Summary
Hier stellen wir zwei einfach zu befolgende Schritt-für-Schritt-Protokolle für Ortspräferenzparadigmen mit Optogenetik bei Mäusen vor. Mit diesen beiden unterschiedlichen Setups können Präferenz- und Vermeidungsverhalten innerhalb desselben Geräts mit hoher räumlicher und zeitlicher Selektivität und auf einfache Weise solide beurteilt werden.
Abstract
Zu verstehen, wie neuronale Aktivierung zu einem spezifischen Verhaltensausgang führt, ist für die moderne Neurowissenschaft von grundlegender Bedeutung. Die Kombination von Optogenetik bei Nagetieren mit Verhaltenstests in validierten Paradigmen ermöglicht die Messung von Verhaltensfolgen bei der Stimulation unterschiedlicher Neuronen in Echtzeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Selektivität und damit die Etablierung von kausale nalitätsbeziehungen zwischen neuronaler Aktivierung und Verhalten. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein RT-PP-Paradigma (Real-Time Place Preference), eine modifizierte Version des klassischen konditionierten Platzpräferenztests (CPP). Der RT-PP wird in einem Drei-Kompartian-Gerät durchgeführt und kann verwendet werden, um zu beantworten, wenn die optogenetische Stimulation einer bestimmten neuronalen Population lohnend oder aversiv ist. Wir beschreiben auch eine alternative Version des RT-PP-Protokolls, das sogenannte Neutral Compartment Preference (NCP) Protokoll, das zur Bestätigung der Abneigung verwendet werden kann. Die beiden Ansätze basieren auf Erweiterungen der klassischen Methodik, die aus der Verhaltenspharmakologie und der jüngsten Umsetzung der Optogenetik im bereich der Neurowissenschaften stammen. Neben der Messung der Platzpräferenz in Echtzeit können diese Setups auch Informationen über konditioniertes Verhalten geben. Wir bieten einfach zu befolgende Schritt-für-Schritt-Protokolle neben Beispielen unserer eigenen Daten und diskutieren wichtige Aspekte, die bei der Anwendung dieser Arten von Experimenten zu berücksichtigen sind.
Introduction
Die Implementierung der Optogenetik, ein modernes neurowissenschaftliches experimentelles Werkzeug, bei dem Licht zur Steuerung der neuronalen Aktivität verwendet wird, hat in den letzten Jahren zu großen Fortschritten im Verständnis geführt, wie spezifische neuronale Populationen das Verhalten1,2,3beeinflussen. Die herausragende räumliche und zeitliche Selektivität der Optogenetik ermöglicht die Herstellung von kausalen Zusammenhängen zwischen Erregung oder Hemmung von Zellgruppen von Interesse und Verhaltensausgang2,3. Die räumliche Selektivität in der Optogenetik wird häufig durch das Cre-Lox-System gewährleistet, bei dem die Aktivität der Cre-Recombinase zur Rekombination aller DNA-Sequenzen zwischen Lox-Standorten führt, sogenannte Floxalllele (flankiert von Lox-Sites)4. Das Ziel mit der Verwendung des Cre-Lox-Systems in der Optogenetik ist es, die Expression von Allele zu erreichen, die optogenetische Opsine in bestimmten Neuronen von Interesse kodieren, während umliegende Neuronen frei von Expression bleiben. Opsine sind lichtempfindliche Proteine, die bei Lichtstimulation bestimmter Wellenlänge einen Ionenfluss ermöglichen, der die neuronale Erregbarkeit beeinflusst oder die zellulären Funktionen beeinflusst, indem sie nachgeschaltete Effektorbahnen modulieren. Neue Varianten von Opsinen, die sich in der Aktion unterscheiden (exzitatorisch, hemmend, modulatorisch), Mechanismus, Aktivierung durch Lichtwellenlänge und Kinetikeigenschaften5 werden kontinuierlich entwickelt, um den Bedürfnissen spezifischer experimenteller Ansätze gerecht zu werden. In Bezug auf die Erregbarkeit diktiert die Verwendung eines depolarisierenden oder hyperpolarisierenden Opsins die Aktivität der Neuronen (Erregung bzw. Hemmung) bei Lichtstimulation bei einer bestimmten Wellenlänge, die in das Gehirn abgegeben wird3.
Selektive Promotoraktivität leitet die Expression der Cre-Rekombination zu den Neuronen von Interesse. Durch die Implementierung eines floxierten Alleels des Opsins von Interesse wird cre-vermittelte Rekombination sicherstellen, dass das Opsin selektiv in Neuronen ausgedrückt wird, die Cre Recombinase3,6mitexprimieren. Diese Verwendung von Doppeltransgenen zur direkten räumlichen Selektivität hat sich in der Optogenetik als sehr effizient erwiesen. Während also die Lichtstimulation zur Aktivierung der Opsine weitgehend über eine intracerebral implantierte Optische Faser geliefert wird, die mit einer Lichtquelle (LED oder Laser)3verbunden ist, reagieren nur Neuronen, die sowohl Cre Recombinase als auch das Floxed Opsin-Allel exdrücken, auf diese Stimulation. Das Cre-Lox-System bei Nagetieren kann auf unterschiedliche Weise erreicht werden, indem nur Transgenen verwendet werden (sowohl Cre recombinase als auch das Floxed-Opsin-Konstrukt sind bei transgenen Tieren kodiert), nur virale Injektionen (DNA-Konstrukte für Cre-Recombinase und das Floxed-Opsin werden beide über einen Viralträger geliefert) oder eine Kombination aus beidemen (z. B. Cre Recombinase wird von einem transgenen Tier kodiert, das mit einem Virus injiziert wird, das das Floxed-Opsin-Konstrukt trägt)5. Das floxierte Opsin-DNA-Konstrukt wird in der Regel im Rahmen mit einem Reporter-Gen geklont, um die Visualisierung der Cre-vermittelten Rekombination in Gewebeabschnitten zu ermöglichen. Während Optogenetik auch bei Ratten durchgeführt werden kann, wurden die vorgestellten Protokolle für Mäuse erzeugt. Der Einfachheit halber werden Mäuse, die sowohl Cre Recombinase als auch das floxed opsin tragen, als "Optogenetik-Mäuse" bezeichnet. In den unten beschriebenen Protokollen wurden Optogenetik-Mäuse durch einen gemischten transgenen (Cre Recombinase unter Kontrolle von zwei verschiedenen Promotoren) und viral (mit einem Adeno-assoziierten Virus, AAV, erzeugt, um das Floxed-Opsin-DNA-Konstrukt - in unserem Fall ChR2/H134R) Ansatz zu liefern. Die Beschaffung und Pflege transgener Mauslinien ist ein wesentlicher Bestandteil der Methodik. Cre-Driver und floxed opsin transgene Mäuse können für jeden Zweck produziert werden, oder gekauft werden, wenn kommerziell verfügbar, wie eine Reihe von Viren tragen DNA-Sequenzen codierung Cre Recombinase und floxed Opsins in verschiedenen Formen.
