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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

बेसिलस एंथ्रेसिस और अन्य एनकैप्सुलेटेड रोगजनकों के खिलाफ वैक्सीन विकास में कार्यात्मक एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए ऑप्सोनो-पालन परख

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60873
Automatic Translation
*1, *1, 1,3, 2
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual
* These authors contributed equally

Summary

ऑप्सोनो-पालन परख टीका विकास में एंटीबॉडी के ऑपसोनिक कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए ऑप्सोनो-फैगोसाइटिक हत्या परख के लिए एक वैकल्पिक तरीका है।

Abstract

ओपोनो-पालन परख एक कार्यात्मक परख है जो पेशेवर फैगोसाइट्स के लिए बैक्टीरियल रोगजनकों के लगाव की गणना करती है। क्योंकि अनुवर्ती phagocytosis और हत्या के लिए अपेक्षित है, परख opsono-phagocytic हत्या परख के लिए एक वैकल्पिक तरीका है । ऑप्सोनो-पालन परख का एक लाभ निष्क्रिय रोगजनकों और स्तनधारी सेल लाइनों का उपयोग करने का विकल्प है, जो कई प्रयोगों में मानकीकरण की अनुमति देता है। परख में एक निष्क्रिय रोगजनक का उपयोग जैवसेफ्टी स्तर 3 संक्रामक एजेंटों और अन्य उग्र रोगजनकों के साथ काम करने की सुविधा भी प्रदान करता है। हमारे काम में, ऑप्सोनो-पालन परख का उपयोग एंटीबॉडी की कार्यात्मक क्षमता का आकलन करने के लिए किया गया था, एक एंथ्रेक्स कैप्सूल आधारित वैक्सीन के साथ प्रतिरक्षित जानवरों के सेरा से, एक माउस मैक्रोफेज सेल लाइन, रॉ 264.7 के लिए निश्चित बैसिलस एंथ्रेसिस के पालन को प्रेरित करने के लिए। मैक्रोफेज का पालन करने वाले बैसिली की छवियों को कैप्चर करने के लिए स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। सीरम में एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी की उपस्थिति के साथ वृद्धि का पालन सहसंबद्ध किया गया था। गैर-मानव वानरों ने उच्च सीरम एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी सांद्रता का प्रदर्शन किया, एंथ्रेक्स चुनौती से संरक्षित थे। इस प्रकार, ऑप्सोनो-पालन परख का उपयोग सेरा में एंटीजन विशिष्ट एंटीबॉडी के जैविक कार्यों को स्पष्ट करने, वैक्सीन उम्मीदवारों और अन्य चिकित्सीय चिकित्सा की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने और प्रतिरक्षा के संभावित सहसंबद्ध के रूप में सेवा करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

एक रोगजनक की मान्यता, पालन, आंतरिककरण और क्षरण फैगोसाइटोसिस1का अभिन्न अंग है, जो मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक प्रमुख मार्ग है जो पहले 18832, 3में इलिया मेचनिकोफ द्वारा वर्णित है। फागोसाइटिक ल्यूकोसाइट्स, साथ ही प्रतिरक्षा प्रणाली की अन्य कोशिकाएं, लक्ष्यों के चयन में अत्यधिक भेदभावपूर्ण हैं; वे पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआरएस)4,5के अपने प्रदर्शनों की सूची द्वारा रोगजनक संबद्ध आणविक पैटर्न के माध्यम से "संक्रामक गैर-स्व" और "गैर-संक्रामक स्वयं" के बीच अंतर करने में सक्षम हैं । एक रोगजनक की मेजबान मान्यता भी मेजबान ओपसोनिन के बाध्यकारी के साथ हो सकती है, जैसे पूरक और एंटीबॉडी6। इस प्रक्रिया, opsonization कहा जाता है, इन अणुओं के साथ रोगजनक कोट, opsonic रिसेप्टर्स (जैसे, पूरक और एफसी रिसेप्टर्स) के लिए बाध्यकारी पर आंतरिककरण बढ़ाने6। एक रोगजनक के लिए एक फागोसिट का पालन करने के लिए, उनके कॉग्नेट लिगांड के साथ कई रिसेप्टर्स का सामूहिक बाध्यकारी आवश्यक है। तभी आंतरिककरण शुरू करने के लिए मेजबान कोशिका के अंदर सिग्नलिंग कैस्केड को ट्रिगर और बनाए रखसकतेहैं ।

रोगजनकों की मंजूरी और संक्रमण की रोकथाम में फैगोसाइटोसिस के महत्व के कारण, बाह्य रोगजनकों ने अपने अस्तित्व को लम्बा करने के लिए इस प्रक्रिया को विकृत करने के कई तरीके विकसित किए हैं। महत्व की एक रणनीति एनियोनिक पॉलीमेरिक (जैसे, पॉलीसैकराइड या पॉलीमिनो एसिड) कैप्सूल का उत्पादन है जो इसके आवेश के आधार पर एंटी-फैगोसाइटिक है, खराब इम्यूनोजेनिक है, और पीआरआरएस6,7से बैक्टीरियल लिफाफे पर अणुओं को ढाल देता है। क्रिप्टोकोकस नियोफॉर्मेंस और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया जैसे रोगजनकों में सैकराइड पॉलिमर से बने कैप्सूल होते हैं, जबकि स्टेफिलोकोकस एपिडर्मिडिस और कुछ बैसिलस प्रजातियां पॉली-ɣ-ग्लूटामिक एसिड (पीजीजीए)7,8का उत्पादन करती हैं। फिर भी अन्य रोगजनक कैप्सूल का उत्पादन करते हैं जो गैर-संक्रामक स्वयं के समान होते हैं। उदाहरण के लिए, स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन और बी सेरियस के रोगजनक तनाव में एक हायलूरोनिक एसिड कैप्सूल होता है जो न केवल एंटी-फैगोसाइटिक होता है बल्कि जिसे प्रतिरक्षा प्रणाली9,10द्वारा विदेशी के रूप में भी मान्यता नहीं दी जा सकती है।

