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Immunology and Infection

Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60873
* These authors contributed equally

Summary

Il saggio opsono-aderenza è un metodo alternativo al saggio di uccisione opsono-fagocitica per valutare le funzioni opsoniche degli anticorpi nello sviluppo del vaccino.

Abstract

Il saggio opsono-aderenza è un saggio funzionale che enumera l'attaccamento di agenti patogeni batterici ai fagociti professionisti. Poiché l'aderenza è necessaria per la fagocitosi e l'uccisione, il saggio è un metodo alternativo ai test di uccisione opsono-fagocitica. Un vantaggio del saggio opsono-aderenza è la possibilità di utilizzare agenti patogeni inattivati e linee cellulari di mammiferi, che consente la standardizzazione in più esperimenti. L'uso di un agente patogeno inattivato nel saggio facilita anche il lavoro con agenti infettivi di livello di biosicurezza 3 e altri agenti patogeni virulenti. Nel nostro lavoro, il saggio opsono-aderenza è stato utilizzato per valutare la capacità funzionale degli anticorpi, dai sieri di animali immunizzati con un vaccino a base di capsula di antrace, per indurre l'aderenza del Bacillus anthracis fisso a una linea cellulare di macrofagi del topo, RAW 264.7. La microscopia a fluorescenza automatizzata è stata utilizzata per catturare immagini di bacilli che aderiscono ai macrofagi. L'aumento dell'aderenza è stato correlato con la presenza di anticorpi anti-capsula nel siero. I primati non umani che mostravano alte concentrazioni di anticorpi anti-capsula sierati erano protetti dalla sfida dell'antrace. Pertanto, il saggio opsono-aderenza può essere usato per chiarire le funzioni biologiche degli anticorpi specifici dell'antigene nei sieri, per valutare l'efficacia dei candidati al vaccino e di altre terapie e per servire come possibile correlato dell'immunità.

Introduction

Riconoscimento, aderenza, internalizzazione e degradazione di un agente patogeno sono parte integrante della fagocitosi1, una via saliente nella risposta immunitaria innata dell'ospite descritta per la prima volta da Ilya Metchnikoff nel 18832,3. I leucociti fagocitici, così come altre cellule del sistema immunitario, sono altamente discriminatori nella loro selezione di bersagli; sono in grado di distinguere tra "non-sé infettivo" e "sé non infettivo" attraverso modelli molecolari associati agli agenti patogeni per il loro repertorio di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)4,5. Il riconoscimento dell'ospite di un agente patogeno può verificarsi anche con il legame delle opsonine ospiti, come complemento eanticorpi 6. Questo processo, chiamato opsonizzazione, ricopri l'agente patogeno con queste molecole, migliorando l'internalizzazione al legame con i recettori opsonici (ad esempio, complemento e recettori Fc) sulle cellule fagocitiche6. Affinché un agente patogeno aderisca a un fagocita, è necessario il legame collettivo di più recettori con i loro ligandi affini. Solo allora l'aderenza può attivare e sostenere le cascate di segnalazione all'interno della cella host per avviare l'internalizzazione6.

A causa dell'importanza della fagocitosi nella clearance degli agenti patogeni e nella prevenzione delle infezioni, gli agenti patogeni extracellulari hanno sviluppato numerosi modi per sovvertire questo processo per prolungarne la sopravvivenza. Una strategia importante è la produzione di una capsula polimerica anionica (ad esempio polisaccaride o poliaminoacido) che è anti-fagocitica in virtù della sua carica, è scarsamente immunogenica e protegge le molecole sull'involucro batterico dai PRR6,7. Agenti patogeni come Cryptococcus neoformans e Streptococcus pneumoniae hanno capsule composte da polimeri saccharide, mentre Staphylococcus epidermidis e alcune specie di Bacillus producono acido poli-ɣ-glutammico (PGGA)7,8. Tuttavia, altri agenti patogeni producono capsule che assomigliano all'io non infettivo. Ad esempio, lo Streptococcus pyogenes e un ceppo patogeno di B. cereus hanno una capsula di acido ialuronico che non è solo anti-fagocitico ma che potrebbe anche non essere riconosciuta come estranea dal sistema immunitario9,10.