Optogenetik in Verbindung mit Verhaltenstests hat sich als wertvolles Werkzeug erwiesen, um die Rolle von verschiedenen Hirnregionen oder diskreten neuronalen Populationen, in bestimmten Arten von Verhalten zu untersuchen. Im Kontext des belohnungsbezogenen Verhaltens hat die Optogenetik die Überprüfung früherer Erkenntnisse in den Bereichen Verhaltenspharmakologie und experimentelle Psychologie ermöglicht und auch eine neue Ebene der räumlich-zeitlich relevanten Zerlegung ermöglicht, wie bestimmte Neuronen das Verhalten beeinflussen. Eine Methode, die in mehreren Studien verwendet wurde, um das belohnungsbezogene Verhalten zu bewerten, ist eine modifizierte Version der klassischen Methode, die als Conditioned Place Preference (CPP) bekannt ist. Klassische CPP wurde verwendet, um die lohnenden oder aversiven Eigenschaften von Drogen des Missbrauchs durch ihre Fähigkeit zu induzieren Pavlovian Assoziationen mit Hinweisen der Umwelt7,8. In Pavlovian Begriffen, das Medikament ist ein unkonditionierter Stimulus, da es Ansatz oder Rückzug auslösen kann, wenn es lohnend oder aversiv ist, bzw.. Kontinuierliche Paarung des Medikaments mit verschiedenen neutralen Reizen, die selbst keine Reaktion hervorrufen, kann zu Annäherung oder Entzug nur nach Derart führen, aber nach der Paarung, so genannte konditionierte Reize9. Die CPP-Analyse wird in der Regel in einem Gerät durchgeführt, das zwei Fächer gleicher Größe enthält, wobei jedoch jedes Fach durch unterschiedliche Merkmale wie Bodenstruktur, Wandmuster und Beleuchtung (neutrale Reize) definiert ist. Die beiden Fächer sind entweder durch einen Korridor oder eine Öffnung zwischen den Fächern verbunden. Während der Konditionierung erhält das Subjekt, in der Regel ein kleines Nagetier, passive Injektionen eines Medikaments, während es auf eines der beiden Hauptfächer und die Saline beschränkt ist, während es auf das andere Fach beschränkt ist. Die lohnende Wirkung des Medikaments wird anschließend in einer drogenfreien Sitzung bewertet, wenn das Subjekt den gesamten Apparat frei erforschen darf. Die Zeit, die im zuvor medikamentösen Fach (die konditionierte Reaktion) verbracht wird, wird als Spiegellowsche Lernmechanismen zwischen den lohnenden Wirkungen des Medikaments und den Hinweisen des Mit seiner Verabreichung verbundenen Fachs(konditionierte Reize) betrachtet. Wenn das Tier mehr Zeit im drogengepaarten Fach verbringt, hat das Medikament eine konditionierte Platzpräferenz induziert, was bedeutet, dass es lohnende Auswirkungen auf das Verhalten hat. Auf der anderen Seite, wenn das Medikament als aversiv wahrgenommen wird, wird das Tier das medikamentöse Fach vermeiden und mehr Zeit im saline-gepaarten Fach verbringen, was auf konditionierte Ortsaversion (CPA)8,9,10,11hinweist.
Da die Optogenetik implementiert werden kann, um die neuronale Aktivität in "Echtzeit" zu steuern, ermöglicht die Verwendung eines Verhaltensparadigmas, das dem ähnelt, aber sich von dem unterscheidet, die Messung der Platzpräferenz bei direkter neuronaler Aktivierung. Optogenetik-gesteuerte Analyse der Ortspräferenz wird daher oft als RT-PP-Analyseparadigma (Real-Time Place Preference) bezeichnet. Im RT-PP-Paradigma ersetzt die optogenetische Stimulation verschiedener Neuronen über das Cre-Lox-System die systemische Abgabe eines Medikaments, das im klassischen CPP durchgeführt wird, so dass das RT-PP-Paradigma stattdessen misst, ob optogenetisch induzierte neuronale Stimulation als lohnend oder aversiv wahrgenommen werden. Die aktuelle Beschreibung wird sich auf optogenetische Mäuse konzentrieren, aber auch optogenetische Ratten können mit ähnlichen Protokollen getestet werden.
Anstatt sich wie im klassischen CPP-Paradigma auf ein Fach zu konditionieren, darf sich die Optogenetikmaus im RT-PP-Paradigma frei im gesamten Apparat bewegen und das Verhalten wird während der gesamten Sitzung aufgezeichnet. Der Eintritt in eines der Fächer ist mit intrakranieller Lichtstimulation gepaart. Unter geeigneten Lichtstimulationsparametern werden dabei Neuronen aktiviert, die ein erregendes Opsin ausdrücken. Wenn die Lichtstimulation als lohnend empfunden wird, bleibt die Optogenetik-Maus im lichtgepaarten Fach, während die Maus, wenn die Lichtstimulation als aversiv wahrgenommen wird, das Fach verlässt, um der Stimulation zu entkommen. Diese Art der Analyse ermöglicht die Beurteilung des kontingenten Lernens: Das Subjekt kann Lichtstimulation und damit neuronale Aktivierung auslösen, indem es ein Fach betritt, und die Stimulation durch Verlassen des Fachs stoppen, ähnlich wie beim Hebeldrücken während einer instrumentalen Aufgabe. Darüber hinaus können assoziative Lernmechanismen in nachfolgenden Sitzungen bewertet werden, bei denen die in jedem Fach verbrachte Zeit in Ermangelung einer Stimulation gemessen wird. Auf diese Weise kann der Forscher zwischen den unmittelbar lohnenden Wirkungen bei der Stimulation der Neuronen von Interesse und der damit verbundenen assoziativen Gedächtnisbildung dissoziieren12.
In der aktuellen Studie beschreiben wir zwei Schritt-für-Schritt-Setup-Protokolle für optogenetics-gesteuertes Ortspräferenzverhalten frei beweglicher Mäuse. Das erste Protokoll beschreibt RT-PP innerhalb eines Drei-Kompartianten-Geräts und wurde auf der Grundlage der Protokolle skizziert, die kürzlich von Root und Kollegen 13 und anderen Autoren12, 14,15,16,17,18vorgestellt wurden. Das Experiment besteht aus zwei Phasen, die mehrere tägliche Sitzungen umfassen (siehe Abbildung 1A). Jede Sitzung ist für verschiedene Zwecke ausgelegt und die Parameter der Kopplungsstimulation mit einem Fach werden entsprechend geändert. Die erste Sitzung, der "Pretest", wird verwendet, um die anfängliche Präferenz des Subjekts für eines der Fächer zu bewerten. Während der Verbindung mit dem Patchkabel ist es dem Subjekt erlaubt, das Gerät frei zu erkunden, wenn es 15 min lang keine Stimulation gibt. Wenn die anfängliche Präferenz für ein Fach mehr als 80 % beträgt, wird die Maus von der Analyse ausgeschlossen, da die anfängliche Seitenverzerrung die Analyse verzerren könnte. Nach dem "Pretest" beginntPhase 1. Der erste Teil besteht aus zwei aufeinanderfolgenden, täglichen, 30 min Sitzungen von "RT-PP". Während phase1wird die Optogenetik-Maus über das Patchkabel mit der Laserquelle verbunden und in der Arena platziert, um sie frei zu erkunden. Die Maus erhält eine intrakranielle Laserstimulation beim Eintritt in eines der Hauptfächer. Pilotexperimente können durchgeführt werden, um zu bestimmen, welches Fach als lasergekoppelt und welches als ungepaart zugeordnet wird. Wenn sich die Stimulation als lohnend erweist, wird der Laser während des "Pretests" an das am wenigsten bevorzugte Fach gekoppelt und an den am meisten bevorzugten, wenn die Stimulation aversiv ist. Somit folgt das vorgestellte RT-PP-Protokoll einem voreingenommenen Design in dem Sinne, dass die Laserstimulation keinem der beiden Hauptfächer zufällig zugeordnet wird (unvoreingenommenes Design), sondern gewählt wird, um jede anfängliche Präferenz der Maus zu vermeiden. Der Eintritt in das andere Hauptfach oder das neutrale Fach, das die beiden Hauptfächer verbindet, führt nicht zu einer intrakraniellen Lichtstimulation und ist daher nicht lichtgepaart. Diese Sitzungen ermöglichen eine Echtzeit-Bewertung der lohnenden oder aversiven Eigenschaften der Stimulation bestimmter neuronaler Populationen. Am letzten Tag der Phase1findet eine 15-min-Sitzung ohne Stimulation statt. Diese Sitzung dient dazu, konditionierte Antworten ("CR") zu adressieren, die sich aus dem assoziativen Lernen zwischen der Stimulation und der Umgebung ergeben, in der sie empfangen wurde. Mindestens drei Tage nach Phase1findet die "Reversal Phase" statt, die der gleichen Struktur wie Phase1folgt, aber das bisher nicht gepaarte Hauptfach ist nun mit Lichtstimulation gepaart. Wie im Fall vonPhase 1folgen auf die beiden Stimulationssitzungen eine "CR"-Sitzung. Die "Umkehrphase" wird verwendet, um zu bestätigen, dass das Verhalten der Maus von der optogenetischen Stimulation abhängig ist und nicht mit zufälligen Parametern zusammenhängt. Jede Sitzung des RT-PP-Experiments muss innerhalb der Tracking-Software separat programmiert werden. Das aktuelle Protokoll beschreibt solche Einstellungen innerhalb einer bestimmten Software, aber jede andere Tracking-Software, die transistor-transistor-logic (TTL) Modulationssignale an die Lichtquelle senden kann, kann verwendet werden.
