Summary
Qui presentiamo due protocolli passo-passo facili da seguire per i paradigmi delle preferenze dei piazzamenti usando l'optogenetica nei topi. Utilizzando queste due diverse configurazioni, i comportamenti di preferenza ed elusione possono essere valutati saldamente all'interno dello stesso apparato con elevata selettività spaziale e temporale, e in modo semplice.
Abstract
Comprendere come l'attivazione neuronale porta alla produzione comportamentale specifica è fondamentale per le neuroscienze moderne. La combinazione dell'optogenetica nei roditori con test comportamentali in paradigmi convalidati consente di misurazione delle conseguenze comportamentali sulla stimolazione di neuroni distinti in tempo reale con un'elevata selettività spaziale e temporale, e quindi la creazione di relazioni causali tra attivazione neuronale e comportamento. In questo articolo viene descritto un protocollo passo-passo per un paradigma RT-PP (Real-Time Place Preference), una versione modificata del test CPP (Conditioned Place Preference) classico. Il RT-PP viene eseguito in un apparato a tre compartimenti e può essere utilizzato per rispondere se la stimolazione optogenetica di una specifica popolazione neuronale è gratificante o avversiva. Descriviamo anche una versione alternativa del protocollo RT-PP, il cosiddetto protocollo di preferenza del compartimento neutro (NCP), che può essere utilizzato per confermare l'avversione. I due approcci si basano sulle estensioni della metodologia classica provenienti dalla farmacologia comportamentale e sulla recente attuazione dell'optogenetica nel campo delle neuroscienze. Oltre a misurare la preferenza del luogo in tempo reale, queste configurazioni possono anche fornire informazioni sul comportamento condizionato. Forniamo protocolli passo-passo facili da seguire insieme ad esempi dei nostri dati e discutiamo aspetti importanti da considerare quando si applicano questi tipi di esperimenti.
Introduction
L'implementazione dell'optogenetica, un moderno strumento sperimentale di neuroscienza in cui la luce viene utilizzata per controllare l'attività neuronale, negli ultimi anni ha portato a importanti progressi nella comprensione di come specifiche popolazioni neuronali influenzano il comportamento1,2,3. L'eccezionale selettività spaziale e temporale dell'optogenetica permette di stabilire relazioni causali tra eccitazione o inibizione di gruppi cellulari di interesse e produzione comportamentale2,3. La selettività spaziale nell'optogenetica è comunemente garantita attraverso il sistema Cre-Lox in cui l'attività di Cre ricombinase porta alla ricombinazione di eventuali sequenze di DNA presenti tra i siti di Lox, i cosiddetti alleli squallidi (affiancati da siti di lox)4. L'obiettivo con l'utilizzo del sistema Cre-Lox in optogenetica è quello di raggiungere l'espressione degli alleli codificando le operazioni optogenetiche in specifici neuroni di interesse, lasciando i neuroni circostanti privi di espressione. Le opsine sono proteine sensibili alla luce che su una stimolazione della luce di specifica lunghezza d'onda consentono il flusso di ioni che influenza l'eccitabilità neurale o influenzano le funzioni cellulari modulando le vie degli effetti a valle. Nuove varianti di opsins che differiscono in azione (eccitatorio, inibitorio, modulatori), meccanismo, attivazione per lunghezza d'onda della luce e proprietà cinetica5 sono continuamente sviluppati per soddisfare le esigenze di approcci sperimentali specifici. Per quanto riguarda l'eccitabilità, utilizzando un opsin depolarizzante o iperpolarizzante detta l'attività dei neuroni (eccitazione o inibizione, rispettivamente) su stimolazione della luce a una specifica lunghezza d'onda consegnata nel cervello3.
L'attività promotrice selettiva dirige l'espressione di Crericombinase ai neuroni di interesse. Implementando un allele scisso dell'opsin di interesse, la ricombinazione mediata da Cre farà in modo che l'opsin sia espresso in modo selettivo nei neuroni che co-esprimono Cre ricombinarsi3,6. Questo uso della doppia transgenica per la selettività spaziale diretta si è dimostrato molto efficiente nell'optogenetica. Così, mentre la stimolazione della luce per attivare le opsine viene ampiamente fornita attraverso una fibra ottica impiantata intracerebralmente collegata a una fonte di luce (LED o laser)3, solo i neuroni che esprimono sia Cre ricombinante e l'allele opsin flossed risponderanno a questa stimolazione. Il sistema Cre-Lox nei roditori può essere realizzato in modi diversi utilizzando solo transgenici (sia la ricombinante Cre ricombinante che il costrutto di opsina in seminato sono codificati in animali transgenici), solo iniezioni virali (i costrutti di DNA per Cre ricombinarsi e l'opsina in semixed sono entrambi erogati tramite un supporto virale), o una combinazione dei due (ad esempio, Cre ricombinase è codificato da un animale transgenico che viene iniettato con un virus che trasporta il costrutto di opsina dissata)5. Il costrutto del DNA di opsino dissingato è di solito clonato nel telaio con un gene reporter per consentire la visualizzazione della ricombinazione mediata da Cre nelle sezioni di tessuto. Mentre l'optogenetica può essere eseguita anche nei ratti, i protocolli presentati sono stati generati per i topi. Per semplicità, i topi che trasportano sia la ricombinante Cre che l'opsina sxed saranno chiamati "topi optogenetici". Nei protocolli descritti di seguito, i topi optogenetici sono stati generati da un approccio misto transgenico (Cre ricombinase sotto il controllo di due diversi promotori) e virale (utilizzando un virus adeno-associato, AAV, per fornire l'approccio di DNA dell'opsina fissonerato - nel nostro caso ChR2/H134R). L'ottenimento e la manutenzione di linee di topo transgeniche è una parte essenziale della metodologia. Cre-driver e topi transgenici insonina bilorati possono essere prodotti per ogni scopo, o acquistati se disponibili in commercio, così come una serie di virus che trasportano sequenze di DNA che codificano le opsine ricombinate e semixed in diverse forme.