La coniugazione della capsula in proteine portanti li converte da antigeni poveri e indipendenti dalla T in antigeni altamente immunogenici dipendenti da T che possono indurre alti tigatori di anticorpi anti-capsula sierati11,12. Questa strategia viene utilizzata per i vaccini autorizzati contro S. pneumoniae, Haemophilus influenzaee Neisseria meningitides11. Le attività opsoniche degli anticorpi anti-capsula sono state comunemente valutate da test di uccisione opsono-fagocitica (OPKA)13,14,15,16. Questi test testano se gli anticorpi funzionali possono innescare la fagocitosi e uccidere14. Tuttavia, l'uso di OPKA con agenti patogeni infettivi, come agenti e tossine di selezione biologica di livello 1 (BSAT), tra cui B. anthracis17, è pericoloso e presenta rischi per la sicurezza; questi saggi richiedono un'ampia gestione di un agente selezionato. La manipolazione di agenti selezionati può essere effettuata solo in laboratori di livello di biosicurezza limitato 3 (BSL-3); il lavoro in questi settori richiede procedure operative prolungate a causa delle numerose precauzioni di sicurezza che devono essere seguite. Anche i laboratori BSL-3 in genere non sono dotati delle attrezzature specializzate utilizzate per il lavoro OPKA, come microscopi e citometri. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio alternativo basato sull'uso di batteri inattivati18,19. Ci riferiamo a questo come un saggio opsono-aderenza (OAA) che non dipende dall'internalizzazione e dall'uccisione delle uscite di saggio; invece, l'aderenza di agenti patogeni inattivati opsonizzati è usata come indice di fagocitosi. Meccanicamente, L'OAA è un sostituto adatto perché l'aderenza avviene a priori ed è intimamente intrecciata con l'internalizzazione e l'uccisione intracellulare. Dal punto di vista della biosicurezza, l'OAA è preferito perché richiede una manipolazione minima di un agente infettivo, è sperimentalmente di durata inferiore rispetto all'OPKA e può essere eseguito nei laboratori BSL-2 dopo che uno stock di agente patogeno inattivato è stato prodotto e trasferito.

Dimostriamo l'utilizzo dell'OAA per esaminare la funzione opsonica degli anticorpi anti-capsule trovati nei sieri di primati non umani (NMP) vaccinati con un coniugato a capsula [cioè PGGA da B. anthracis coniugato al complesso proteico della membrana esterna (OMPC) di Neisseria meningitides]20. I bacilli opsonizzati al siero sono stati incubati con una linea cellulare di macrofagi di topo aderente, RAW 264.7. Dopo la fissazione, il monostrato cellulare e i bacilli aderenti sono stati immaginiti dalla microscopia a fluorescenza. L'aderenza batterica è aumentata quando i bacilli sono stati incubati con siero da NSP vaccinati con il coniugato della capsula rispetto al siero di controllo20. Aderenza correlata alla sopravvivenza della sfida dell'antrace20,21. Pertanto, l'uso di OAA ha caratterizzato la funzione degli anticorpi anti-capsula e ha notevolmente facilitato il test del nostro candidato vaccino.

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Protocol

In conformità con la legge sul benessere degli animali, la politica del servizio sanitario pubblico e altri statuti e regolamenti federali relativi agli animali e agli esperimenti che coinvolgono animali, la ricerca qui descritta è stata condotta nell'ambito di un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. La struttura in cui è stata condotta questa ricerca è accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio, internazionale e aderisce ai principi indicati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Consiglio Nazionale delle Ricerche, 201124.

1. Coltura e manutenzione della linea cellulare, RAW 264.7

NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite con tecniche asettiche.