Das zweite Protokoll beschreibt ein neuartiges Setup, das als NCP-Paradigma (Neutral Compartment Preference) bezeichnet wird. Dieses modifizierte Protokoll des RT-PP nutzt die geringe Größe und Transparenz des Verbindungskorridors, der durch die Maus aufgrund seiner engen und transparenten Zusammensetzung natürlich vermieden wird. Durch die Kopplung beider Hauptfächer mit Lichtstimulation und nur das Verlassen des Korridors frei von Lichtstimulation, kann das NCP-Setup verwendet werden, um zu testen, ob die optogenetische Stimulation die Maus zwingt, mehr Zeit im Korridor zu verbringen, um den Empfang zu vermeiden optogenetische Stimulation. Durch den Vergleich der Zeit, die in den beiden lichtgepaarten Fächern verbracht wird, mit der Zeit, die im Korridor verbracht wird, kann eine Überprüfung der optogenetisch induzierten Abneigung vorgenommen werden. Das NCP-Experiment besteht aus zwei aufeinanderfolgenden täglichen Sitzungen, bei denen Optogenetik-Mäuse Stimulation erhalten (jeweils 30 min), um Präferenzen in Echtzeit zu messen, und einer laserfreien Sitzung (15 min), um konditionierte Reaktionen ähnlich wie im RT-PP zu bewerten. Protokoll.
Die unten aufgeführten RT-PP- und NCP-Protokolle wurden kürzlich in unserem Labor validiert, um zu untersuchen, wie verschiedene Arten von Neuronen im ventralen Tegmentalbereich (VTA) an verschiedenen Aspekten des belohnungsbezogenen Verhaltens beteiligt sind12. Hier wurden zum Beispiel die Implementierung der RT-PP- und NCP-Protokolle, Dopamin-Transporter (DAT)-Cre19 und vesikulärer Glutamattransporter 2 (VGLUT2)-Cre20 transgene Mäuse stereotaktisch mit AAV injiziert, die ein Floxed Channelrhodopsin2 (ChR2) DNA-Konstrukt in das VTA trugen, woraufhin eine Glasfaser über dem VTA implantiert wurde. Verhaltensreaktionen, die bei der Analyse dieser Mäuse mit den bereitgestellten RT-PP- und NCP-Protokollen erzielt wurden, zeigen, wie die Aktivierung von dopaminergen und glutamatergen Neuronen innerhalb des VTA zu unterschiedlichen Verhaltensreaktionen führt (Abbildung 1).
Schritt-für-Schritt-Protokolle für RT-PP- und NCP-Paradigmen werden mit Informationen bereitgestellt, die von der Genotypisierung transgener Mäuse, stereotaxic-Virusinjektionen und der Platzierung von Fiberoptik bis hin zur Programmierung von Tracking-Software für Lasersteuerung und Verhaltenstherapie reichen. Bewertung. Darüber hinaus werden Vorschläge für Änderungen des Protokolls in Bezug auf Stimulationsparameter und experimentelle Aspekte diskutiert, die das wissenschaftliche Ergebnis beeinflussen können. Während Protokolle im Kontext des VTA beschrieben werden, können sie auf jedes Gehirngebiet oder jede neuronale Population angewendet werden, vorausgesetzt, die relevanten Optogenetik-Tools, wie relevante Cre-Driver und Floxed Opsins, sind verfügbar.
Protocol
Diese Studie wurde mit heterozygoten DAT-Cre19 und VGLUT2-Cre20 Mäusen beiderlei Geschlechts durchgeführt, im Alter von >8 Wochen und einem Gewicht von >20 g. Alle Experimente wurden gemäß dem schwedischen (Animal Welfare Act SFS 1998:56) und den Rechtsvorschriften der Europäischen Union (Übereinkommen ETS 123 und Richtlinie 2010/63/EU) mit Genehmigung der örtlichen Tierethikkomitees durchgeführt.
1. Genotypisierung von Mäusen
- Nehmen Sie Ohrbiopsien mit einem Ohr-Puncher für die Genotypisierung der transgenen Mäuse zu verwenden.
- Bereiten Sie die Ohrstanzen vor, um eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit speziell erstellten Primern durchzuführen.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden cre-gerichtete Primer verwendet.- Fügen Sie in jedem 1,5 ml-Rohr mit einem Ohrstanz 75 l Lysepuffer (Puffer 1: 250 mM NaOH, 2 mM EDTA) hinzu.
- Inkubieren Sie in einem Heizblock bei 96 °C für 30 min.
- Lassen Sie die Proben 5 min abkühlen und fügen Sie dann 75 l des Neutralisationspuffers hinzu (Puffer 2: 400 mM Tris-HCl pH 8.0).
- PCR nach den Standardverfahren12,21 mit den entsprechenden Primern durchführen (hier: Cre FW 5'-ACGAGTGATGAGGGCGCAAGA-3', Cre REV 5'-ACCGACGATGAAGCATGTTTAG-3').
VORSICHT: Arbeiten Sie auf Eis unter einer PCR-Haube und achten Sie darauf, die Reagenzien und Proben nicht zu kontaminieren.- Bereiten Sie den PCR-Master-Mix vor. Multiplizieren Sie die folgenden Volumina entsprechend der Menge der Zuanalyseproben, einschließlich geeigneter Kontrollproben. Mischen Sie die Reagenzien für eine einzelne 25-L-Endvolumenreaktion in folgender Reihenfolge: destilliertes Wasser (18,9 l), 10x Puffer mit MgCl2 (2,5 l), 10 mM dNTP-Mischung (0,5 l), 10 -M-Vorwärtsprimer (1 l), 10 -M-Reverse-Primer (1 l), 5 U/L-DNA-Polymerase (0,1 l) und Vorlagen-DNA (1 l; werden in den nächsten Schritten hinzugefügt).
HINWEIS: Fügen Sie immer ein negatives, ein positives und ein leeres (ohne Vorlagen-DNA) Steuerelement hinzu, um gültige Ergebnisse zu gewährleisten. - Fügen Sie 24 L Master-Mix in PCR-Röhren hinzu.
- Fügen Sie in jeder PCR-Röhre 1 L Vorlagen-DNA (aus dem Ohrstanz von jeder Maus) hinzu.
- Zentrifugieren Sie die PCR-Röhren kurz, um sicherzustellen, dass sich die Vorlagen-DNA im Master-Mix befindet.
- PCR mit einem Thermocycler mit dem Fahrradprogramm in Tabelle 1durchführen.