L'optogenetica associata ai test comportamentali si è dimostrata uno strumento prezioso per studiare il ruolo di regioni cerebrali distinte, o popolazioni neuronali discrete, in particolari tipi di comportamento. Nel contesto del comportamento correlato alla ricompensa, l'optogenetica ha permesso la verifica dei risultati precedenti nei campi della farmacologia comportamentale e della psicologia sperimentale, e ha anche permesso un nuovo livello di dissezione spatio-temporale rilevante su come alcuni neuroni influenzano il comportamento. Un metodo che è stato utilizzato in diversi studi per valutare il comportamento correlato alla ricompensa è una versione modificata del metodo classico noto come Conditioned Place Preference (CPP). La CPP classica è stata utilizzata per valutare le proprietà gratificanti o avverse delle droghe di abuso attraverso la loro capacità di indurre associazioni pavloviane con spunti dell'ambiente7,8. In termini pavloviani, il farmaco è uno stimolo incondizionato in quanto può suscitare avvicinamento o ritiro se è gratificante o avversante, rispettivamente. L'accoppiamento continuo del farmaco con vari stimoli neutri, che essi stessi non suscitano alcuna risposta, può portare ad avvicinarsi o ritirare semplicemente dopo la presentazione del precedentemente neutro, ma dopo l'accoppiamento, i cosiddetti stimoli condizionati 9. L'analisi CPP viene di solito eseguita in un apparato contenente due compartimenti della stessa dimensione, ma in cui ogni compartimento è definito da caratteristiche distinte, come la texture del pavimento, i modelli delle pareti e l'illuminazione (stimoli neutri). I due scomparti sono collegati da un corridoio o da un'apertura tra i compartimenti. Durante il condizionamento, il soggetto, di solito un piccolo roditore, riceve iniezioni passive di un farmaco mentre limitato a uno dei due compartimenti principali e salina mentre limitato all'altro compartimento. Gli effetti gratificanti del farmaco vengono successivamente valutati in una sessione libera dalla droga quando il soggetto è autorizzato a esplorare liberamente l'intero apparato. La quantità di tempo trascorso nel compartimento precedentemente accoppiato alla droga (la risposta condizionata) è considerato per riflettere i meccanismi di apprendimento pavloviano mediati tra gli effetti gratificanti del farmaco e i segnali del compartimento associato alla sua somministrazione (stimolicondizionati). Se l'animale passa più tempo nel compartimento accoppiato alla droga, il farmaco ha indotto una preferenza di luogo condizionato che significa che ha effetti gratificanti sul comportamento. D'altra parte, se il farmaco è percepito come avverso, l'animale eviterà il compartimento accoppiato alla droga e trascorrerà più tempo nel compartimento accoppiato con salina, indicando l'avversione del luogo condizionata (CPA)8,9,10,11.
Poiché l'optogenetica può essere implementata per controllare l'attività neuronale in "tempo reale", l'uso di un paradigma comportamentale simile, ma distinto da, consente la misurazione della preferenza del posto sull'attivazione neuronale diretta. L'analisi dell'optogenetica della preferenza del luogo è quindi spesso indicata come un paradigma di analisi della preferenza dei place in tempo reale (RT-PP). Nel paradigma RT-PP, la stimolazione optogenetica di neuroni distinti attraverso il sistema Cre-Lox sostituisce la somministrazione sistemica di un farmaco eseguito nel CPP classico, in modo che il paradigma RT-PP invece misura se la stimolazione neuronale indotta optogeneticamente è percepito come gratificante o avverso. La descrizione attuale si concentrerà sui topi optogenetici, ma anche i ratti optogenetici possono essere testati utilizzando protocolli simili.
Invece di condizionare ad un compartimento alla volta come nel paradigma CPP classico, il mouse optogenetica nel paradigma RT-PP è autorizzato a muoversi liberamente nell'intero apparato e il comportamento è registrato durante tutta la sessione. L'ingresso in uno dei compartimenti è abbinato alla stimolazione della luce intracranica. In base ai parametri di stimolazione della luce appropriati, i neuroni che esprimono un opsino eccitatorio saranno quindi attivati. Se la stimolazione della luce viene percepita come gratificante, il topo di optogenetica rimarrà nel compartimento accoppiato alla luce, mentre se la stimolazione della luce viene percepita come avvese, il mouse uscirà dal compartimento per sfuggire alla stimolazione. Questo tipo di analisi consente di valutare l'apprendimento contingente: il soggetto può innescare la stimolazione della luce e quindi l'attivazione neuronale entrando in uno scompartimento, e fermare la stimolazione uscendo dal compartimento, simile alla pressione della leva durante un compito strumentale. Inoltre, i meccanismi di apprendimento associativo possono essere valutati durante le sessioni successive in cui il tempo trascorso in ogni compartimento viene misurato in assenza di stimolazione. In questo modo, il ricercatore può dissociare tra gli effetti immediatamente gratificanti sulla stimolazione dei neuroni di interesse e la formazione di memoria associativa ad esso correlati12.
Nello studio attuale, descriviamo due protocolli di configurazione passo-passo per il comportamento di preferenza del luogo basato sull'optogenetica dei topi liberamente in movimento. Il primo protocollo descrive RT-PP all'interno di un apparato a tre compartimenti ed è stato delineato sulla base dei protocolli recentemente presentati da Root e colleghi13 e altri autori12,14,15,16,17,18. L'esperimento è costituito da due fasi che comprendono diverse sessioni giornaliere (illustrato nella Figura 1A). Ogni sessione è progettata per scopi diversi e i parametri di stimolazione di accoppiamento con un compartimento vengono modificati di conseguenza. La prima sessione, il "Pretest", viene utilizzata per valutare la preferenza iniziale del soggetto a uno dei compartimenti. Mentre è collegato al cavo patch, il soggetto è permesso di esplorare liberamente l'apparato in assenza di stimolazione per 15 min. Se la preferenza iniziale rispetto a un compartimento è superiore all'80%, il mouse viene escluso dall'analisi poiché la distorsione laterale iniziale potrebbe inclinare l'analisi. Dopo il "Pretest", "Fase 1" inizia. La prima parte consiste di due sessioni consecutive, giornaliere, di 30 min di "RT-PP". Durante la "Fase 1", il mouse optogenetica è collegato alla sorgente laser attraverso il cavo patch e posto nell'arena per esplorarlo liberamente. Il mouse riceve la stimolazione laser intracranica all'ingresso in uno dei compartimenti principali. Gli esperimenti pilota possono essere eseguiti per determinare quale compartimento verrà assegnato come accoppiato al laser e quale come non accoppiato. Se la stimolazione risulta gratificante, il laser sarà accoppiato al vano meno preferito durante il "Pretest" e al più preferito se la stimolazione è avvetale. Così, il protocollo RT-PP presentato segue un design di parte nel senso che la stimolazione laser non è assegnata casualmente a uno qualsiasi dei due scomparti principali (design imparziale), ma è scelto per evitare qualsiasi preferenza iniziale del mouse. L'ingresso nell'altro vano principale o nel vano neutro che collega i due compartimenti principali non dà luogo a stimolazione della luce intracranica e quindi non sono accoppiati con la luce. Queste sessioni consentono una valutazione in tempo reale delle proprietà gratificanti o avverse della stimolazione di specifiche popolazioni neuronali. L'ultimo giorno di "Fase 1", avviene una sessione di 15 min senza alcuna stimolazione. Questa sessione serve ad affrontare le risposte condizionate ("CR") che derivano dall'apprendimento associativo tra la stimolazione e l'ambiente in cui è stata ricevuta. Almeno tre giorni dopo la "Fase 1", si svolge la " Fase diinversione" che segue la stessa struttura di "Fase 1", ma il compartimento principale precedentemente non accoppiato è ora accoppiato con la stimolazione della luce. Come nel caso di "Fase 1", le due sessioni di stimolazione sono seguite da una sessione "CR". La " Fase diinversione" è usata per confermare che il comportamento del topo è subordinata alla stimolazione optogenetica e non è correlato a parametri casuali. Ogni sessione dell'esperimento RT-PP deve essere programmata separatamente all'interno del software di monitoraggio. Il protocollo corrente descrive tali impostazioni all'interno di un software specifico, ma qualsiasi altro software di monitoraggio in grado di inviare segnali di modulazione Transistor-transistor-logic (TTL) alla sorgente luminosa può essere utilizzato.