  1. Scaldare il siero bovino fetale (FBS) in un bagno d'acqua a 56 °C per 30 minuti per inattivare il complemento.
    NOTA: Il tempo di inattivazione di 30 minuti inizia quando FBS raggiunge i 56 °C. Per monitorare la temperatura, riscaldare un volume simile di acqua in un becher nello stesso bagno d'acqua. Una volta che l'acqua raggiunge i 56 °C, inizia il conto alla rovescia di 30 minuti per FBS. In alternativa, FBS che è stato inattivato dal calore è anche disponibile in commercio.
  2. Preparare il mezzo per raw 264.7 cellule combinando il 90% di DMEM con glucosio alto e FBS inattivato al calore al 10% (v/v). Aggiungere L-glutammina ad una concentrazione finale di 6 mM.
    NOTA: DMEM con alto glucosio è formulato con 4 mM L-glutammina. L'integrazione della L-glutammina a 6 mM favorisce una crescita cellulare costante. 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina possono essere aggiunti per prevenire la contaminazione. Un'altra linea cellulare murina comune, J774A.1, può anche essere utilizzata ed è coltivata in condizioni simili.
  3. Scongelare una fiala congelata di cellule in un bagno d'acqua a 37 °C e rimuovere dal bagno non appena si scioglie. Aggiungere il contenuto aseticamente a un mezzo completo da 5 ml in un tubo conico. Invertire due volte il tubo conico e ruotare a 300 x g per 5 min per le celle a pellet.
  4. Aspirare il mezzo utilizzando un pipetto Pasteur sterile attaccato a un vuoto per rimuovere l'agente congelante. Resuspend cell pellet in 5 mL di mezzo fresco.
  5. Trasferire la sospensione in un pallone o piatto trattato con coltura tissutale. Aggiungere abbastanza mezzo per coprire completamente il fondo del pallone e ruotare per distribuire uniformemente le cellule. Indicare il numero di passaggio a partire da "1".
  6. Incubare le cellule a 37 °C in presenza del 5% di CO2 e dell'umidità fino a raggiungere la confluenza dal 95% al 100%. Controllare le cellule ogni giorno al microscopio a partire dal secondo giorno di incubazione. Non permettere alle celle di raggiungere la confluenza >100% in quanto ciò causerà il decollo e la morte delle cellule.
    NOTA: Il tempo necessario per raggiungere la confluenza dipende dal numero di cellule vive placcate e dall'area di crescita del pallone. Pertanto, è prudente controllare le cellule ogni giorno.
  7. Cellule di sottocoltura raschiando e diluendo il patrimonio cellulare in mezzo fresco consentendo almeno due giorni di crescita tra i raschiamenti. Aumentare il numero di passaggio di 1 con ogni sottocultura.
    NOTA: Il passaggio e la raschiatura immediata il giorno successivo si tradurranno in una perdita più rapida dell'aderenza generale delle cellule nel tempo. Raw 264.7 cellule devono essere utilizzate solo fino a circa il passaggio 15.
  8. Per placcare RAW 264.7 celle per il saggio OAA, sostituire con mezzo fresco e utilizzare un raschietto cellulare per raschiare delicatamente le cellule dal pallone. Pipetta su e giù per rompere i grumi cellulari per un più facile conteggio delle celle.
    NOTA: Il metodo tradizionale per la subcultura di RAW 264.7 è la raschiatura. Nella nostra esperienza, l'uso della tripside fa sì che le cellule RAW 264.7 perdano aderenza nel tempo più velocemente rispetto alla raschiatura.
  9. Per contare le celle, diluire volumi uguali di celle e cercare una soluzione blu. Caricare 10 μL su un emocitometro. Osservare e contare il numero di cellule vive che escludono il colorante utilizzando un microscopio composto invertito con una lente obiettivo 10x.
  10. Piastra 1,4 x 104 celle vitali per pozzo in una piastra inferiore piatta di vetro spessa 96 ben 0,15 μm (piastra #1). Consentire alle cellule di crescere per 3 giorni. Sostituire il mezzo trascorso un giorno prima di eseguire OAA.
    NOTA: Dopo 3 giorni di incubazione, il numero di cellule dovrebbe essere di circa 5 x 104/ bene.

2. Coltura e preparati batterici

NOTA: La specie batterica utilizzata in questo protocollo è un ceppo virulento incapsulato, B. anthracis Ames. Tutte le manipolazioni con questa specie richiedono adeguate autorizzazioni di biosicurezza e sicurezza e devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II o classe III situato in un laboratorio BSL-3. Seguire le procedure operative istituzionali per il lavoro BSL-3 e per l'uso di dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione dei batteri.

