Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Opsono-overholdelse analyse for å evaluere funksjonelle antistoffer i vaksineutvikling mot Bacillus anthracis og andre innkapslede patogener

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60873
Automatic Translation
*1, *1, 1,3, 2
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual
* These authors contributed equally

Summary

Opsono-adherence analysen er en alternativ metode for opsono-fagocytisk drapsanalyse for å evaluere opsonisk funksjoner av antistoffer i vaksineutvikling.

Abstract

Opsono-etterlevelsesanalysen er en funksjonell analyse som nummererer vedlegget av bakterielle patogener til profesjonelle fagocytter. Fordi overholdelse er nødvendig for fagocytose og drap, er analysen en alternativ metode for opsono-phagocytic drapsanalyser. En fordel med opsono-overholdelsesanalysen er muligheten til å bruke inaktiverte patogener og pattedyrcellelinjer, noe som tillater standardisering på tvers av flere eksperimenter. Bruken av et inaktivert patogen i analysen letter også arbeid med biosikkerhetsnivå 3 smittsomme stoffer og andre virulent patogener. I vårt arbeid ble opsono-adherence analysen brukt til å vurdere antistoffenes funksjonelle evne, fra sera av dyr vaksinert med en miltbrannkapselbasert vaksine, for å indusere overholdelse av fast Bacillus-anthracis til en musemakrofagcellelinje, RAW 264.7. Automatisert fluorescensmikroskopi ble brukt til å ta bilder av bacilli som følge makrofager. Økt etterlevelse var korrelert med tilstedeværelsen av antistoffer mot kapsel i serumet. Ikke-menneskelige primater som viste høye serum anti-kapsel antistoffkonsentrasjoner ble beskyttet mot miltbrann utfordring. Dermed kan opsono-overholdelsesanalysen brukes til å belyse de biologiske funksjonene til antigenspesifikke antistoffer i sera, for å evaluere effekten av vaksinekandidater og andre terapeutiske midler, og for å tjene som en mulig korrelering av immunitet.

Introduction

Anerkjennelse, etterlevelse, internalisering og nedbrytning av et patogen er integrert i fagocytose1, en fremtredende vei i verten medfødt immunrespons først beskrevet av Ilya Metchnikoff i 18832,3. Fagocytiske leukocytter, så vel som andre celler i immunsystemet, er svært diskriminerende i deres valg av mål; de er i stand til å skille mellom "smittsomme ikke-selv" og "ikke-smittsomme selv" gjennom patogene assosiert molekylære mønstre ved deres repertoar av mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs)4,5. Vertsgjenkjenning av et patogen kan også oppstå med binding av vertsopsoniner, for eksempel komplement ogantistoffer 6. Denne prosessen, kalt opsonisering, strøk patogenet med disse molekylene, og forbedrer internaliseringen ved binding til opsonisk reseptorer (f.eks. komplement og Fc reseptorer) på fagocytiske celler6. For at et patogen skal følge en fagocyte, er det nødvendig med kollektiv binding av flere reseptorer med sine kognate ligande. Først da kan etterlevelse utløse og opprettholde signalkaskader inne i vertscellen for å starte internalisering6.

På grunn av viktigheten av fagocytose i clearance av patogener og forebygging av infeksjon, har ekstracellulære patogener utviklet mange måter å undergrave denne prosessen for å forlenge overlevelsen. En strategi av betydning er produksjonen av en anionisk polymer (f.eks polysakkarid eller polyaminosyre) kapsel som er anti-fagocytisk i kraft av sin ladning, er dårlig immunogen, og beskytter molekyler på bakteriell konvolutt fra PRRs6,7. Patogener som Cryptococcus neoformans og Streptococcus pneumoniae har kapsler bestående av sakkaridpolymerer, mens Staphylococcus epidermidis og noen Bacillus arter produserer poly-ɣ-glutaminsyre (PGGA)7,8. Likevel produserer andre patogener kapsler som ligner det ikke-smittsomme selvet. For eksempel har Streptococcus pyogenes og en patogen stamme av B. cereus en hyaluronsyrekapsel som ikke bare er anti-phagocytic, men som heller ikke kan gjenkjennes som fremmed avimmunsystemet 9,10.

