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Developmental Biology

Microwaving e Fluorophore-Tyramide per l'immunostainizzazione multiplex sulle intendire del mouse - Utilizzo di anticorpi primari non conformi della stessa specie ospite

Published: February 21, 2020 doi: 10.3791/60868

Summary

Sono stati stabiliti diversi metodi per l'immunostaining multiplex utilizzando anticorpi primari della stessa specie ospite. Qui, descriviamo l'uso di anticorpi mediati a microonde e di fluoroforo-tiramide per bloccare la reattività incrociata dell'anticorpo durante l'immunostaining multiplex su sezioni adrenali del topo con paraffina fissata in formalina.

Abstract

L'immunostazione è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica per mostrare il modello di espressione cellulare di una data proteina. L'immunostaining multiplex consente l'etichettatura utilizzando più anticorpi primari. Per ridurre al minimo la reattività incrociata degli anticorpi, l'immunostaining multiplex che utilizza la colorazione indiretta richiede anticorpi primari senza etichetta provenienti da diverse specie ospiti. Tuttavia, la combinazione appropriata di diversi anticorpi di specie non è sempre disponibile. Qui, descriviamo un metodo di utilizzo di anticorpi primari non etichettati provenienti dalla stessa specie ospite (ad esempio, in questo caso entrambi gli anticorpi provengono dal coniglio) per l'immunofluorescenza multiplex sulle sezioni surrenali con paraffina fissata a formalina (FFPE). Questo metodo utilizza la stessa procedura e reagenti utilizzati nella fase di recupero dell'antigene per rimuovere l'attività del complesso anticorpale primario precedentemente macchiato. I vetrini sono stati macchiati con il primo anticorpo primario utilizzando un protocollo di immunostaining generale seguito da un passo di legame con un anticorpo secondario biotinylato. Poi, un metodo di sviluppo del segnale avidina-biotina-perossidasi è stato utilizzato con fluoroforo-tiramide come substrato. L'immunoattività del primo complesso di anticorpi primari è stata ridotta attraverso l'immersione in una soluzione di citrato di sodio bollente a microonde per 8 min. La deposizione insolubile fluoroforo-tiramide è rimasta sul campione, il che ha permesso di colorare la diapositiva con altri anticorpi primari. Anche se questo metodo elimina la maggior parte dei segnali falsi positivi, alcuni sfondi da anticorpo reattività incrociata può rimanere. Se i campioni sono arricchiti con biotina endogena, un anticorpo secondario coniugato perossidia può essere utilizzato per sostituire l'anticorpo secondario biotinylato per evitare il falso positivo dalla biotina endogena recuperata.

Introduction

Nell'immunostaining multiplex, la colorazione diretta che utilizza anticorpi primari coniugati può fornire risultati informativi. Senza l'uso di anticorpi secondari, il metodo di colorazione diretta ha un basso rischio di falsi segnali di co-localizzazione da reattività incrociata degli anticorpi. Tuttavia, i reporter coniugati (fluoroforo, enzimi) o biotina sull'anticorpo primario ne limitano l'uso futuro. In alternativa, l'immunostaining indiretto di solito fornisce segnali più forti utilizzando un anticorpo primario non coniugato con un anticorpo secondario etichettato. Idealmente, gli anticorpi primari non coniugati utilizzati nell'immunostaining multiplex dovrebbero provenire da diverse specie ospiti per evitare la reattività incrociata degli anticorpi. Tuttavia, l'appropriata combinazione di anticorpi primari di diverse specie ospiti non è sempre disponibile.

Sono stati stabiliti diversi metodi per eliminare il rischio che l'anticorpo secondario reagisca con un anticorpo primario indesiderato. Un metodo comune è l'uso di un anticorpo monomerico F(ab) per bloccare eventuali epitopi leganti rimanenti sul primo complesso anticorpo primario prima della colorazione con il secondo anticorpo primario1. Lo stripping anticorpale, che è simile alla striscia e resonera di un foglio di macchia occidentale, rimuove il complesso anticorpale precedentemente macchiato senza spogliare la deposizione di molecole di reporter rilevabili come 3,3'-diaminobenzidine tetraidrocloruro (DAB)2 e la deposizione di tyramide fluorescente3 . Con questo metodo, le molecole reporter in colori diversi possono mostrare un risultato multiplex sulla stessa diapositiva. La colorazione multiplex è anche realizzabile con la completa rimozione degli strati precedentemente depositati di anticorpi e l'allineamento di immagini successivamente acquisite da altri anticorpi4,5. Tutti questi metodi danno risultati affidabili, anche se ogni metodo ha i suoi limiti e richiede procedure complicate o un sistema di imaging speciale.