  1. Preparare il brodo di infusione di cuore cerebrale (BHI) sciogliendo 37 g di polvere BHI in acqua da 1 L e autoclave a 121 °C per 15 minuti. Conservare il brodo a temperatura ambiente.
  2. Preparare la soluzione di bicarbonato di sodio all'8% in acqua e sterilizzare utilizzando una siringa filtrante da 0,20 μm. Conservare la soluzione a 4 °C e utilizzarla entro 1 giorno.
  3. Mescolare 8 g di brodo nutriente, 3 g di estratto di lievito e 15 g di agar in 1 L di acqua per preparare piatti di agar NBY. Autoclave a 121 °C per 15 min. Versare nelle piastre di Petri e lasciare solidificare. Conservare le lastre a 4 °C.
    NOTA: Le piastre di agar NBY possono essere fatte con o senza bicarbonato di sodio. L'aggiunta di bicarbonato di sodio alle placche di brodo e agar induce la crescita di colonie di mucoidi costituite da bacilli incapsulati. La concentrazione finale di bicarbonato di sodio sia in mezzi liquidi che solidi è dello 0,8%.
  4. Preparare il brodo di coltura per B. anthracis mescolando il 50% di brodo BHI autoclavato, il 40% di FBS e la soluzione di bicarbonato di sodio al 10% (v/v).
    NOTA: Questo brodo è formulato per produrre brevi catene di bacilli incapsulati.
  5. Preparare un piatto principale di B. anthracis strizzandolo per l'isolamento su una piastra di agar NBY da uno stock di spore un giorno prima di coltivare in brodo. Incubare a 37 °C.
  6. Inoculare 30 ml di brodo di coltura in un pallone ventilato da 250 ml con diverse colonie di B. anthracis.
    NOTA: È necessario uno specifico rapporto volume/superficie del brodo, come specificato qui, per produrre bacilli incapsulati al massimo.
  7. Agitare la coltura del brodo a 125 giri/min, 37 °C con 20% di CO2 e umidità per 18-24 ore.
    NOTA: La coltivazione di B. anthracis a temperature superiori a 37 °C può inibire la produzione di capsule.
  8. Utilizzare la colorazione negativa con inchiostro indiano per garantire un incapsulamento sufficiente e che i bacilli siano in catene corte (1-5 bacilli/catena) prima della fissazione (vedere la sezione 3).
  9. Per determinare le unità di formazione delle colonie (CFU), diluire serialmente 100 μL di coltura 1:10 nella soluzione di soluzione di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e diluizioni di coltura delle placche sulle piastre di agar del sangue di pecora. Incubare per 12-18 h a 37 °C. Contare i CFC e determinare il numero di batteri per mL di coltura.
    NOTA: Il conteggio può anche essere eseguito utilizzando un emocitometro al microscopio una volta che i batteri sono stati riparato. Tuttavia, questo non è raccomandato perché i bacilli sono difficili da vedere sotto basso ingrandimento.
  10. Aggiungere il 16% di paraformaldeide (PF) all'intero volume della coltura batterica ad una concentrazione finale del 4% di PF per fissare i bacilli. Agitare lentamente su uno shaker a temperatura ambiente per 7 giorni.
    NOTA: Sette giorni di incubazione nel 4% di PF si basano sulla procedura operativa standard istituzionale USAMRIID per la fissazione dei bacilli vegetativi.
  11. Per rimuovere il fissativo e testare la sterilità, lavare tre volte 4 ml (10% di volume) di sospensione batterica fissa in un tubo conico da 50 ml per centrifugazione a ≥3000 x g per 45 min e utilizzando un 30 mL/lavaggio con PBS. Conservare il campione rimanente in PF al 4% a 4 °C.
    NOTA: Dopo la pellettizzazione, il pellet batterico è soffice a causa della presenza di capsula. Fare attenzione a non disturbare il pellet durante il lavaggio. È necessario rimuovere tutto il fissatore in modo che non interferisca con il test di fattibilità. Se necessario, aumentare il numero di lavaggi.
  12. Per le prove di vitalità, inoculare 40 mL di un mezzo di crescita batterico (ad esempio brodo BHI) con 4 mL di sospensione lavata (≤ 10% del volume di brodo) e incubare a 37 °C per 7 giorni. Controllare la densità ottica a 600 nm prima e dopo 7 giorni per misurare la torbidità.
  13. Dopo 7 giorni di incubazione nella coltura del brodo, ≥100 μL di brodo su una piastra di agar e incubare per altri 7 giorni. Se non si vede alcun aumento della torbidità e nessuna crescita sulle piastre, la coltura originale è considerata sterile e può essere trasferita in un laboratorio BSL-2.
    NOTA: Il Federal Select Agent Program22 impone che l'inattivazione di B. anthracis possa essere trasferita solo dai laboratori BSL-3 dopo aver dimostrato la completa sterilità del campione. Il test di vitalità per l'inattivazione B. anthracis consiste nel coltivare il 10% del campione in brodo per 7 giorni seguito da una coltura su terreno solido per altri 7giorni 22,23. Segui le linee guida istituzionali per ricevere l'approvazione del trasferimento una volta stabilita la sterilità.

3. Colorazione negativa e microscopia leggera per osservare catene di incapsulamento e bacilli

  1. Mescolare sospensioni batteriche da 5 μL con 2 μL di inchiostro indiano su uno scivolo al microscopio. Posizionare un vetro di copertura spesso 1 o 1,5 μm sopra la sospensione senza creare bolle.
    NOTA: Lo smalto per unghie può essere utilizzato per sigillare il vetro di copertura sullo scivolo.
  2. Osservare le sospensioni batteriche utilizzando una lente obiettivo olio da 40x a 100x su un microscopio leggero. Assicurarsi che i bacilli siano incapsulati osservando una zona di gioco (la capsula esclude l'inchiostro indiano) che circonda ogni batterio e che le catene di bacilli siano corte.

4. Etichettatura FITC dei batteri

  1. Sciogliere l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) nel solfossido di dimetile ad una concentrazione di 2 mg/mL.
  2. Misurare il volume di stock batterico inattivato.
  3. Lavare il materiale 3 volte in PBS per rimuovere il fissatore.
  4. Aggiungere la soluzione FITC ad una concentrazione finale di 75 μg/mL. Agitare lentamente la miscela per 18-24 ore a 4 °C.
  5. Lavare tre volte i batteri pellettizzazione a ≥3000 x g, 45 min e utilizzando 30 mL PBS/lavaggio per rimuovere il FITC in eccesso. Assicurarsi che il pellet soffice non sia disturbato durante il lavaggio. Riutilizza i bacilli in PBS nello stesso volume iniziale.
  6. Aliquota e conservare i bacilli in microtubi a -20 °C fino all'uso. Non congelare/scongelare i bacilli più volte in quanto i bacilli potrebbero perdere capsula.