Bøyning av kapsel til bærerproteiner omdannes dem fra fattige, T-uavhengige antigener til svært immunogene T-avhengige antigener som kan indusere høy serum anti-kapsel antistoff titers11,12. Denne strategien er ansatt for lisensierte vaksiner mot S. pneumoniae, Haemophilus influenzae,og Neisseria meningitides11. De opsonisk aktivitetene til antikapselantistoffer har ofte blitt evaluert av opsono-fagocytiske drapsanalyser (OPKA)13,14,15,16. Disse analysene tester om funksjonelle antistoffer kan utløse fagocytose og drepe14. Imidlertid er bruk av OPKA med smittsomme patogener, som Tier 1 Biological Select Agents og Toxins (BSAT), inkludert B. anthracis17,farlig og utgjør sikkerhetsrisiko; disse analysene nødvendiggjør omfattende håndtering av en utvalgt agent. Utvalgte agenthåndtering kan bare gjøres i begrensede biosikkerhetsnivå 3 (BSL-3) laboratorier; arbeid på disse områdene krever langvarige driftsprosedyrer på grunn av de mange sikkerhets- og sikkerhetsforanstaltningene som må følges. BSL-3 laboratorier er heller ikke utstyrt med spesialutstyr som brukes til OPKA arbeid, for eksempel mikroskoper og cytometere. Dermed utviklet vi en alternativ analyse basert på bruk av inaktiverte bakterier18,19. Vi refererer til dette som en opsono-overholdelse analyse (OAA) som ikke er avhengig av internalisering og drap som analyse utganger; I stedet brukes overholdelse av opsoniserte inaktiverte patogener som en indeks av fagocytose. Mekanistisk er OAA en passende erstatning fordi etterlevelse skjer en priori og er nært sammenvevd med internalisering og intracellulært drap. Fra et biosikkerhetsperspektiv foretrekkes OAA fordi det krever minimal håndtering av et smittsomt middel, er eksperimentelt kortere varighet enn OPKA, og kan utføres i BSL-2-laboratorier etter at en bestand av det inaktiverte patogenet er produsert og overført.

Vi demonstrerer utnyttelsen av OAA for å undersøke opsonisk funksjon av antikapsel antistoffer som finnes i sera av ikke-menneskelige primater (NHPs) vaksinert med en kapsel konjugat [det vil si PGGA fra B. anthracis konjugert til ytre membran protein kompleks (OMPC) av Neisseria meningitides]20. Serum opsonisert bacilli ble inkubert med en tilhengermus makrofag cellelinje, RAW 264.7. Etter fiksering ble cellemonolaget og tilhengerbakilli avbildet av fluorescensmikroskopi. Bakteriell etterlevelse økte når bacilli ble inkubert med serum fra NHPs vaksinert med kapselkonjugatet sammenlignet med kontrollserum20. Overholdelse korrelert med overlevelse av miltbrann utfordring20,21. Dermed karakteriserte bruken av OAA funksjonen til antikapselantistoffer og sterkt tilrettelagt testing av vår vaksinekandidat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I samsvar med dyrevelferdsloven, folkehelsetjenestepolitikken og andre føderale vedtekter og forskrifter knyttet til dyr og eksperimenter som involverer dyr, ble forskningen beskrevet her utført under en godkjent protokoll for institusjonell dyreomsorgs- og brukskomité. Anlegget der denne forskningen ble utført er akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International og overholder prinsippene som er angitt i Veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr, National Research Council, 201124.

1. Kultur og vedlikehold av cellelinjen, RAW 264.7

MERK: Følgende prosedyrer må utføres med aseptiske teknikker.

