Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Summary

Este protocolo demonstra métodos para permitir a cultura in vitro estendida de xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Um passo aumenta a viabilidade geral das culturas de cluster multicelulares em hidrogéis 3D, através da remoção direta de células únicas não viáveis. Um passo secundário demonstra as melhores práticas para a cultura PDX em uma plataforma microfluida perfumada.

Abstract

Os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), gerados quando ressecados do tecido tumoral do paciente são grafados diretamente em camundongos imunocomprometidos, permanecem biologicamente estáveis, preservando características moleculares, genéticas e histológicas, bem como a heterogeneidade do tumor original. No entanto, usar esses modelos para realizar uma infinidade de experimentos, incluindo a triagem de medicamentos, é proibitivo tanto em termos de custo quanto de tempo. Sistemas de cultura tridimensional (3D) são amplamente vistos como plataformas nas quais as células cancerígenas retêm sua integridade biológica através de interações bioquímicas, morfologia e arquitetura. Nossa equipe tem ampla experiência em cultivo de células PDX in vitro usando matrizes 3D compostas de ácido hialurônico (HA). A fim de separar as células estromais do fibroblasto do camundongo associadas aos PDXs, usamos cultura de rotação, onde células estromais aderem à superfície das placas tratadas pela cultura tecidual enquanto células tumorais PDX dissociadas flutuam e se associam a aglomerados multicelulares. Também flutuando no supernante estão células solteiras, muitas vezes mortas, que representam um desafio na coleta de agrupamentos PDX viáveis para encapsulamento a jusante em hidrogéis para cultura celular 3D. Para separar essas células únicas de aglomerados de células vivas, empregamos centrifugação gradiente de passo de densidade. O protocolo aqui descrito permite o esgotamento de células únicas não viáveis da população saudável de aglomerados celulares que serão usados para mais experimentações in vitro. Em nossos estudos, incorporamos as culturas 3D em placas microfluidas que permitem a perfusão da mídia durante a cultura. Depois de avaliar as culturas resultantes usando um ensaio de viabilidade baseado em imagem fluorescente de células purificadas versus não purificadas, nossos resultados mostram que essa etapa de separação adicional reduziu substancialmente o número de células não viáveis de nossas culturas.

Introduction

Na última década, o campo da pesquisa sobre o câncer demonstrou um entusiasmo renovado pelos xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) como uma ferramenta para avaliar a dependência da via celular do câncer e a suscetibilidade de medicamentos¹. Os modelos PDX mais comuns são estabelecidos pela implantação subcutânea ou ortotópica de células tumorais humanas — um fragmento de tumor, um conjunto de células derivadas de tumor dissociados ou uma amostra de células tumorais circulantes isoladas (CTCs) — em um hospedeiro de roedores. Se o tumor "tomar" for bem sucedido, as células de xenoenxerto se proliferarão, vascularizarão e interagirão com o tecido hospedeiro para criar um tumor, que pode ser colhido em um tamanho ideal, subdividido e reimplantado em outros hospedeiros. Entre suas muitas vantagens como sistema modelo, os PDXs normalmente retêm uma parcela substancial da heterogeneidade da população de células tumorais nativas e permitem a avaliação de vias específicas humanas e respostas celulares^2,,3. O contexto in vivo permite a interação tumoral com vasculatura e outros estroma adjacentes e recapitula características teciduais, como dinâmica de difusão de drogas, tensão de oxigênio e influência de matriz extracelular que impacta biologicamente e mecanicamente a progressão do tumor. Um aspecto negativo dos PDXs é sua dependência de um hospedeiro roedor, tanto para expansão do tumor quanto, em última instância, para testes de hipóteses. Como muitos PDXs não conseguem se adaptar à cultura bidimensional tradicional (2D) no poliestireno da cultura tecidual sem perder muitas de suas características desejáveis, houve um meio termo mínimo para os pesquisadores entre este método in vitro relativamente controlado, e o aumento significativo dos requisitos de despesas, instalações e tempo para o uso in vivo do PDX.

Descrevemos vários modelos in vitro que implementam a cultura celular 3D dentro de uma matriz de apoio, e recentemente expandimos esse trabalho para demonstrar a cultura ex vivo de PDXs derivados de múltiplos câncer de próstata (PDXs) derivados, tanto sozinhos quanto em co-cultura com fibroblastos derivados da medula óssea^4,,5. As matrizes de hidrogel baseadas em ácido hialurônico (HA) fornecem suporte personalizável e biologicamente relevante para ambos os tipos de células, com controle fácil sobre características de hidrogel e clareza óptica para imagem através da profundidade do hidrogel⁶.

Os tecidos tumorais PDX maduros compreendem uma mistura variável de células cancerígenas humanas heterogêneas e estroma de camundongos (fibroblastos, células endoteliais, etc.). Para estudar contribuições específicas do tipo celular para a progressão do tumor in vitro, pode ser vantajoso para dissociar tumores, separar as populações celulares e incorporá-los experimentalmente de forma organizada para dissecar caminhos da comunicação intercelular. As populações de células mistas dentro dos digestados teciduais têm compatibilidade diferencial com condições específicas de cultura. Por exemplo, a viabilidade do fibroblasto associado ao tumor requer a adesão à superfície ou matrizes 3D funcionalizadas com ligantes integrin, enquanto as células PDX derivadas da epitelial não costumam ter esses requisitos, em vez de favorecer interações célula-células. Essas diferenças podem ser exploradas para alcançar a separação efetiva das células PDX da contaminação das células estromais do rato. A cultura de rotação dos digestatos teciduais permite a adesão das células estrois à superfície da cultura tecidual, enquanto as aderências das células celulares impulsionam as células PDX flutuando acima da superfície da cultura rotativa para formar aglomerados multicelulares no supernante em 24-48 h. As características específicas desses clusters variam com o PDX (por exemplo, grandes, apertados, altamente esféricos ou agregados menores e mais soltos que se assemelham a cachos de uvas), mas são tipicamente de tamanhos biologicamente relevantes (50-250 μm de diâmetro), suficientes para avaliar interações celulares que dependem de contatos intercelulares.