- Bereiten Sie den PCR-Master-Mix vor. Multiplizieren Sie die folgenden Volumina entsprechend der Menge der Zuanalyseproben, einschließlich geeigneter Kontrollproben. Mischen Sie die Reagenzien für eine einzelne 25-L-Endvolumenreaktion in folgender Reihenfolge: destilliertes Wasser (18,9 l), 10x Puffer mit MgCl2 (2,5 l), 10 mM dNTP-Mischung (0,5 l), 10 -M-Vorwärtsprimer (1 l), 10 -M-Reverse-Primer (1 l), 5 U/L-DNA-Polymerase (0,1 l) und Vorlagen-DNA (1 l; werden in den nächsten Schritten hinzugefügt).
- Bereiten Sie ein Agarose-Gel vor, um die Proben mit Elektrophorese auszuführen.
HINWEIS: Die Größe hängt von der Anzahl der zu analysierenden Proben ab.- 1% w/v Agarosepulver in 1x Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer in einer Glasflasche zugeben. In der Mikrowelle erhitzen, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist, und überprüfen Sie regelmäßig, ob sie nicht überkocht.
VORSICHT: Vorsicht: Vorsicht, um Verbrennungen zu vermeiden. - Lassen Sie das Gel auf ca. 50 °C abkühlen und fügen Sie einen Nukleinsäure-Gelfleck (0,5 l/50 ml Gel) hinzu.
- Gießen Sie das Gel in das Gießtablett mit Brunnenkämmen und lassen Sie es bei Raumtemperatur, bis es vollständig erstarrt. Entfernen Sie die Kämme vorsichtig.
- Füllen Sie den Elektrophoresetank mit 1x TAE Puffer und legen Sie das Gel in den Tank.
- Fügen Sie in jeder der DNA-Proben 2 l 1x DNA-Ladefarbstoff hinzu.
- Laden Sie 4 l DNA-Leiter in den ersten Brunnen des Gels, dann fahren Sie fort, das volle Volumen der Proben in die verbleibenden Brunnen zu laden.
- Stellen Sie die Stromquelle der Elektrophorese auf 140 V und laufen Sie für 25 bis 30 min.
- Legen Sie das Gel unter eine UV-Quelle und machen Sie ein Bild der Ergebnisse.
- 1% w/v Agarosepulver in 1x Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer in einer Glasflasche zugeben. In der Mikrowelle erhitzen, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist, und überprüfen Sie regelmäßig, ob sie nicht überkocht.
2. Stereotaxie Chirurgie
- Nach der Genotypisierung, separate Mäuse halten die positiv für Cre. Warten Sie, bis sie mindestens 8 Wochen alt sind und wiegen >20 g, um eine Operation durchzuführen.
- Sanitisieren Sie die Umgebung und sterilisieren Sie die chirurgischen Werkzeuge, um eine Operation unter aseptischen Bedingungen durchzuführen.
- Injizieren Sie die Mäuse subkutan mit Analgetika 30 min vor der Operation.
- Anästhesisieren Sie die Mäuse mit Isofluran (2-3% in normaler Luft zur Induktion und 1,5 bis 2,0% zur Aufrechterhaltung der Anästhesie). Sicherstellen, dass ein angemessenes Anästhesieniveau erreicht wird, indem das Fehlen von Schmerzreflexen durch sanftes Kneifen der Maus getestet wird. Passen Sie die Isofluran-Lieferung entsprechend an.
- Legen Sie die Maus auf das stereotaxic Gerät. Fügen Sie Augenschmierstoff hinzu, um Augenläsion durch Trockenheit zu verhindern und rasieren Sie die Haare der Oberseite des Schädels. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Temperatur der Maus stabil zu halten.
- Injizieren Sie 100 l Lokalanästhetikum unter die Schädelhaut und lassen Sie 5 min wirkung.
- Bereiten Sie die Einschnittstelle durch drei kreisförmige Anwendungen von Alkohol oder steriler Salzin abwechselnd mit Jod vor. Verwenden Sie eine sterile Baumwollspitze und initiieren Sie die Anwendung von der Einschnittlinie nach außen.
- Heben Sie die Haut vorsichtig mit Dereins, und machen Sie einen Schnitt von 1,5 cm entlang der rostrocaudalen Achse mit chirurgischer Schere, um die Oberfläche des Schädels zu offenbaren.
- Mit einem Baumwollstab, wenden Sie H2O2 Lösung, um das Periost zu entfernen.
- Spülen Sie den Schädel mit steriler Saline und trocknen Sie ihn mit sterilen Baumwollspitzenapplikatoren.
- Finden Sie die Bregma und Lambda.
- Stellen Sie die flache Schädelausrichtung sicher, indem Sie die Spitze der Injektionsnadel, die am stereotaxic-Rahmen angepasst ist, auf Bregma und Lambda positionieren. Messen Sie die ventralen Koordinaten für jede Position und vergleichen Sie sie. Wenn der Schädel flach ist, ist die ventrale Koordinate für Bregma und Lambda identisch. Wenn nicht, stellen Sie die Kopfposition ein und nehmen Sie die Messungen erneut vor.
- Finden und markieren Sie die Position (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm von Bregma nach Franklin und Paxinos22), wo die Injektion des Cre-abhängigen Virus und die Implantation der Optischen Faser stattfinden und ein kleines Loch mit einem Mikrobohrer bilden.
- Laden Sie 400 nL Virus in die 10-L-Spritze, die mit einer Präzisionspumpe auf dem Stereotaxic-Gerät montiert ist.
- Die Nadel (34 G, abgeschrägt) vorsichtig senken und 300 nL des cre-abhängigen optogenetischen Virus (AAV5-EF1a-DIO-ChR2(H134)-eYFP [5,6 x 1012 vg/mL]) in den VTA injizieren (AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm von Bregma und -4,4 mm von der Schädeloberfläche, nach Franklin und Paxinos22) bei 100 nL/min Einspritzrate mit der Präzisionspumpe.
- Nach der Injektion die Nadel für weitere 10 min an Ort und Stelle lassen, um eine Diffusion des Virus zu ermöglichen (Abbildung 2A).
- Ziehen Sie die Nadel langsam von der Injektionsstelle ein.
- Machen Sie kleine Löcher mit einem Mikrobohrer, um Ankerschrauben zu montieren, die die Glasfaser und Zahnzement-Komplex stabilisieren.
- Nehmen Sie die Bregma-Koordinaten erneut und implantieren Sie die Glasfaser (200 m Durchmesser, 0,37 NA) bei: AP: -3,45 mm, ML: -0,2 mm von Bregma und -4,0 mm von der Schädeloberfläche (Abbildung 2B) nach Franklin und Paxinos22.
- Sichern Sie die Faser auf dem Schädel mit Zahnzement. Tragen Sie genug Zement um die Glasfaserferule auf, um sie am Schädel zu befestigen, aber achten Sie darauf, 3 x 4 mm der Oberseite der Ferule zementfrei zu lassen, um den Anschluss des Pflasterkabels zu ermöglichen (Abbildung 2C).
HINWEIS: Achten Sie darauf, das Loch nicht mit Zement zu füllen, da dies Hirngewebeschäden verursachen kann. Hemostatische Materialien können in das Loch hinzugefügt werden, um dies zu verhindern. - Verwenden Sie Gewebekleber oder resorbierbare Nähte, um jede offene Wunde zu schließen und das Tier für mindestens zwei Wochen zu erholen. Geben Sie nach der Operation eine zusätzliche Dosis Analgetika 12 bis 24 h.
3. Einrichten der Steuerung der Laserquelle
- Verwenden Sie Einplatinen-Mikrocontroller, um die Laserquelle zu steuern. Schreiben Sie ein Skript mit der entsprechenden Software. Laden Sie das Skript über das entsprechende Verbindungskabel zum Computer auf die Mikrocontrollerplatine.