  1. Varm føtal storfe serum (FBS) i et 56 ° C vannbad i 30 min for å inaktivere komplement.
    MERK: Inaktiveringstiden på 30 min begynner når FBS når 56 °C. For å overvåke temperaturen, varme et lignende volum vann i et beger i samme vannbad. Når vannet når 56 °C, begynner du nedtellingen på 30 min for FBS. Alternativt er FBS som har blitt varmeaktivert også kommersielt tilgjengelig.
  2. Forbered medium for RAW 264,7 celler ved å kombinere 90% DMEM med høy glukose og 10% varme inaktivert FBS (v / v). Legg L-glutamin til en endelig konsentrasjon på 6 mM.
    MERK: DMEM med høy glukose er formulert med 4 mM L-glutamin. Supplere L-glutamin til 6 mM fremmer konsekvent cellevekst. 100 E/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin kan tilsettes for å forhindre kontaminering. En annen vanlig murine cellelinje, J774A.1, kan også brukes og dyrkes under lignende forhold.
  3. Tin et frossent hetteglass med celler i et 37 °C vannbad og fjern fra badet så snart det smelter. Tilsett innholdet aseptisk til 5 ml komplett medium i et konisk rør. Inverter konisk rør to ganger og spinn på 300 x g i 5 min til pelletceller.
  4. Aspirer medium ved hjelp av en steril Pasteur pipet festet til et vakuum for å fjerne frysemiddel. Resuspend cellepellet i 5 ml friskt medium.
  5. Overfør suspensjon til en vevskultur behandlet kolbe eller tallerken. Tilsett nok medium til å dekke bunnen av kolben helt og virvle for å fordele celler jevnt. Angi passasjenummer fra og med "1".
  6. Inkuber celler ved 37 °C i nærvær av 5 % CO2 og fuktighet til 95 % til 100 % samløpet er nådd. Sjekk celler daglig under mikroskopet som begynner med den andre inkubasjonsdagen. Ikke la cellene nå > 100% samløpet, da dette vil føre til at cellene løfter seg av og dør.
    MERK: Tiden som trengs for å nå samløpet avhenger av hvor mange levende celler som ble belagt og vekstområdet i kolben. Dermed er det forsvarlig å sjekke cellene daglig.
  7. Subkulturceller ved å skrape og fortynne cellebestanden i friskt medium slik at minst to dager med vekst mellom skraping. Øk passasjen med 1 med hver subkultur.
    MERK: Bestått og umiddelbar skraping neste dag vil resultere i raskere tap av generell celleoverholdelse over tid. RAW 264,7 celler skal kun brukes opp til ca. passasje 15.
  8. For å plate RAW 264.7 celler for OAA analysen, erstatte med frisk medium og bruke en celle skrape for å forsiktig skrape celler av kolben. Pipette opp og ned for å bryte opp celleclumps for enklere celletelling.
    MERK: Den tradisjonelle metoden for subculturing RAW 264.7 er ved å skrape. Etter vår erfaring fører bruken av trypsin til at RAW 264,7-celler mister etterlevelse over tid raskere enn ved skraping.
  9. For å telle celler, fortynne like mengder celler og trypan blå løsning. Legg 10 μL på et hemocytometer. Observere og telle antall levende celler som utelukker fargestoffet ved hjelp av et omvendt sammensatt mikroskop med en 10x objektiv linse.
  10. Plate 1,4 x 104 levedyktige celler per brønn i en 96 godt 0,15 μm tykk glass flat bunnplate (Plate #1). La cellene vokse i 3 dager. Erstatt brukt medium en dag før du utfører OAA.
    MERK: Etter 3 dager med inkubasjon skal antall celler være ca. 5 x 104/well.

2. Bakteriell kultur og preparater

MERK: Bakterieartene som brukes i denne protokollen er en innkapslet virulent stamme, B. anthracis Ames. Alle manipulasjoner med denne arten krever passende biosikkerhet og sikkerhetsklareringer og må utføres i et biologisk sikkerhetskabinett i klasse II eller klasse III som ligger i et BSL-3-laboratorium. Følg institusjonelle driftsprosedyrer for BSL-3 arbeid og for bruk av personlig verneutstyr ved håndtering av bakterier.