5. Opsonizzazione batterica

  1. Il calore inattiva un piccolo volume di sieri di prova (da SMP) a 56 °C per 30 minuti in un blocco termico.
  2. Scongelare e lavare i batteri marcati FITC con PBS 2x mediante pellettizzazione a 15000 x g per 3-5 minuti. Resuspend in PBS nello stesso volume iniziale.
  3. In una piastra inferiore ben rotonda 96 (piastra #2), diluire serialmente i sieri di prova in mezzo cellulare. In un'altra piastra inferiore ben rotonda (piastra #3), aggiungere 10 μL di sieri di prova diluiti in ogni pozzo.
    NOTA: In ogni piatto, PBS e normali sieri di scimmie sono stati inclusi al posto dei sieri di prova diluiti come controlli negativi. Abbiamo anche scelto un siero di prova come controllo positivo per generare una curva standard per normalizzare tutti i test eseguiti in giorni diversi. Il siero del test di controllo positivo è stato scelto arbitrariamente perché abbondante.
  4. Per placcare #3, aggiungere 10 μL di complemento di coniglio appena ricostituito.
    NOTA: Una volta ricostituito, scartare il complemento di coniglio rimanente; non ricongelare e scongelare.
  5. Per placcare #3, aggiungere il volume appropriato di bacilli etichettati FITC per una molteplicità di infezione di 1:20. Ad esempio, aggiungere il volume che contiene 5 x 104 x 20 bacilli per 5 x 104 celle. Completa ogni pozzo in lamiera #3 con il volume appropriato di cellulare medio-totale 105 μL.
    NOTA: La #1, che contiene cellule, riceve 100 μL di batteri opsonizzati con i restanti 5 μL come volume vuoto. Abbiamo testato ogni diluizione dei sieri di prova in duplice copia.
  6. Incubare la #3 a 37 °C per 30 min in presenza del 5% di CO2 con umidità per opsonizzare i bacilli.

6. Saggio di aderenza ed etichettatura fluorescente delle cellule di mammifero

  1. Mantenere tutti i reagenti a 37 °C prima dell'uso.
  2. Posizionare la #1, che contiene cellule aderenti, su un blocco termico a 37 °C.
  3. Utilizzare un pipettor multicanale per rimuovere il mezzo trascorso dai pozzi e sostituire rapidamente con 100 μL di batteri opsonizzati dalla piastra #3. Assicurarsi che non siano state generate bolle nei pozzi durante la pipettazione. Incubare la piastra #1 a 37 °C con 5% di CO2 e umidità per 30 minuti per aderenza.
  4. Lavare ogni pozzo 5x con PBS da 150 μL sopra un blocco termico a 37 °C per rimuovere i bacilli non attaccati.
    NOTA: Fare attenzione a garantire che le cellule non vengano disperse accidentalmente durante il lavaggio.
  5. Diluire il 16% di PF con PBS 1:4 per fare il 4% di PF. Fissare le celle con 4% di PF per 1 h aggiungendo 150 μL ad ogni pozzo. Lavare le celle 2 volte con PBS.
  6. Mescolare 2 μL HCS (screening ad alto contenuto) Orange Cell Stain in 10 mL PBS. Aggiungere 150 μL di questa soluzione di colorazione a cellule fisse e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  7. Lavare i pozzi 2 volte con PBS.
  8. Conservare a 4 °C fino alla microscopia.

7. Microscopia

NOTA: In generale, un microscopio a fluorescenza automatizzata ad alta produttività faciliterà l'imaging per l'OAA. Se non è disponibile un sistema automatizzato, le immagini fluorescenti dei bacilli aderenti possono essere prese manualmente21. In questo studio20,bacilli aderenti e monostrati cellulari sono stati coniati utilizzando il sistema di microscopia a scansione laser Zeiss 700 con apparecchiature specializzate; il nostro sistema era composto dal microscopio invertito Zeiss Axio Observer Z1 dotato di uno stadio automatizzato, dal modulo Definite Focus, dall'obiettivo 40 x NA 0.6, dalla telecamera Axio Cam HRc e dal software Zen 2012 (Blue Edition). Le immagini acquisite sono immagini widefield, non immagini confocali. Il seguente protocollo è inteso come una configurazione al microscopio di base applicabile a una varietà di sistemi di microscopia automatizzati.