Il secondo protocollo descrive una nuova configurazione definita paradigma Neutral Compartment Preference (NCP). Questo protocollo modificato del RT-PP sfrutta le piccole dimensioni e la trasparenza del corridoio di collegamento che è naturalmente evitato dal mouse a causa della sua composizione stretta e trasparente. Associando entrambi i compartimenti principali con stimolazione leggera e lasciando il corridoio libero dalla stimolazione della luce, l'impostazione NCP può essere utilizzata per verificare se la stimolazione optogenetica costringerà il mouse a trascorrere più tempo nel corridoio per evitare di ricevere stimolazione optogenetica. Confrontando il tempo trascorso nei due compartimenti accoppiati alla luce con il tempo trascorso nel corridoio, è possibile effettuare una verifica dell'avversione indotta dall'optogenetica. L'esperimento NCP consiste in due sessioni giornaliere consecutive in cui i topi optogenetici ricevono la stimolazione (30 min ciascuno) per misurare la preferenza in tempo reale e una sessione laser-free (15 min) per valutare le risposte condizionate in modo simile a quelle del RT-PP Protocollo.
I protocolli RT-PP e NCP forniti di seguito sono stati recentemente convalidati nel nostro laboratorio nello studio di come diversi tipi di neuroni situati nell'area tegmentale ventrale (VTA) sono coinvolti in vari aspetti del comportamento correlato alla ricompensa12. Qui, per esemplificare l'implementazione dei protocolli RT-PP e NCP, il trasportatore di dopamina (DAT)-Cre19 e il trasportatore di glutammato veicolare 2 (VGLUT2)-Cre20 topi transgenici sono stati iniettati stereocosamente con AAV che trasporta un costrutto di DNA di canali dissing (ChR2) nella fibra VTA da cui è stata impiantata una tantum. Le risposte comportamentali ottenute dopo l'analisi di questi topi utilizzando i protocolli RT-PP e NCP forniti mostrano come l'attivazione dei neuroni dopaminergici e glutamatergici all'interno della VTA porti a diverse risposte comportamentali (Figura 1).
I protocolli passo-passo per i paradigmi RT-PP e NCP sono forniti con informazioni che vanno dalla genotipizzazione di topi transgenici, iniezioni virali stereotassiche e posizionamento in fibra ottica, alla programmazione di software di monitoraggio per il controllo laser e comportamentale Valutazione. Inoltre, vengono discussi i suggerimenti per le modifiche del protocollo in termini di parametri di stimolazione e aspetti sperimentali che possono influenzare l'esito scientifico. Mentre i protocolli sono descritti nel contesto del VTA, possono essere applicati a qualsiasi area del cervello o popolazione neuronale, a condizione che siano disponibili gli strumenti di optogenetica pertinenti, come le relative cre-driver e le operazioni slosate.
Protocol
Questo studio è stato effettuato utilizzando eterozigous DAT-Cre19 e VGLUT2-Cre20 topi di entrambi i sessi, invecchiati >8 settimane e pesatura >20 g. Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo lo svedese (Animal Welfare Act SFS 1998:56) e la legislazione dell'Unione europea (Convenzione ETS 123 e direttiva 2010/63/UE) con il permesso dei comitati etici animali locali.
1. Genotipizzazione dei topi
- Prendere biopsie auricolari utilizzando un punzonatore auricolare da utilizzare per la genotipizzazione dei topi transgenici.
- Preparare i punzoni dell'orecchio per eseguire una reazione a catena di polimerasi (PCR) utilizzando primer appositamente realizzati.
NOTA: in questo protocollo sono state utilizzate prime rinportatrici abilitate per Cre.- Aggiungere 75 lofildi di buffer di lisi (buffer 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) in ogni tubo da 1,5 mL contenente un punzone dell'orecchio.
- Incubare in un blocco di riscaldamento a 96 gradi centigradi per 30 min.
- Lasciare raffreddare i campioni per 5 min e quindi aggiungere 75 L del buffer di neutralizzazione (buffer 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
- Eseguire la PCR secondo le procedure standard12,21 utilizzando le primer appropriate (qui: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGAGTTCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAGAGAGTTAG-3').
NPISSione: Lavorare sul ghiaccio sotto un cappuccio PCR e prestare attenzione a non contaminare i reagenti e i campioni.- Preparare il master mix PCR. Moltiplicare i volumi seguenti in base al numero di campioni che verranno analizzati, inclusi i campioni di controllo appropriati. Mescolare i reagenti per una singola reazione di volume finale di 25 mL nel seguente ordine: acqua distillata (18,9 l), 10x buffer con MgCl2 (2,5 l), 10 mM di miscela dNTP (10 mM dNTP mix (10 mM) 0,5 l), 10 M di primer di avanzamento (1 l), 10 M di primer inverso (1 l), 5 politasi di DNA U/L (0,1 l) e DNA modello (1 l; verranno aggiunti nei passaggi successivi).
NOTA: aggiungere sempre un controllo negativo, positivo e vuoto (senza DNA del modello) per garantire risultati validi. - Aggiungere 24 - L di master mix nei tubi PCR.
- Aggiungere 1 - L di DNA modello (proveniente dal punzone dell'orecchio da ogni mouse) in ogni tubo PCR.
- Centrifugare brevemente i tubi PCR per assicurarsi che il DNA del modello sia all'interno del mix master.
- Eseguire la PCR con un ciclore termico utilizzando il programma ciclistico nella Tabella 1.
- Preparare il master mix PCR. Moltiplicare i volumi seguenti in base al numero di campioni che verranno analizzati, inclusi i campioni di controllo appropriati. Mescolare i reagenti per una singola reazione di volume finale di 25 mL nel seguente ordine: acqua distillata (18,9 l), 10x buffer con MgCl2 (2,5 l), 10 mM di miscela dNTP (10 mM dNTP mix (10 mM) 0,5 l), 10 M di primer di avanzamento (1 l), 10 M di primer inverso (1 l), 5 politasi di DNA U/L (0,1 l) e DNA modello (1 l; verranno aggiunti nei passaggi successivi).
- Preparare un gel di agarose per eseguire i campioni usando l'elettroforesi.
NOTA: la dimensione dipenderà dal numero di campioni che devono essere analizzati.- Aggiungere 1% di polvere di agarose w/v in 1x tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) in una bottiglia di vetro. Riscaldare nel microonde fino a quando l'agarose è completamente disciolto, controllando regolarmente che non bolle.
AVVISO: Prendere precauzioni per evitare ustioni. - Lasciare raffreddare il gel a circa 50 gradi centigradi e aggiungere una macchia di gel acido nucleico (0,5 l/50 mL di gel).
- Versare il gel nel vassoio di colata contenente pettini ben e lasciarlo a temperatura ambiente fino a quando non diventa completamente solidificato. Rimuovere delicatamente i pettini.
- Riempire il serbatoio dell'elettroforesi con 1x tampone TAE e posizionare il gel nel serbatoio.
- Aggiungere 2 x luna di 1 x di tintura di carico del DNA in ciascuno dei campioni di DNA.
- Caricare 4 - L di scala del DNA nel primo pozzo del gel, quindi procedere a caricare l'intero volume dei campioni nei pozzi rimanenti.
