Summary
In dit protocol beschrijven we een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van weke delen sarcoom voor het testen van (neo)adjuvante therapieën.
Abstract
Chirurgie is vaak de eerste behandeling voor veel vaste tumoren. Echter, lokale recidieven optreden vaak na primaire tumor resectie, ondanks adjuvante of neo-adjuvante therapieën. Dit gebeurt wanneer chirurgische marges onvoldoende tumorvrij zijn, wat resulteert in resterende kankercellen. Vanuit biologisch en immunologisch perspectief is chirurgie geen nulgebeurtenis; de wondhelende omgeving is bekend dat zowel pro- als anti-tumorigenische paden induceren. Als gevolg hiervan moeten preklinische modellen voor medicijnontwikkeling die gericht zijn op het voorkomen van lokale terugval chirurgische resectie bevatten bij het testen van nieuwe (neo)adjuvante therapieën, om de klinische instellingen te modelleren bij patiënten die met een operatie worden behandeld.
Hier beschrijven we een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van WEHI 164 weke delen sarcoom waarmee (neo)adjuvante therapieën kunnen worden getest in de setting van een wondgenezingsrespons. In dit model wordt 50% of 75% van de tumor verwijderd, waardoor er in situ wat kankerweefsel achterblijft om een bruto restziekte te modelleren na een operatie in de klinische setting. Dit model maakt het mogelijk om therapieën te testen in de context van een operatie, terwijl ook rekening wordt gehouden met de wondgenezingsrespons, die de werkzaamheid van (neo)adjuvante behandelingen kan beïnvloeden. De onvolledige chirurgische resectie resulteert in reproduceerbare hergroei van de tumor bij alle muizen bij afwezigheid van adjuvante therapie. Adjuvante behandeling met checkpoint blokkade resulteert in verminderde tumor hergroei. Dit model is dus geschikt voor het testen van therapieën in het kader van debulking chirurgie en de bijbehorende wondgenezing reactie en kan worden uitgebreid tot andere vormen van vaste kanker.
Introduction
Chirurgie blijft de belangrijkste behandelingsoptie voor veel vaste tumoren1, waaronder weke delen sarcoom2,3. Ondanks verbeteringen in kankerchirurgietechnieken en combinaties met (neo)adjuvante therapieën, is er nog steeds een hoog risico op kankerreval en metastase na primaire tumorresectie4,5. In weke delen sarcoom, recidieven optreden bijzonder locoregionaal, op de plaats van de operatie, wat resulteert in een verhoogde morbiditeit en mortaliteit. In de klinische setting kan het moeilijk zijn om ruim genoeg marges te verkrijgen (bijvoorbeeld vanwege anatomische beperkingen), wat resulteert in onvolledige resectie en daaropvolgende tumorrecidief6. Chirurgische stress en het daaropvolgende proces van wondgenezing zijn bekend om een immunosuppressieve tumor micro-omgeving gunstig voor tumor recidief7,8te creëren. Daarom moet de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe therapieën voor weke delen sarcoom, met name immunotherapieën, idealiter rekening houden met de chirurgische wondgenezingsrespons.
De meeste preklinische studies voor adjuvante therapieën worden in eerste instantie uitgevoerd met behulp van onderhuidse syngenetische of xenotransplantatie muismodellen, zonder integratie van de chirurgische stress en wondgenezing respons9,10. Daarom ontwikkelden we een syngeneic onderhuids muiskecotweefsel sarcoom model waarin onvolledige chirurgische resectie. WEHI 164 fibrosarcoomcellen worden onderhuids ingeënt, en zodra tumoren zijn vastgesteld, verwijderen we 50-75% van de tumorbulk(figuur 1A-E). Tumoren consequent opnieuw groeien van de resterende tumor. Dit model maakt het mogelijk voor het testen van adjuvante therapieën, terwijl rekening houdend met het effect van chirurgische stress en wondgenezing. Soortgelijke chirurgische modellen van onvolledige resectie zijn in een aantal studies door verschillende groepen gebruikt en reproduceerbaar en effectiefbevonden 11,12,13. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van dit protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieren die bij deze experimenten werden gebruikt, werden verkregen van het Animal Resource Centre (Perth, West-Australië). Dieren werden onderhouden onder standaard pathogene-vrije omstandigheden aan het Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, West-Australië). Alle experimenten werden uitgevoerd volgens het protocol zoals goedgekeurd door het Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee. BALB/c muizen van 8-12 weken oud werden gebruikt in deze experimenten. De WEHI 164 fibrosarcoma cellijn werd verkregen van CellBank Australia (Westmead, NSW).