कैप्सूल का वाहक प्रोटीन के लिए संाधीनता उन्हें गरीब, टी-स्वतंत्र एंटीजन से अत्यधिक इम्यूनोजेनिक टी-निर्भर एंटीजन में परिवर्तित करती है जो उच्च सीरम एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी टाइटर्स11,12को प्रेरित कर सकती है। यह रणनीति एस निमोनिया, हीमोफिलस इन्फ्लूएंजाऔर नेसेरिया मेनिंगिटाइड्स11के खिलाफ लाइसेंस प्राप्त टीकों के लिए कार्यरत है । एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी की ओपसोनिक गतिविधियों का मूल्यांकन आमतौर पर ओपसोनो-फैगोसाइटिक किलिंग परख(ओपीकेए)13, 14,15,16द्वारा किया गया है। ये परखते हैं कि क्या कार्यात्मक एंटीबॉडी फैगोसाइटोसिस को ट्रिगर कर सकते हैं और14की हत्या कर सकते हैं। हालांकि, बी एंथ्रेस 17सहित टियर 1 बायोलॉजिकल सेलेक्ट एजेंट्स एंड टॉक्सिन्स (बीएसएटी) जैसे संक्रामक रोगजनकों के साथ ओपीकेए का उपयोग खतरनाक है और सुरक्षा जोखिम प्रस्तुत करता है; इन परख एक चुनिंदा एजेंट की व्यापक हैंडलिंग की आवश्यकता है। चुनिंदा एजेंट हैंडलिंग केवल प्रतिबंधित जैवसेफ्टी स्तर 3 (बीएसएल-3) प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है; इन क्षेत्रों में काम कई सुरक्षा और सुरक्षा सावधानियों के कारण लंबी परिचालन प्रक्रियाओं की मांग करता है जिनका पालन किया जाना चाहिए। बीएसएल-3 प्रयोगशालाएं भी आमतौर पर ओपीकेए के काम के लिए उपयोग किए जाने वाले विशेष उपकरणों से सुसज्जित नहीं होती हैं, जैसे माइक्रोस्कोप और साइटोमीटर। इस प्रकार, हमने निष्क्रिय बैक्टीरिया18 , 19के उपयोग के आधार पर एक वैकल्पिक परख विकसित की । हम इसे एक ऑप्सोनो-पालन परख (ओएए) के रूप में संदर्भित करते हैं जो आंतरिककरण और परख आउटपुट के रूप में हत्या पर निर्भर नहीं है; इसके बजाय, अफीम निष्क्रिय रोगजनकों का पालन फागोसिटोसिस के सूचकांक के रूप में उपयोग किया जाता है। मशीनी रूप से, ओएए एक उपयुक्त विकल्प है क्योंकि पालन एक प्राथमिकताओं होता है और आंतरिककरण और इंट्रासेलुलर हत्या के साथ घनिष्ठ रूप से जुड़ा हुआ है। जैव रक्षा के नजरिए से, ओएए को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि इसके लिए संक्रामक एजेंट की न्यूनतम हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, प्रयोगात्मक रूप से ओपीकेए की तुलना में कम अवधि की होती है, और निष्क्रिय रोगजनक के स्टॉक का उत्पादन और स्थानांतरित होने के बाद बीएसएल-2 प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है।

हम गैर-मानव वानरों (एनएचपीएस) के सेरा में पाए जाने वाले एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी के ओपसोनिक फ़ंक्शन की जांच करने के लिए ओएए के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं, जो एक कैप्सूल संयुग के साथ टीका लगाया जाता है [यानी पीजीजीए बी एंथ्रैसिस से एनिसिया मेनिंगिटाइड्सके बाहरी झिल्ली प्रोटीन परिसर (ओएमपीसी) में संयुग्मित किया जाताहै ] 20। सीरम ओपोनाइज्ड बेसिली को एक अनुयायी माउस मैक्रोफेज सेल लाइन, रॉ 264.7 के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। निर्धारण के बाद, सेल मोनोलेयर और अनुयायी बेसिली को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया था। जब बेसिल को सीरम20को नियंत्रित करने की तुलना में कैप्सूल संयोजित कैप्सूल के साथ टीका लगाया गया था , तब बैक्टीरियल पालन में वृद्धि हुई . एंथ्रेक्स चैलेंज20 , 21के अस्तित्व के साथ पालन सहसंबद्ध । इस प्रकार, ओएए के उपयोग ने एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी के कार्य की विशेषता है और हमारे वैक्सीन उम्मीदवार के परीक्षण में बहुत सुविधा प्रदान की है।

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Protocol

पशु कल्याण अधिनियम, लोक स्वास्थ्य सेवा नीति और पशुओं से संबंधित अन्य संघीय कानूनों और विनियमों और पशुओं से जुड़े प्रयोगों के अनुपालन में, यहां वर्णित अनुसंधान एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति-अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत आयोजित किया गया था । जिस सुविधा का यह शोध किया गया था, वह प्रयोगशाला पशु देखभाल, अंतर्राष्ट्रीय के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा मान्यता प्राप्त है और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में बताए गए सिद्धांतों का पालन करती है, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद, 201124।