  1. Forbered hjernehjerteinfusjon (BHI) buljong ved å oppløse 37 g BHI pulver i 1 L vann og autoklavering ved 121 °C i 15 min. Oppbevar kjøttkraft ved omgivelsestemperatur.
  2. Forbered 8 % natriumbikarbonatoppløsning i vann og steriliser med en 0,20 μm filtersprøyte. Oppbevares ved 4 °C og skal brukes innen 1 dag.
  3. Bland 8 g Næringsbuljong, 3 g gjærekstrakt og 15 g agar i 1 L vann for å forberede NBY agarplater. Autoklav ved 121 °C i 15 min. Hell i petriskåler og la det stivne. Oppbevar platene ved 4 °C.
    MERK: NBY agarplater kan gjøres med eller uten natriumbikarbonat. Tilsetning av natriumbikarbonat til kjøttkraft og agarplater induserer veksten av mucoid kolonier bestående av innkapslet bacilli. Endelig konsentrasjon av natriumbikarbonat i både flytende og fast media er 0,8%.
  4. Forbered kulturbuljong for B. antrase ved å blande 50% autoklavet BHI kjøttkraft, 40% FBS og 10% natriumbikarbonatløsning (v / v).
    MERK: Denne kjøttkraft er formulert for å produsere korte kjeder av innkapslet bacilli.
  5. Forbered en master plate av B. anthracis ved å streke den for isolasjon på en NBY agar plate fra en spore lager en dag før kultivering i kjøttkraft. Inkuber ved 37 °C.
  6. Inokuler 30 ml kulturbuljong i en ventilert 250 ml kolbe med flere kolonier av B. anthracis.
    MERK: Et spesifikt volum til overflateforhold av kjøttkraft, som spesifisert her, er nødvendig for å produsere maksimalt innkapslet bacilli.
  7. Rist kjøttkraftkulturen ved 125 o/min, 37 °C med 20 % CO2 og fuktighet i 18–24 timer.
    MERK: Økende B. antracis ved temperaturer over 37 °C kan hemme kapselproduksjonen.
  8. Bruk negativ farging med India-blekk for å sikre tilstrekkelig innkapsling og at bacilli er i korte kjeder (1–5 bacilli/chain) før fiksering (se avsnitt 3).
  9. For å bestemme kolonidanneenheter (CFU), fortynner seriel 100 μL kultur 1:10 i Fosfatbufret saltvann (PBS) løsning og platekulturfortynninger på saublodgarplater. Inkuber i 12–18 timer ved 37 °C. Tell CFUer og bestem antall bakterier per ml kultur.
    MERK: Telling kan også utføres ved hjelp av et hemocytometer under mikroskopet når bakteriene er løst. Dette anbefales imidlertid ikke fordi bacilli er vanskelig å se under lav forstørrelse.
  10. Tilsett 16% paraformaldehyd (PF) til hele volumet av bakteriell kultur ved en endelig konsentrasjon på 4% PF for å fikse bacilli. Rør langsomt på en shaker ved omgivelsestemperatur i 7 dager.
    MERK: Syv dager med inkubasjon i 4 % PF er basert på USAMRIID institusjonell standard driftsprosedyre for å fikse vegetativ bacilli.
  11. For å fjerne fikseringsmiddelet og testen for sterilitet, vask tre ganger 4 ml (10% volum) fast bakteriell suspensjon i et 50 ml konisk rør ved sentrifugering ved ≥3000 x g i 45 min og bruk en 30 ml / vask med PBS. Oppbevar den gjenværende prøven i 4 % PF ved 4 °C.
    MERK: Etter pelleting er bakteriepellet fluffy på grunn av tilstedeværelsen av kapsel. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer pelleten under vasking. Det er nødvendig å fjerne alt fikseringsmiddel slik at det ikke forstyrrer levedyktighetstestingen. Om nødvendig, øke antall vasker.
  12. For levedyktighetstesting inokulerer du 40 ml av et bakterievekstmedium (f.eks. BHI buljong) med 4 ml vasket suspensjon (≤ 10 % av kjøttkraftvolumet) og inkuber ved 37 °C i 7 dager. Kontroller optisk tetthet ved 600 nm før og etter 7 dager for å måle turbiditet.
  13. Etter 7 dager med inkubasjon i buljongkultur, plate ≥ 100 μL kjøttkraft på en agar plate og inkubere i ytterligere 7 dager. Hvis ingen økning i turbiditet og ingen vekst på plater er sett, anses den opprinnelige kulturen steril og kan overføres til et BSL-2-laboratorium.
    MERK: Federal Select Agent Program22 mandater som inaktivert B. anthracis kan bare overføres fra BSL-3 laboratorier etter å ha vist fullstendig sterilitet av prøven. Levedyktighetstesting for inaktivert B. antracis består av å kultere 10% av prøven i kjøttkraft i 7 dager etterfulgt av kultering på solid medium i ytterligere 7 dager22,23. Følg institusjonelle retningslinjer for å motta overføringsgodkjenning når steriliteten er etablert.

3. Negativ farging og lett mikroskopi for å observere innkapsling og bacilli kjeder

  1. Bland 5 μL bakteriell suspensjon med 2 μL India blekk på et mikroskop lysbilde. Plasser et 1 eller 1,5 μm tykt dekkglass på toppen av fjæringen uten å lage bobler.
    MERK: Neglelakk kan brukes til å forsegle dekkglasset på lysbildet.
  2. Følg bakteriell suspensjon ved hjelp av en 40x til 100x olje objektiv linse på et lett mikroskop. Sørg for at bacillien er innkapslet ved å observere en sone med klaring (kapsel utelukker India blekk) rundt hver bakterie og at bacilli kjedene er korte.

4. FITC-merking av bakterier

  1. Oppløs fluorescensisotyocyanat (FITC) i dimetylsulfoksid i en konsentrasjon på 2 mg/ml.
  2. Mål volumet av inaktivert bakteriebestand.
  3. Vask aksjen 3x i PBS for å fjerne fikseringsmiddel.
  4. Tilsett FITC-oppløsning med en endelig konsentrasjon på 75 μg/ml. Rør blandingen langsomt i 18–24 timer ved 4 °C.
  5. Tre ganger vaske bakteriene ved pelleting på ≥3000 x g, 45 min og bruke 30 ml PBS / vask for å fjerne overflødig FITC. Sørg for at den myke pelleten ikke forstyrres under vask. Resuspend bacilli i PBS i samme startvolum.
  6. Aliquot og oppbevar bacilli i mikrorør ved -20 °C til bruk. Ikke frys/tin bacilli flere ganger, da bacilli kan miste kapselen.