Il presente protocollo mostra l'applicazione di un metodo di rimozione degli anticorpi con l'uso di buffer comunemente disponibili. Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire una colorazione multiplex immunofluorescente su sezioni surrenali con paraffina fissata in forma di forma (FFPE) con due anticorpi primari non etichettati della stessa specie ospite.

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Protocol

1. Colorazione con il primo anticorpo

  1. Dewax e reidratato FFPE vetrini con 5 min assegnati a ciascuno dei seguenti passaggi: xilene o reagenti equivalenti 3x, 100% etanolo 2x, 95% etanolo 1x, 70% etanolo 1x, 50% etanolo 1x, e acqua distillata 2x.
    NOTA: I vetrini devono rimanere umidi a partire da questa fase di reidratazione fino al montaggio nella fase finale.
  2. Per il recupero dell'antigene opzionale, posizionare i vetrini in 275 mL di soluzione di citrato di sodio bollente (10 mM, pH e 6,0) per 8 min. Per mantenere la soluzione bollente, posizionare i vetrini piatti sul fondo di una scatola di punta pipetta 14 x 9 x 9 cm3 (W x L x H) con un coperchio e un forno a microonde la soluzione è del 70% di potenza in un forno a microonde 700 W per 8 min. Quindi rimuovere la scatola di punta pipetta dal forno a microonde, aprire il coperchio e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (RT) per almeno 20 minuti.
  3. Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin contenente PBST (fosfato-buffered salina con 0.1% polisorbate 20/80). Lavare con PBST per 5 min 3x. Se non si sposta immediatamente al passaggio successivo, conservare i vetrini in questo passaggio con PBST in un barattolo Coplin a RT per alcune ore o a 4 gradi centigradi per 1-2 giorni, se non si passa immediatamente al passaggio successivo.
  4. Per preparare la soluzione di blocco utilizzare il siero normale delle specie ospiti dell'anticorpo secondario come reagente di blocco. Possono essere utilizzati anche altri reagenti di blocco commerciali. Se si utilizza il siero normale impiegato per lo studio presentato in questo studio, aggiungere 100 l di siero d'asino normale a 4,9 mL di PBST. La soluzione di blocco può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni.
  5. Per il blocco, scrollarsi di dosso il PBST dalle diapositive e coprirli rapidamente con una soluzione di blocco sufficiente. Incubare gli scivoli a RT in una camera umidificata per 30 min.
  6. Preparare la soluzione anticorpale primaria (500 -L per due vetrini) utilizzando la soluzione di blocco per diluire l'anticorpo primario alla concentrazione desiderata. La soluzione deve essere conservata sul ghiaccio fino all'uso.
    1. Per 3-HSD, aggiungere 2 - L L di 3 -HSD in 498 - L di soluzione di blocco.
    2. Per TH, aggiungere 0,5 l'anticorpo TH in 499 - L di soluzione di blocco.
    3. Per la soluzione di blocco di z-catenina, aggiungere 1 L-L di anti-catenina in 499 l di soluzione di blocco.
    4. Per 20 o HSD, aggiungere 1 OL di 20 -HSD anticorpo in 499 - L di soluzione di blocco.
    5. Per CYP2F2, aggiungere 2 -L dell'anticorpo CYP2F2 in 498 - L di soluzione di blocco.
  7. Incubare con l'anticorpo primario scrollando si scrolla la soluzione di blocco dai vetrini e coprendoli rapidamente con una soluzione di anticorpi primari sufficiente. Incubare gli scivoli in una camera umidificata durante la notte a 4 gradi centigradi. Durante l'incubazione i vetrini possono essere coperti da un piccolo pezzo di pellicola di paraffina per evitare l'essiccazione.
  8. La mattina dopo lavare i vetrini con PBST per 5 min 3x.
  9. Preparare la soluzione anticorpale secondaria (500 o L per due vetrini) utilizzando la soluzione di blocco per diluire l'anticorpo secondario biotinylato alla concentrazione desiderata (ad es., 1 l di anticorpi anti-topi anti-tono o anti-coniglio asino in 499 soluzione). La soluzione deve essere conservata sul ghiaccio fino all'uso.
  10. Incubare con il secondo anticorpo scrollando si strappa il PBST dai vetrini e coprendoli rapidamente con una soluzione di anticorpi secondari sufficiente. Incubare i vetrini in una camera umidificata per 1 h a RT.
    NOTA: Se la biotina endogena è una preoccupazione, utilizzare un anticorpo secondario coniugato perossidasi invece dell'anticorpo secondario biotinylato. Passare al passaggio 1.14 se si utilizza un anticorpo secondario coniugato perossidasi nel passaggio 1.10.
  11. Lavare i vetrini con PBST per 5 min 3x.
  12. Preparare la soluzione di streptavidina coniugata a rafano (SA-HRP) (500 -L per due vetrini) aggiungendo 0,5 l di SA-HRP in 499 L di PBS. La concentrazione finale è di 1 g/mL.
  13. Incubare con la soluzione SA-HRP. Agitare PBST dalle diapositive e coprire rapidamente le diapositive con una soluzione SA-HRP sufficiente. Incubare i vetrini in una camera umidificata per 0,5 h a RT.
  14. Lavare i vetrini con PBST per 5 min 3x.
  15. Preparare la soluzione fluoroforo-tiramide diluindo fluoroforo-tyramide con il suo tampone di diluizione secondo le istruzioni del produttore (ad es., 5 l di fluoroforo-tyramide in 496 - L di tampone di diluizione).
  16. Eseguire lo sviluppo del segnale con fluoroforo-tiramide scrollandosi di dosso il PBST dai vetrini e coprendo rapidamente i vetrini con sufficiente soluzione fluoroforo-tiramide. Incubare in una camera umidificata per 1 min a RT. Il tempo di incubazione può essere regolato per ottenere l'intensità di fluorescenza desiderata. Interrompere la reazione trasferendo le diapositive in un barattolo Coplin contenente PBST. Lavare i vetrini con PBST per 3 min 2x.
  17. I segnali possono essere controllati rapidamente al microscopio a fluorescenza per confermare il risultato in questa fase. Se non vengono utilizzati copricopertine, applicare una goccia di glicerol:PBS (1:1) su ogni sezione per mantenere i campioni umidi. Lavare i vetrini con PBST per 3 min 2x. Le diapositive possono essere conservate in PBST a 4 gradi centigradi per alcuni giorni prima di passare alla fase successiva.