  1. Incubare la #1 a temperatura ambiente per 30 minuti. Accendere il microscopio e le relative apparecchiature.
    NOTA: L'acclimatazione a temperatura ambiente impedisce la formazione di condensa sulla piastra di vetro durante l'imaging. Inoltre, impedisce la sfocatizzazione a causa dello spostamento della temperatura.
  2. Posizionare la piastra sul palco e concentrarsi sulle celle utilizzando il campo luminoso o il contrasto di fase.
  3. Selezionare il formato 96 e l'impostazione della piastra. Selezionare le impostazioni del canale.
    NOTA: L'eccitazione di picco e la lunghezza d'onda di emissione di FITC sono di 495/519 nm; la macchia di cellule arancioni HCS è di 556 e 572 nm. Altri fluorofori possono essere utilizzati a seconda dei filtri disponibili al microscopio.
  4. Selezionare l'impostazione per la modalità riquadro. Indicare il numero di immagini da acquisire.
    NOTA: la funzione di piastrellatura consente l'acquisizione di più posizioni in un pozzo campione e può essere impostata per acquisire immagini in un accodamento o in un formato casuale. Abbiamo immaginato 10 aree casuali per pozzo.
  5. Cambia la modalità di acquisizione in "bianco e nero" o "monocromatico" e binning ≥ 2x2.
    NOTA: L'impostazione del binning da 1x1 a 2x2 o 4x4 aumenterebbe la velocità della microscopia, ma comporterebbe anche una risoluzione inferiore dell'immagine. Per l'OAA, è sufficiente utilizzare queste impostazioni poiché il saggio enumera sia i macrofagi che i batteri aderenti.
  6. Attivare il modulo di messa a fuoco automatica o di messa a fuoco. Indicare la frequenza con cui deve essere eseguita la funzione di messa a fuoco automatica. Attivare la funzione Z stack, se disponibile. Indicare il numero di pile Z che cattureranno lo spessore del monostrato di cellule e dei bacilli aderenti.
    NOTA: il numero di pile Z scelte aumenterà il tempo di microscopia, ma assicurerà che un'immagine con lo stato attivo corretto sia scattata in ogni pila Z.
  7. Designare una cartella di file in cui salvare le immagini. Eseguire il programma di imaging automatizzato.

8. Raccolta e analisi dei dati

  1. Contare il numero di bacilli aderenti e cellule di mammiferi per immagine. Contare ogni catena di bacilli come un batterio.
  2. Tracciare i bacilli/cellule del siero e del titolo del test di controllo positivo (ad esempio, la diluizione 1:10 è di 10 unità di titolo) per generare una curva standard in un programma statistico appropriato.
  3. Analizzare il siero di prova del controllo positivo utilizzando il raccordo della curva di regressione non lineare. Quindi analizzare i campioni rimanenti utilizzando la curva standard del siero di prova di controllo positivo per determinare i titer corrispondenti.
    NOTA: Di solito è più accurato scegliere le diluizioni del campione vicino al centro della curva standard quando si determinano i titolori.
  4. Calcola la media geometrica dei campioni di ogni gruppo di vaccini. Calcolare i valori P- dei formicolii trasformati di log in base all'analisi ANOVA della differenza meno significativa.

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Representative Results

Questa sezione mostra le micrografie rappresentative raccolte durante un esperimento OAA insieme ai risultati che mostrano che l'OAA può essere utilizzato per esaminare la funzione biologica degli anticorpi. Qui, il test è stato utilizzato con successo per valutare l'efficacia di un candidato al vaccino contro l'antrace. È fondamentale verificare lo stato di incapsulamento sui bacilli poiché il poco o nessun incapsulamento li fa aderire alle cellule ospiti, producendo uno sfondo elevato. La figura 1 è un'immagine di B. anthracis Ames macchiata negativamente con inchiostro indiano per esaminare l'incapsulamento. L'OAA richiede l'illuminazione di più campi di vista adiacenti e, se si utilizza la microscopia confocale, più pile o sezioni. Pertanto, è necessario verificare che i bacilli non siano né troppo fiochi né foto-candeggine troppo rapidamente. La figura 2 è un'immagine dei bacilli etichettati con FITC. La figura 3 mostra le immagini di proiezione massime di B. anthracis Ames attaccate ai monostrati cellulari. Si tratta di campi di vista rappresentativi che sono stati conteggiati e valutati per l'OAA. L'aumento dell'attaccamento dei bacilli incubati con antisiero PGGA-OMPC è dovuto alla presenza di anticorpi anti-capsula che hanno opsonizzato i bacilli. La figura 4 mostra che i titer siepi degli NSP vaccinati con PGGA-OMPC da 10 e 50 μg sono significativamente più alti dei formicolio solo per OMPC e PGGA.