5. Bakteriell opsonisering

  1. Varme inaktivere et lite volum av test sera (fra NHPs) ved 56 °C i 30 min i en varmeblokk.
  2. Tin og vask FITC-merkede bakterier med PBS 2x ved pelleting ved 15000 x g i 3–5 min. Gjenoppliv i PBS i samme startvolum.
  3. I en 96 godt rund bunnplate (#2), seriefortynnet test sera i cellemedium. I en annen 96 godt rund bunnplate (plate #3), tilsett 10 μL fortynnet testsera i hver brønn.
    MERK: I hver plate ble PBS og normal apesera inkludert i stedet for fortynnet test sera som negative kontroller. Vi valgte også ett testserum som en positiv kontroll for å generere en standardkurve for å normalisere alle analyser gjort på forskjellige dager. Det positive kontrolltestserumet ble vilkårlig valgt fordi det var rikelig.
  4. For å #3, tilsett 10 μL nykonstituert baby kanin komplement.
    MERK: Når den er rekonstituert, kast gjenværende babykanin komplement; ikke fryses på igjen og tine.
  5. For å #3, tilsett riktig volum av FITC-merket bacilli for et mangfold av infeksjon på 1:20. Du kan for eksempel legge til volumet som inneholder 5 x 104 x 20 bacilli for 5 x 104 celler. Topp av hver brønn i #3 med riktig volum av cellemedium til totalt 105 μL.
    MERK: #1, som inneholder celler, mottar 100 μL opsoniserte bakterier med de resterende 5 μL som tomromsvolum. Vi testet hver fortynning av testseraen i duplikat.
  6. Inkuber plate #3 ved 37 °C i 30 min i nærvær av 5% CO2 med fuktighet for å opsonisere bacilli.

6. Overholdelse av analyse og fluorescerende merking av pattedyrceller

  1. Vedlikehold alle reagenser ved 37 °C før bruk.
  2. Plasser plateplaten #1, som inneholder følgeceller, på en 37 °C varmeblokk.
  3. Bruk en flerkanals pipettor til å fjerne brukt medium fra brønner og raskt erstatte med 100 μL opsoniserte bakterier fra plate #3. Sørg for at det ikke er generert bobler i brønnene under pipettering. Inkuber plate #1 ved 37 °C med 5 % CO2 og fuktighet i 30 min for etterlevelse.
  4. Vask hver brønn 5x med 150 μL PBS på toppen av en 37 °C varmeblokk for å fjerne ufestede bacilli.
    MERK: Det må tas hensyn til at cellene ikke spres ved et uhell under vask.
  5. Fortynn 16% PF med PBS 1: 4 for å lage 4% PF. Fest celler med 4% PF i 1 time ved å legge 150 μL til hver brønn. Vask celler 2x med PBS.
  6. Bland 2 μL HCS (høyinnholdsscreening) Oransje celleflekk i 10 ml PBS. Tilsett 150 μL av denne fargeløsningen til faste celler og inkuber i 30 min ved omgivelsestemperatur.
  7. Vask brønner 2x med PBS.
  8. Oppbevares ved 4 °C til mikroskopi.

7. Mikroskopi

MERK: Generelt vil et automatisert fluorescensmikroskop med høy gjennomstrømning lette avbildningen for OAA. Hvis et automatisert system ikke er tilgjengelig, kan fluorescerende bilder av tilhengerbakilli tas manuelt21. I denne studienble 20tilhengere bacilli og cellemonolag avbildet ved hjelp av Zeiss 700 laserskanningsmikroskopisystem med spesialisert utstyr; systemet vårt var sammensatt av Zeiss Axio Observer Z1 invertert mikroskop utstyrt med et automatisert stadium, Definite Focus-modulen, 40 x NA 0.6-objektivet, Axio Cam HRc-kameraet og Zen 2012 (Blue Edition)-programvaren. Bildene som er anskaffet er widefield-bilder, ikke confocal bilder. Følgende protokoll er ment som et grunnleggende mikroskopoppsett som gjelder for en rekke automatiserte mikroskopsystemer.