1. संस्कृति और सेल लाइन के रखरखाव, रॉ २६४.७

नोट: निम्नलिखित प्रक्रियाओं को एसेप्टिक तकनीकों के साथ किया जाना चाहिए।

  1. 30 मिनट के लिए एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में हीट भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) पूरक निष्क्रिय करने के लिए।
    नोट: 30 मिनट की निष्क्रियता का समय तब शुरू होता है जब एफबीएस 56 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है। तापमान की निगरानी के लिए, एक ही पानी स्नान में एक बीकर में पानी की एक समान मात्रा गर्म करें। एक बार पानी 56 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है, तो एफबीएस के लिए 30 मिनट की उलटी गिनती शुरू करें। वैकल्पिक रूप से, एफबीएस जो गर्मी-निष्क्रिय किया गया है, व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध है।
  2. उच्च ग्लूकोज और 10% गर्मी निष्क्रिय FBS (v/v) के साथ 90% DMEM के संयोजन से कच्चे 264.7 कोशिकाओं के लिए मध्यम तैयार करें। 6 mM की अंतिम एकाग्रता में एल-ग्लूटामाइन जोड़ें।
    नोट: उच्च ग्लूकोज के साथ डीएमईएम 4 एमएमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ तैयार किया गया है। एल-ग्लूटामाइन को 6 एमएम तक पूरक करना लगातार सेल ग्रोथ को बढ़ावा देता है। प्रदूषण को रोकने के लिए 100 यू/एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन को जोड़ा जाए। एक और आम मुरीन सेल लाइन, J774A.1, भी इस्तेमाल किया जा सकता है और इसी तरह की परिस्थितियों में उगाया जाता है ।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में कोशिकाओं की एक जमे हुए शीशी गल और जैसे ही यह पिघला स्नान से हटा दें। एक शंकु नली में 5 एमएल पूर्ण माध्यम में सामग्री को प्रासंगिक रूप से जोड़ें। दो बार शंकु नली उलटा और 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर गोली कोशिकाओं को स्पिन।
  4. फ्रीजिंग एजेंट को हटाने के लिए वैक्यूम से जुड़े बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके एस्पिरेट माध्यम। ताजा माध्यम के 5 एमएल में रिस्सुपेंड सेल पैलेट।
  5. एक ऊतक संस्कृति का इलाज फ्लास्क या पकवान के लिए निलंबन स्थानांतरण। फ्लास्क के नीचे को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त माध्यम जोड़ें और समान रूप से वितरित कोशिकाओं को भंवर करें। "1" से शुरू होने वाले पैसेज नंबर को इंगित करें।
  6. 5% सीओ2 और आर्द्रता की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाएं 95% से 100% तक पहुंच जाती हैं। इनक्यूबेशन के दूसरे दिन के साथ शुरू माइक्रोस्कोप के तहत दैनिक कोशिकाओं की जांच करें । कोशिकाओं को 100% तक पहुंचने की अनुमति न दें क्योंकि इससे कोशिकाएं ऊपर उठती हैं और मर जाएंगी।
    नोट: समय के लिएगिलता तक पहुंचने की जरूरत है कितने जीवित कोशिकाओं चढ़ाया गया और फ्लास्क के विकास क्षेत्र पर निर्भर करता है । इस प्रकार, यह दैनिक कोशिकाओं की जांच करने के लिए समझदारी है।
  7. नए माध्यम में सेल स्टॉक को स्क्रैपिंग और पतला करके उपसंस्कृति कोशिकाएं स्क्रैपिंग के बीच कम से कम दो दिन की वृद्धि की अनुमति देती हैं। प्रत्येक उपसंस्कृति के साथ 1 से मार्ग संख्या बढ़ाएं।
    नोट: अगले दिन पासिंग और तत्काल स्क्रैपिंग के परिणामस्वरूप समय के साथ सामान्य सेल पालन में तेजी से नुकसान होगा। रॉ 264.7 कोशिकाओं को केवल लगभग 15 मार्ग तक इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  8. OAA परख के लिए रॉ 264.7 कोशिकाओं को प्लेट करने के लिए, ताजा माध्यम से बदलें और फ्लास्क से कोशिकाओं को धीरे से परिमार्जन करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। आसान सेल गिनती के लिए सेल झुरमुट को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट।
    नोट: रॉ 264.7 को उपसंकुलित करने के लिए पारंपरिक विधि स्क्रैपिंग द्वारा है। हमारे अनुभव में, ट्रिप्सिन का उपयोग रॉ 264.7 कोशिकाओं को स्क्रैपिंग की तुलना में तेजी से समय के साथ पालन खोने का कारण बनता है।
  9. कोशिकाओं की गिनती करने के लिए, कोशिकाओं और ट्राइपैन ब्लू समाधान के बराबर मात्रा को पतला करें। एक हीमोसाइटोमीटर पर 10 μL लोड करें। 10x उद्देश्य लेंस के साथ एक उल्टे यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके डाई को बाहर करने वाली जीवित कोशिकाओं की संख्या का निरीक्षण करें और गिनती करें।
  10. प्लेट 1.4 x 104 व्यवहार्य कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह से 0.15 माइक्रोन-मोटी ग्लास फ्लैट बॉटम प्लेट (प्लेट #1)। कोशिकाओं को 3 दिनों तक बढ़ने दें। OAA प्रदर्शन से पहले एक दिन बिताए मध्यम की जगह ।
    नोट: इनक्यूबेशन के 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं की संख्या लगभग 5 x 104/

2. बैक्टीरियल कल्चर और तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली जीवाणु प्रजातियां एक समझाया हुआ उग्र तनाव, बी एंथ्रैसिस एम्स है। इस प्रजाति के साथ सभी जोड़तोड़ उचित जैव सुरक्षा और सुरक्षा मंजूरी की आवश्यकता है और एक कक्षा द्वितीय या कक्षा 3 जैविक सुरक्षा कैबिनेट में एक बीएसएल-3 प्रयोगशाला में स्थित किया जाना चाहिए । बीएसएल-3 काम के लिए संस्थागत ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं का पालन करें और बैक्टीरिया को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के उपयोग के लिए।