A recuperação e o processamento do tumor inevitavelmente resultam em algum grau de morte celular colateral, seja devido a danos a curto prazo causados por interrupção mecânica/enzimática, ou incompatibilidade a longo prazo das subpopulações com as condições de cultura escolhidas. Apesar da utilidade da cultura de rotação como uma separação em massa inicial, células mortas ou moribundas são inevitavelmente transferidas com os clusters PDX e podem influenciar a cultura resultante. Essas células mortas são muitas vezes células PDX individuais que não foram integradas em um aglomerado, fibroblastos estromamais de camundongos que não podem sobreviver em condições de cultura selecionadas, ou células endoteliais particularmente frágeis. Essas células moribundas podem influenciar resultados experimentais de "sobreviventes" e podem impactar substancialmente a quantificação, por exemplo, através de ensaios de triagem de viabilidade fluorescentes baseados em imagem. Para melhorar a seleção de células PDX vivas a partir deste método, adaptamos métodos de centrifugação com passos de densidade para remover facilmente células mortas/moribundas individuais de misturas PDX e reter aglomerados multicelulares predominantemente vivos.

Para aprimorar o estudo de clusters derivados do PDX resultantes na cultura 3D, utilizamos uma plataforma de cultura de perfusão baseada em microfluidos, a OrganoPlate (Figura 1), que é uma plataforma de órgão-sobre-chip de alta produtividade que permite uma cultura simultânea de até 96 culturas 3D perfumadas e individuais em uma base de placas de microtiter de 384 poços(Figura 1A)^7,,8. Na placa microfluida de 2 pistas, um único chip de tecido é conectado por dois canais microfluidos (Figura 1B, canal de gel: vermelho, canal de perfusão: azul) que abrangem quatro poços seguidos. Os dois canais microfluidos são separados por uma pequena crista de plástico chamada Phaseguide que impede o transbordamento de um canal em seu canal vizinho adjacente, e simultaneamente permite uma interface livre de membrana entre o conteúdo do gel e do canal de perfusão⁹. Como a parte inferior da placa microfluiida é composta de vidro de microscópio, as culturas podem ser vistas na janela de observação através da parte inferior da placa com um microscópio padrão ou automatizado. A perfusão é estabelecida na placa microfluida com um roqueiro programável, utilizando gravidade para conduzir a mídia através dos canais microfluidos, entre poços de reservatórios(Figura 1C). A imitação do fluxo de perfusão recapitula mais de perto o microambiente tumoral do que a cultura estática, permitindo a incorporação do estresse da cisalhamento e maior distribuição de gases e nutrientes. Os benefícios da manutenção de uma cultura de células cancerígenas perfumadas na placa microfluida foram descritos anteriormente como culturas de câncer de mama perfundidas apresentaram viabilidade ideal em comparação com uma cultura estática 3D das mesmas células⁷.

O presente relatório descreve um método de centrifugação de gradiente de densidade adaptada para isolar clusters PDX multicelulares vivos e demonstra sua utilidade no estabelecimento de culturas PDX 3D dentro de placas microfluidas perfusíveis. Como um número crescente de laboratórios de pesquisa está buscando métodos para facilitar o uso do PDX, prevemos que os protocolos aqui apresentados serão de utilidade imediata.

Protocol

O tecido tumoral foi obtido com o consentimento do paciente e de acordo com um protocolo aprovado do Conselho de Revisão Institucional (IRB). Os xenoenxertos foram implantados, cultivados e colhidos de acordo com um protocolo aceito do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

NOTA: Todo o trabalho deve ser realizado em um armário de segurança biológica estéril para manter a esterilidade. Todas as etapas devem ser conduzidas à temperatura ambiente, a menos que seja especificada de outra forma.

1. Preparação de materiais para processamento de PDX

1. Fórceps autoclave e alça de bisturi ou lâminas de barbear.
2. Solução de enzima dissociação de descongelamento a 4 °C durante a noite ou à temperatura ambiente no mesmo dia que a dissociação do tecido.
   NOTA: O degelo a 37 °C não é aconselhável, pois isso pode inativar algumas enzimas de dissociação.
3. Prepare pelo menos 100 mL de meio de cultura PDX (mistura de nutrientes médios-nutrientes de Dulbecco F-12 [DMEM-F12] com penicilina U/mL de 100 U/mL e estreptomicina e 30% soro bovino fetal [FBS]), e pelo menos 25 mL de meio de processamento PDX (DMEM-F12 com penicilina u/mL 100 U/mL e estreptomicina e sem FBS). Armazene a 4 °C até ficar pronto para usar.