  1. Inkuber plate #1 ved omgivelsestemperatur i 30 min. Slå på mikroskopet og tilhørende utstyr.
    MERK: Akklimatisering ved omgivelsestemperatur hindrer kondens fra å danne seg på glassplaten under bildebehandling. I tillegg forhindrer det defocusing på grunn av temperaturforskyvning.
  2. Plasser platen på scenen og fokuser på cellene ved hjelp av lyse felt eller fasekontrast.
  3. Velg 96-brønnformat som plateinnstilling. Velg kanalinnstillinger.
    MERK: FITCs topp eksitasjon og utslippsbølgelengde er 495/519 nm; HCS oransje celleflekk er 556 og 572 nm. Andre fluoroforer kan brukes avhengig av filtrene som er tilgjengelige på mikroskopet.
  4. Velg innstilling til Flismodus. Angi antall bilder som skal anskaffes.
    MERK: Flisingsfunksjonen gjør det mulig å fange flere steder i en prøvebrønn og kan settes til å hente bilde i et flislegging eller et tilfeldig format. Vi avbildet 10 tilfeldige områder per brønn.
  5. Endre oppkjøpsmodus til "svart-hvitt" eller "monokrom" og binning ≥ 2x2.
    MERK: Hvis du setter binning fra 1x1 til 2x2 eller 4x4, vil det øke mikroskopihastigheten, men vil også resultere i lavere oppløsning på bildet. For OAA er det tilstrekkelig å bruke disse innstillingene da analysen nummererer både makrofagene og tilhengerbakteriene.
  6. Slå på autofokus eller fokuseringsmodul. Angi hvor ofte autofokusfunksjonen skal utføres. Slå på Z-stakkfunksjonen hvis tilgjengelig. Angi antall Z-stabler som fanger tykkelsen på cellemonolaget og tilhengerbakilli.
    MERK: Antall Z-stabler som er valgt, øker mikroskopitiden, men vil sikre at et bilde med riktig fokus tas på hver Z-stabel.
  7. Angi en filmappe du vil lagre bilder i. Kjør det automatiserte bildebehandlingsprogrammet.

8. Datainnsamling og analyse

  1. Telle antall tilhengere bacilli og pattedyr celler per bilde. Telle hver kjede av bacilli som en bakterie.
  2. Plott bacilli / cellene i den positive kontrolltestserumet og titeren (f.eks. 1:10 fortynning er 10 titerenheter) for å generere en standardkurve i et passende statistikkprogram.
  3. Analyser det positive kontrolltestserumet ved hjelp av ikke-lineær regresjonskurvetilpasning. Analyser deretter de gjenværende prøvene ved hjelp av standardkurven til det positive kontrolltestserumet for å bestemme tilsvarende titre.
    MERK: Det er vanligvis mest nøyaktig å velge prøvefortynninger nær midten av standardkurven når du bestemmer titers.
  4. Beregn det geometriske gjennomsnittet av prøvene fra hver vaksinegruppe. Beregn P-verdiene av logg forvandlet titers med minst betydelig forskjell ANOVA analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne delen viser representative mikrografer samlet under et OAA-eksperiment sammen med resultater som viser at OAA kan brukes til å undersøke antistoffenes biologiske funksjon. Her ble analysen vellykket brukt til å evaluere effekten av en miltbrannvaksinekandidat. Det er viktig å verifisere tilstanden av innkapsling på bacilli som lite eller ingen innkapsling fører dem til å følge vertsceller, produsere en høy bakgrunn. Figur 1 er et bilde av B. anthracis Ames negativt farget med India blekk for å undersøke innkapsling. OAA krever at flere tilstøtende synsfelt lyser, og hvis konfokal mikroskopi brukes, flere stabler eller inndelinger. Dermed er det nødvendig å verifisere at bacilli er verken for dim eller foto-blekemiddel for fort. Figur 2 er et bilde av bacilli merket med FITC. Figur 3 viser maksimale projeksjonsbilder av B. anthracis Ames festet til cellemonolagene. Dette er representative synsfelt som ble talt og scoret for OAA. Økningen i vedlegg av bacilli inkubert med PGGA-OMPC antiserum skyldes tilstedeværelsen av anti-kapsel antistoffer som opsoniserte bacilli. Figur 4 viser at serumtitere av NHPs vaksinert med 10 og 50 μg PGGA-OMPC er betydelig høyere enn titers for OMPC og PGGA alene.

Figure 1
Figur 1. Et India-blekkbilde av faste B. anthracis Ames. Legg merke til clearance sonen rundt bacilli på grunn av tilstedeværelsen av kapsel. Bar = 10 μm. Bildet ble tatt på EVOS FL automatisert mikroskopisystem med 100 x 1,4 numerisk blenderåpning (NA) oljemålobjektivobjektiv. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Bilder av FITC merket fast B. anthracis Ames. (Venstre) Differensial interferens kontrastbilde; fluorescerende bilde pseudo-farget i grønt (midten); slått sammen (høyre). Bar = 10 μm. Konfokalbilder ble tatt på Zeiss 700 LSM Confocal Microscopy med 40 x 1,3 NA oljemålslinse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Fluorescerende bilder av B. anthracis Ames fulgte RAW 264.7 celle monolayers. Bacilli ble opsonisert med testserum fra NHPs vaksinert og forsterket med (A) 10 μg PGGA-OMPC, (B) 50 μg PGGA-OMPC, (C) 50 μg PGGA alene, eller (D) OMPC alene. Grønn = B. anthracis Ames, rød = RAW 264,7 celler. Bar = 20 μm. Brede feltbilder ble tatt på Zeiss Axio Observer Z1-mikroskopet med 40 x 0,6 objektivobjektiv og Axio Cam HRc-kameraet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Opsono-tilslutning av NHPs vaksinert med 10 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA alene, eller OMPC alene. De geometriske midlene til 5 dyr per gruppe er grafert. Feilfelt indikerer SEM. *p ≤ 0,001 sammenlignet med PGGA alene. P-verdiene ble beregnet ved hjelp av ANOVA med LSD posthoc test. Dataene ble opprinnelig publisert i Chabot, et al., 201620. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kapselbaserte vaksiner har vist seg å være effektive mot mange bakterielle patogener, og mange er lisensiert for bruk hos mennesker25,26,27. Disse vaksinene virker ved å generere antistoffer rettet motkapselen,og mange av disse studiene bruker OPKA til å vise opsono-fagocytiske funksjoner av antistoffene13,14,16,28,29. På grunn av biosikkerhetsbekymringer og for enkel arbeid utviklet vi en OAA for å evaluere antistoffer fra dyr vaksinert med B. anthracis kapselkonjugater. Tilstedeværelsen av kapsel på B. anthracis forhindrer etterlevelse og fagocytose30,men opsonisering av bacilli med sera fra vaksinerte dyr induserer vedlegg til makrofager20,21.