  1. 1 एल पानी में 37 ग्राम बीएचआई पाउडर को घोलकर ब्रेन हार्ट इन्फ्यूजन (बीएचआई) शोरबा तैयार करें और 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेविंग करें। परिवेश के तापमान पर शोरबा स्टोर करें।
  2. पानी में 8% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान तैयार करें और 0.20 माइक्रोन फिल्टर सिरिंज का उपयोग करके स्टरलाइज करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर करें और 1 दिन के भीतर उपयोग करें।
  3. NBY आगर प्लेट्स तैयार करने के लिए 1 एल पानी में 8 ग्राम न्यूट्रिएंट शोरबा, 3 ग्राम खमीर निकालने और 15 ग्राम एगर मिलाएं। 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव। पेट्री व्यंजनों में डालो और जमना करने के लिए अनुमति देते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्टोर करें।
    नोट: NBY आगर प्लेटों के साथ या सोडियम बाइकार्बोनेट के बिना किया जा सकता है । शोरबा और आगर प्लेटों के लिए सोडियम बाइकार्बोनेट के अलावा म्यूकॉइड कॉलोनियों के विकास को प्रेरित करता है जिसमें एनकैप्सुलेटेड बैसिली शामिल है। तरल और ठोस मीडिया दोनों में सोडियम बाइकार्बोनेट की अंतिम एकाग्रता 0.8% है।
  4. बी एंथ्रेसिस के लिए 50% ऑटोक्लेवेड बीएचआई शोरबा, 40% एफबीएस और 10% सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान (v/v) मिलाकर संस्कृति शोरबा तैयार करें।
    नोट: यह शोरबा समझाया बेसिली की छोटी श्रृंखला का उत्पादन करने के लिए तैयार किया गया है ।
  5. शोरबा में खेती से एक दिन पहले एक बीजाणु स्टॉक से एक NBY आगर प्लेट पर अलगाव के लिए लकीर द्वारा बी एंथ्रेसिस की एक मास्टर प्लेट तैयार करें । 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  6. बी एंथ्रेक्सकी कई उपनिवेशों के साथ एक वेंटेड 250 एमएल फ्लास्क में संस्कृति शोरबा के 30 एमएल टीका।
    नोट: शोरबा के सतह अनुपात के लिए एक विशिष्ट मात्रा, जैसा कि यहां निर्दिष्ट है, अधिकतम समझाया बेसिली का उत्पादन करने की आवश्यकता है ।
  7. शोरबा संस्कृति को 125 आरपीएम, 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 20% सीओ2 और आर्द्रता 18-24 घंटे के लिए हिलाएं।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर बी एंथ्रेसिस बढ़ने से कैप्सूल उत्पादन बाधित हो सकता है।
  8. पर्याप्त एनकैप्सुलेशन सुनिश्चित करने के लिए भारत स्याही के साथ नकारात्मक धुंधला का उपयोग करें और फिक्सेशन से पहले बैसिली छोटी जंजीरों (1-5 बेसिली/चेन) में हैं (धारा 3 देखें)।
  9. कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) का निर्धारण करने के लिए, सीरियलली संस्कृति के 100 माइक्रोन को पतला करें 1:10 फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) समाधान और भेड़ रक्त आगर प्लेटों पर प्लेट संस्कृति कमजोर करता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-18 घंटे के लिए इनक्यूबेट। CFUs गिनती और संस्कृति के एमएल प्रति बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करते हैं।
    नोट: बैक्टीरिया तय होने के बाद माइक्रोस्कोप के नीचे हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके भी गिनती की जा सकती है। हालांकि, यह सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि बैसिली को कम आवर्धन के तहत देखना मुश्किल है।
  10. बेसिली को ठीक करने के लिए 4% पीएफ की अंतिम एकाग्रता पर बैक्टीरियल कल्चर की पूरी मात्रा में 16% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफ) जोड़ें। धीरे-धीरे 7 दिनों के लिए परिवेश के तापमान पर एक शेखर पर आंदोलन करें।
    नोट: 4% पीएफ में इनक्यूबेशन के सात दिन वनस्पति बेसिली को ठीक करने के लिए USAMRIID संस्थागत मानक परिचालन प्रक्रिया पर आधारित है ।
  11. बंध्यता के लिए फिक्सेटिव और टेस्ट को हटाने के लिए, तीन बार 45 मिनट के लिए ≥3000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र द्वारा 50 एमएल शंकु नली में फिक्स्ड बैक्टीरियल सस्पेंशन के 4 एमएल (10% वॉल्यूम) धोएं और पीबीएस के साथ 30 एमएल/वॉश का उपयोग करें। बचे हुए सैंपल को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 फीसदी पीएफ में स्टोर करें।
    नोट: गोली के बाद, कैप्सूल की उपस्थिति के कारण बैक्टीरियल गोली शराबी है। इस बात का ध्यान रखें कि धुलाई के दौरान गोली से परेशान न हों। सभी फिक्सेटिव को हटाना जरूरी है ताकि यह व्यवहार्यता परीक्षण में हस्तक्षेप न करे। यदि आवश्यक हो, तो वॉश की संख्या बढ़ाएं।
  12. व्यवहार्यता परीक्षण के लिए, एक बैक्टीरियल ग्रोथ मीडियम (जैसे बीएचआई शोरबा) के 40 एमएल को धुले हुए निलंबन (शोरबा की मात्रा के ≤ 10%) के साथ टीका लगाएं और 7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। टर्बिडिटी मापने के लिए 7 दिनों से पहले और बाद में 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व की जांच करें।
  13. शोरबा संस्कृति में इनक्यूबेशन के 7 दिनों के बाद, प्लेट ≥एक आगर की थाली पर शोरबा के 100 μL और एक और 7 दिनों के लिए इनक्यूबेट। यदि टर्बिडिटी में कोई वृद्धि नहीं हुई है और प्लेटों पर कोई वृद्धि नहीं देखी जाती है, तो मूल संस्कृति को बाँझ माना जाता है और इसे बीएसएल-2 प्रयोगशाला में स्थानांतरित किया जा सकता है।
    नोट: संघीय चयन एजेंट कार्यक्रम22 जनादेश है कि निष्क्रिय बी एंथ्रैसिस केवल नमूने की पूरी बांझपन का प्रदर्शन करने के बाद बीएसएल-3 प्रयोगशालाओं से स्थानांतरित किया जा सकता है । निष्क्रिय बी एंथ्रैसिस के लिए व्यवहार्यता परीक्षण में 7 दिनों के लिए शोरबा में 10% नमूना होता है और इसके बाद 7 दिनों तक ठोस माध्यम पर खेती की जाती है22,23। एक बार बंध्यता स्थापित होने के बाद स्थानांतरण अनुमोदन प्राप्त करने के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें।

3. नकारात्मक धुंधला और प्रकाश माइक्रोस्कोपी एनकैप्सुलेशन और बेसिली चेन का निरीक्षण करने के लिए

  1. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर भारत की 2 माइक्रोन स्याही के साथ 5 माइक्रोन बैक्टीरियल सस्पेंशन मिलाएं। बुलबुले बनाने के बिना निलंबन के शीर्ष पर एक 1 या 1.5 माइक्रोन मोटा कवर ग्लास रखें।
    नोट: नेल पॉलिश स्लाइड पर कवर ग्लास सील करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. एक हल्के माइक्रोस्कोप पर 40x से 100x तेल उद्देश्य लेंस का उपयोग करके बैक्टीरियल निलंबन का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक जीवाणु के आसपास क्लीयरेंस (कैप्सूल में भारत की स्याही शामिल नहीं है) के एक क्षेत्र को देख कर बेसिली को समझाया जाता है और बैसिली चेन कम हैं।

4. बैक्टीरिया की फिटसी-लेबलिंग

  1. 2 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर डिमिथाइल सल्फोक्साइड में फ्लोरोसेइन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) को भंग करें।
  2. निष्क्रिय बैक्टीरियल स्टॉक की मात्रा को मापें।
  3. फिक्सेटिव को हटाने के लिए स्टॉक को पीबीएस में 3x धोएं।
  4. 75 μg/mL की अंतिम एकाग्रता पर फिटसी समाधान जोड़ें। धीरे-धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे के लिए मिश्रण आंदोलन करें।
  5. तीन बार ≥३० एक्स जी, ४५ मिनट पर पेलेट करके बैक्टीरिया को धोएं और अतिरिक्त फिटसी को हटाने के लिए 30 एमएल पीबीएस/वॉश का उपयोग करें । सुनिश्चित करें कि शराबी गोली धोने के दौरान परेशान न हो। इसी स्टार्ट वॉल्यूम में पीबीएस में बैसिली को रीसुस्पेंड करें।
  6. अलीकोट और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोट्यूब में बेसिली स्टोर करें। फ्रीज/गल बेसिली कई बार न करें क्योंकि बैसिली कैप्सूल खो सकता है ।