HINWEIS: Das Skript sollte externe Modulation (Eingang) von der Tracking-Software über eine TTL-Box und eine Ausgabe an den Laser enthalten, um Stimulationsparameter zu steuern. Für 10 ms Pulsbreite bei 20 Hz Frequenz, verwenden Sie das Skript in der Supplemental Coding Filegefunden . - Schließen Sie das Board an den Laser und die TTL-Box der Tracking-Hardware an.
- Verwenden Sie ein Netzwerkkabel, um die TTL-Box mit der Platine zu verbinden (Pin 5 für das bereitgestellte Skript) (Abbildung 3A,C).
- Stellen Sie sicher, dass der Laser durch externe Modulation gesteuert wird, und schließen Sie den Laser über ein FC/PC-Kabel (Pin 13 für das angegebene Skript) an die Platine an (Abbildung 3B,C).
- Schließen Sie die entsprechenden Stifte an geerdete Teile der Platine an.
- Verbinden Sie die Laserquelle mit der Glasfaser.
- Verbinden Sie die Laserquelle mit einem Drehgelenk (Abbildung 3D).
- Schließen Sie ein Patchkabel (Abbildung 3E) an das Drehgelenk an.
- Stabilisieren Sie das Drehgelenk über dem Gerät, aber außerhalb des Aufnahmebereichs. Stellen Sie sicher, dass die Länge des Glasfaser-Patchkabels geeignet ist, damit sich die Maus in der Arena problemlos bewegen kann (Abbildung 3F).
4. Einrichten des Experiments für den RT-PP-Ansatz innerhalb der Tracking-Software
- Kalibrieren Sie den Arena-Setup. Verwenden Sie ein Lineal, um einen bestimmten Teil des physikalischen Geräts zu messen, zeichnen Sie eine Linie, die dem Teil entspricht, der auf dem Bild innerhalb der Software unter der Registerkarte Draw Scale to Calibrate gemessen wird, und geben Sie den bereits bekannten Wert ein (Schritt 1 in Abbildung 4).
- Gestalten Sie die Arena. Zeichnen Sie den Bereich, in dem die Bewegung der Mäuse aufgezeichnet wird (Schritt 2 in Abbildung 4).
- Erstellen Sie die Zonen. Zeichnen Sie die Zonen, die schließlich als lasergekoppelt, laserungepaart und "neutral" zugewiesen werden (Schritt 3 in Abbildung 4).
- Überprüfen Sie die Einrichtung, um sicherzustellen, dass keine widersprüchlichen Parameter vorhanden sind, z. B. Zonen außerhalb der Arena (Schritt 4 in Abbildung 4)
- Legen Sie die experimentellen Parameter unter den Einstellungen für die Registerkarten-Teststeuerung fest (Schritt 5 in Abbildung 4).
- Legen Sie die Testzeit wie in Schritt 1 in Abbildung 5 für eine 30 min RT-PP-Sitzung dargestellt fest.
- Stellen Sie sicher, dass "Hardware-Steuerung" aktiviert ist, weisen Sie ein Fach als lasergekoppelt zu, in dem die Eingabe der Maus ein TTL-Signal über die Tracking-Software an die Mikrocontrollerplatine auslöst. In Abbildung 5 (Schritt 2) befindet sich das lasergekoppelte Fach fach A. Für die Umkehrphase, schalten Sie die Fächer, so dass Fach B wird lasergekoppelt und Fach A wird entkoppelt werden. Ersetzen Sie dies durch A durch B und B durch A in der Software.
5. Änderung des Setups, um die aversiven Eigenschaften der Stimulation mit dem NCP-Ansatz zu testen
- Führen Sie die Schritte 4.1-4.4 wie zuvor beschrieben aus.
- Stellen Sie die Zeit des Experiments über die Option "Repeat till" in den Einstellungen des Feldes "Referenz" auf 30 minuten fest (Schritt 1 in Abbildung 6).
- Weisen Sie sowohl A- als auch B-Zonen als lasergekoppelt zu (Schritt 2 in Abbildung 6), indem Sie "wenn sich der Mittelpunkt in einer Zone A und Zone B befindet" für das Bedingungsfeld hinzufügen, das sich auf die Einstellungen für A- und B-Fächer bezieht. Beachten Sie, dass sich der Laser ausschaltet, wenn sich das Tier im neutralen Fach befindet.
6. Durchführen eines Experiments mit Laserstimulation
- Richten Sie die Erkennungseinstellungen ein.
- Verwenden Sie einen Dummy, um der Maus zu ähneln, um die entsprechenden Erkennungseinstellungen sicherzustellen.
- Legen Sie den Dummy in ein Fach des Geräts und verwenden Sie automatisiertes Setup mit dynamischer Subtraktion.
- Entfernen Sie den Dummy und legen Sie ihn in das gegenüberliegende Fach. Stellen Sie sicher, dass der Dummy vollständig erkannt wird, und wenn nicht, passen Sie die Einstellungen über die Software an, um eine ordnungsgemäße Erkennung zu erreichen.
- Prüfen Sie in diesem Schritt auch, ob die Stimulation so funktioniert, wie sie soll. Beginnen Sie die Erfassung mit den zuvor konfigurierten Teststeuerungseinstellungen und legen Sie den Dummy in das lasergekoppelte Fach und sehen Sie, ob die Stimulation wie geplant ausgelöst wird. Legen Sie dann die Attrappe in das ungepaarte und/oder neutrale Fach und sehen Sie, ob die Stimulation gestoppt wird.
- Verwenden Sie einen Leistungsmesser mit einem Sensor, um die Laserleistung mit dem Knopf am Laser auf 10 mW einzustellen (Abbildung 3B). Führen Sie diesen Schritt jedes Mal durch, wenn eine Laserstimulation verwendet wird.
VORSICHT: Verwenden Sie schützende Augenausrüstung, da die direkte Exposition gegenüber Laserlicht zu dauerhaften Augenschäden führen kann. - Legen Sie die Maus in das Gerät.
- Nehmen Sie die Maus vorsichtig aus ihrem Käfig und verbinden Sie das Glasfaserimplantat mit einer Keramikhülse an das Glasfaser-Patchkabel.
- Legen Sie die Maus sanft in das neutrale Fach des Drei-Fach-Geräts.
- Warten Sie, bis die Maus von der Software erkannt wird.
- Entfernen Sie die vertikalen Schiebetüren, die das Tier am Betreten der Hauptfächer hindern.
- Lassen Sie das Tier frei und ohne Störungen erkunden.
HINWEIS: Das gleiche Verfahren wird befolgt, wenn das Tier keine Stimulation erhält, mit der Ausnahme, dass Schritt 6.2 nicht benötigt wird und der Laser die ganze Zeit ausgeschaltet ist.
Representative Results
Das Drei-Kompartier-Gerät (Abbildung 3F) eignet sich, um die lohnenden Wirkungen von Medikamenten zu adressieren und in Echtzeit die lohnenden oder aversiven Eigenschaften der direkten Stimulation von Neuronen mittels Optogenetik zu beurteilen. Es besteht aus zwei Hauptfächern (20 cm [B] x 18 cm [L] x 25 cm [H]) und einem kleineren Anschlussfach (20 cm [B] x 7 cm [L] x 25 cm [H]). Die Hauptfächer haben unterschiedliche Wand- und Bodenstruktur und Muster, um assoziatives Lernen zu erleichtern, während das Verbindungs-/Neutralfach schmal und transparent ist, so dass die Mäuse natürlich weniger Zeit darin verbringen. Wie oben beschrieben, kann die Tracking-Software verwendet werden, um mehrere Verhaltensparameter der Mäuse aufzuzeichnen, einschließlich Bewegung und Zeit, die in jedem Fach verbracht wird, und um die Laserstimulation zu steuern. Das gesamte RT-PP-Experiment findet während 8 Sitzungen statt (Abbildung 1A) und ermöglicht sowohl die Beurteilung der lohnenden oder aversiven Eigenschaften der direkten Stimulation (Tage 3, 4, 6 und 7) als auch die Bildung von Assoziationen, positiv oder negativ, als Reaktion auf frühere Erfahrungen (Tage 5 und 8, "CR").