2. Dissociação pdx e purificação inicial do componente estromal

1. Reúna utensílios autoclavados, filtros de células de 70 μm (2-3), pratos de cultura de tecido redondo de 60 mm (2), placas de cultura tecidual de 6 poços, tubos de centrífugas cônicas estéreis de 1x fosfato (PBS). Cultura quente de média a 37 °C e permitir que a solução de enzima dissociação chegue à temperatura ambiente.
2. Quando o tecido PDX atingir um diâmetro de 1,0-1,5 cm em um hospedeiro do camundongo, remova cirurgicamente o tumor do camundongo por meios padrão (por exemplo, sob anestesia aceita) e armazene no gelo em um tubo de 50 mL com meio de cultura PDX(Figura 2A). Processe o tecido prontamente, através das etapas abaixo, para maximizar a viabilidade celular, de preferência dentro de 1-2 h após a colheita.
3. Transfira tecido tumoral para um tubo cônico pré-pesado de 50 mL. Enxágüe 6x com 30 mL de PBS estéril para remover sangue e contaminantes. Remova o máximo de líquido possível e pese o tecido tumoral.
4. Transfira o tecido tumoral para um prato de cultura de tecido redondo de 60 mm e pique em ~1 mm³ pedaços usando uma lâmina de barbear estéril ou bisturi.
5. Adicione 5 mL de meio de processamento PDX para coletar chorume tumoral e transfira para um novo tubo estéril de 50 mL. Enxágüe o prato de cultura com mais 5 mL de meio de processamento PDX, em seguida, com solução de enzima dissociação (tumor de 10 mL/g, pelo menos 5 mL), adicionando todas as enxágues ao tubo de 50 mL.
6. Incubar 20 min a 37 °C com agitação suave. Gire o tubo suavemente no meio do tempo de incubação.
7. Pipeta para cima e para baixo suavemente com uma pipeta sorológica para quebrar aglomerados. Células filtradoras com um coador de células de 70 μm colocado sobre um novo tubo estéril de 50 mL.
   NOTA: Pode ser necessário mais de um filtro.
8. Centrífuga a 200 x g por 5 min para células de pelota. Remova o supernatante e resuspend em 2-3 mL de meio de cultura PDX. Conte células usando um hemótmetro ou contador de células automatizada.
9. Use a Tabela 1 para estimar o número necessário de células derivadas do PDX dissociadas necessárias para alcançar a densidade celular desejada por chip.
   NOTA: Os valores na Tabela 1 destinam-se a ser um ponto de partida. Os valores reais variam devido à viabilidade/celularidade tecidual e perda celular de congelamento/recuperação. Os tumores PDX são indivíduos mesmo dentro de um dado tipo de câncer, então esses valores devem ser ajustados empiricamente.
10. Do número calculado na etapa 2.9, placa 1-2 x 10⁶ células em 5 mL de cultura PDX média por poço de uma placa de cultura tecidual de 6 poços. Incubar (37 °C, 5% DE CO₂, 95% de umidade) por 48h com agitação suave (50-55 rpm) para promover a formação de cluster(Figura 2B). Após a formação do cluster, prossiga para a seção 3 para centrifugação.
11. Criopreserve células PDX nãousadas da dissociação inicial em 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% de sulfóxido de dimetil (DMSO) ou um meio de congelamento de células primárias comercialmente disponível.
    NOTA: As células estromais do rato aderente também podem ser recuperadas da superfície da placa de tecido, se desejar, enxaguando brevemente com meio de cultura e expandindo por meios padrão.
12. Para uso posterior de células tumorais PDX criopreservadas/estroma de rato, descongelar células em um banho de água de 37 °C por 2 min. Conde e placa em uma placa de cultura de tecido de 6 poços, conforme descrito na etapa 2.10 antes de prosseguir para a seção 3. Aumente o número de células PDX em ~20% para acomodar perdas de viabilidade da criopreservação.

3. Separação baseada em centrifugação de gradiente de densidade de aglomerados derivados do PDX de células únicas

1. Prepare 20 mL de solução de gradiente de densidade de 100% misturando completamente 18 mL de solução de centrifugação de gradiente de densidade com 2 mL de solução de sal balanceada de 10x estéril da Hanks (HBSS) em um tubo cônico estéril de 50 mL. Faça 10 mL cada um de 20%, 30%, 40% e 55% de soluções gradientes de densidade diluindo esta solução 100% com HBSS estéril e misturando bem.
   NOTA: Estes volumes são suficientes para dois gradientes de 15 mL que podem ser usados para separar ~15 x 10⁶ células cada. Se separar menos de ~15 x 10⁶ células, o segundo gradiente deve ser usado como um equilíbrio para centrifugação.
2. Adicione 3 mL de solução gradiente de densidade de 55% ao fundo de um tubo cônico de 15 mL. Segurando o tubo em um ângulo, muito suavemente camada 3 mL de 40% de solução de gradiente de densidade em cima da camada de 55%, lentamente distribuindo o líquido para o lado angular do tubo para evitar misturar as camadas. Repita com a solução de gradiente de densidade de 30%.
3. Colete o supernatante das culturas de rotação PDX com uma pipeta sorológica de 5 mL, enxaguando a superfície da placa suavemente. Centrífuga a 200 x g por 2 min para células de pelota.
4. Remova o supernasciente e resuspense a pelota celular em 3 mL de solução gradiente de densidade de 20% de acordo com o número de gradientes necessários para separar as células. Cuidadosamente camada 20% solução gradiente de densidade com células na parte superior do gradiente(s). Se usar apenas um tubo de gradiente para células, cubra o tubo de gradiente de equilíbrio com solução de gradiente de densidade livre de células de 20%.
5. Tampe os tubos e centrífugas em uma centrífuga de rotor de balde de balanço por 30 min a 4 °C, 2.000 x ge 0 freio.
6. Após a centrifugação, as frações serão visíveis(Figura 2C). Colete 2-3 mL de frações em tubos frescos de 15 mL. Adicione 3−4 volumes de HBSS 1x estéril a cada fração e inverta para misturar bem.
7. Centrífuga a 1.000 x g por 3 min para células de pelota. Remova o supernascimento e resuspense a pelota da célula em 1-2 mL de meio de processamento PDX.
   NOTA: Os clusters viáveis de células PDX são tipicamente encontrados na interface de solução de gradiente de densidade de 40-55%(Figura 2D)com células mortas/moribundas únicas acumuladas na interface de solução de gradiente de densidade de 20-40% para a maioria dos PDXs testados.
8. Remova uma pequena alíquota representativa (50-100 μL) para re dissociação com um volume igual de solução de enzima dissociação para avaliar o número de célula na suspensão da célula agrupada. Conte células com hemótmetro ou contador de células automatizada.