2. Spoglia il primo anticorpo

  1. Posizionare i vetrini in 275 mL di soluzione di citrato di sodio bollente (10 mM, pH - 6,0) per almeno 8 min. Se si preferisce un tempo di stripping più lungo, potrebbe essere necessario ricaricare il buffer utilizzando una soluzione di citrato di sodio bollente per mantenere sempre i vetrini immersi in una soluzione tampone. Togliere la scatola di punta della pipetta dal forno a microonde, aprire il coperchio e lasciare raffreddare la soluzione a RT per almeno 20 minuti.
  2. Trasferire le diapositive in un barattolo Coplin contenente PBST. Lavare con PBST per 5 min 3x. Se il passaggio successivo se non viene eseguito immediatamente, conservare i vetrini in un barattolo Coplin con PBST a RT per alcune ore o a 4 gradi centigradi per 1-2 giorni.

3. Macchia con il secondo anticorpo

  1. Iniziare dal passaggio di blocco e seguire le stesse procedure nel passaggio da 1.5 a 1.14. Nelle fasi di sviluppo del segnale (passaggio 1.15 e 1.16), utilizzare il fluoroforo-tyramide in un spettro di fluorescenza diverso.
    NOTA: Le diapositive possono essere rimosse utilizzando questo metodo più volte per consentire la colorazione multiplex. L'ultimo anticorpo non richiede fluoroforo-tiramide come reporter. Un anticorpo secondario coniugato a fluoroforo potrebbe essere usato per mostrare segnali dall'ultimo anticorpo primario.
  2. Incubare i vetrini con soluzione DAPI (DaPI) o Hoechst per 1 min a RT se è necessario il contro-macchia nucleare. Quindi lavare i vetrini con PBST per 3 min 2x.

4. Imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza per rilevare i segnali

  1. Montare un coperchio con una goccia di mezzo di montaggio adatto per l'immunofluorescenza.
  2. Per l'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza per rilevare i segnali di ogni canale di fluorescenza. Iniziare con il canale di colorazione nucleare (DAPI) e la lente 4x per individuare il tessuto sul vetrino.
  3. Passare all'obiettivo 10x per l'imaging. Regolare il tempo di esposizione (300 ms) e l'intensità della sorgente luminosa (80% di intensità). Regolare queste impostazioni se il segnale è troppo luminoso o troppo scuro. Scatta foto di ogni canale senza spostare il palco. Per ogni canale potrebbe essere necessaria una rifocalizzazione. Unire le immagini di ogni canale utilizzando il software del microscopio o ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).

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Representative Results

I risultati sono stati ottenuti da campioni trattati con tutti i passaggi descritti, incluso il passaggio 1.2 di recupero dell'antigene. Tutti gli anticorpi secondari utilizzati qui sono stati biotinylati. Fluorophore-tyramide è stato utilizzato per sviluppare segnali dal primo e dal secondo anticorpo primario. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluescenza dotato di cubo FITC (per la fluorescenza verde), un cubo TxRED (per Cy3) e un cubo DAPI (per DAPI).

Lo stripping mediato da microonde elimina la reattività incrociata.
Le sezioni surrenali FFPE del topo sono state macchiate usando due anticorpi primari del coniglio. Senza stripping (Figura 1A-C), l'anticorpo secondario per TH ha raccolto siti di 3- HSD () e ha dato segnali rossi nella corteccia surrenale (Figura 1B). La mancanza di stripping ha portato ai falsi segnali di co-localizzazione visti in giallo (Figura 1C). Questa reattività incrociata deriva da (1) l'enzima HRP che ha catalizzato la prima reazione di tiramide e (2) le specie di anticorpi reattività incrociata. Per rimuovere l'anticorpo cross-reactivity e hrP dalla prima immunostaining, abbiamo testato un 1 min (Figura 1D-F) e uno stripping mediato a microonde di 8 min (Figura 1G-I). Entrambi i trattamenti sono stati sufficienti per eliminare il segnale non specifico, dando risultati di doppia colorazione pulita (Figura 1F,I). Il controllo negativo ha seguito tutte le stesse fasi, ad eccezione dell'incubazione con anticorpi primari (Figura 1J). Nessun segnale significativo è stato rilevato nel controllo negativo. Abbiamo scoperto che uno stripping di 8 min in un tampone di citrati bollente era sufficiente per eliminare la reattività incrociata degli anticorpi per molti anticorpi comunemente utilizzati nella ghiandola surrenale (Figura 2).

La limitazione - l'efficacia dello stripping mediato a microonde è dipendente da anticorpi.
Anche se lo stripping mediato a microonde utilizzato in questo protocollo funziona per la maggior parte dei casi, esistono limitazioni a questo metodo. Per alcuni anticorpi, un metodo di rimozione mediato a microonde con un tampone di citrati potrebbe non rimuovere completamente la reattività incrociata dell'anticorpo. Ad esempio, una rimozione di 8 min ha rimosso la maggior parte dei segnali non specifici dall'anticorpo anti-TH del topo e dall'anticorpo anti-CYP2F2 del topo, ma un segnale falso positivo debole era ancora rilevabile (la medulla nella Figura 3E e la corteccia interna nella Figura 3K). Si noti che un aumento del tempo di microwaving a 20 min ancora non ha rimosso completamente anticorpo reattività incrociata (Figura 3H,K).