5. बैक्टीरियल ऑप्टोनाइजेशन

  1. गर्मी ब्लॉक में 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण सेरा (एनएचपीएस से) की एक छोटी मात्रा को निष्क्रिय कर देती है।
  2. गल और 3-5 मिनट के लिए 15000 x g पर पेलेट करके पीबीएस 2x के साथ फिटसी लेबल बैक्टीरिया को धोएं। एक ही स्टार्ट वॉल्यूम में पीबीएस में रीसुस्पेंड करें।
  3. एक 96 अच्छी तरह से गोल नीचे की थाली (प्लेट #2) में, सेल माध्यम में क्रमिक रूप से पतला परीक्षण सेरा। एक और 96 अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट (प्लेट #3) में, प्रत्येक अच्छी तरह से पतला परीक्षण सेरा के 10 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: हर थाली में, पीबीएस और सामान्य बंदर सीरा नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पतला परीक्षण सेरा के स्थान पर शामिल थे। हमने अलग-अलग दिनों में किए गए सभी परख को सामान्य बनाने के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक परीक्षण सीरम भी चुना। सकारात्मक नियंत्रण परीक्षण सीरम मनमाने ढंग से चुना गया था क्योंकि यह बहुतायत से था ।
  4. #3 प्लेट करने के लिए, 10 माइक्रोन हौसले से पुनर्गठित बच्चे खरगोश पूरक जोड़ें ।
    नोट: एक बार पुनर्गठन, शेष बच्चे खरगोश पूरक त्यागें; फिर से फ्रीज और गल मत करो।
  5. #3 प्लेट करने के लिए, 1:20 के संक्रमण की बहुलता के लिए फिटसी-लेबल बेसिली की उचित मात्रा जोड़ें। उदाहरण के लिए, 5 x 10 4कोशिकाओं के लिए 5 x10 4 x 20 बेसिली वाले वॉल्यूम जोड़ें। प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर #3 सेल माध्यम की उचित मात्रा के साथ कुल 105 माइक्रोन तक।
    नोट: प्लेट #1, जिसमें कोशिकाएं होती हैं, को शून्य मात्रा के रूप में शेष 5 माइक्रोन के साथ 100 माइक्रोनयुक्त बैक्टीरिया प्राप्त होते हैं। हमने डुप्लीकेट में परीक्षण सेरा के प्रत्येक कमजोर पड़ने का परीक्षण किया।
  6. इनक्यूबेट प्लेट 5% सीओ2 की उपस्थिति में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर #3 है जिसमें नमी के साथ बेसिली को ऑपसोनाइज करने के लिए।

6. स्तनधारी कोशिकाओं का पालन परख और फ्लोरोसेंट लेबलिंग

  1. उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी अभिकर् ती बनाए रखें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक पर प्लेट #1 रखें, जिसमें अनुयायी कोशिकाएं होती हैं।
  3. कुओं से खर्च किए गए माध्यम को हटाने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेटर का उपयोग करें और प्लेट #3 से 100 माइक्रोनाइज्ड बैक्टीरिया के साथ जल्दी से बदलें। सुनिश्चित करें कि पाइपिंग के दौरान कुओं में कोई बुलबुले उत्पन्न नहीं हुए हैं। इनक्यूबेट प्लेट 5% सीओ2 और पालन के लिए 30 मिनट के लिए आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर #1।
  4. असंबद्ध बेसिली को हटाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक के शीर्ष पर 150 माइक्रोन पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 5x धोएं।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए कि धोने के दौरान कोशिकाओं को गलती से फैलाया न जाए।
  5. पीबीएस 1:4 के साथ पतला 16% पीएफ 4% पीएफ बनाने के लिए। 1 घंटे के लिए 4% पीएफ के साथ सेल फिक्स प्रत्येक कुएं में 150 माइक्रोन जोड़कर। पीबीएस के साथ 2x कोशिकाओं को धोएं।
  6. 10 एमएल पीबीएस में 2 माइक्रोन एचसीएस (हाई-कंटेंट स्क्रीनिंग) ऑरेंज सेल दाग मिलाएं। फिक्स्ड कोशिकाओं के लिए इस धुंधला समाधान के 150 μL जोड़ें और परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  7. पीबीएस के साथ कुओं को 2x धोएं।
  8. माइक्रोस्कोपी तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. माइक्रोस्कोपी

नोट: सामान्य तौर पर, एक उच्च-थ्रूपुट स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप ओएए के लिए इमेजिंग की सुविधा प्रदान करेगा। यदि एक स्वचालित प्रणाली उपलब्ध नहीं है, तो अनुयायी बेसिली की फ्लोरोसेंट छवियों को मैन्युअल रूप से21लिया जा सकता है। इस अध्ययन में20,अनुयायी बेसिली और सेल मोनोलेयर को विशेष उपकरणों के साथ Zeiss 700 लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके चित्रित किया गया था; हमारा सिस्टम एक स्वचालित चरण, निश्चित फोकस मॉड्यूल, 40 x एनए 0.6 उद्देश्य, एक्सियो कैम एचआरसी कैमरा और ज़ेन 2012 (ब्लू एडिशन) सॉफ्टवेयर से लैस Zeiss एक्सियो ऑब्जर्वर Z1 उल्टे माइक्रोस्कोप से बना था। अधिग्रहीत छवियां वाइडफील्ड छवियां हैं, न कि कॉन्फोकल छवियां। निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक बुनियादी माइक्रोस्कोप सेटअप के रूप में है जो विभिन्न प्रकार के स्वचालित माइक्रोस्कोपी सिस्टम पर लागू होता है।