4. Preparação de hidrogel e semeadura de placas microfluídicas

1. Reconstituir soluções de hidrogel HA (HA, HA-SH modificadas por tiol; diacrilato de polietileno glicol de polietileno reativo de tiol-reativo, PEGDA) de acordo com as instruções do fabricante.
2. Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 μL de HBSS a todos os poços em colunas de janelas de observação (coluna 3, 7, 11, 15, 19, 23) de uma placa microfluidic de 2 pistas para manter a umidade da cultura e condições ideais de imagem.
3. Calcule o volume de suspensão celular da seção 3 necessária para 50 μL de hidrogel na densidade celular desejada (ou seja, 5.000 células/μL). Para semear uma placa microfluida, aliquot o volume calculado em cada um dos 4 tubos de centrífuga estéril de 1,5 mL.
   NOTA: Os hidrogéis HA têm um tempo fixo para gelação. Ajuste o volume de alíquotas de solução de gel para a eficiência do usuário na dispensação se ocorrer gelação prematura.
4. Ajuste o pH da solução HA-SH para 8.0 com 1 N NaOH imediatamente antes de ser usado. Realize uma gelação de teste misturando 40 μL de HA-SH com 10 μL de PEGDA e monitorando a gelação ao longo do tempo. A gelação geralmente começa 5-8 min depois de misturar HA-SH com o crosslinker PEGDA.
5. As alíquotas de suspensão de células centrífugas por 2 min (200 x g, temperatura ambiente) para células de pelotização. Remova cuidadosamente as células supernascidas e resuspend no volume apropriado de HA-SH.
   NOTA: O hidrogel final é uma solução HA-SH:PEGDA de 4:1 (em volume) para que as células sejam resuspendidas em 40 μL de HA-SH para um volume final de 50 μL.
6. Adicione 10 μL de PEGDA a uma alíquota de células em HA. Misture bem e espere 1−3 min (dependendo do tempo de gelação da etapa 4.4) antes de semear a placa microfluida.
   NOTA: Permitir a reação de gelação do início antes da semeadura ajuda a minimizar a acomodação celular.
7. Afixe uma dica para dispensar volumes de 1,5 μL a um único canal repetindo pipeta e carga com células na solução de hidrogel HA. Lembre-se de manter a alíquota de hidrogel bem misturada para garantir a distribuição uniforme da célula.
8. Para semear a placa microfluida, alinhe a ponta pipeta perpendicular à placa enquanto coloque suavemente a ponta no centro da entrada de gel (colunas 1, 5, 9, 13, 17, 21) para garantir o contato, mas sem pressão ao dispensar a solução de hidrogel. Trabalhando rapidamente para evitar a solidificação prematura do hidrogel, dispense 1,5 μL de solução de gel em cada entrada de gel.
9. Observe o status de preenchimento dos canais microfluidos visualizando a partir da parte superior da placa, parte inferior da placa, ou por microscópio, e avalie o carregamento, utilizando a Figura 3 como guia (carregamento bem sucedido na Figura 3A,orientação de posicionamento de tubulação na Figura 3B, carregamento perdido na Figura 3C, não preenchido para terminar na Figura 3D, transbordar na Figura 3E). Identifique quaisquer ajustes necessários na técnica que possam melhorar o sucesso do preenchimento para a próxima rodada de chips (consulte discussão para dicas de solução de problemas).
10. Repita as etapas 4.6-4.9 com as 3 alíquotas restantes das células na solução HA. Inverta a placa enquanto prepara a próxima alíquota (~1 min).
    NOTA: O tempo de espera de 1 min e a inversão da placa melhoram a distribuição 3D das células reduzindo a fixação celular à medida que ocorre a gelação.
11. Depois que todos os chips forem preenchidos, incubar a placa a 37 °C em uma incubadora umidificada até que a gelação esteja completa (~45 min).
12. Utilizando o manual fornecido, certifique-se de que o roqueiro de perfusão esteja instalado na incubadora de cultura celular com as configurações corretas de perfusão (ângulo de 14°, intervalos de 4 minutos).
13. Adicione 50 μL de cultura PDX média a todas as entradas médias (colunas 2, 6, 10, 14, 18, 22) e verifique se os canais preenchidos corretamente invertendo a placa. Bata suavemente a placa contra uma superfície para incentivar o líquido a preencher os canais microfluidos.
14. Adicione 50 μL de DMEM-F12 (10% FBS) para todas as tomadas médias (coluna 4, 8, 12, 16, 20, 24). Se alguma bolha de ar estiver presa no canal de perfusão, remova tocando suavemente a placa contra uma superfície.
15. Usando um microscópio e um formulário de layout de placa(Figura Suplementar 1),recorde de preenchimento de chip. Exclua os chips mal preenchidos de uso experimental posterior.
16. Coloque a placa em um roqueiro inclinado definido para uma inclinação de 14° e um ciclo de 4 minutos para começar a perfusão. Substitua o meio de cultura PDX a cada 2 dias (primeiro 50 μL na entrada, depois 50 μL na tomada).