For OAA brukes etterlevelsesaktiviteten, ikke internalisering og drap, til å kvantate opsonisk aktivitet. Dette ga OAA flere fordeler. Vi var i stand til å utnytte paraformaldehyd drept, fluorescerende merket innkapslet bacilli i stedet for levende organismer. Endringer i bakterieoverflaten fra aldehydfiksering og fluorescerende merking endret ikke bakterienes generelle overholdelse av makrofagene; fast og merket bacilli var ikke mer tilhenger enn levende bacilli (data som ikke vises). Graden av innkapsling kan variere fra kultur til kultur og påvirke generell overholdelse til tross for lignende vekstforhold. Dermed tillater bruken av en enkelt inaktivert bakterielager standardisering på tvers av eksperimenter utført på forskjellige dager og på tvers av ulike sett med eksperimenter. Dette var verdifullt for å sammenligne sera fra de 20 NHPs som brukes i dette arbeidet og sera som vil bli generert i våre kommende studier. Sist, de fleste makrofager, inkludert RAW 264.7 celler, er følsomme for miltbrann dødelig toksin produsert av levende patogen31, noe som gjør bruk av levende bacilli iboende problematisk.

Bruken av RAW 264.7-celler forenklet også standardisering. Vi brukte først en vanlig cellelinje i OPKA, HL-60 celler. Vi fant imidlertid vanskeligheter med å differensiere dem til granulocytter med dimetylformamid, som rapportert av andre28,32. RAW 264.7-celler har fordelen at de ikke trenger å være kjemisk differensiert og er tilhenger og dermed mer mottagelig for mikroskopibasert OAA. Denne cellelinjen har blitt brukt i mange fagocytosestudier med intracellulære patogener33,34, samt B. anthracis31. Bruken av RAW 264.7 celler, som er avledet fra mus, er også en fordel fordi musen Fc reseptorer er promiskuøse i sin bindende spesifisitet for IgG avledet fra andre arter35. Dette tillot oss å evaluere anti-kapsel antistoffer fra NHPs med en murine cellelinje.

Miltbrann, selv om det er sjeldent, er endemisk i noen regioner i verden og USA. En bekymring er at FBS brukes, hentet fra USA, kan allerede inneholde anti-kapsel antistoffer som følge av at dyret blir utsatt for B. anthracis sporer eller andre PGGA-produserende mikrober i jorda. For å løse dette problemet ble FBS-tomten vi brukte forhåndstestet. Vi fant at tillegg av varme inaktivert FBS økte tilslutning sammenlignet med DMEM alene (data ikke vist). Det økte imidlertid ikke overholdelse sammenlignet med varmeaktivert normal sera fra marsvin, ape, mus eller menneske (data som ikke vises). Dermed inneholdt FBS-tomten vi brukte ikke antistoffer mot kapsel som følge av eksponering. I tillegg vil det heller ikke inneholde antistoffer mot kapsel som følge av at dyret ble vaksinert med den uinnkapslede B. anthracis Sterne, en stamme som mangler pXO2 plasmid som er nødvendig for kapselproduksjon. Den testede FBS-tomten ble brukt til alle påfølgende OAA.