Zunächst haben wir DAT-Cre-Mäuse getestet, die mit dem AAV-ChR2-eYFP-Virus im VTA injiziert wurden, um dopaminerge Neuronen ins Visier zu nehmen. In Übereinstimmung mit der Literatur, wir beobachteten, dass die Mäuse es vorzogen, Zeit im Fach zu verbringen, gepaart mit der Stimulation(Abbildung 1B,Phase 1, Tage 3 und 4, blaue Kreise, zweiseitig wiederholte Messungen [RM] Varianzanalyse [ANOVA], Wirkung des Fachs F(2,18) = 141, p < 0,001; Wirkung von Sitzung x Fach F(12,108) = 42,1, p < 0,001; Tukeys Post-hoc-Test gepaart gegen ungepaart p < 0.001). Die Umkehrphase, in der die Paarung der Fächer mit der Laserstimulation umgeschaltet wurde, bestätigte diese Beobachtungen(Abbildung 1B, Tage 6 und 7, blaue Kreise, Tukeys Post-hoc-Test gepaart vs. ungepaartes Fach p < 0.001) und schloss somit aus, dass die Ergebnisse aus Phase 1 mit Seitenverzerrungen oder zufälligen Parametern zusammenhängten. Die durchschnittliche Zeit, die während der vier Tage von RT-PP in jedem Fach verbracht wurde, bestätigte, dass die Mäuse im Durchschnitt etwa 70 % ihrer Zeit im Laserpaarfach verbrachten, im Gegensatz zu den ungepaarten (20 %) und die neutrale (ca. 10%) (Abbildung1B-Bar-Diagramm, einwegig RM ANOVA, Stimulationseffekt F(2,6) = 139, p < 0,001, Tukeys Beitrag wie gepaart vs. ungepaart und neutrale Fächer p < 0.001). Darüber hinaus verbrachten die Mäuse in Ermangelung einer Stimulation an den Tagen 5 und 8 deutlich mehr Zeit im Fach, das zuvor mit Laserstimulation gepaart war (Tukeys post hoc p < 0.001), was darauf hindeutet, dass die bisherigen Erfahrungen ausreichten, um assoziative Lernverhalten auszulösen, das als "Suche" der Stimulation reflektiert wurde. Diese Daten entsprechen der Literatur und zeigen, dass die aktuelle Methode zuverlässig eingesetzt werden kann, um die lohnenden Wirkungen optogenetischer Stimulation bestimmter neuronaler Populationen im VTA zu untersuchen.
Anschließend testeten wir VGLUT2-Cre-Mäuse, die mit AAV-ChR2-eYFP in der VTA injiziert wurden, wie oben, um glutamaterge Neuronen des VTA anzuvisieren. In diesem Experiment beobachteten wir einen entgegengesetzten Verhaltens-Phänotyp von dem, der von den DAT-Cre-Mäusen nachgewiesen wurde. So vermieden die Mäuse das mit der Stimulation gekoppelte Fach und verbrachten während aller RT-PP-Tage mehr Zeit in der Ungepaartung(Abbildung 1C links, zweiseitig RM ANOVA, Wirkung des Fachs F(2,12) = 40,9, p < 0,001; Wirkung von Sitzung x Fach F(12,72) = 16,1, p < 0,001; Tukeys Post-hoc-Test gepaart vs ungepaart p < 0.001; Abbildung 1C rechts, einseitiger RM ANOVA-Effekt der Stimulation F(2,6) = 162, p < 0,001, Tukeys Post-hoc-gekoppelte vs. ungepaarte und neutrale Fächer p < 0.001). Interessanterweise zeigten die Mäuse während der "CR" Tage 5 und 8 keine klare Vermeidung des zuvor gepaarten Fachs (keine Unterschiede zwischen gepaarten und ungepaarten Fächern). Es ist möglich, dass der Mangel an konditionierten Reaktionen auf unzureichende Zeit im Laser-Paarfach zurückzuführen ist, die die Bildung von Assoziationen zwischen laseraktivierung und der besonderen Umgebung verhindert, in der dies stattfand. Um diesen Vermeidungs-Phänotyp weiter zu erforschen, verwendeten wir ein modifiziertes Protokoll, das wir "neutrale Kompartimentpräferenzung" nannten, abgekürzt NCP. In diesem Experiment wurden beide Hauptfächer mit Stimulation gepaart und das neutrale Fach blieb stimulationfrei (Abbildung 7A). Wir vermuteten, dass, wenn die Stimulation aversive Eigenschaften hat, dann wird die Maus gezwungen sein, Zeit im kleineren, neutralen Fach zu verbringen, um es zu vermeiden. Tatsächlich verbrachten die Mäuse an beiden Tagen der Stimulation (Stim1 und Stim2) die meiste Zeit im neutralen Fach (ca. 80%) im Vergleich zu den gepaarten Fächern(Abbildung 7B,C; links: Zwei-Wege-RM ANOVA-Effekt des Fachs F(2,8) = 70,9, p < 0.001; Wirkung von Sitzung x Fach F(4,16) = 6,9, p = 0,002, Tukeys post hoc "Stimulation 1" neutrales Fach vs. Fach 1 und 2 p < 0,01, "Stimulation 2" neutrales Fach vs. Fach 1 und 2 p < 0,001; rechts: einwegig RM ANOVA, Stimulationseffekt F(2,2) = 54,2, p 0.018, Tukeys Post-hoc-Test gepaart 1 und 2 gegen neutral p < 0.05). Wie bei den "CR"Tagen während des RT-PP-Tests schienen die Mäuse keine negativen Assoziationen zwischen den Kompartimenten und der Stimulation zu bilden; d. h. in Ermangelung einer Stimulation (CR) untersuchten sie alle Fächer in gleichem Maße(Abbildung 7B, keine Unterschiede zwischen der Zeit, die in gepaarten Fächern und neutralen Fächern verbracht wurde). Die Ergebnisse dieser Experimente bestätigten den verhaltensbasierten Phänotyp, der während des RT-PP-Setups beobachtet wurde, und unterstützten damit die kombinatorische Umsetzung sowohl der RT-PP- als auch der NCP-Paradigmen.