5. Coloração celular, imagem e quantificação de imagem

1. Prepare uma solução de ensaio de viabilidade celular contendo três corantes fluorescentes (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).
   1. Preparar soluções de estoque de cada corante da seguinte forma: Hoechst 33342 a 1,6 mM (1 mg/mL) em água desionizada; calcein AM a 4 mM em DMSO anidro; ethidium homodimer-1 a 2 mM em DMSO/H₂O (1:4, v/v).
      NOTA: As soluções calcein AM e ethidium homodimer-1 são fornecidas no kit notatado na Tabela de Materiais.
   2. Prepare uma única solução de trabalho em HBSS ou meio sem fenol, contendo os três corantes. Otimize a concentração final de trabalho para cada tipo e matriz celular, dentro das faixas de 1,6−8,0 μM para Hoechst 33342, 0,1−10 μM para calcein AM e 0,1−10 μM para ethidium homodimer-1.
2. Remova o meio de cultura e aplique a solução de corante de viabilidade de trabalho aos chips microfluidos desejados (75 μL na entrada, 25 μL na tomada) e coloque de volta no roqueiro de perfusão na incubadora de cultura celular por 1h.
3. Imagem dos vidros de observação das culturas manchadas usando um microscópio confocal manual ou automatizado(Tabela de Materiais)com filtros fluorescentes (listados como comprimentos de onda de excitação/emissão, em nm) observar todos os núcleos (Hoechst 33342, 350/461), núcleos de células mortas (ethidium homodimer-1, 528/617) e citoplasma de células vivas (calcein AM, 494/517).
4. Capture 140 μm Z-stacks com um tamanho de passo de ≤ 1 μm usando um objetivo de ar de 20x. Três campos de visão são necessários para visualizar todo o microcanal com uma pequena quantidade de sobreposição. Para evitar a dupla amostragem, imagem apenas dois campos de visão por chip.
   NOTA: As condições de imagem devem ser otimizadas para garantir a amostragem adequada de NyQuist. Na experiência dos autores, um sistema de imagem rápida, baseado na desconvolução de uma fonte convencional de epi-fluorescência ou modo de varredura de ressonância em um confocal, é necessário para avaliar totalmente uma pilha Z completa, com três cores laser, em 96 chips em uma placa dentro de uma quantidade razoável de tempo (aproximadamente 3,5 h com imagem automatizada, incluindo configuração).
5. Usando o software de análise de imagens, teste as imagens da pilha Z para os dados quantificados desejados, como morfologia, estado de agregação ou outros recursos. Para quantificar a viabilidade celular, conte o número de células mortas (vermelhas) e núcleos celulares totais (azul).

Representative Results

Um roqueiro de perfusão programável foi preparado em uma incubadora padrão de cultura celular tomada pela água, e placas microfluídicas de duas pistas foram preparadas em um armário padrão de biossegurança para carregamento(Figura 1). Um tumor PDX MDA-PCA-118b foi expandido in vivo, colhido quando atingiu um tamanho máximo, e dissociado como descrito no protocolo seção 2 para criar uma suspensão de chorume de células, aproximadamente em um estado de célula única(Figura 2A). O chorume foi dispensado em placas de cultura de tecido de 6 poços, e colocado em um rotador XY como descrito, por 48 h. Estroma de rato preso à parte inferior da placa de cultura tecidual, como foi descrito anteriormente, e as células PDX humanas permaneceram flutuando no meio, montadas em aglomerados(Figura 2B). Células únicas desmontadas também eram visíveis em toda a solução.

Um gradiente de densidade de passos foi estabelecido em um tubo de centrífuga usando os métodos na seção de protocolo 3. A suspensão sobrenante das células PDX foi aspirada suavemente da placa multiwell, carregada no gradiente do degrau, e centrifulada como descrito. Após a centrifugação, uma banda nebulosa, contendo os clusters PDX, era visível perto da interface entre as frações 2 e 3, e células únicas foram identificadas na interface entre as frações 1 e 2 (Figura 2D). Frações foram coletadas como descrito, diluídas ainda mais no HBSS e centrifadas novamente para remover a solução de gradiente de densidade. O supernascimento foi aspirado, e as pelotas de células resultantes foram resuspendidas em meio de processamento PDX. Uma pequena alíquota de cada fração processada foi avaliada por microscópio, para confirmar que a fração esperada continha cluster PDX, e que a fração separada continha principalmente células únicas.

As soluções de hidrogel HA foram reconstituídas conforme descrito na seção de protocolo 4, e os clusters PDX foram resuspendidos na solução de hidrogel. As soluções PDX foram carregadas em chips na placa microfluida e avaliadas para carregamento bem-sucedido(Figura 3). Na maioria dos casos, >90% dos chips foram carregados com sucesso após alguma prática com a técnica e ajuste dos volumes de carregamento. Depois de carregar o número desejado de chips, e incubar para gelação como descrito, o meio de cultura PDX foi adicionado à placa microfluida, e a placa foi cultivada com perfusão.

Utilizando corantes fluorescentes e os métodos na seção de protocolo 5, e microscopia confocal, a viabilidade e a morfologia da cultura PDX microfluídica 3D foram avaliadas em condições separadas de centrífugas de gradiente não paraparadas e de densidade(Figura 4A). As imagens dessas placas foram registradas como pilhas Z no microscópio confocal e avaliadas para viabilidade celular em software de análise de imagens. No primeiro dia, as culturas submetidas ao método de separação apresentaram 10 vezes menos células mortas (vermelhas) em comparação com culturas não paraparadas(Figura 4B). É importante ressaltar que os aglomerados separados consistiam principalmente de células vivas (verde). Não foi identificada diferença estatisticamente significativa para a distribuição do tamanho do cluster(Figura 4C).