Figure 1
Figura 1: Rappresentativa doppia immunostaining sulle surrenali per topi P1 FFPE. Le sezioni surrenali del topo FFPE sono state macchiate con due anticorpi primari dei conigli: anti-3HSD (verde e corteccia), anti-TH (rosso e medulla). I tre gruppi di macchie includono le tre diverse procedure di stripping utilizzate: (A-C) senza stripping, (D-F) 1 min stripping e (G-I) 8 min stripping. Si noti che senza microonde, l'anticorpo secondario con TH ha ancora raccolto i segnali 3-HSD, mentre sono stati ottenuti risultati di colorazione specifici nei gruppi trattati a microonde da 1 min e 8 min. Non c'è segnale positivo nel controllo negativo, non incubato con anticorpi primari. Barra di scala: 100 m. DAPI - nuclei cellulari, blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rappresentativa doppia immunostaining sulle surrenali per topi P21 FFPE. Le sezioni surrenali del topo FFPE sono state macchiate con due anticorpi primari provenienti dai conigli nel seguente ordine: anti-z-catenina (verde - corteccia esterna) e poi anti-20-HSD (rosso - corteccia interna). Un passo di stripping di 8 min è stato eseguito in mezzo. Barra della scala: 100 m; DAPI - nuclei cellulari, blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Alcuni anticorpi potrebbero non essere completamente rimossi, il che può portare a deboli segnali non specifici. Le sezioni surrenali del topo FFPE sono state macchiate con due anticorpi primari dei topi: anti-CYP2F2 (verde - corteccia interna) e anti-TH (rosso e medulla). I risultati del gruppo no stripping(A-C) hanno mostrato che le reazioni per il rilevamento della proteina CYP2F2 hanno ancora macchiato l'area di TH( Una falsa colocalizzazione è stata osservata nella medulla surrenale (C). Anche se un trattamento a microonde di 8 min e 20 min ha ridotto l'intensità della fluorescenza verde nella medulla, è ancora presente uno sfondo evidente (D-I). L'anticorpo anti-CYP2F2 è un altro esempio che mostra che la reattività incrociata non può essere completamente rimossa anche dopo 20 min di microwaving (J-L). Si noti che non c'era alcun segnale positivo nel controllo negativo, non incubato con anticorpi primari, indicando che il segnale falso positivo era dalla reattività incrociata dell'anticorpo (M). Barra della scala: 100 m; DAPI - nuclei cellulari, blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'immunostaining multiplex è utile per esaminare la co-localizzazione cellulare di due o più antigeni. Questa tecnica ampiamente utilizzata fornisce risultati convincenti di co-localizzazione quando gli anticorpi primari sono coniugati con diversi reporter (colorazione diretta). Tuttavia, la colorazione diretta di solito fornisce segnali più deboli rispetto alla colorazione indiretta, che coinvolge anticorpi secondari coniugati per rilevare gli anticorpi primari. Nella colorazione indiretta, un risultato immunostaining multiplex di alta qualità si basa sul fatto che gli anticorpi secondari possano distinguere tra i diversi anticorpi primari. A causa della possibile reattività incrociata degli anticorpi, la colorazione multiplex che utilizza il metodo di colorazione indiretta è osservata più chiaramente con gli anticorpi primari di diverse specie ospiti. Carl e altri hanno sviluppato un protocollo utilizzando un eccesso di unconjugated IgG F(ab) frammento per bloccare anticorpo reattività incrociata1. Una strategia simile viene utilizzata nella colorazione "mouse-on-mouse" che utilizza un anticorpo f(ab) monomerico anti-topo per impedire all'anticorpo secondario anti-topo di rilevare qualsiasi immunoglobulina endogena del topo nel tessuto. Tuttavia, questo metodo di blocco richiede molto tempo e potrebbe non bloccare completamente gli anticorpi dai passaggi precedenti, soprattutto se gli antigeni di rilevamento sono di grande abbondanza2.

Lo stripping mediato dal calore è un altro metodo per prevenire la reattività incrociata degli anticorpi nell'immunostaining multiplex. Il concetto è simile al metodo striscia e reprobe di una macchia occidentale. L'uso di un forno a microonde per far bollire i vetrini in un tampone di citrati ha avuto un marcato effetto positivo sul blocco della reattività incrociata dell'anticorpo. Due trattamenti a microonde di 5 min tra cicli sequenziali di immunostaining colorimetrico consentono il rilevamento di più antigeni sullo stesso vetrino utilizzando anticorpi monoclonali murini2. I trattamenti a microonde combinati con il metodo di amplificazione del segnale di tiramide (TSA), che utilizza il fluoroforo-tiproro come substrato di HRP, sono utili anche per immunofluorescenza doppia colorazione3,6,7. Il trattamento a microonde tra il primo e il secondo ciclo di colorazione blocca l'attività del primo immunocomplesso senza lavare la sua precipitazione di tiramide fluorescente. Tuttavia, un trattamento a microonde potrebbe non essere in grado di prevenire completamente la contaminazione nella colorazione8. Anche se alcuni metodi che utilizzano diversi tipi di buffer di stripping possono fornire una migliore efficacia di stripping, sono necessari buffer specializzati con tempi di incubazione più lunghi o campioni devono essere sottoposti all'acquisizione di immagini prima che venga applicata un'altra macchia prima che venga applicata un'altra macchia4,5,7,9,10,11. Qui dimostriamo un metodo semplice con una procedura meno complicata e un buffer comune per il recupero di antigeni mediati a microonde nella colorazione immunofluorescente multiplex. Anche se questo metodo elimina la maggior parte della reattività incrociata, gli utenti dovrebbero essere consapevoli di una possibile falsa colocalizzazione debole vista con alcuni anticorpi anche dopo un trattamento a microonde di 20 min.