Abbildung 1: Verhaltenstests mit Optogenetik im RT-PP-Paradigma. (A) Schematische Darstellung der Zeitachse der Experimente. (B,C) Oben links: Diagramm, das den Prozentsatz der Zeit darstellt, die in jedem Fach während des RT-PP-Experiments für DAT-Cre (N = 10) und VGLUT2-Cre (N = 7) Mäuse injiziert wurde, die mit AAV-ChR2-eYFPinjiziert wurden. Blaue Kreise: lasergekoppeltes Fach; weiße, schwarze Kreise: Hauptfächer; graue Kreise: neutrales Fach. Oben rechts: durchschnittlicher Prozentsatz der in jedem Fach verbrachten Zeit an den Tagen 3, 4, 6 und 7 (RT-PP). Unten: repräsentative Heatmaps der Zeit, die in jedem Fach für eine DAT-Cre- und eine VGLUT2-Cre-Maus verbracht wird. Alle Daten wurden normal verteilt (Shapiro-Wilk-Test). Die Ergebnisse werden als Mittelwert dargestellt. ***p < 0,001 gepaart vs ungepaart; •p < 0,05,p < 0,01, p< 0,001 gepaart im Vergleich zu neutralem Fach; •p < 0,01, sp < 0,001 ungepaartes vs neutrales Fach. Diese Zahl wurde von Bimpisidis et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Chirurgischeverfahren für optogenetische Experimente. (A) Injektion eines cre-abhängigen viralen Vektors in die VTA. (B) Implantation der Optischen Faser über der Injektionsstelle. Beachten Sie die Zur Stabilisierung verwendeten Ankerschrauben. (C) Dauerhafte Verankerung der Faser auf dem Schädel mit Zahnzement. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ausrüstung, die in den Optogenetikexperimenten verwendet wird. (A) Die in den Studien verwendete TTL-Box. Es empfängt Eingaben von der Tracking-Software und sendet TTL-Signale an die Mikrocontroller-Platine. (B) Front (oben) und Rückansicht (unten) der für die Experimente verwendeten Laserquelle. (C) Die Mikrocontrollerplatine zur Steuerung der Laserstimulation. Beachten Sie die Verbindungen von der TTL-Box und zur Laserquelle. (D) Drehgelenk. (E) Glasfaser-Patch-Akkord in den Experimenten verwendet. (F) Das dreiteilige Gerät, das für RT-PP- und NCP-Experimente verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Entwerfen von Arena und Zonen innerhalb der Tracking-Software. Schritt 1: Kalibrierung des Setups. Schritt 2: Zeichnen der gesamten Arena. Schritt 3: Zeichnen von Zonen innerhalb der Arena. Schritt 4: Setup-Validierung. Schritt 5: Registerkarte Teststeuerungseinstellungen zum Einrichten von Zeit- und Stimulationsparametern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Einrichten von Zeit- und Stimulationsparametern eines RT-PP-Experiments innerhalb der Tracking-Software. Hinzufügen spezifischer Regeln für die Dauer (Schritt 1) und die Bedingungen für die Lichtstimulation (Schritt 2). Die Bedingungen können leicht an die Anforderungen für die Umkehrphase angepasst werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Einrichten von Zeit- und Stimulationsparametern von NCP-Experimenten innerhalb der Tracking-Software. Die Dauer der Stimulationssitzungen (Schritt 1) ist ähnlich wie bei RT-PP, aber die Bedingungen für die Lichtstimulationsaktivierung (Schritt 2) sind unterschiedlich. Der Zugang zu beiden Hauptfächern (hier Zone A und Zone B) führt zu einer optogenetischen Stimulation, die nur beendet wird, wenn die Maus in das neutrale Fach eintritt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Verhaltenstests mit Optogenetik im NCP-Paradigma. (A) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. (B) Links: Grafik, die den Prozentsatz der Zeit darstellt, die in jedem Fach während der beiden Tage der Stimulation (Stim1 und Stim 2) und während der konditionierten Reaktionssitzung (CR) für VGLUT2-Cre-Mäuse, die mit AAV-ChR2 in die VTA (N = 5) injiziert wurden, verbracht wurde. Rechts: durchschnittlicher Prozentsatz der Zeit, die in jedem Fach während der zwei Tage der Stimulation des NCP verbracht wurde. (C) Repräsentative Heatmap der Zeit, die in jedem Fach für eine VGLUT2-Cre-Maus während eines der Stimulationstage verbracht wird. Die Daten wurden normal verteilt (Shapiro-Wilk-Test). Die Ergebnisse werden als Mittelwert dargestellt: SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ungepaart vs gepaart 1 und gepaart 2 Fächer. Diese Zahl wurde von Bimpisidis et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Schritt | Temperatur | Dauer | Zyklen |
| 1. Anfängliche Denaturierung | 95 °C | 4 Min. | 1 |
| 2. Denaturierung | 95 °C | 30 s | 30 |
| 3. Glühen | 55 °C | 30 s | |
| 4. Verlängerung | 72 °C | 40 s | |
| 5. Endgültige Verlängerung | 72 °C | 6 Min. | 1 |
| 6. Halten | 4 °C | Bis vom Experimentator gestoppt | 1 |
Tabelle 1: Das PCR-Zyklusprogramm.
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Discussion
In der aktuellen Studie stellen wir zwei Schritt-für-Schritt-Protokolle vor, wie verschiedene Arten von Ortspräferenzanalysen mit Optogenetik bei Mäusen durchgeführt werden können. Die skizzierten Protokolle wurden verwendet, um die lohnenden oder aversiven Verhaltensphänotypen von VTA-Neuronen zu bewerten (Abbildung 1 und Abbildung 6)12, können aber auch verwendet werden, um die Verhaltensrolle von Neuronen in anderen Hirnregionen zu erforschen.
Mehrere neuere Studien haben RT-PP Paradigmen inzweiteiligen 23,24 und dreiteiligen Apparaten13,14,15,16,17,18beschrieben. Die aktuellen Protokolle beschreiben detaillierte Einstellungen für die RT-PP- und NCP-Protokolle in einem Drei-Kompartier-Gerät, das denen ähnelt, die traditionell in CPP-Experimenten verwendet werden, um Verhaltenseffekte auf die Verabreichung von Missbrauchsmedikamenten zu bewerten. Während die Ergebnisse hier nur als Prozentsatz der Zeit dargestellt werden, die die Maus in jedem Fach verbracht hat, ermöglicht die Tracking-Software die Analyse mehrerer anderer Verhaltensparameter, wie Z. B. Übergänge zu Zonen, Geschwindigkeit, Zeit, die immobile verbracht wird, und vieles mehr. Die Analyse verschiedener Parameter kann für die Interpretation von Daten von Bedeutung sein.
Die aktuellen RT-PP-Protokolle sind flexibel und können geändert werden, um zu testen, ob verschiedene Arten von Stimulationsmustern lohnende Effekte haben. Die Parameter der Lasersteuerung können einfach entweder durch das Skript der Mikrocontrollerplatine oder innerhalb der Tracking-Software geändert werden, was die Vielseitigkeit des Setups demonstriert. Wir schlagen eine 20 Hz Stimulationsfrequenz vor, die innerhalb des Bereichs und manchmal niedriger ist, der Frequenzen, die in früheren Studien mit der gleichen Opsin-Variante (ChR2/H134R) angewendet wurden, um dopaminerge und glutamaterge Neuronen und ihre Klemmen13,14,16,17 ,17,18,23,24,25,26,27zu untersuchen. Jüngste Studien haben gezeigt, dass höhere Stimulationsfrequenzen die gegenteiligen Auswirkungen auf das Verhalten haben können als niedrigere, und dass diese Effekte durch einen Depolarisationsblock vermittelt werden, der durch höhere Frequenzen verursacht wird28. In ähnlicher Weise wurden Unterschiede in der Verhaltensleistung bei der Stimulierung glutamatergen und GABAergen Neuronen im seitlichen voroptischen Bereichgezeigt 15. Diese Studien untersuchten Neuronen verschiedener Bereiche als die VTA und die größten Effekte wurden auf hohe Frequenzen von nicht-glutamatergen Neuronen15,28beobachtet. Unsere Wahl auf 20 Hz basiert auf früheren Studien von glutamatergen und dopaminergen VTA-Neuronen, die zeigen, dass durch unterschiedliche Stimulationsfrequenzen die reward-bezogene Verhaltensleistung nicht signifikant verändert wird24,26.