As culturas foram mantidas na placa microfluida por sete dias (Figura 5A). As amostras foram avaliadas periodicamente, utilizando os mesmos métodos de imagem e quantificação acima. O número total de células vivas permaneceu consistente (Figura 5B) e os clusters mantiveram ~80% de viabilidade(Figura 5C) ao longo da vida da cultura. A densidade celular na condição não paralisada é aproximadamente um terço da condição separada porque as células únicas estão vivas durante a contagem de células, mas morrem rapidamente dentro do hidrogel. Há também mais variabilidade no tamanho do cluster sem a separação gradiente de densidade.

Figura 1: A placa microfluídica perfusível de 2 pistas. (A) A placa microfluida de 2 pistas é uma placa microtiter padrão de 384 poços com um fundo modificado composto por canais microfluidos embutidos entre placas de vidro. Cada placa consiste em 96 chips de tecido para a cultura celular 3D. (B) Como visto a partir do topo da placa, um único chip microfluido de 2 pistas é composto por 4 poços seguidos conectados pelo canal de gel (vermelho) e canal de perfusão (azul); a entrada de gel, entrada de perfusão, janela de observação e saída de perfusão. (C) A perfusão é alcançada na placa microfluidica com um roqueiro programável que usa a gravidade para conduzir a mídia entre entrada de perfusão e poços de saída que são reservatórios de mídia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Isolamento do cluster PDX. (A) Disseque o tecido PDX primário e dissociar-se em uma única suspensão celular contendo células PCa humanas e estroma tumor do rato. Tanto criopreservar a mistura celular dissociada ou (B) adicionar à cultura de rotação para reclusar células tumorais e permitir que as células estromais do rato aderam à placa de cultura tecidual (48 h). (C) Use centrifugação gradiente de densidade para remover células mortas residuais e (D) coletar clusters PDX viáveis na interface entre camadas de gradiente de densidade 40% e 55% (caixa vermelha tracejada). (E) Recupere os clusters PDX, resuspenque-se na solução precursora do hidrogel e dispense a placa com uma pipeta repetindo. (F) Cálculos de exemplo, correspondentes à Tabela 1,demonstram os números de células iniciais necessários para atingir uma concentração celular final desejada para todos os chips em uma placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Monitorando o carregamento da placa microfluidica. O sucesso e os erros de carregamento podem ser avaliados por olho (nas vistas superior e inferior), com confirmação por microscópio. (A) O carregamento bem-sucedido é identificado por uma faixa de perfusão aberta (brilhante) nas vistas superior e inferior, e uma faixa de gel ligeiramente mais escura na vista inferior. A visualização por microscópio confirma que a pista de gel foi preenchida completamente com células e precursores de gel, sem derramar na pista adjacente. (B) Desenho animado demonstrando a colocação correta da ponta da tubulação durante a dispensação do gel, com a colocação correta sendo um pouco acima da porta de entrada (esquerda) e a colocação incorreta sendo fora do centro (médio) ou aplicando força na porta de entrada (à direita). (C) Faixas brilhantes em todas as vistas indicam um carregamento perdido, sugerindo que a ponta da tubulação não foi corretamente colocada dentro da entrada de gel. (D) Um preenchimento parcial da faixa de gel (não preenchido até o fim) é identificado pela seta vermelha, que mostra onde a frente de solução de gel avançando foi interrompida, seja por uma bolha de ar presa, ou uma pausa prematura no carregamento. A seta vermelha na visualização do microscópio identifica o mesmo local. (E) O conteúdo da pista de gel transbordou o PhaseGuide, derramando-se na faixa de perfusão e, finalmente, bloqueando-a. Este transbordamento é visível na vista inferior pela aparência escura das pistas de gel e perfusão. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Avaliação de coloração celular e viabilidade na placa microfluidica. (A) Utilizando manchas fluorescentes, a viabilidade foi avaliada em aglomerados celulares PCa não parasparados e separados semeados na placa microfluida (todos os núcleos: Hoechst 33342, azul; células mortas: ethidium homodimer-1, vermelho; e células vivas: calcein AM, verde). Barra de escala = 50 μm. (B) As células mortas totais foram quantificadas no primeiro dia da cultura e as culturas PDX separadas MDA-PCa-118b demonstraram uma diminuição significativa no número de células mortas. (C) A quantificação do tamanho do cluster para PCa PDXs, em culturas separadas e desseparadas, apresentou um ligeiro aumento, mas sem diferença estatisticamente significativa. Barras e barras de erro no painel B representam o desvio médio e padrão de 4 imagens por condição (2 chips com 2 imagem/chip). O asterisco (*) representa diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) em comparação com a condição não paralisada usando o teste t de um aluno. Para a caixa e o enredo do bigode no painel C, o ícone cruzado indica a média, e a linha horizontal representa a mediana, de 4 imagens por condição (2 chips com 2 imagem/chip). A caixa contém 50% dos dados, enquanto os bigodes estendem-se ao diâmetro mínimo e máximo do cluster para cada condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Caracterização de MDA-PCa-118b separado na placa microfluida. (A) Agrupamentos de células cancerígenas PCa separados (esquerda) e não parasparados (direita) foram semeados na placa microfluida e perfundidos por até sete dias. As culturas foram manchadas com três corantes específicos para todos os núcleos (Hoechst 33342, azul), células mortas (ethidium homodimer-1, vermelho) e células vivas (calcein AM, verde). Barra de escala = 50 μm. (B,C) Quantitação do número de células e viabilidade cultural de imagens ao longo de uma semana de cultura a uma densidade de semeadura de 8.000 células/μL. Barras e barras de erro representam o desvio médio e padrão de quatro imagens por condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Densidade celular final desejada em chip único (células/μL)	Volume carregado por chip (μL)	Número de chips na placa microfluidic	Mutiplier para volume extra	Figura 2C: Número de células separadas necessárias para uma placa de microwell completa (etapa 3.8)	Multiplicador para perdas celulares (remoção de estroma, morte celular)	Figura 2B: Inicial # de células PDX dissociadas para protocolo (etapa 2.8)
2,500	1.5	96	1.3	4.7E+05	3	1.4E+06
5,000	1.5	96	1.3	9.4E+05	3	2.8E+06
10,000	1.5	96	1.3	1.9E+06	3	5.7E+06
20,000	1.5	96	1.3	3.7E+06	3	1.1E+07