La biotina endogena può essere utilizzata come marcatore di cellule steroidogeniche nella corteccia surrenale12. Il fluoroforo coniugato streptavidino da solo è sufficiente a rilevare la biotina endogena e a illuminare l'intera corteccia surrenale, specialmente nelle sezioni congelate. Poiché la biotina endogena è solitamente bloccata nei campioni FFPE, la procedura avidin-biotina-peroxidase (cioè, kit ABC) è ancora ampiamente utilizzata per amplificare i bersagli nei campioni surrenali FFPE. È importante notare che il passo di recupero dell'antigene smaschera anche la biotina endogena e induce la sua immunoattività13. Poiché il nostro metodo combina il recupero di antigene mediato a microonde e l'uso di HRP coniugato streptavidin, è possibile che la biotina endogena porterà a falsi segnali positivi, soprattutto nei tessuti ricchi di biotina endogena (ad esempio, fegato, reni e alcuni tumori)13. Se la procedura avidin-biotin-perossidi-perossidia è necessaria per amplificare il segnale, un ulteriore passo di blocco come la preincubazione con avidin libero e biotina libera può contribuire a ridurre il segnale biotina endogeno14. Mentre il nostro metodo dà un basso sfondo di biotina endogena su surrenali per topi FFPE, è importante includere sempre un controllo negativo con ogni campione in ogni momento quando si utilizza la procedura avidin-biotin-peroxidase. L'approccio alternativo consiste nell'utilizzare un anticorpo secondario coniugato perossidasi invece dell'anticorpo secondario biotinylato.

I nostri risultati dimostrano che il trattamento a microonde con un tampone di citrati è un metodo utile per la colorazione dell'immunofluorescenza multiplex. Tuttavia, va notato che non tutte le attività trasversali possono essere completamente bloccate. È possibile una falsa co-localizzazione debole. Questo protocollo può essere utilizzato come approccio alternativo quando non è disponibile un'appropriata combinazione di anticorpi primari di diverse specie ospiti. Gli utenti devono essere consapevoli di possibili falsi positivi dalla reattività incrociata rimanente, nonché la biotina endogena recuperata. I controlli negativi devono essere inclusi in ogni momento.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato da NIH R00 HD032636.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antifade Mounting Medium Vector Laboratories H-1000
Biotinylated donkey anti-mouse JacksonImmuno 715-066-151 1:500 dilution
Biotinylated donkey anti-rabbit JacksonImmuno 711-066-152 1:500 dilution
DAPI BioLegend 422801 2 μg/mL in distilled water
Fluorescence microscope ECHO Revolve 4
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin JacksonImmuno 016-030-084 1:1,000 dilution
Microwave oven, 700 W General Electric JEM3072DH1BB
Mouse anti-CYP2F2 Santa Cruz SC-374540 1:250 dilution
Mouse anti-TH Santa Cruz SC-25269 1:1,000 dilution
Normal donkey serum JacksonImmuno 017-000-121 2% serum in PBST
Rabbit anti-20αHSD Kerafast EB4002 1:500 dilution
Rabbit anti-3βHSD TransGenic KO607 1:250 dilution
Rabbit anti-TH NOVUS NB300-109 1:1,000 dilution
Rabbit anti-β-catenin Abcam ab32572 1:500 dilution
Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) JacksonImmuno 016-303-084 1:1,000 dilution
TSA Cy3 Tyramide PerkinElmer SAT704B001EA 1:100 dilution
TSA Fluorescein Tyramide PerkinElmer SAT701001EA 1:100 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia dello sviluppo numero 156 immunostaining multiplex immunofluorescenza tiramide microonde recupero di antigeni stripping anticorpale
Microwaving e Fluorophore-Tyramide per l'immunostainizzazione multiplex sulle intendire del mouse - Utilizzo di anticorpi primari non conformi della stessa specie ospite
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Lyu, Q., Zheng, H. S., Laprocina,More

Lyu, Q., Zheng, H. S., Laprocina, K., Huang, C. C. J. Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals − Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species. J. Vis. Exp. (156), e60868, doi:10.3791/60868 (2020).

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