Figure 1
Figura 1. Immagine inchiostrata indiana di B. anthracis Ames fissa. Si noti la zona di gioco che circonda i bacilli a causa della presenza di capsula. Bar = 10 μm. L'immagine è stata scattata sul sistema di microscopia automatizzata EVOS FL con obiettivo olio 100 x 1.4 (NA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Immagini di FITC etichettate B. anthracis Ames fisse. (A sinistra) Immagine a contrasto di interferenza differenziale; immagine fluorescente pseudocolore in verde (al centro); uniti (a destra). Bar = 10 μm. Le immagini confocali sono state scattate sulla microscopia confocale Zeiss 700 LSM con obiettivo olio 40 x 1,3 NA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Le immagini fluorescenti di B. anthracis Ames hanno aderito ai monostrati a cellule RAW 264.7. I bacilli sono stati opsonizzati con siero di prova da NSP vaccinati e potenziati con (A) 10 μg PGGA-OMPC, (B) 50 μg PGGA-OMPC, (C) 50 μg PGGA da solo, o (D) OMPC da solo. Verde = B. antrace Ames, rosso = RAW 264,7 cellule. Bar = 20 μm. Immagini a campo largo sono state scattate sul microscopio Zeiss Axio Observer Z1 con obiettivo 40 x 0,6 e sulla fotocamera Axio Cam HRc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Nti di opsono-aderenza di NSP vaccinati con 10 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA-OMPC, 50 μg solo PGGA o OMPC da solo. I mezzi geometrici di 5 animali per gruppo sono grafici. *p ≤ 0,001 rispetto alla sola PGGA. I valori p sono stati calcolati utilizzando ANOVA con test posthoc LSD. I dati sono stati originariamente pubblicati su Chabot, et al., 201620. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I vaccini a base di capsule hanno dimostrato di essere efficaci contro numerosi agenti patogeni batterici e molti sono autorizzati perl'uso nell'uomo 25,26,27. Questi vaccini funzionano generando anticorpi mirati alla capsula e molti di questi studi utilizzano l'OPKA per mostrare le funzioni opsono-fagocitichedegli anticorpi 13,14,16,28,29. A causa di problemi di biosicurezza e per facilità di lavoro, abbiamo sviluppato un OAA per valutare gli anticorpi degli animali vaccinati con coniugati a capsule B. anthracis. La presenza di capsula su B. anthracis previene l'aderenza e la fagocitosi30,ma l'opsonizzazione dei bacilli con sieri da animali vaccinati induce l'attaccamento ai macrofagi20,21.

Per l'OAA, l'attività di aderenza, non l'internalizzazione e l'uccisione, è usata per quantificare l'attività opsonica. Ciò ha offerto all'OAA diversi vantaggi. Siamo stati in grado di utilizzare la paraformaldeide uccisa, etichettata fluorescentmente bacilli incapsulati invece di organismi vivi. Le modifiche apportate alla superficie batterica dalla fissazione dell'aldeide e dall'etichettatura fluorescente non hanno modificato l'aderenza complessiva del batterio ai macrofagi; bacilli fissi ed etichettati non erano più aderenti dei bacilli vivi (dati non mostrati). Il grado di incapsulamento può variare da cultura a cultura e influenzare l'aderenza complessiva nonostante condizioni di crescita simili. Pertanto, l'uso di un singolo stock batterico inattivato consente la standardizzazione tra gli esperimenti eseguiti in giorni diversi e attraverso diversi set di esperimenti. Questo è stato prezioso per confrontare i sieri dei 20 NSP utilizzati in questo lavoro e i sieri che saranno generati nei nostri prossimi studi. Infine, la maggior parte dei macrofagi, comprese le cellule RAW 264.7, sono sensibili alla tossina letale dell'antrace prodotta dall'agente patogenovivo 31,rendendo l'uso di bacilli vivi intrinsecamente problematico.

Anche l'uso di celle RAW 264.7 ha facilitato la standardizzazione. Inizialmente abbiamo usato una linea cellulare comunemente usata nelle cellule OPKA, HL-60. Tuttavia, abbiamo riscontrato difficoltà nel differenziarli ai granulociti con dimetil-formamide, come riportato da altri28,32. Raw 264.7 cellule hanno il vantaggio che non hanno bisogno di essere chimicamente differenziate e sono aderenti e quindi più suscettibili di OAA a base di microscopia. Questa linea cellulare è stata utilizzata in numerosi studi di fagocitosi con agenti patogeni intracellulari33,34, così come B. anthracis31. L'uso di cellule RAW 264.7, che derivano dal topo, è vantaggioso anche perché i recettori Fc del topo sono promiscui nella loro specificità di legame per IgG derivato da altrespecie 35. Questo ci ha permesso di valutare gli anticorpi anti-capsula da SNF con una linea cellulare murina.

L'antrace, sebbene raro, è endemico in alcune regioni del mondo e negli Stati Uniti. Una preoccupazione è che l'FBS utilizzato, proveniente dagli Stati Uniti, potrebbe già contenere anticorpi anti-capsula a causa dell'esposizione dell'animale a spore di B. antrace o altri microbi produttori di PGGA nel terreno. Per risolvere questo problema, il lotto FBS che abbiamo usato è stato pre-testato. La Corte ha riscontrato che l'aggiunta di FBS inattivato dal calore ha aumentato l'aderenza rispetto al solo DMEM (dati non mostrati). Tuttavia, non ha aumentato l'aderenza rispetto ai normali sieri inattivati dal calore da cavia, scimmia, topo o umano (dati non mostrati). Pertanto, il lotto FBS che abbiamo usato non conteneva anticorpi anti-capsula a causa dell'esposizione. Inoltre, non conterrebbe anticorpi anti-capsula a causa della vaccinazione dell'animale con il B. anthracis Sterne non incapsulato, un ceppo privo del plasmide pXO2 necessario per la produzione di capsule. Il lotto FBS testato è stato utilizzato per tutti gli OAA successivi.