Tabela 1: Material PDX inicial e final aproximado necessário para carregar uma única placa microfluida de 2 pistas.

Figura suplementar 1: O layout da placa microfluidica de 2 pistas. Depois de semear a placa microfluidic, registou o sucesso do carregamento individual de chips (carga bem sucedida, não preenchida para terminar ou transbordar) usando o layout da placa de 2 pistas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui descrevemos um método para processar e cultivar células tumorais viáveis derivadas de PDX em um sistema de cultura 3D de alta produtividade e perfundido. Embora este protocolo utilize tecido PDX PCa, é igualmente eficaz para outros tumores derivados da epitelial. As características tumorais variam entre linhas PDX individuais mesmo dentro do mesmo tecido de origem (próstata, mama, etc.). Algumas linhas PDX são mais fibrosas e difíceis de isolar células viáveis, enquanto outras são mais celulares. O tamanho do tumor observado aqui pode ser variado dentro das diretrizes da IACUC para fornecer mais tecido para tumores particularmente de baixo rendimento. Além disso, fragmentos tumorais podem ser coletados após a etapa 2.7, re digeridos e agrupados com a digestão inicial para aumentar o rendimento. Isso é especialmente útil para tumores mais extracelulares de matriz pesada. Rodadas adicionais de digestão após duas tipicamente resultam em baixa viabilidade e baixo rendimento e não são recomendadas.

A purificação de populações derivadas do PDX, para remover células mortas/moribundas ou contaminar células hospedeiras, é benéfica para a cultura 3D estendida e quantificação das células cancerosas desejadas. O primeiro passo da purificação descrito aqui — cultura de suspensão em um volume relativamente grande de mídia, juntamente com a rotação XY em velocidades moderadas — promove 1) a extração seletiva de células altamente dependentes da adesão, tipicamente fibroblastos estrômicos de camundongos e 2) a formação de agregados celulares para fornecer contato célula-célula pró-sobrevivência celular. A eficiência da extração de fibroblastos de camundongos derivados do hospedeiro durante a etapa de rotação XY de 48 h é muito alta, como descrito em Fong et al.⁵. Co-culturas de PCa-fibroblast intencionais são certamente viáveis, como demonstramos, mas requerem uma matriz afinada (para apoiar a adesão do fibroblasto à matriz) e uma proporção maior de fibroblastos. O PDX ocasional, geralmente aqueles com características mais mesenquimais, aderirão mais facilmente às superfícies da cultura tecidual durante a etapa de cultura de rotação de 48 horas. As linhas PDX devem ser monitoradas de perto na primeira vez que este protocolo é realizado, e imunossuídas para HNA, para identificar a proporção de células humanas nas populações aderentes e não aderentes. As placas tratadas com cultura não tecidual devem ser usadas para a formação de cluster com estes PDXs. As células estromais do rato ainda aderirão eventualmente à superfície, mas a separação não será tão eficiente.

Após a cultura de rotação, o supernascimento contendo a população não aderente é processado através do método de centrifugação de gradiente de densidade descrita. O protocolo aqui relatado pode ser simplificado para excluir pelo menos uma etapa de densidade (por exemplo, usando apenas as soluções de 20%, 40% e 55%), mas todas as quatro devem ser usadas ao estabelecer este método a cada novo PDX. Os aglomerados multicelulares são facilmente separados das células individuais por este método, e em grande parte mantêm seu fenótipo agrupado e outras características. A população de células únicas descartadas representa ou (a) células que estavam mortas/morrendo antes da etapa de rotação de 48 horas, e, portanto, nunca se integraram a um aglomerado, ou (b) células que permaneceram vivas após a rotação de 48 horas, mas ainda não se integraram em aglomerados. É importante notar que o grupo (b) pode incluir células que alguns investigadores acham desejáveis; por exemplo, alguns relatórios descreveram culturas celulares primárias contendo células-tronco/progenitoras precoces, ou células resistentes a medicamentos, que flutuam dentro de células únicas pouco aderentes acima de uma população de outra forma aderente¹⁰. Relevantes para estudos de câncer, células tumorais circulantes (CTCs), células de início de tumores (TICs) ou outros tipos de células similares que promovem metástase podem fazer parte dessa população de células únicas. Portanto, os investigadores que utilizam nosso protocolo devem analisar cuidadosamente a população de células únicas descartadas para garantir que quaisquer células de interesse não tenham sido perdidas. Em nossas mãos, a grande maioria dessas células individuais são uma pequena fração de células cancerígenas que estão mortas/morrendo devido ao protocolo inicial de dissociação de tecidos, ou fibroblastos de roedores que já estão procedendo através de anoikis.