- Impostare la fonte di alimentazione dell'elettroforesi su 140 V ed eseguire per 25-30 min.
- Posizionare il gel sotto una sorgente UV e scattare una foto dei risultati.
- Aggiungere 1% di polvere di agarose w/v in 1x tampone Tris-acetato-EDTA (TAE) in una bottiglia di vetro. Riscaldare nel microonde fino a quando l'agarose è completamente disciolto, controllando regolarmente che non bolle.
2. Chirurgia stereotassica
- Dopo la genotipizzazione, i topi separati mantengono quelli positivi per Cre. Attendere fino a quando non sono almeno 8 settimane di età e pesare s 20 g per eseguire un intervento chirurgico.
- Sanificare l'ambiente e sterilizzare gli strumenti chirurgici per eseguire un intervento chirurgico in condizioni asettiche.
- Iniettare i topi sottocutaneamente con analgesico 30 min prima dell'intervento chirurgico.
- Anestesizzare i topi con isoflurane (2,3% in aria normale per l'induzione e 1,5,2,0% per la manutenzione dell'anestesia). Assicurarsi che un adeguato livello di anestesia si otturi testando l'assenza di riflessi di dolore pizzicando delicatamente la punta del mouse. Regolare la consegna isoflurane di conseguenza.
- Posizionare il mouse sull'apparato stereotassico. Aggiungere lubrificante per gli occhi per evitare lesioni agli occhi a causa della secchezza e radere i capelli della parte superiore del cranio. Utilizzare una piastra di riscaldamento per mantenere stabile la temperatura del mouse.
- Iniettare 100 l di anestetico locale sotto la pelle del cranio e lasciare agire per 5 min.
- Preparare il sito di incisione con tre applicazioni circolari di alcool o salina sterile alternando lo iodio. Utilizzare una punta di cotone sterile e avviare l'applicazione dalla linea di incisione, verso l'esterno.
- Sollevare delicatamente la pelle con pinze, e fare un'incisione di 1,5 cm lungo l'asse rostrocaudal con forbici chirurgiche per rivelare la superficie del cranio.
- Utilizzando un bastoncino di cotone, applicare la soluzione H2O2 per rimuovere il periosteo.
- Sciacquare il cranio con una salina sterile e asciugarlo con applicatori sterili di punta di cotone.
- Individuare il bregma e lambda.
- Assicurarsi l'allineamento del cranio piatto posizionando la punta dell'ago di iniezione, regolato sul telaio stereotassico, su bregma e lambda. Misurare le coordinate ventrali per ogni posizione e confrontare. Quando il cranio è piatto, la coordinata ventrale sia per bregma che per la lambda è identica. In caso contrario, regolare la posizione della testa e prendere di nuovo le misure.
- Trovare e contrassegnare la posizione (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm da bregma secondo Franklin e Paxinos22) dove avrà luogo l'iniezione del virus Cre-dependent e l'impianto della fibra ottica e fare un piccolo foro utilizzando un micro trapano.
- Caricare 400 nL di virus nella siringa da 10 litri montata sull'apparato stereotassico utilizzando una pompa di precisione.
- Abbassare attentamente l'ago (34 G, smussato) e iniettare 300 nL di virus optogenetico dipendente dalla cremisi (AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5.6 x 1012 vg/mL]) nel VTA (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm da bregma e -4,4 mm dalla superficie del cranio, secondo Franklin e Paxinos22) a 100 nL/min velocità di iniezione utilizzando la pompa di precisione.
- Dopo l'iniezione, lasciare l'ago in posizione per altri 10 min per consentire la diffusione del virus (Figura 2A).
- Ritirare lentamente l'ago dal sito di iniezione.
- Fare piccoli fori utilizzando un microdrill per adattarsi viti di ancoraggio che stabilizzerà la fibra ottica e cemento dentale complesso.
- Riprendere le coordinate del bregma e impiantare la fibra ottica (200 m di diametro, 0,37 NA) a: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm da bregma e -4,0 mm dalla superficie del cranio (Figura 2B) secondo Franklin Paxinos22.
- Fissare la fibra sul cranio utilizzando cemento dentale. Applicare abbastanza cemento intorno alla fibra ottica ferule per fissarlo al cranio, ma prestare attenzione a lasciare 3 -4 mm della parte superiore della ferule privo di cemento per consentire il collegamento del cavo patch (Figura 2C).
NOTA: Prestare attenzione a non riempire il buco con il cemento in quanto ciò può causare danni al tessuto cerebrale. I materiali emostatici possono essere aggiunti nel foro per evitare che ciò accada. - Utilizzare colla di tessuto o suture assorbibili per chiudere qualsiasi ferita aperta e lasciare l'animale a recuperare per almeno due settimane. Dare una dose aggiuntiva di analgesico 12-24 h dopo l'intervento chirurgico.
3. Impostazione del controllo della sorgente laser
- Utilizzare microcontrollori a scheda singola per controllare la sorgente laser. Scrivere uno script utilizzando il software appropriato. Caricare lo script sulla scheda del microcontrollore utilizzando il cavo di connessione appropriato al computer.
NOTA: lo script deve includere la modulazione esterna (input) proveniente dal software di tracciamento tramite una casella TTL e un'uscita al laser per controllare i parametri di stimolazione. Per la larghezza dell'impulso di 10 ms con una frequenza di 20 Hz, utilizzare lo script presente nel file di codifica supplementare. - Collegare la scheda al laser e alla casella TTL dell'hardware di tracciamento.
- Utilizzare un cavo di rete per collegare la casella TTL alla scheda (pin 5 per lo script fornito) (Figura 3A,C).
- Assicurarsi che il laser sia impostato per il controllo mediante modulazione esterna e collegare il laser alla scheda utilizzando un cavo FC/PC (pin 13 per lo script specificato) (Figura 3B,C).
- Collegare i perni appropriati alle parti a terra della scheda.
- Collegare la sorgente laser alla fibra ottica.
- Collegare la sorgente laser ad un giunto rotante (Figura 3D).
- Collegare un cavo di patch (Figura 3E) all'articolazione rotante.
- Stabilizzare l'articolazione rotante sopra l'apparato ma al di fuori dell'area di registrazione. Assicurarsi che la lunghezza del cavo patch in fibra ottica sia appropriata per consentire al mouse di muoversi senza difficoltà nell'arena (Figura 3F).
4. Impostazione dell'esperimento per l'approccio RT-PP all'interno del software di monitoraggio
- Calibrare la configurazione dell'arena. Utilizzare un righello per misurare una parte specifica dell'apparato fisico, disegnare una linea corrispondente alla parte misurata sull'immagine all'interno del software nella scheda Disegna scala su calibrazione e immettere il valore già noto (passaggio 1 nella Figura 4).
- Progetta l'arena. Disegnare l'area in cui verrà registrato il movimento dei topi (passaggio 2 nella Figura 4).
- Creare le zone. Disegnare le zone che verranno assegnate come associate al laser, non associate al laser e "neutre" (passaggio 3 nella Figura 4).
- Convalidare l'impostazione per verificare che non siano presenti parametri in conflitto, ad esempio zone esterne all'arena (passaggio 4 nella Figura 4)
- Impostare i parametri sperimentali nelle impostazioni di controllo della prova di tabulazione (passaggio 5 in Figura 4).