1. Inenting van cellen
- Bereiding van cellen en dieren
- Zorg ervoor dat de cellijn in de aanbevolen media wordt gehandhaafd. Houd bijvoorbeeld de WEHI 164-cellijn in het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% foetale runderserum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomcine.
OPMERKING: Passagecellen ten minste 3 en tot 5 keer nadat ze uit cryogene opslag zijn verwijderd. Om een optimale cel levensvatbaarheid te garanderen, cellen moeten worden gesplitst wanneer ze tussen 70-80% confluent. Tumorcellijnen moeten worden getest op mycoplasma, omdat infectie de celgroei kan veranderen en de immuunrespons in vivo kan beïnvloeden. - Een dag voor inenting scheer je muizen op de rechterflank met behulp van tondeuse.
OPMERKING: Vrouwelijke BALB/c muizen, tussen 8-12 weken, van normaal gewicht (16 -22 gram) werden gebruikt in dit experiment. - Op de dag van inenting, oogst WEHI 164 cellen wanneer 70-80% confluent door trypsinization.
- Het kweekmedium uit de weefselkweekkolven aanzuigen en vervolgens steriele fosfaatbuffers (1x PBS) toevoegen om de resterende sporen van foetaal runderserum (FBS) te verwijderen.
- Aspirate de PBS uit de weefselkweekkolven. Voeg 3 mL van 0,05% trypsine (voor een T75 kolf) toe en draai de kolf zodat het hele oppervlak van de kolf met cellen bedekt is met trypsine.
- Incubeer de kolf bij 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 3 min. Controleer de cellen periodiek, door op de zijkanten van de kolf te tikken om te zien of de cellen zijn losgemaakt.
- Verwijder kolven uit de celkweek incubator en voeg 5 mL media aangevuld met FBS om de trypsine te neutraliseren.
OPMERKING: Laat cellen niet langer in trypsine achter dan nodig is, omdat dit cellen kan beschadigen en kan leiden tot een lage cel levensvatbaarheid. - Pipet vering meerdere keren om een enkele cel schorsing te verkrijgen. Breng celsuspensie over naar een kegelvormige centrifugebuis.
- Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.
- Was de cellen drie keer in 1x PBS.
- Resuspend cellen in 50 mL steriele 1x PBS en was cellen door pipetten cel suspensie op en neer. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.
- Aspirate de supernatant en resuspend cellen in 15 mL steriele 1x PBS. Was cellen door pipetten cel suspensie op en neer. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.
- Aspirate de supernatant en resuspend cellen in precies 10 mL steriele 1x PBS. Was cellen zoals in stap 1.1.4.2 en breng een kleine hoeveelheid (ongeveer 100 μL) celsuspensie over naar een centrifugebuis om te tellen. Pelletcellen door te draaien op 350 x g gedurende 3 min.
- Bepaal het celnummer met behulp van de trypan blauwe uitsluitingsmethode met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. Resuspend cellen in steriele 1x PBS bij een concentratie van 5 x 106 cellen/mL. Houd celopsusopening op ijs.
OPMERKING: De levensvatbaarheid van tumorcellen moet gelijk of meer dan 80 % zijn om reproduceerbare tumorgroei te garanderen.
- Zorg ervoor dat de cellijn in de aanbevolen media wordt gehandhaafd. Houd bijvoorbeeld de WEHI 164-cellijn in het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 10% foetale runderserum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomcine.
- Onderhuidse inenting
- Meng de celsuspensie grondig en vul een spuit met een 26 G naald met 100 μL celsuspensie (5 x 105 cellen) in steriele 1x PBS. Herhaal het mengen van cellen voordat u de volgende spuit laadt.