  1. इनक्यूबेट प्लेट 30 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर #1 । माइक्रोस्कोप और संबंधित उपकरण चालू करें।
    नोट: परिवेश के तापमान पर अभिनंदन इमेजिंग के दौरान कांच की प्लेट पर बनाने से संघनन को रोकता है। इसके अलावा, यह तापमान में बदलाव के कारण डिफोकसिंग को रोकता है।
  2. मंच पर प्लेट रखें और उज्ज्वल क्षेत्र या चरण विपरीत का उपयोग कर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें।
  3. प्लेट सेटिंग के रूप में 96 अच्छी तरह से प्रारूप का चयन करें। चैनल सेटिंग का चयन करें।
    नोट: फिटसी की पीक एक्सटिटेशन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 495/519 एनएम हैं; एचसीएस ऑरेंज सेल दाग 556 और 572 एनएम हैं। अन्य फ्लोरोफोरस का उपयोग माइक्रोस्कोप पर उपलब्ध फिल्टर के आधार पर किया जा सकता है।
  4. टाइल मोड के लिए सेटिंग का चयन करें। अधिग्रहीत की जाने वाली छवियों की संख्या को इंगित करें।
    नोट: टाइलिंग फ़ंक्शन एक नमूने में कई स्थानों को अच्छी तरह से पकड़ने की अनुमति देता है और एक टाइलिंग या यादृच्छिक प्रारूप में छवि प्राप्त करने के लिए सेट किया जा सकता है। हमने प्रति अच्छी तरह से 10 यादृच्छिक क्षेत्रों की छवि की।
  5. अधिग्रहण मोड को "ब्लैक एंड व्हाइट" या "मोनोक्रोम" और 2x2 ≥ बिनिंग में बदलें।
    नोट: 1x1 से 2x2 या 4x4 तक बिनिंग सेट करने से माइक्रोस्कोपी की गति बढ़ेगी लेकिन इसके परिणामस्वरूप छवि का कम रिज़ॉल्यूशन भी होगा। ओएए के लिए, इन सेटिंग्स का उपयोग करना पर्याप्त है क्योंकि परख मैक्रोफेज और अनुयायी बैक्टीरिया दोनों की गणना करता है।
  6. ऑटोफोकस या फोकसिंग मॉड्यूल चालू करें। इंगित करें कि कितनी बार ऑटोफोकसिंग फ़ंक्शन किया जाना है। यदि उपलब्ध हो तो जेड स्टैक फ़ंक्शन चालू करें। जेड स्टैक की संख्या इंगित करें जो सेल मोनोलेयर और अनुयायी बेसिली की मोटाई को कैप्चर करेगा।
    नोट: चुने गए जेड स्टैक की संख्या माइक्रोस्कोपी समय में वृद्धि करेगी लेकिन यह सुनिश्चित करेगी कि प्रत्येक जेड स्टैक पर सही फोकस के साथ एक छवि ली जाए।
  7. छवियों को सहेजने के लिए फ़ाइल फ़ोल्डर नामित करें। स्वचालित इमेजिंग कार्यक्रम चलाएं।

8. डेटा संग्रह और विश्लेषण

  1. प्रति छवि अनुयायी बेसिली और स्तनधारी कोशिकाओं की संख्या गिनें। बेसिली की प्रत्येक श्रृंखला को एक जीवाणु के रूप में गिनें।
  2. एक उपयुक्त सांख्यिकी कार्यक्रम में एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण परीक्षण सीरम और टाइटर (जैसे, 1:10 कमजोर पड़ने 10 टाइटर इकाइयों) की बेसिली/कोशिकाओं को प्लॉट करें।
  3. गैर-रैखिक प्रतिगमन वक्र फिटिंग का उपयोग करके सकारात्मक नियंत्रण परीक्षण सीरम का विश्लेषण करें। फिर इसी टाइटर्स का निर्धारण करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण परीक्षण सीरम के मानक वक्र का उपयोग करके शेष नमूनों का विश्लेषण करें।
    नोट: टाइटर्स का निर्धारण करते समय मानक वक्र के बीच के पास नमूना कमजोर पड़ने का चयन करना आमतौर पर सबसे सटीक होता है।
  4. प्रत्येक वैक्सीन समूह से नमूनों के ज्यामितीय मतलब की गणना करें। कम से कम महत्वपूर्ण अंतर ANOVA विश्लेषण द्वारा लॉग परिवर्तित टाइटर्स के पी-मूल्यों की गणना करें।

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Representative Results

यह अनुभाग एक ओएए प्रयोग के दौरान एकत्र किए गए प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ को दिखाता है जिसमें यह दर्शाया गया है कि ओएए का उपयोग एंटीबॉडी के जैविक कार्य की जांच करने के लिए किया जा सकता है। यहां, परख सफलतापूर्वक एक एंथ्रेक्स वैक्सीन उंमीदवार की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । बैसिली पर एनकैप्सुलेशन की स्थिति को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है क्योंकि कोई एनकैप्सुलेशन उन्हें मेजबान कोशिकाओं का पालन करने का कारण बनता है, जो उच्च पृष्ठभूमि का उत्पादन करता है। चित्र 1 बी एंथ्रैसिस एम्स की एक छवि है जो एनकैप्सुलेशन की जांच करने के लिए भारत की स्याही से नकारात्मक रूप से सना हुआ है। ओएए को प्रबुद्ध होने के लिए दृश्य के कई आसन्न क्षेत्रों की आवश्यकता होती है और यदि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है, तो कई ढेर या अनुभाग। इस प्रकार, यह सत्यापित करना आवश्यक है कि बैसिली न तो बहुत मंद हैं और न ही फोटो-ब्लीच भी जल्दी। चित्रा 2 फिटसी के साथ लेबल किए गए बैसिली की एक छवि है। चित्रा 3 सेल मोनोलेयर्स से जुड़े बी एंथ्रैसिस एम्स की अधिकतम प्रक्षेपण छवियों को दर्शाता है। ये देखने के प्रतिनिधि क्षेत्र है कि गिना और OAA के लिए रन बनाए गए हैं । पीजीजीए-ओएमसीए एंटीसेरम के साथ इनक्यूबेटेड बैसिली के लगाव में वृद्धि एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी की उपस्थिति के कारण होती है जो बेसिली को opsonized करता है। चित्रा 4 से पता चलता है कि 10 और ५० μg पीजीजीए-ओएमपीसी के साथ टीका लगाया गया एनएचपीएस के सीरम टाइटर्स अकेले ओएमपीसी और पीजीजीए के लिए टाइटर्स की तुलना में काफी अधिक हैं ।