En begrensning av teknikken er oppgaven med å telle bacilli og celler av laboratoriepersonell, som tok en enorm mengde tid og krefter. Dette kan rettes opp med bruk av programvare som har denne typen analyse; denne programvaren var ikke tilgjengelig for oss på den tiden. Men fordi manuell telling var nødvendig, var et kritisk trinn fjerning eller vasking av overflødig og ufestet bacilli for å lette oppgaven. Det var også nødvendig å teste reagenser som førte til lavere bakgrunnsstøy. OAA krever en komplementkilde fordi det forbedrer opsonisering36. Derfor testet vi en rekke komplementkilder, inkludert marsvin, menneske og babykanin komplement. Vi valgte baby kanin komplement for vår analyse fordi vi fant ut at den ikke har svake, multispesifikke aktiviteter mot heterofile antigener, det er ofte brukt i OPKA-studier14,15,37,og det er lett tilgjengelig kommersielt.

Vi finner OAA å være kvantitativ og svært reproduserbar. Vi bruker den til å utfylle studier som involverer ligand bindende analyser som ELISAs, som bare kvantifiserer totale IgG-nivåer, men skiller ikke mellom funksjonelle og ikke-funksjonelle antistoffer. OAA kan brukes til å utfylle andre funksjonelle analyser (f.eks. serumbaktericidale aktivitet og toksinnøytraliseringsanalyser) for å vise den forskjellige funksjonaliteten til vaksinegenererteantistoffer 16,38. Utviklingen av OAA har økt vårt repertoar av immunogenisitetsstudier for å evaluere vaksiner og terapeutiske midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke en kommersiell eller annen tilknytning som kan utgjøre en interessekonflikt.

Acknowledgments

J. Chua, D. Chabot og A. Friedlander designet prosedyrene som er beskrevet i manuskriptet. J. Chua og T. Putmon-Taylor utførte eksperimentene. D. Chabot utførte dataanalyse. J. Chua skrev manuskriptet.

Forfatterne takker Kyle J. Fitts for utmerket teknisk assistanse.

Arbeidet ble støttet av Defense Threat Reduction Agency grant CBM. VAXBT.03.10.RD.015, plannummer 921175.

Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger er forfatternes og er ikke nødvendigvis godkjent av den amerikanske hæren. Innholdet i denne publikasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjene til Forsvarsdepartementet, og nevner heller ikke varenavn, kommersielle produkter eller organisasjoner som innebærer støtte fra den amerikanske regjeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) Corning, Corning, NY 431222
10 mL syringe (Luer-Lok tip) BD, Franklin Lakes, NJ 302995
15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA P96-1-N
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 15710
75 cm sq. tissue culture treated flask Corning, Corning, NY 430641
Agar (powder) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1296
Baby Rabbit Complement Cedarlane Labs, Burlington, NC CL3441
Bacto Yeast Extract BD, Sparks, MD 288620
BBL Brain Heart Infusion (BHI) BD, Sparks, MD 211059
Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates Remel, Lenexa, KS R01198
Cell scraper Sarstedt, Newton, NC 83.183
Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) Corning, Corning, NY 3596
Cover glass Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 72200-10
Difco Nutrient Broth BD, Sparks, MD 234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 11965-092 contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red
EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AMAFD1000
Fetal Bovine Serum Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SH30071.03 not gamma irradiated, not heat inactivated
Fluorescein isothiocyanate Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA F143
HCS Cell Mask Orange Cell Stain Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA H32713
hemocytometer (Improved Neubauer) Hausser Scientific, Horsham, PA 3900
India Ink solution BD, Sparks, MD 261194
L- glutamine (200 mM) Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA 25030081 supplement medium with additional 2mM L-glutamine
Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) Nikon Instruments, Melville, NY TE2000
PBS without Calcium or Magnesium Lonza, Walkersville, MD 17-516F
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SV30010
petri dishes (100 x 15 mm) Falcon, Corning, Durham, NC 351029 for agar plates
RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) ATCC, Manassas, VA ATCC TIB-71
Slides VWR, Radnor, PA 16004-422
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S5761
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8154
Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY 4109001865956000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
  2. Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
  3. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  4. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  5. Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
  7. Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
  8. Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
  9. Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
  10. Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
  11. Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
  12. Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
  13. Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
  14. Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
  15. Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
  16. Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
  17. List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
  18. Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
  19. Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
  20. Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
  21. Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
  22. Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
  23. Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
  24. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  25. Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
  26. Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
  27. Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
  28. Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
  29. Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
  30. Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
  31. Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
  32. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  33. Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
  34. Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
  35. Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
  36. Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
  37. Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
  38. Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 159 Opsonisering etterlevelse antistoffer serum makrofager kapsel vaksineutvikling medfødt immunitet ikke-menneskelige primater RAW 264,7 celler automatisert fluorescensmikroskopi korrelering av immunitet
Opsono-overholdelse analyse for å evaluere funksjonelle antistoffer i vaksineutvikling <em>mot Bacillus anthracis</em> og andre innkapslede patogener
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chua, J., Chabot, D. J.,… More

Chua, J., Chabot, D. J., Putmon-Taylor, T., Friedlander, A. M. Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens. J. Vis. Exp. (159), e60873, doi:10.3791/60873 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter