ों को मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *पी एंड एलटी; 0.05, **पी एंड एलटी; 0.01, ***पी एंड एलटी; 0.001 अनपेयर बनाम जोड़ी 1 और 2 डिब्बों को जोड़ा जाता है। इस आंकड़े को बिम्पिडिस एट अल12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चरण तापमान अवधि चक्र
1. प्रारंभिक निंदा 95 डिग्री सेल्सियस 4 मिन 1
2. डेनाटुरिशन 95 डिग्री सेल्सियस 30 एस 30
3. एनीलिंग 55 डिग्री सेल्सियस 30 एस
4. एक्सटेंशन 72 डिग्री सेल्सियस 40 एस
5. अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 6 मिन 1
6. पकड़ो 4 डिग्री सेल्सियस जब तक प्रयोगकर्ता द्वारा बंद कर दिया 1

तालिका 1: पीसीआर साइकिल कार्यक्रम।

पूरक कोडिंग फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Discussion

वर्तमान अध्ययन में, हम चूहों में ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करके विभिन्न प्रकार के स्थान वरीयता विश्लेषण करने के दो चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग वीटीए न्यूरॉन्स(चित्रा 1 और चित्रा 6)12के पुरस्कृत या प्रतिकूल व्यवहार फेनोटाइप का आकलन करने के लिए किया गया था, लेकिन अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स की व्यवहार भूमिका का पता लगाने के लिए भी उपयोग किया जा सकता है।

हाल के कई अध्ययनों में दो डिब्बे 23,24और तीन डिब्बे वालेउपकरणों मेंआरटी-पीपी प्रतिमान ों का वर्णन किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक तीन डिब्बे तंत्र में आरटी पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल के लिए विस्तृत सेटअप का वर्णन पारंपरिक रूप से सीपीपी प्रयोगों में इस्तेमाल किया दुरुपयोग की दवाओं के प्रशासन पर व्यवहार प्रभाव का आकलन करने के लिए उन जैसी । जबकि परिणाम केवल यहां प्रत्येक डिब्बे में बिताए गए माउस के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं, ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर कई अन्य व्यवहार मापदंडों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जैसे क्षेत्रों में संक्रमण, वेग, समय स्थिर और अधिक खर्च किया जाता है। विभिन्न मापदंडों का विश्लेषण डेटा की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है।

वर्तमान आरटी-पीपी प्रोटोकॉल लचीले हैं और यदि विभिन्न प्रकार के उत्तेजना पैटर्न में पुरस्कृत प्रभाव होते हैं तो परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। लेजर नियंत्रण के मापदंडों को आसानी से या तो माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड की स्क्रिप्ट के माध्यम से या ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर के भीतर बदला जा सकता है, सेटअप की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन। हम एक 20 हर्ट्ज उत्तेजना आवृत्ति का सुझाव देते हैं जो सीमा के भीतर है, और कभी-कभी कम, डोपामिनर्जिक और ग्लूटामिजर न्यूरॉन्स और उनकेटर्मिनलों 13,14,16,17,18,23,24, 25,26,27का अध्ययन करने के लिए एक ही ऑप्सिन संस्करण (ChR2/H134R) का उपयोग करके पिछले अध्ययनों में लागू आवृत्तियों का। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि उच्च उत्तेजना आवृत्तियों कम लोगों की तुलना में व्यवहार पर विपरीत प्रभाव हो सकता है, और है कि इन प्रभावों को एक ध्रुवीकरण28उच्च आवृत्तियों की वजह से ब्लॉक के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं । इसी तरह, पार्श्व प्रीप्टिक क्षेत्र15में ग्लूटार्गिक और गैबार्गिक न्यूरॉन्स को उत्तेजित करते समय व्यवहार उत्पादन में अंतर दिखाया गया है। इन अध्ययनों में वीटीए की तुलना में विभिन्न क्षेत्रों के न्यूरॉन्स की जांच की गई और गैर - ग्लूटाएग्नेस न्यूरॉन्स15,28की उच्च आवृत्तियों पर सबसे बड़ा प्रभाव देखा गया । 20 हर्ट्ज पर हमारी पसंद ग्लूटाएर्गिक और डोपामिनर्जिक वीटीए न्यूरॉन्स के पिछले अध्ययनों पर आधारित है जो यह प्रदर्शित करती है कि उत्तेजना आवृत्तियों को अलग करके, इनाम से संबंधित व्यवहार उत्पादन24,26में काफी परिवर्तन नहीं किया जाता है।

एक अतिरिक्त पैरामीटर जिसे समायोजित किया जा सकता है और जो प्रायोगिक परिणाम को प्रभावित कर सकता है वह प्रकाश स्रोत की शक्ति है। उच्च लेजर शक्ति प्रकाश-उत्तेजित क्षेत्र के आकार को बढ़ा सकती है, जो कुछ प्रकार के प्रयोगों में फायदेमंद हो सकती है लेकिन तापमान5में वृद्धि की कमी के साथ। दरअसल, हाल ही में एक अध्ययन से पता चला है कि तापमान में लेजर प्रेरित वृद्धि मस्तिष्क शरीर विज्ञान को बदल सकते है और व्यवहार माप29को प्रभावित करते हैं । ये टिप्पणियां प्रायोगिक डिजाइन में ऑप्सिन-नकारात्मक नियंत्रण ों को शामिल करने के महत्व को उजागर करती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हमने 10 मिलीआर लेजर पावर का उपयोग किया जो समान है और पहले वीटीए16,24,26में डोपामिनेर्गिक और ग्लूटामिजर न्यूरॉन्स को उत्तेजित करने में प्रभावी दिखाया गया है। प्रयोगों की स्थापना करते समय, उस क्षेत्र के आकार पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है जिसमें ब्याज की कोशिकाएं स्थित हैं और फाइबर-ऑप्टिक्स और पैच कॉर्ड गुण (संख्यात्मक एपर्चर, कोर व्यास)। लेजर पावर से संबंधित गणना ओं को निष्पादित करते समय इन मापदंडों को ध्यान में रखना आवश्यक है। विवरण के लिए, कार्ल डिसेरोथ की प्रयोगशाला(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)द्वारा विकसित कैलकुलेटर का उपयोग किया जा सकता है।

ऑप्टोजेनेटिक्स प्रयोगों को लागू करते समय क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन का हिस्टोलॉजिकल सत्यापन एक और महत्वपूर्ण पहलू है। पुनर्संयोजन दक्षता का सत्यापन हमेशा जानवरों के एक बड़े समूह में किसी भी व्यवहार प्रयोगों की शुरुआत से पहले एक पायलट पलटन में होना चाहिए। यह नैतिक कारणों के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन अनुकूलित प्रयोगात्मक उत्पादन के लिए भी। प्रत्येक वायरल निर्माण अलग न्यूरोनल प्रकार के लिए और विभिन्नक्षेत्रों5 में चर विशिष्टता दिखा सकता है, एक पैरामीटर जो अप्रत्याशित और यहां तक कि भ्रामक तरीकों से प्रयोगों को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, हमने पहले डैट-क्रे चूहों के वीटीए में AAV5 वायरस के क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन पैटर्न को मान्य किया है और पाया है कि एकतरफा इंजेक्शन ब्याज के अधिकांश क्षेत्र को लक्षित करने के लिए पर्याप्त थे। जब हमने वीटीए के भीतर स्थानिक रूप से प्रतिबंधित उपआबादी का अध्ययन किया, जैसे कि न्यूरोडी6 अभिव्यक्ति की विशेषता, हमने देखा कि द्विपक्षीय वायरल इंजेक्शन ऑप्टोजेनेटिक प्रकाश-उत्तेजना12पर अधिक स्पष्ट व्यवहार प्रभाव देने वाले न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या को लक्षित करने के लिए अधिक कुशल थे। इसके अलावा, सर्जरी से व्यवहार प्रयोगों की दीक्षा के लिए समय को ध्यान से संबोधित किया जाना है । दो सप्ताह के लिए पर्याप्त समय के लिए एक ChR2 डीएनए निर्माण सेल निकायों में व्यक्त किया जा सकता है के रूप में हम यहां दिखाने के लिए, लेकिन अब प्रतीक्षा समय (~ 8 सप्ताह) की जरूरत हो सकती है अगर अन्वेषक प्रक्षेपण क्षेत्रों में उत्तेजना के प्रभाव का परीक्षण कर रहा है13,14,15, 17।

यह देखने लायक है कि वीटीए में न्यूरॉन्स का अध्ययन करते समय इंजेक्शन वायरस की मात्रा (हमारे मामले में 300 एनएल) उपयुक्त हो सकती है, लेकिन ट्रांसडक्शन की दक्षता और अध्ययन की गई संरचना के आकार के आधार पर मात्रा और टिटर को समायोजित किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, औसत दर्जे की धुरी से दूरी पर स्थित द्विपक्षीय संरचनाओं के लिए, द्विपक्षीय इंजेक्शन करना और दोनों गोलार्द्धों में सक्रियण/अवरोध सुनिश्चित करने के लिए द्विपक्षीय रूप से फाइबरऑप्टिक्स को प्रत्यारोपित करना भी आवश्यक हो सकता है ।

अंत में, क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन की दक्षता को मान्य और पुष्टि करने और इच्छित स्थान पर ऑप्टिक फाइबर की सही प्रत्यारोपण साइट को सत्यापित करने के लिए पोस्टमार्टम हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करना हमेशा आवश्यक होता है। अप्रत्याशित, अधिक प्रतिबंधित या अत्यधिक क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन अभीष्ट क्षेत्र की सीमाओं के बाहर क्रे व्यक्त न्यूरॉन्स के अज्ञात वितरण के कारण हो सकता है, या वायरस सेरोटाइप में मतभेदों के कारण, वायरस की खराब हैंडलिंग, के क्लोजिंग वायरस डिलीवरी या सर्जरी से जुड़ी अन्य समस्याओं के लिए सिरिंज। सुरक्षित निष्कर्ष निकालने के लिए व्यवहार आकलन के किसी भी सांख्यिकीय परिणामकी पुष्टि करने के लिए संतोषजनक क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन और सही फाइबरऑप्टिक्स-प्रत्यारोपण का सत्यापन किया जाना चाहिए।

यहां उपलब्ध कराए गए आंकड़ों के संदर्भ में दो व्यवहार प्रतिमानों का उपयोग कैसे किया जा सकता है, आरटी-पीपी प्रतिमान में डैट-क्रे चूहों का विश्लेषण करके वीटीए में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना द्वारा प्राप्त प्रकाश-जोड़ी पक्ष को महत्वपूर्ण वरीयता पिछले निष्कर्षों के आधार पर23,24,25,26,27 की उम्मीद थी जबकि VGLUT2-क्री2-चूहों द्वारा दिखाए गए इस पक्ष से परिहार की आशंका नहीं थी। वीटीए के VGLUT2 न्यूरॉन्स और उनके अनुमानों को इनाम और घृणा16,17,24,30,31दोनों में शामिल दिखाया गया है, और इसलिए हमने वर्तमान आरटी-पीपी सेटअप में देखे गए स्पष्ट परिहार व्यवहार का अधिक विस्तार से आकलन करने के लिए एनसीपी विश्लेषण किया। वीटीए ग्लूटाएटलार्ग न्यूरॉन्स की उत्तेजना के प्रतिकूल गुणों की पुष्टि करने के लिए एकमात्र गैर-प्रकाश युग्मित डिब्बे के रूप में संकीर्ण, पारदर्शी गलियारे का उपयोग करके, यह स्पष्ट है कि इस विशेष तीन-डिब्बे सेटअप में, इन न्यूरॉन्स की ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण एक प्रतिकूल प्रतिक्रिया का कारण बनती है। ये प्रयोग, जो यहां उन स्थितियों का उदाहरण देने के लिए दिखाए गए थे जो आरटी-पीपी और एनसीपी प्रोटोकॉल दोनों का उपयोग करने से लाभान्वित हो सकते हैं, हाल ही में प्रकाशित अध्ययन का हिस्सा थे, और इन निष्कर्षों के बारे में पूर्ण डेटा सेट के साथ-साथ चर्चाएं इस प्रकाशन12में पाई जा सकती हैं ।

एनसीपी के अलावा, घृणा की पुष्टि करने के वैकल्पिक तरीकों में एक खुले क्षेत्र क्षेत्र के भीतर एक क्षेत्र की मजबूत रोशनी शामिल है, जबकि बाकी क्षेत्र को लेजर सक्रियण के लिए बांधना, या एक सक्रिय परिहार कार्य करना है जिसमें माउस को लेजर उत्तेजना15को समाप्त करने के लिए व्यवहार का एक विशिष्ट पैटर्न करना पड़ता है।

संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल इनाम और घृणा में न्यूरोनल सक्रियण की भूमिका को जानने के लिए सबसे कुशल तरीके से आरटी-पीपी और एनसीपी विश्लेषण को सफलतापूर्वक करने के तरीके की महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं। वैज्ञानिक परिकल्पना के आधार पर, इन प्रोटोकॉलों का उपयोग करके कई मापदंडों का विश्लेषण किया जा सकता है, और प्रत्येक प्रोटोकॉल को विशिष्ट मस्तिष्क को संबोधित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स को लागू करने वाले अनुकूलित व्यवहार विश्लेषणों के लिए अन्य मान्य प्रतिमानों के साथ भी जोड़ा जा सकता है क्षेत्रों और ब्याज के न्यूरॉन्स।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हमारे वित्तपोषण स्रोतों को कृतज्ञता से स्वीकार किया जाता है: उपसाला विश्वविद्यालय, वेटेन्सकापस्रैडेट (स्वीडिश रिसर्च काउंसिल), Hjärnfonden, पार्किंसंसफोडेन, बर्टिल हैल्स्टन, ओई & एडला जोहानसन, ज़ूलोगिस्क फोर्सेंजिंग और Åhlén के रिसर्च फाउंडेशन। उपसाला विश्वविद्यालय में जानवरों को रखा गया था और उपसाला विश्वविद्यालय व्यवहार सुविधा में प्रयोग किए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV-Cre dependent virus UNC Vector Core - a great variety of viruses to suit any project's needs
Agarose VWR Life Science 443666A
Buffer for PCR KAPA BIOSYSTEMS KB1003 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x
Bupivacaine (Marcain) Aspen N01BB01 local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription
Carprofen (Norocarp) N-Vet 27636 anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription
dNTP set Thermo Fisher Scientific R0181 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed
DNA ladder Thermo Fisher Scientific SM0243 100 bp, 50 μg Gene Ruler
DNA loading dye Thermo Fisher Scientific R0611 6x, dilute to 1x before using
Ear puncher AgnThos AT7000 ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals
Fiberoptic patchcords Doric Lenses MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25
Implantable fiberoptics Doric Lenses MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT the properties of the fibers might change depending on the experiment
Infusion pump for virus injections AgnThos Legato 130 contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame
Isoflurane (Forane) Baxter N01AB06 Volatile anesthetic, requires prescription
Jewelry screws AgnThos MCS1x2
Laser source Marwell Laser Systems CNI MBL-III-473-100mW
Microcontroller board Arduino "Uno" board can be ordered from several companies
Microdrill AgnThos 1474 could be ordered with or without stereotaxic holder
Needle (34G) World Precision Instruments NF36BV
Nucleic Acid gel stain - GelRed Biotium 41003-T
PCR tubes Axygen PCR-0208-CP-C
Power meter Thorlabs PM100D
Place Preference Apparatus Panlab 76-0278
Rotary joint Doric Lenses FRJ_1x1_FC-FC
Sleeves Doric Lenses SLEEVE_ZR_1-25 mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber
Stabilization cement Ivoclar Vivadent Tetric EvoFlow
Syringe (10ul) World Precision Instruments NanoFil
Taq polymerase KAPA BIOSYSTEMS KE1000 500U
TAE buffer Omega BIO-TEK SKU:AC10089 50x concentration, has to be dilluted before use
Thermal cycler BIO-RAD S1000 1852148 necessary to perfrom PCR reactions
Tissue glue AgnThos Vetbond
Tracking software Noldus Ethovision XT
TTL box Noldus Noldus USB-IO box
UV transilluminator Azure Biosystems c200 model

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References

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व्यवहार अंक 156 घृणा व्यवहार कंडीशनिंग क्रे-लोक्स डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (DAT) ऑप्टोजेनेटिक्स प्लेस वरीयता इनाम ट्रांसजेनिक चूहे वेसिकुलर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर (VGLUT2)
माउस के वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र के भीतर ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करके दो अलग-अलग रियल-टाइम प्लेस वरीयता प्रतिमान
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Bimpisidis, Z., König, N., Wallén-Mackenzie, Å. Two Different Real-Time Place Preference Paradigms Using Optogenetics within the Ventral Tegmental Area of the Mouse. J. Vis. Exp. (156), e60867, doi:10.3791/60867 (2020).

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