- Impostare il tempo di prova come illustrato nel passaggio 1 nella Figura 5 per una sessione RT-PP di 30 min.
- Assicurandosi che il "controllo hardware" sia abilitato, assegnare un vano come associato a laser in cui l'ingresso del mouse attiverà un segnale TTL attraverso il software di tracciamento alla scheda del microcontrollore. Nella Figura 5 (passaggio 2) il compartimento accoppiato al laser è il compartimento A. Per la fase di inversione, passare i compartimenti in modo che il compartimento B venga accoppiato al laser e il compartimento A non sia associato. Farlo sostituendo A con B e B con A nel software.
5. Modifica dell'impostazione per testare le proprietà avverse della stimolazione utilizzando l'approccio NCP
- Seguire i passaggi da 4.1 a 4.4 come descritto in precedenza.
- Impostare il tempo dell'esperimento su 30 min tramite l'opzione "Ripeti fino a" nelle impostazioni della casella "Riferimento" (passaggio 1 nella Figura 6).
- Assegnare entrambe le zone A e B come coppie laser (passaggio 2 nella Figura 6) aggiungendo "quando il punto centrale si trova in uno dei bit di zona A e zona B" per la casella delle condizioni relativa alle impostazioni per i compartimenti A e B. Si noti che il laser si spegne quando l'animale si trova nel vano neutro.
6. Esecuzione di un esperimento con stimolazione laser
- Configurare le impostazioni di rilevamento.
- Utilizzare un manichino per assomigliare al mouse al fine di garantire le impostazioni di rilevamento appropriate.
- Posizionare il manichino in un vano dell'apparecchio e utilizzare l'installazione automatica con sottrazione dinamica.
- Rimuovere il manichino e posizionarlo nel vano opposto. Assicurarsi che il manichino viene completamente rilevato e, in caso contrario, regolare le impostazioni tramite il software per ottenere il rilevamento corretto.
- Durante questo passaggio anche controllare se la stimolazione funziona come dovrebbe. Avviare l'acquisizione utilizzando le impostazioni di controllo di prova configurate in precedenza e posizionare il manichino nel vano accoppiato laser e vedere se la stimolazione viene attivata come dovrebbe. Quindi posizionare il manichino nel vano non accoppiato e/o neutro e vedere se la stimolazione è interrotta.
- Utilizzare un misuratore di potenza con un sensore per impostare la potenza del laser a 10 mW utilizzando la manopola sul laser (Figura 3B). Eseguire questa fase ogni volta che viene utilizzata la stimolazione laser.
AVVISO: utilizzare dispositivi oculari protettivi poiché l'esposizione diretta alla luce laser può causare danni permanenti agli occhi. - Posizionare il mouse nell'apparato.
- Estrarre delicatamente il mouse dalla gabbia e collegare l'impianto in fibra ottica al cavo patch in fibra ottica utilizzando un manicotto in ceramica.
- Posizionare delicatamente il mouse nel vano neutro dell'apparato a tre compartimenti.
- Attendere che il mouse venga rilevato dal software.
- Rimuovere le porte scorrevoli verticali che impediscono all'animale di entrare nei compartimenti principali.
- Lascia che l'animale esplori liberamente senza disturbi.
NOTA: La stessa procedura viene seguita quando l'animale non riceve la stimolazione con l'eccezione che il passaggio 6.2 non è necessario e che il laser è spento per tutto il tempo.
Representative Results
L'apparato a tre compartimenti (Figura 3F) è adatto per affrontare gli effetti gratificanti dei farmaci e per valutare in tempo reale le proprietà gratificanti o avverse della stimolazione diretta dei neuroni mediante l'optogenetica. È costituito da due compartimenti principali (20 cm [W] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) e un compartimento di collegamento più piccolo (20 cm [W] x 7 cm [L] x 25 cm [H]). I compartimenti principali hanno texture e motivi distinti per la parete e il pavimento per facilitare l'apprendimento associativo, mentre lo scomparto di collegamento/neutro è stretto e trasparente in modo che i topi trascorrono naturalmente meno tempo in esso. Come descritto in precedenza, il software di tracciamento può essere utilizzato per registrare diversi parametri comportamentali dei topi, tra cui il movimento e il tempo trascorso in ogni compartimento e per controllare la stimolazione laser. L'intero esperimento RT-PP si svolge in 8 sessioni (Figura 1A) e consente sia la valutazione delle proprietà gratificanti o avverse della stimolazione diretta (giorni 3, 4, 6 e 7) e la formazione di associazioni, positive o negative, in risposta all'esperienza precedente (giorni 5 e 8, "CR").
In primo luogo, abbiamo testato i topi DAT-Cre iniettati con il virus AAV-ChR2-eYFP nel VTA per colpire i neuroni dopaminergici. In conformità con la letteratura, abbiamo osservato che i topi preferivano trascorrere del tempo nel compartimento accoppiato con la stimolazione (Figura 1B, fase 1, giorni 3 e 4, cerchi blu, misure ripetute bidirezionali [RM] analisi della varianza [ANOVA], effetto del compartimento F(2,18) - 141, p < 0.001; effetto della sessione x compartimento F(12,108) Test post hoc di Tukey abbinato a p < 0.001). La fase di inversione, in cui è stato commutato l'accoppiamento dei compartimenti alla stimolazione laser, ha confermato queste osservazioni (Figura 1B, giorni 6 e 7, cerchi blu, test post hoc di Tukey accoppiati o scompartimento non accoppiato p < 0.001) escludendo così la possibilità che i risultati ottenuti dalla fase 1 fossero correlati a distorsioni laterali o parametri casuali. La media del tempo trascorso in ogni compartimento durante i quattro giorni di RT-PP ha confermato che i topi hanno trascorso in media circa il 70% del loro tempo nel vano accoppiato laser rispetto a quello non accoppiato (-20%) e il neutro (10%) (Figura1b grafico a barre, unidirezionale RM ANOVA, effetto della stimolazione F(2,6) - 139, p < 0.001, post di Tukey come accoppiato vs compartimenti non accoppiati e neutri p < 0,001). Inoltre, in assenza di stimolazione, nei giorni 5 e 8, i topi hanno trascorso molto più tempo nello scompartimento precedentemente accoppiato con stimolazione laser (Tukey post hoc p < 0.001), indicando che l'esperienza precedente era sufficiente a indurre comportamenti di apprendimento associativi riflessi come "ricerca" della stimolazione. Questi dati sono conformi alla letteratura e dimostrano che il metodo attuale può essere utilizzato in modo affidabile per studiare gli effetti gratificanti della stimolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali nella VTA.
Abbiamo quindi testato i topi VGLUT2-Cre iniettati con AAV-ChR2-eYFP nella VTA come sopra, per indirizzare i neuroni glutamatergici del VTA. In questo esperimento, abbiamo osservato un fenotipo comportamentale opposto da quello dimostrato dai topi DAT-Cre. Così, i topi evitarono il compartimento accoppiato alla stimolazione e passarono più tempo in quelli non accoppiati durante tutti i giorni RT-PP(Figura 1C a sinistra, a due vie RM ANOVA, effetto del compartimento F(2,12) - 40,9, p < 0.001; effetto della sessione x compartimento F(12,72) - 16,1, p < 0.001; Test post hoc di Tukey abbinato a p < 0.001; Figura 1C destra, effetto RM ANOVA unidirezionale della stimolazione F(2,6) - 162, p < 0.001, post hoc di Tukey accoppiati vs compartimenti non accoppiati e neutri p < 0.001). È interessante notare che, durante i "CR" giorni 5 e 8, i topi non hanno mostrato una chiara prevenzione del compartimento precedentemente accoppiato (nessuna differenza tra i compartimenti accoppiati e non accoppiati). È possibile che la mancanza di risposta condizionata sia dovuta al tempo inadeguato trascorso nel compartimento accoppiato al laser, che ha impedito la formazione di associazioni tra l'attivazione laser e l'ambiente particolare in cui si è verificato. Per esplorare ulteriormente questo fenotipo di elusione, abbiamo usato un protocollo modificato che abbiamo chiamato "preferenza di compartimento neutro", abbreviato NCP. In questo esperimento, entrambi i compartimenti principali sono stati accoppiati alla stimolazione e il compartimento neutro è rimasto senza stimolazione(Figura 7A). Abbiamo ipotizzato che, se la stimolazione ha proprietà avverse, allora il mouse sarà costretto a trascorrere del tempo nel più piccolo, compartimento neutro, per evitarlo. Infatti, in entrambi i giorni di stimolazione (Stim1 e Stim2) i topi hanno trascorso la maggior parte del tempo nel compartimento neutro (circa l'80%) rispetto ai compartimenti accoppiati ( Figura7B,C; sinistra: effetto RM ANOVA bidirezionale del compartimento F(2,8) - 70,9, p < 0.001; effetto della sessione x compartimento F(4,16) - 6,9, p - 0,002, scomparto neutro post hoc post hoc di Tukey "Stimolazione 1" vs compartimento 1 e 2 p < 0,01, "Stimolazione 2" neutro vs compartimento 1 e 2 p < 0,001; destra: univoca RM ANOVA, effetto di stimolazione F(2,2) 0.018, il test post hoc di Tukey accoppiato 1 e 2 vs neutro p < 0,05). Come nel caso di giorni "CR" durante il test RT-PP, i topi non sembravano formare associazioni negative tra i compartimenti e la stimolazione; vale a dire, in assenza di stimolazione (CR), hanno esplorato tutti i compartimenti allo stesso grado (Figura 7B, nessuna differenza tra il tempo trascorso in compartimenti accoppiati e compartimenti neutri). I risultati di questi esperimenti hanno confermato il fenotipo comportamentale osservato durante la configurazione rt-PP e quindi supportano l'implementazione combinatoria dei paradigmi RT-PP e NCP.
Figura 1: Test comportamentali con optogenetica nel paradigma RT-PP. (A) Rappresentazione schematica della linea temporale degli esperimenti. (B, C) In alto a sinistra: grafico che rappresenta la percentuale di tempo trascorso in ogni compartimento in tutto l'esperimento RT-PP per i topi DAT-Cre (N - 10) e VGLUT2-Cre (N - 7) iniettati con AAV-ChR2-eYFP. Cerchi blu: scomparto accoppiato al laser; bianchi, cerchi neri: scomparti principali; cerchi grigi: compartimento neutro. In alto a destra: percentuale media di tempo trascorso in ogni compartimento durante i giorni 3, 4, 6 e 7 (RT-PP). In basso: mappe di calore rappresentative del tempo trascorso in ogni scompartimento per un DAT-Cre e un mouse VGLUT2-Cre. Tutti i dati erano normalmente distribuiti (test Shapiro-Wilk). I risultati sono presentati come media : SEM. -p < 0,05,ss p < 0.01, s'è accoppiato a 0,001 interno vs vano neutro; N.p < 0.01, sezionep < 0.001 compartimento non accoppiato o neutro. Questa cifra è stata modificata da Bimpisidis etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Procedura chirurgica per esperimenti optogenetici. (A) Iniezione di vettore virale dipendente dal Cre nel VTA. (B) Impianto della fibra ottica sopra il sito di iniezione. Notare le viti di ancoraggio utilizzate per la stabilizzazione. (C) Ancoraggio permanente della fibra sul cranio con cemento dentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Attrezzature utilizzate negli esperimenti di optogenetica. (A) La scatola TTL utilizzata negli studi. Riceve l'input dal software di tracciamento e invia segnali TTL alla scheda microcontroller. (B) Vista anteriore (superiore) e posteriore (in basso) della sorgente laser utilizzata per gli esperimenti. (C) La scheda microcontrollore utilizzata per controllare la stimolazione laser. Notare le connessioni dalla casella TTL e alla sorgente laser. (D)Giunto del Rotary. (E) Accordo patch in fibra ottica utilizzato negli esperimenti. (F) L'apparato a tre compartimenti utilizzato per gli esperimenti RT-PP e NCP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Progettazione di arene e zone all'interno del software di monitoraggio. Passo 1: Calibrazione della configurazione. Fase 2: Disegno dell'intera arena. Fase 3: Disegno di zone all'interno dell'arena. Passaggio 4: Configurare la convalida. Passo 5: Scheda Impostazioni di controllo della prova per impostare i tempi e i parametri di stimolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Impostazione dei tempi e dei parametri di stimolazione di un esperimento RT-PP all'interno del software di monitoraggio. Aggiunta di regole specifiche per la durata (passaggio 1) e le condizioni per la stimolazione della luce (passaggio 2). Le condizioni possono essere facilmente modificate per adattarsi ai requisiti per la fase di inversione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Impostazione dei tempi e dei parametri di stimolazione degli esperimenti NCP all'interno del software di monitoraggio. La durata delle sessioni di stimolazione (passaggio 1) è simile a quelle per RT-PP, ma le condizioni per l'attivazione della stimolazione leggera (passaggio 2) sono diverse. L'ingresso in uno dei compartimenti principali (qui denominata zona A e zona B) provoca una stimolazione optogenetica che viene terminata solo quando il mouse entra nel compartimento neutro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Test comportamentali con optogenetica nel paradigma NCP. (A) Rappresentazione schematica dell'installazione sperimentale. (B) Sinistra: grafico che rappresenta la percentuale di tempo trascorso in ogni compartimento durante i due giorni di stimolazione (Stim1 e Stim 2) e durante la sessione di risposta condizionata (CR) per i topi VGLUT2-Cre iniettati con AAV-ChR2 nella VTA (N. 5). A destra: percentuale media di tempo trascorso in ogni compartimento durante i due giorni di stimolazione del PCN. (C) Mappa di calore rappresentativa del tempo trascorso in ogni compartimento per un topo VGLUT2-Cre durante uno dei giorni di stimolazione. I dati erano normalmente distribuiti (test Shapiro-Wilk). I risultati sono presentati come media : SEM. ,p < 0,05,p < 0,01, p< 0,001 non accoppiati rispetto a 1 accoppiati e compartimenti accoppiati a 2. Questa cifra è stata modificata da Bimpisidis etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passo | Temperatura | Durata | Cicli |
| 1. Denaturazione iniziale | 95 gradi centigradi | 4 min | 1 |
| 2. Denaturazione | 95 gradi centigradi | 30 s | 30 |
| 3. Analing | 55 gradi centigradi | 30 s | |
| 4. Estensione | 72 gradi centigradi | 40 s | |
| 5. Estensione finale | 72 gradi centigradi | 6 min | 1 |
| 6. Tenere premuto | 4 gradi centigradi | Fino a quando non si fermava dallo sperimentatore | 1 |
Tabella 1: Il programma di ciclismo PCR.