Figure 1
चित्रा 1. फिक्स्ड बी एंथ्रैसिस एम्स की एक भारत स्याही छवि । कैप्सूल की उपस्थिति के कारण बेसिली के आसपास की निकासी के क्षेत्र पर ध्यान दें। बार = 10 माइक्रोन। छवि 100 x 1.4 संख्यात्मक अपर्चर (एनए) तेल उद्देश्य लेंस के साथ EVOS FL स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्रणाली पर लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। फिटसी की छवियां फिक्स्ड बी एंथ्रैसिस एम्स लेबल । (बाएं) अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि; फ्लोरोसेंट छवि हरे रंग में छद्म रंग (मध्य); विलय (दाएं) । बार = 10 माइक्रोन। कॉन्फोकल इमेजेज 40 x 1.3 एनए ऑयल ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ ज़ीस 700 एलएसएम कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर ली गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। बी एंथ्रैसिस एम्स की फ्लोरोसेंट छवियों ने रॉ 264.7 सेल मोनोलेयर का पालन किया। बेसिली को एनएचपीएस से परीक्षण सीरम के साथटीका लगाया गया था और 10 माइक्रोग्राम पीजीजीए-ओएमपीसी,(बी)50 माइक्रोग्राम पीजीजीए-ओएमपीसी,(सी)50 माइक्रोग्राम पीजीजीए अकेले, या(डी)ओएमपीसी के साथ बढ़ाया गया था। ग्रीन = बी एंथ्रैसिस एम्स, लाल = रॉ 264.7 कोशिकाएं। बार = 20 माइक्रोन। वाइड फील्ड इमेजेज 40 x 0.6 ऑब्जेक्टिव लेंस और एक्सियो कैम एचआरसी कैमरे के साथ Zeiss Axio Observer Z1 माइक्रोस्कोप पर ली गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4. एनएचपीएस के ऑप्सो-पालन टाइटर्स को 10 μजी पीजीजीए-ओएमपीसी, 50 माइक्रोग्राम पीजीजीए-ओएमपीसी, 50 μअकेलेजी पीजीजीए या अकेले ओएमसीपी के साथ टीका लगाया गया। प्रति समूह 5 जानवरों के ज्यामितीय साधनों को ग्राफ किया जाता है। त्रुटि सलाखों एसईएम से संकेत मिलता है । *पी ≤ ०.००१ अकेले पीजीजीए की तुलना में । पी मानों की गणना एलएसडी पोस्टहोक परीक्षण के साथ ANOVA का उपयोग करके की गई थी। डेटा मूल रूप से Chabot, एट अल में प्रकाशित किए गए थे, २०१६20। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कैप्सूल आधारित टीकों को कई जीवाणु रोगजनकों के खिलाफ प्रभावोत्पादक दिखाया गया है, और कई को मनुष्यों में उपयोग के लिए लाइसेंस प्राप्त है25,26,27। ये टीके कैप्सूल को लक्षित करते हुए एंटीबॉडी पैदा करके काम करते हैं और इनमें से कई अध्ययन ओपीकेए का उपयोग एंटीबॉडी 13 , 14,16, 28 ,29के ओपसोनो-फैगोसाइटिक कार्यों कोदिखानेकेलिए करते हैं। जैवसेफ्टी चिंताओं के कारण और काम में आसानी के लिए, हमने बी एंथ्रेस कैप्सूल संजुगेट्स के साथ टीका लगाए गए जानवरों से एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए एक ओएए विकसित किया। बी एंथ्रेसिस पर कैप्सूल की उपस्थिति पालन और फागोसिटोसिस30को रोकती है, लेकिन टीका लगाए गए जानवरों से सीरा के साथ बैसिली का टीकाकरणमैक्रोफेज 20,21के प्रति लगाव पैदा करता है ।

OAA के लिए, पालन गतिविधि, आंतरिककरण और हत्या नहीं, ओपसोनिक गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इससे ओएए को कई फायदे हुए। हम मारे गए पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करने में सक्षम थे, फ्लोरोसेंट रूप से जीवित जीवों के बजाय एनकैप्सुलेटेड बेसिली लेबल किए गए थे। एल्डिहाइड निर्धारण और फ्लोरोसेंट लेबलिंग से बैक्टीरियल सतह में परिवर्तन ने बैक्टीरिया के मैक्रोफेज के समग्र पालन को नहीं बदला; फिक्स्ड और लेबल वाले बेसिली लाइव बेसिली (डेटा नहीं दिखाए गए) से अधिक अनुयायी नहीं थे। एनकैप्सुलेशन की डिग्री संस्कृति से संस्कृति में भिन्न हो सकती है और समान विकास स्थितियों के बावजूद समग्र पालन को प्रभावित कर सकती है। इस प्रकार, एक निष्क्रिय बैक्टीरियल स्टॉक का उपयोग विभिन्न दिनों और प्रयोगों के विभिन्न सेटों में किए गए प्रयोगों में मानकीकरण की अनुमति देता है। यह इस काम में इस्तेमाल किए गए 20 एनएचपीएस और सीरा से सेरा की तुलना करने के लिए मूल्यवान था जो हमारी आगामी अध्ययनों में उत्पन्न होगा। पिछले, रॉ 264.7 कोशिकाओं सहित अधिकांश मैक्रोफेज, जीवित रोगजनक31द्वारा उत्पादित एंथ्रेक्स घातक विष के प्रति संवेदनशील होते हैं, जिससे जीवित बैसिली का उपयोग स्वाभाविक रूप से समस्याग्रस्त हो जाताहै।

रॉ 264.7 कोशिकाओं के उपयोग से मानकीकरण की भी सुविधा हुई। हमने शुरू में ओपीकेए, एचएल-60 कोशिकाओं में आमतौर पर उपयोग की जाने वाली सेल लाइन का उपयोग किया। हालांकि, हमें उन्हें डाइमेथिल-फॉर्ममाइड के साथ ग्रैनुलोसाइट्स में अंतर करने में कठिनाइयां मिलीं, जैसा कि अन्य28,32द्वारा बताया गया है। रॉ 264.7 कोशिकाओं को लाभ है कि उन्हें रासायनिक रूप से विभेदित होने की आवश्यकता नहीं है और वे अनुयायी हैं और इस प्रकार माइक्रोस्कोपी-आधारित ओएए के लिए अधिक उत्तरदायी हैं। इस सेल लाइन का उपयोग इंट्रासेलुलर रोगजनकों33 , 34और बी एंथ्रैसिस31के साथ अनेक फैगोसाइटोसिस अध्ययनों में किया गया है । रॉ 264.7 कोशिकाओं का उपयोग, जो माउस से प्राप्त होते हैं, भी लाभप्रद है क्योंकि माउस एफसी रिसेप्टर्स अन्य प्रजातियों35से प्राप्त आईजीजी के लिए अपनी बाध्यकारी विशिष्टता में संकीर्ण हैं। इससे हमें एक मुरीन सेल लाइन के साथ एनएचपीएस से एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने की अनुमति मिली।

एंथ्रेक्स, हालांकि दुर्लभ, दुनिया और अमेरिका के कुछ क्षेत्रों में स्थानिक है एक चिंता का विषय यह है कि इस्तेमाल किया FBS, अमेरिका से sourced, पहले से ही विरोधी कैप्सूल एंटीबॉडी जानवर बी एंथ्रैसिस बीजाणु या अंय PGGA के संपर्क में होने के परिणामस्वरूप मिट्टी में रोगाणुओं का उत्पादन हो सकता है । इस मुद्दे को हल करने के लिए, हमारे द्वारा उपयोग की जाने वाली एफबीएस लॉट का पूर्व-परीक्षण किया गया था। हमने पाया कि गर्मी निष्क्रिय FBS के अलावा अकेले DMEM (डेटा नहीं दिखाया) की तुलना में पालन में वृद्धि हुई है । हालांकि, गिनी पिग, बंदर, माउस या मानव (डेटा नहीं दिखाया गया) से गर्मी निष्क्रिय सामान्य सीरा की तुलना में इसने पालन में वृद्धि नहीं की। इस प्रकार, हमारे द्वारा उपयोग किए जाने वाले एफबीएस लॉट में एक्सपोजर के परिणामस्वरूप एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी नहीं थीं। इसके अलावा, इसमें एंटी-कैप्सूल एंटीबॉडी भी नहीं होगी, जिसके परिणामस्वरूप जानवर को अनएनेप्सुलेटेड बी एंथ्रैसिस स्टर्ने के साथ टीका लगाया जा रहा है, एक तनाव जो कैप्सूल उत्पादन के लिए आवश्यक pXO2 प्लाज्मिड का अभाव है। परीक्षण एफबीएस लॉट सभी बाद OAA के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