Recomenda-se fortemente praticar a técnica de semeadura da placa microfluida com células menos preciosas para garantir o sucesso ao trabalhar com material PDX limitado e valioso. Esteja atento à colocação da ponta durante a dispensação, pois é provável que a técnica inadequada resulte em 1) estouro se a pressão for aplicada durante o carregamento, ou 2) canais vazios ou parcialmente preenchidos se a ponta não estiver centrada sobre a porta de entrada. A gelação prematura também fará com que os canais não sejam preenchidos até o fim. Se isso ocorrer, diminua o tempo de espera entre a adição do crosslinker PEGDA e a distribuição da solução de gel, ou trabalhe com alíquotas menores de solução de gel por vez. Os volumes de dispensação utilizados neste protocolo são bem otimizados para o sucesso com hidrogéis HA. O uso de soluções mais viscosas, como o Matrigel neste sistema, requer um aumento no volume de dispensação para ~2 μL para o preenchimento adequado dos canais microfluidos. Observe também que a escolha de incrementos de 50 μL na etapa 4.3, a preparação de quatro pelotas de células nesta mesma etapa e as resuspensões repetidas na etapa 4.10 são deliberadas; embora produzam mais material do que o necessário, eles também fornecem excessos para contabilizar perdas da pipeta repetindo.

Deve-se notar que cada PDX provavelmente terá uma morfologia única e distribuição de tamanho dentro deste modelo de cultura 3D. Em certo sentido, isso é esperado, devido à diversidade da doença do paciente, histórico tecidual, parâmetros matriciais e muitos outros fatores. Uma avaliação expansiva de múltiplas linhas de câncer de próstata em Matrigel demonstrou essa potencial diversidade¹¹. Ainda assim, os investigadores podem se surpreender ao encontrar uma grande variação nos parâmetros acima. Em um manuscrito em preparação, apresentamos um amplo olhar sobre vários PDXs nesta plataforma de cultura; as células mantêm uma resposta consistente dentro de cada tipo PDX, mas podem variar substancialmente entre os espécimes, resultando em aglomerados que são, por exemplo, grandes com alta densidade celular por aglomerado, ou menores, com conexões intercelulares mais frouxas. O comportamento específico de cada PDX deve ser avaliado pelos investigadores ao longo de vários ensaios, para confirmar uma morfologia previsível e característica. Os investigadores podem esperar que os espécimes sigam os comportamentos gerais descritos neste artigo.

Em resumo, o protocolo apresentado oferece aos pesquisadores um novo método para empregar PDXs ex vivo em uma plataforma que permite o ajuste fino das condições de cultura e a incorporação de pistas ambientais 3D relevantes, como matriz extracelular específica de tecido (ECM) e fluxo de perfusão, permitindo a sobrevivência celular estendida ao longo de vários dias ou semanas. A caracterização detalhada dessas culturas foi alcançada pelas análises coloritivas e morfológicas aqui demonstradas. Além disso, se necessário, as culturas podem ser submetidas a ensaios baseados em leitores de placas, rotulagem imunofluorescente ou utilizadas para a preparação de lysates que permitem uma caracterização molecular adicional. Embora tenhamos publicado anteriormente alguns elementos da cultura PDX 3D dentro de hidrogéis, esta aplicação de purificação multistep é nova, fácil de empregar em um laboratório padrão, e bem sucedida em reter culturas representativas de alta viabilidade. A plataforma OrganoPlate, em suas variedades de 2 pistas e 3 pistas, oferece mais complexidade através de seu modelo de perfusão tecidual, e uma oportunidade chave para usar ainda menos células por experimento. Em comparação com nossos modelos anteriores, a plataforma microfluida reduziu os requisitos celulares em um fator de ~30, por experimento, o que é um enorme benefício, dada a escassa disponibilidade de tecido tumoral PDX na maioria dos laboratórios. O sistema microfluido permite imagens estendidas, imunostaining e imagens fáceis, através de uma população celular que é grande o suficiente (n = ~2.000-4.000 células por janela de imagem) para permitir quantificação do fenótipo dentro do contexto da organização espacial.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1N NaOH			any suitable tissue culture grade
60 mm round tissue culture dishes			any suitable
6-well tissue culture plates			any suitable
70 µm cell strainers	Corning	431751	or equivalent
Centrifuge	Eppendorf	5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes	or equivalent
Density gradient centrifugation solution	Millipore Sigma	P1644	Percoll
Dimethylsulfoxide			any suitable tissue culture grade
Dissociation enzyme solution	StemCell Technologies	07921	ACCUMAX
DMEM-F12	ThermoFisher Scientific	11039021	or equivalent
Forceps			any suitable
HA hydrogel kit	ESI BIO	GS311	HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)
Hanks Balanced Salt Solution	Lonza	10-527F	or equivalent
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Hemocytometer	Fisher Scientific	02-671-51B Hausser BrightLine	or equivalent
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H1398	or equivalent
Image processing software	Oxford Instruments	Imaris 9.3	or equivalent
LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)	ThermoFisher Scientific	L3224	or equivalent
Microfluidic culture plate	Mimetas	9603-400-B	2-lane OrganoPlate
Microscope	Nikon	A1R	or equivalent
Multichannel pipette	Eppendorf	3125000036	or equivalent
PDX-derived tumor tissue			obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140-122	or equivalent
Perfusion rocker	Mimetas	OrganoPlate Perfusion Rocker Mini
pH strips (pH 5-9)			any suitable
Phosphate-buffered saline solution	Lonza	17-516F	or equivalent
Razor blades			any suitable
Rotating xy-shaker	VWR	Advanced 3500 Orbital Shaker	or equivalent
Scalpel handle			any suitable
Single channel repeating pipette	Eppendorf	22260201
Sterile, 15mL conical centrifuge tubes			any suitable
Sterile, 50mL conical centrifuge tubes			any suitable