Ein zusätzlicher Parameter, der angepasst werden kann und das experimentelle Ergebnis beeinflussen kann, ist die Leistung der Lichtquelle. Höhere Laserleistung kann die Größe des lichtstimulierten Bereichs erhöhen, was bei einigen Arten von Experimenten von Vorteil sein kann, aber mit dem Nachteil eines Temperaturanstiegs5. Tatsächlich hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass laserinduzierte Temperatursteigerungen die Physiologie des Gehirns verändern und Verhaltensmessungen beeinflussen können29. Diese Beobachtungen unterstreichen, wie wichtig es ist, opsinnegative Kontrollen in das Versuchsdesign einzubeziehen. Im aktuellen Protokoll verwendeten wir 10 mW Laserleistung, die ähnlich ist und sich zuvor als wirksam bei der Stimulierung von dopaminergen und glutamatergen Neuronen im VTA16,24,26erwiesen hat. Bei der Einrichtung von Experimenten ist es wichtig, auf die Größe des Bereichs zu achten, in dem sich die relevanten Zellen befinden, sowie auf die Faseroptik und die Patchschnureigenschaften (numerische Blende, Kerndurchmesser). Diese Parameter sind bei der Durchführung von Berechnungen im Zusammenhang mit der Laserleistung unbedingt zu berücksichtigen. Für Details kann der von Karl Deisseroths Labor (http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php) entwickelte Rechner verwendet werden.
Die histologische Verifizierung der Cre-Lox-Rekombination ist ein weiterer kritischer Aspekt bei der Anwendung von Optogenetik-Experimenten. Die Validierung der Rekombinationseffizienz sollte immer in einer Pilotkohorte stattfinden, bevor Verhaltensexperimente an einer großen Gruppe von Tieren eingeleitet werden. Dies ist aus ethischen Gründen, aber auch für optimierte experimentelle Ergebnisse wichtig. Jedes virale Konstrukt kann variable Spezifität für verschiedene neuronale Typen und in verschiedenen Regionen5zeigen, ein Parameter, der die Experimente auf unvorhersehbare und sogar irreführende Weise beeinflussen kann. Zum Beispiel haben wir zuvor das Cre-Lox-Rekombinationsmuster von AAV5-Viren im VTA von DAT-Cre-Mäusen validiert und festgestellt, dass einseitige Injektionen ausreichen, um den Großteil des Interessenbereichs anzusprechen. Als wir dann räumlich begrenzte Subpopulationen innerhalb des VTA untersuchten, wie eine, die durch NeuroD6-Expression gekennzeichnet ist, beobachteten wir, dass bilaterale virusische Injektionen effizienter waren, um eine größere Anzahl von Neuronen zu zielen, was ausgeprägtere Verhaltenseffekte auf die optogenetische Lichtstimulation12. Darüber hinaus muss die Zeit von der Operation bis zur Einleitung von Verhaltensexperimenten sorgfältig angegangen werden. Zwei Wochen sind genug Zeit, um ein ChR2-DNA-Konstrukt in Zellkörpern exprimieren zu können, wie wir hier zeigen, aber längere Wartezeiten (ca. 8 Wochen) könnten erforderlich sein, wenn der Forscher die Wirkung der Stimulation in den Projektionsbereichen13,14,15,17testet.
Es ist erwähnenswert, dass das Volumen des injizierten Virus (in unserem Fall 300 nL) geeignet sein könnte, wenn Neuronen im VTA untersucht werden, aber Volumen und Titer müssen abhängig von der Effizienz der Transduktion und der Größe der untersuchten Struktur angepasst werden. Darüber hinaus kann es bei bilateralen Strukturen, die sich in einem Abstand von der mediolateralen Achse befinden, notwendig sein, bilaterale Injektionen durchzuführen und auch Fasern bilateral zu implantieren, um die Aktivierung/Hemmung in beiden Hemisphären zu gewährleisten.
Schließlich ist es immer notwendig, eine post-mortem histologische Analyse durchzuführen, um die Effizienz der Cre-Lox-Rekombination zu validieren und zu bestätigen und die korrekte Implantationsstelle der Glasfaser am vorgesehenen Ort zu überprüfen. Unerwartete, überbeschränkte oder übermäßige Cre-Lox-Rekombinationen können aufgrund einer unbekannten Verteilung von Neuronen auftreten, die Cre außerhalb der Grenzen des vorgesehenen Bereichs ausdrücken, oder aufgrund von Unterschieden im Virusserotyp, schlechtem Umgang mit dem Virus, Verstopfung der Spritze für Virusabgabe oder andere chirurgische Probleme. Die Überprüfung einer zufriedenstellenden Cre-Lox-Rekombination und der korrekten Faseroptik-Implantation muss durchgeführt werden, um alle statistischen Ergebnisse der Verhaltensbeurteilungen zu bestätigen, um sichere Schlussfolgerungen zu ziehen.
In Bezug auf die hier zur Verfügung gestellten Daten als Beispiele für die Verwendung der beiden Verhaltensparadigmen wurde die signifikante Bevorzugung der lichtgepaarten Seite, die durch die optogenetische Stimulation von dopaminergen Neuronen im VTA durch die Analyse von DAT-Cre-Mäusen im RT-PP-Paradigma erzielt wurde, auf der Grundlage früherer Befunde erwartet23,24,25,26,27, während die Vermeidung dieser Seite, die von den VGLUT2-Cre-Mäusen gezeigt wurde, nicht erwartet wurde. VGLUT2-Neuronen des VTA und ihre Projektionen haben gezeigt, dass sie sowohl an Belohnung als auch an Deraversion16,17,24,30,31beteiligt sind, und deshalb haben wir die NCP-Analyse durchgeführt, um das im aktuellen RT-PP-Setup beobachtete scheinbare Vermeidungsverhalten genauer zu bewerten. Durch die Verwendung des schmalen, transparenten Korridors als einziges nicht-leicht gepaartes Fach, das die aversiven Eigenschaften der Stimulation von VTA glutamatergen Neuronen bestätigt, ist es offensichtlich, dass in diesem speziellen Drei-Fach-Setup die optogenetische Aktivierung dieser Neuronen eine aversive Reaktion bewirkt. Diese Experimente, die hier gezeigt wurden, um Situationen zu veranschaulichen, die von der Verwendung sowohl der RT-PP- als auch der NCP-Protokolle profitieren könnten, waren Teil einer kürzlich veröffentlichten Studie, und der vollständige Datensatz sowie Diskussionen über diese Ergebnisse finden Sie in dieser Publikation12.
Zusätzlich zum NCP sind alternative Möglichkeiten zur Bestätigung der Abneigung die starke Ausleuchtung eines Bereichs innerhalb eines offenen Feldbereichs, während der Rest der Arena mit der Laseraktivierung kombiniert wird, oder eine aktive Vermeidungsaufgabe durchzuführen, bei der die Maus ein bestimmtes Verhaltensmuster ausführen muss, um die Laserstimulation zu beenden15.
Zusammenfassend lassen sich sagen, dass die beschriebenen Protokolle wichtige Informationen darüber liefern, wie RT-PP- und NCP-Analysen auf die effizienteste Weise durchgeführt werden können, um die Rolle der neuronalen Aktivierung bei Belohnung und Aversion zu entwirren. Je nach wissenschaftlicher Hypothese kann eine Reihe von Parametern mit diesen Protokollen analysiert werden, und jedes Protokoll kann auch mit anderen validierten Paradigmen für optimierte Verhaltensanalysen kombiniert werden, die Optogenetik implementieren, um bestimmte Gehirne zu adressieren. Bereiche und Neuronen von Interesse.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Unsere Finanzierungsquellen werden dankbar anerkannt: Universität Uppsala, Vetenskapsrédet (Schwedischer Forschungsrat), Hjärnfonden, Parkinsonfonden, die Forschungsstiftungen von Bertil Héllsten, OE&Edla Johansson, Zoologisk Forskning und Hlén. Die Tiere wurden an der Universität Uppsala gehalten und Experimente wurden in der Verhaltenseinrichtung der Universität Uppsala durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | - | a great variety of viruses to suit any project's needs |
| Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
| Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
| Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
| Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
| DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
| DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
| Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
| Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
| Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
| Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
| Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
| Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
| Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
| Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
| Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
| Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
| Nucleic Acid gel stain - GelRed | Biotium | 41003-T | |
| PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | |
| Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
| Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
| Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
| Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
| Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
| Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
| TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
| Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
| Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
| UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |
References
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