तकनीक की एक सीमा प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा बेसिली और कोशिकाओं की गिनती का काम है, जिसमें भारी मात्रा में समय और प्रयास लिया गया। इसे सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ सुधारा जा सकता है जिसमें इस प्रकार का विश्लेषण होता है; यह सॉफ्टवेयर समय पर हमारे लिए उपलब्ध नहीं था। हालांकि, क्योंकि मैनुअल गिनती आवश्यक थी, एक महत्वपूर्ण कदम को हटाने या बाहरी और असंबद्ध bacilli के बंद धोने के लिए कार्य की सुविधा थी । यह भी कम पृष्ठभूमि शोर करने के लिए नेतृत्व किया है कि अभिकर एजेंटों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक था। ओएए को पूरक के स्रोत की आवश्यकता होती है क्योंकि यह ओपोनाइजेशन36को बढ़ाता है। इसलिए, हमने गिनी पिग, मानव और बेबी खरगोश पूरक सहित विभिन्न पूरक स्रोतों का परीक्षण किया। हमने अपने परख के लिए बेबी खरगोश के पूरक को चुना क्योंकि हमने पाया कि इसमें हेट्रोफिल्क एंटीजन के खिलाफ कमजोर, बहु-विशिष्ट गतिविधियां नहीं हैं, इसका उपयोग आमतौर पर ओपीकेए अध्ययन14,15,37में किया जाता है, और यह व्यावसायिक रूप से आसानी से उपलब्ध है।

हम ओएए को मात्रात्मक और अत्यधिक पुन: उत्पन्न करने योग्य पाते हैं। हम इसका उपयोग ELISAs जैसे लिगांड बाध्यकारी परख से जुड़े अध्ययनों को पूरक करने के लिए करते हैं, जो केवल कुल आईजीजी स्तरों की मात्रा बताते हैं लेकिन कार्यात्मक और गैर-कार्यात्मक एंटीबॉडी के बीच अंतर नहीं करते हैं। ओएए का उपयोग टीका जनित एंटीबॉडी16,38की विभिन्न कार्यक्षमता दिखाने के लिए अन्य कार्यात्मक परख (उदाहरण के लिए, सीरम जीवाणुरोधी गतिविधि और विष बेअसर परख) के पूरक के लिए किया जा सकता है। ओएए के विकास ने टीकों और चिकित्सीय चिकित्सा का मूल्यांकन करने के लिए इम्यूनोजेनिसिटी अध्ययनों के हमारे प्रदर्शनों की सूची में वृद्धि की है।

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Disclosures

लेखकों के पास एक वाणिज्यिक या अन्य संघ नहीं है जो हितों का टकराव पैदा कर सकता है।

Acknowledgments

जे चुआ, डी चैबोट और ए फ्रीलैंडर ने पांडुलिपि में वर्णित प्रक्रियाओं को डिजाइन किया। जे चुआ और टी पुटमोन-टेलर ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया । डी चैबोट ने डेटा विश्लेषण किया। जे चुआ ने पांडुलिपि लिखी थी ।

लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए केली जे फिट्स का शुक्रिया अदा करते हैं ।

काम रक्षा खतरा न्यूनीकरण एजेंसी अनुदान सीबीएम द्वारा समर्थित था । VAXBT.03.10.RD.015, योजना संख्या 921175.

राय, व्याख्याओं, निष्कर्ष और सिफारिशों लेखकों के उन है और जरूरी अमेरिकी सेना द्वारा समर्थन नहीं कर रहे हैं । इस प्रकाशन की सामग्री जरूरी विचारों या रक्षा विभाग की नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और न ही व्यापार के नाम, वाणिज्यिक उत्पादों, या संगठनों का उल्लेख करता है अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) Corning, Corning, NY 431222
10 mL syringe (Luer-Lok tip) BD, Franklin Lakes, NJ 302995
15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA P96-1-N
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 15710
75 cm sq. tissue culture treated flask Corning, Corning, NY 430641
Agar (powder) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1296
Baby Rabbit Complement Cedarlane Labs, Burlington, NC CL3441
Bacto Yeast Extract BD, Sparks, MD 288620
BBL Brain Heart Infusion (BHI) BD, Sparks, MD 211059
Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates Remel, Lenexa, KS R01198
Cell scraper Sarstedt, Newton, NC 83.183
Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) Corning, Corning, NY 3596
Cover glass Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 72200-10
Difco Nutrient Broth BD, Sparks, MD 234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 11965-092 contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red
EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AMAFD1000
Fetal Bovine Serum Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SH30071.03 not gamma irradiated, not heat inactivated
Fluorescein isothiocyanate Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA F143
HCS Cell Mask Orange Cell Stain Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA H32713
hemocytometer (Improved Neubauer) Hausser Scientific, Horsham, PA 3900
India Ink solution BD, Sparks, MD 261194
L- glutamine (200 mM) Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA 25030081 supplement medium with additional 2mM L-glutamine
Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) Nikon Instruments, Melville, NY TE2000
PBS without Calcium or Magnesium Lonza, Walkersville, MD 17-516F
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SV30010
petri dishes (100 x 15 mm) Falcon, Corning, Durham, NC 351029 for agar plates
RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) ATCC, Manassas, VA ATCC TIB-71
Slides VWR, Radnor, PA 16004-422
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S5761
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8154
Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY 4109001865956000

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 159 रचना पालन एंटीबॉडी सीरम मैक्रोफेज कैप्सूल वैक्सीन विकास जन्मजात प्रतिरक्षा गैर-मानव वानरों रॉ 264.7 कोशिकाएं स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रतिरक्षा का सहसंबंधित
<em>बेसिलस एंथ्रेसिस</em> और अन्य एनकैप्सुलेटेड रोगजनकों के खिलाफ वैक्सीन विकास में कार्यात्मक एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए ऑप्सोनो-पालन परख
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Chua, J., Chabot, D. J.,… More

Chua, J., Chabot, D. J., Putmon-Taylor, T., Friedlander, A. M. Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens. J. Vis. Exp. (159), e60873, doi:10.3791/60873 (2020).

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