File di codifica supplementare. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Discussion
Nello studio attuale, presentiamo due protocolli passo-passo su come eseguire diversi tipi di analisi delle preferenze di luogo utilizzando l'optogenetica nei topi. I protocolli descritti sono stati utilizzati per valutare i fenotipi comportamentali gratificanti o avversi dei neuroni VTA (Figura 1 e Figura 6)12, ma possono essere utilizzati per esplorare il ruolo comportamentale dei neuroni anche in altre regioni del cervello.
Diversi studi recenti hanno descritto i paradigmi RT-PP in apparecchi a duescomparti 23,24 e tre compartimenti13,14,15,16,17,18. I protocolli attuali descrivono configurazioni dettagliate per i protocolli RT-PP e NCP in un apparato a tre compartimenti simile a quelli tradizionalmente utilizzati negli esperimenti CPP per valutare gli effetti comportamentali sulla somministrazione di droghe di abuso. Mentre i risultati sono presentati qui solo come la percentuale di tempo che il mouse ha trascorso in ogni compartimento, il software di monitoraggio consente l'analisi di diversi altri parametri comportamentali, come transizioni a zone, velocità, tempo trascorso immobile e altro ancora. L'analisi dei diversi parametri può essere importante per l'interpretazione dei dati.
Gli attuali protocolli RT-PP sono flessibili e possono essere modificati per verificare se diversi tipi di modelli di stimolazione hanno effetti gratificanti. I parametri del controllo laser possono essere facilmente modificati attraverso lo script della scheda microcontroller o all'interno del software di tracciamento, dimostrando la versatilità della configurazione. Suggeriamo una frequenza di stimolazione di 20 Hz che è all'interno della gamma, e talvolta più bassa, delle frequenze applicate negli studi precedenti utilizzando la stessa variante di opsina (ChR2/H134R) per studiare i neuroni dopaminergici e glutamatergici e i loro terminali13,14,16,17,18,23,24,25,26,27. Recenti studi hanno dimostrato che frequenze di stimolazione più elevate possono avere gli effetti opposti sul comportamento rispetto a quelle più basse, e che questi effetti sono mediati attraverso un blocco di depolarizzazione causato da frequenze più alte28. Allo stesso modo, differenze nella produzione comportamentale sono stati mostrati quando si stimolano i neuroni glutamatergici e GABAergici nella zona preoptica laterale15. Questi studi hanno esaminato neuroni di aree diverse rispetto al VTA e gli effetti più grandi sono stati osservati sulle alte frequenze dei neuroni non-glutamatergici15,28. La nostra scelta su 20 Hz si basa su studi precedenti di neuroni VTA glutamatergici e dopaminergici dimostrando che da frequenze di stimolazione variabile, la produzione comportamentale correlata alla ricompensa non è significativamente alterata24,26.
Un parametro aggiuntivo che può essere regolato e che può influenzare il risultato sperimentale è la potenza della fonte di luce. Una maggiore potenza laser può aumentare le dimensioni dell'area stimolata dalla luce, che può essere utile in alcuni tipi di esperimenti, ma con lo svantaggio di un aumento della temperatura5. Infatti, uno studio recente ha dimostrato che gli aumenti di temperatura indotti dal laser possono alterare la fisiologia cerebrale e influenzare le misurazioni comportamentali29. Queste osservazioni evidenziano l'importanza di includere controlli opsin-negativi nella progettazione sperimentale. Nel protocollo attuale, abbiamo usato 10 mW di potenza laser che è simile e ha dimostrato in precedenza di essere efficace nello stimolare i neuroni dopaminergici e glutamatergici nel VTA16,24,26. Quando si impostano esperimenti, è importante prestare attenzione alle dimensioni dell'area in cui si trovano le cellule di interesse e alle proprietà della fibra ottica e del cavo patch (apertura numerica, diametro del nucleo). Questi parametri sono essenziali da prendere in considerazione quando si eseguono calcoli relativi alla potenza del laser. Per i dettagli, è possibile utilizzare la calcolatrice sviluppata dal laboratorio di Karl Deisseroth (http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php).
La verifica istologica della ricombinazione Cre-Lox è un altro aspetto critico quando si applicano esperimenti di optogenetica. La convalida dell'efficienza di ricombinazione dovrebbe sempre avvenire in una coorte pilota prima dell'inizio di qualsiasi esperimento comportamentale in un grande gruppo di animali. Questo è importante per motivi etici ma anche per un output sperimentale ottimizzato. Ogni costrutto virale potrebbe mostrare specificità variabile per tipi neuronali distinti e in diverse regioni5, un parametro che può influenzare gli esperimenti in modi imprevedibili e persino fuorvianti. Per esempio, abbiamo già convalidato il modello di ricombinazione Cre-Lox dei virus AAV5 nella VTA dei topi DAT-Cre e abbiamo scoperto che le iniezioni unilaterali erano sufficienti per indirizzare la maggior parte dell'area di interesse. Quando abbiamo poi studiato sottopopolazioni spazialmente limitate all'interno del VTA, come quella caratterizzata dall'espressione NeuroD6, abbiamo osservato che le iniezioni virali bilaterali erano più efficienti per colpire un maggior numero di neuroni dando effetti comportamentali più pronunciati sulla stimolazione optogenetica della luce12. Inoltre, il tempo dalla chirurgia all'inizio degli esperimenti comportamentali deve essere affrontato con attenzione. Due settimane sono abbastanza tempo per un costrutto di DNA ChR2 da esprimere in corpi cellulari come vi mostriamo qui, ma potrebbero essere necessari tempi di attesa più lunghi (8 settimane) se lo sperimentatore sta testando l'effetto della stimolazione nelle aree di proiezione13,14,15,17.
Vale la pena notare che il volume del virus iniettato (nel nostro caso 300 nL) potrebbe essere adatto quando si studiano i neuroni nel VTA, ma il volume e il tire devono essere regolati a seconda dell'efficienza di trasduzione e delle dimensioni della struttura studiata. Inoltre, per le strutture bilaterali situate a distanza dall'asse mediolaterale, potrebbe essere necessario eseguire iniezioni bilaterali e impiantare anche le fibre ottica bilateralmente per garantire l'attivazione/inibizione in entrambi gli emisferi.
Infine, è sempre necessario eseguire analisi istologiche post-mortem per convalidare e confermare l'efficienza della ricombinazione Cre-Lox e per verificare il corretto sito di impianto della fibra ottica nella posizione prevista. Una ricombinazione Cre-Lox inaspettata, iperlimitata o eccessiva potrebbe verificarsi a causa di una distribuzione sconosciuta di neuroni che esprimono Cre al di fuori dei confini dell'area prevista, o a causa di differenze nel sierotipo del virus, scarsa gestione del virus, intasamento del virus siringa per la somministrazione di virus o altri problemi legati alla chirurgia. La verifica di una ricombinazione Cre-Lox soddisfacente e di una corretta impianto in fibra ottica deve essere eseguita per confermare eventuali risultati statistici delle valutazioni comportamentali al fine di trarre conclusioni sicure.
In termini di dati forniti qui come esempi di come i due paradigmi comportamentali possono essere utilizzati, la preferenza significativa al lato accoppiato alla luce ottenuto dalla stimolazione optogenetica dei neuroni dopaminergici nella VTA analizzando i topi DAT-Cre nel paradigma RT-PP era previsto sulla base dei risultati precedenti23,24,25,26,27 mentre l'elusione di questo lato da parte del VGLUT2 non era prevista. VGLUT2 neuroni del VTA e le loro proiezioni hanno dimostrato di essere coinvolti in ricompensa e avversione16,17 ,24,30,31, e quindi eseguito l'analisi NCP per valutare l'apparente comportamento di elusione osservato nell'attuale setup RT-PP in modo più dettagliato. Utilizzando il corridoio stretto e trasparente come unico compartimento accoppiato non leggero a confermare le proprietà avverse della stimolazione dei neuroni glutamatergici VTA, è evidente che in questa particolare configurazione a tre compartimenti, l'attivazione optogenetica di questi neuroni provoca una risposta avversa. Questi esperimenti, che sono stati mostrati qui per esemplificare situazioni che potrebbero trarre vantaggio dall'utilizzo di entrambi i protocolli RT-PP e NCP, facevano parte di uno studio pubblicato di recente, e il set di dati completo e le discussioni su questi risultati possono essere trovati nella presente pubblicazione12.
Oltre al NCP, modi alternativi per confermare l'avversione includono la forte illuminazione di un'area all'interno di un'area di campo aperto, mentre si associa il resto dell'arena all'attivazione laser, o eseguire un compito di evitamento attivo in cui il mouse deve eseguire uno specifico modello di comportamento per terminare la stimolazione laser15.
Per riassumere, i protocolli descritti forniscono informazioni critiche su come eseguire con successo l'analisi RT-PP e NCP nel modo più efficiente al fine di svelare il ruolo dell'attivazione neuronale in ricompensa e avversione. A seconda dell'ipotesi scientifica, una serie di parametri può essere analizzata utilizzando questi protocolli, e ogni protocollo può anche essere combinato con altri paradigmi convalidati per analisi comportamentali ottimizzate che implementano l'optogenetica per affrontare il cervello specifico aree e neuroni di interesse.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Le nostre fonti di finanziamento sono riconoscete con gratitudine: L'Università di Uppsala, Vetenskapsràdet (Consiglio svedese per la ricerca), Hjàrnfonden, Parkinsonfonden, le Fondazioni di ricerca di Bertil H'llsten, OE&Edla Johansson, zoologisk Forskning e . Gli animali sono stati tenuti presso l'Università di Uppsala e gli esperimenti sono stati effettuati presso l'Uppsala University Behavioral Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | - | a great variety of viruses to suit any project's needs |
| Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
| Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
| Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
| Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
| DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
| DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
| Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
| Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
| Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
| Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
| Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
| Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
| Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
| Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
| Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
| Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
| Nucleic Acid gel stain - GelRed | Biotium | 41003-T | |
| PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | |
| Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
| Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
| Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
| Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
| Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
| Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
| TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
| Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
| Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
| UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |
References
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The Development and Application of Optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34 (1), 389-412 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Pupe, S., Wallén-Mackenzie, Å Cre-driven optogenetics in the heterogeneous genetic panorama of the VTA. Trends in Neurosciences. 38 (6), 375-386 (2015).
- Spanagel, R. Animal models of addiction. Dialogues in Clinical Neuroscience. 19 (3), 247-258 (2017).
- Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), 227 (2007).
- Hoffman, D. C. The use of place conditioning in studying the neuropharmacology of drug reinforcement. Brain Research Bulletin. 23 (4-5), 373-387 (1989).
- Huston, J. P., Silva, M. A. D. S., Topic, B., Müller, C. P. What's conditioned in conditioned place preference? Trends in Pharmacological Sciences. 34 (3), 162-166 (2013).
- Bardo, M. T., Bevins, R. A. Conditioned place preference: What does it add to our preclinical understanding of drug reward? Psychopharmacology. 153 (1), 31-43 (2000).
- Bimpisidis, Z., et al. The NeuroD6 subtype of VTA neurons contributes to psychostimulant sensitization and behavioral reinforcement. eNeuro. 6 (3), e0066 (2019).
- Root, D. H., Mejias-Aponte, C. A., Qi, J., Morales, M. Role of Glutamatergic Projections from Ventral Tegmental Area to Lateral Habenula in Aversive Conditioning. Journal of Neuroscience. 34 (42), 13906-13910 (2014).
- Steidl, S., Wang, H., Ordonez, M., Zhang, S., Morales, M. Optogenetic excitation in the ventral tegmental area of glutamatergic or cholinergic inputs from the laterodorsal tegmental area drives reward. European Journal of Neuroscience. 45 (4), 559-571 (2017).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Wang, H. L., Qi, J., Zhang, S., Wang, H., Morales, M. Rewarding Effects of Optical Stimulation of Ventral Tegmental Area Glutamatergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 35 (48), 15948-15954 (2015).
- Qi, J., et al. VTA glutamatergic inputs to nucleus accumbens drive aversion by acting on GABAergic interneurons. Nature Neuroscience. 19, 725-733 (2016).
- Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nature Communications. 5, 5390 (2014).
- Ekstrand, M. I., et al. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (4), 1325-1330 (2007).
- Borgius, L., Restrepo, C. E., Leao, R. N., Saleh, N., Kiehn, O. A transgenic mouse line for molecular genetic analysis of excitatory glutamatergic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 45 (3), 245-257 (2010).
- Papathanou, M., et al. Targeting VGLUT2 in Mature Dopamine Neurons Decreases Mesoaccumbal Glutamatergic Transmission and Identifies a Role for Glutamate Co-release in Synaptic Plasticity by Increasing Baseline AMPA/NMDA Ratio. Frontiers in Neural Circuits. 12, 64 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. Boston, MA. (2008).
- Tsai, H. C., et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Pascoli, V., Terrier, J., Hiver, A., Lüscher, C. Sufficiency of Mesolimbic Dopamine Neuron Stimulation for the Progression to Addiction. Neuron. 88 (5), 1054-1066 (2015).
- Ilango, A., Kesner, A. J., Broker, C. J., Wang, D. V., Ikemoto, S. Phasic excitation of ventral tegmental dopamine neurons potentiates the initiation of conditioned approach behavior: parametric and reinforcement-schedule analyses. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 155 (2014).
- Kim, K. M., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PLoS ONE. 7 (4), 1-8 (2012).
- Kroeger, D., et al. Galanin neurons in the ventrolateral preoptic area promote sleep and heat loss in mice. Nature Communications. 9, 4129 (2018).
- Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22 (7), 1061-1065 (2019).
- Root, D. H., Estrin, D. J., Morales, M. Aversion or Salience Signaling by Ventral Tegmental Area Glutamate Neurons. iScience. 2, 51-62 (2018).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