Una limitazione della tecnica è il compito di contare bacilli e cellule da parte del personale di laboratorio, che ha richiesto un'enorme quantità di tempo e fatica. Questo può essere corretto con l'uso di software che ha questo tipo di analisi; questo software non era disponibile per noi in quel momento. Tuttavia, poiché era necessario il conteggio manuale, un passaggio critico è stata la rimozione o il lavaggio di bacilli estranei e non attaccati per facilitare il compito. È stato anche necessario testare i reagenti che hanno portato a un rumore di fondo inferiore. OAA richiede una fonte di complemento perché migliora l'opsonizzazione36. Pertanto, abbiamo testato una varietà di fonti di complemento tra cui cavia, complemento di coniglio umano e bambino. Abbiamo scelto il complemento di coniglio per il nostro saggio perché abbiamo scoperto che non ha attività deboli e multi-specifiche contro gli antigeni eterofili, è comunemente usato negli studi OPKA14,15,37ed è prontamente disponibile in commercio.

Riteniamo che l'OAA sia quantitativo e altamente riproducibile. Lo usiamo per integrare studi che coinvolgono test di legame ligando come gli ELISA, che quantificano solo i livelli totali di IgG ma non distinguono tra anticorpi funzionali e non funzionali. L'OAA può essere utilizzato per integrare altri saggi funzionali (ad esempio, attività battericida sierica e test di neutralizzazione delle tossine) per mostrare la diversa funzionalità degli anticorpi generati dal vaccino16,38. Lo sviluppo dell'OAA ha aumentato il nostro repertorio di studi di immunogenicità per valutare vaccini e terapie.

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Disclosures

Gli autori non hanno un'associazione commerciale o di altro tipo che potrebbe rappresentare un conflitto di interessi.

Acknowledgments

J. Chua, D. Chabot e A. Friedlander disegnano le procedure descritte nel manoscritto. J. Chua e T. Putmon-Taylor eseguirono gli esperimenti. D. Chabot ha eseguito l'analisi dei dati. J. Chua scrisse il manoscritto.

Gli autori ringraziano Kyle J. Fitts per l'eccellente assistenza tecnica.

Il lavoro è stato supportato dalla concessione della Defense Threat Reduction Agency CBM. VAXBT.03.10.RD.015, piano numero 921175.

Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dall'esercito degli Stati Uniti. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Difesa, né la menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) Corning, Corning, NY 431222
10 mL syringe (Luer-Lok tip) BD, Franklin Lakes, NJ 302995
15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA P96-1-N
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 15710
75 cm sq. tissue culture treated flask Corning, Corning, NY 430641
Agar (powder) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1296
Baby Rabbit Complement Cedarlane Labs, Burlington, NC CL3441
Bacto Yeast Extract BD, Sparks, MD 288620
BBL Brain Heart Infusion (BHI) BD, Sparks, MD 211059
Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates Remel, Lenexa, KS R01198
Cell scraper Sarstedt, Newton, NC 83.183
Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) Corning, Corning, NY 3596
Cover glass Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 72200-10
Difco Nutrient Broth BD, Sparks, MD 234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 11965-092 contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red
EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AMAFD1000
Fetal Bovine Serum Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SH30071.03 not gamma irradiated, not heat inactivated
Fluorescein isothiocyanate Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA F143
HCS Cell Mask Orange Cell Stain Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA H32713
hemocytometer (Improved Neubauer) Hausser Scientific, Horsham, PA 3900
India Ink solution BD, Sparks, MD 261194
L- glutamine (200 mM) Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA 25030081 supplement medium with additional 2mM L-glutamine
Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) Nikon Instruments, Melville, NY TE2000
PBS without Calcium or Magnesium Lonza, Walkersville, MD 17-516F
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SV30010
petri dishes (100 x 15 mm) Falcon, Corning, Durham, NC 351029 for agar plates
RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) ATCC, Manassas, VA ATCC TIB-71
Slides VWR, Radnor, PA 16004-422
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S5761
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8154
Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY 4109001865956000

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Immunologia e Infezione Numero 159 Opsonizzazione aderenza anticorpi siero macrofagi capsula sviluppo di vaccini immunità innata primati non umani cellule RAW 264.7 microscopia a fluorescenza automatizzata correlato dell'immunità
Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro <em>bacillus anthracis e</em> altri agenti patogeni incapsulati
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