OPMERKING: Houd cellen in de hele procedure op ijs om de levensvatbaarheid te behouden. - Beperk de muis op de juiste manier, zodat de toegang tot de rechterflank onder te gaan. Inenting van de muis onderhuids op de geschoren rechterflank.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de inenting zich niet in het buikvlies bevindt door de naald iets op te tillen, wat zichtbaar moet zijn onder de huid. Een bellen-achtige knobbel moet vormen onder de huid na inenting. - Controleer muizen zoals vereist door de toepasselijke ethische goedkeuring en voer chirurgische resectie uit wanneer de tumoren zijn gegroeid tot een grootte van ongeveer 50 mm2.
- Meng de celsuspensie grondig en vul een spuit met een 26 G naald met 100 μL celsuspensie (5 x 105 cellen) in steriele 1x PBS. Herhaal het mengen van cellen voordat u de volgende spuit laadt.
2. Gedeeltelijke chirurgische resectie van de tumor
OPMERKING: Dit protocol vereist TWEE onderzoekers; een voor chirurgische ingrepen (CHIRURG), en een andere voor muismonitoring (ASSISTANT).
- Chirurgie setup
- Op dag 12 na de inenting, wanneer tumoren een grootte van ongeveer 50 mm2hebben bereikt, dosismuizen met 100 μL (0,1 mg/kg) buprenorfine s.c. in de scruff van de nek, 30 minuten voor de operatie.
- Zet het chirurgische gebied met een warmtekussen bedekt met bankjas en zet een neuskegel voor anesthesie. Steriliseren chirurgische instrumenten voorafgaand aan het gebruik, en tussen elk dier met behulp van een warmte kraal sterilisator, waardoor gereedschappen om af te koelen voor gebruik. Laat de volgende chirurgische apparatuur schoon en binnen handbereik: chloorhexidine, wattenstaafje, gaas, ooggel, twee gebogen tangen, schaar, clip applicator, clip remover, clip vullingen (Figuur 2A, 2B).
- Verwarm de verwarmingskamer tot 37 °C en zet een ander warmtekussen voor terugwinning op (figuur 2C). Plaats gesteriliseerde gereedschappen op een steriel oppervlak, zoals autoclaved pads.
- Anesthesie
- Plaats de muis in de inductiekamer en verdoven de muis met 4% isoflurane (4% in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 1 L/min) totdat de ademhaling vertraagt tot ongeveer 60 ademhalingen per minuut (1 per seconde) (dit duurt meestal <1 min).
LET OP: Laat de muis niet te lang in de kamer, omdat dat kan leiden tot verstikking en de dood. Slechts één muis tegelijk onder narcose. - Breng de muis op het warmtekussen op de operatietafel, plaats de muis met zijn neus in de neuskegel en behoud de verdovingstoestand met 3-4% isoflurane in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 0,5 L/min. Controleer de ademhalingssnelheid om ervoor te zorgen dat de diepte van anesthesie wordt gehandhaafd.
OPMERKING: De ASSISTENT moet de ademhaling van de muis tijdens de operatie controleren om ervoor te zorgen dat het juiste niveau van anesthesie wordt gehandhaafd. Verlaag de verdovingsconcentratie als de ademhaling te langzaam wordt of verhoog de concentratie als de diepte van anesthesie te ondiep is. Als de muis begint te hijgen, verwijder de muis uit de neuskegel, verklein de verdovingsconcentratie en wacht tot de ademhaling normaliseert voordat u de neuskegel opnieuw plaatst. - Voer een "pinch test" en "hoornvlies reflex test"14 om ervoor te zorgen dat de muis volledig verdoofd voordat de operatie begint.
OPMERKING: Beweging van een deel van de muis is een indicatie dat de muis niet volledig verdoofd is. Het dier moet onmiddellijk extra verdoving krijgen door de verdovingsconcentratie te verhogen. - Bedek de ogen van de muis met een kleine hoeveelheid oogheelkundige gel om oogdroogte te voorkomen.
- Plaats de muis in de inductiekamer en verdoven de muis met 4% isoflurane (4% in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 1 L/min) totdat de ademhaling vertraagt tot ongeveer 60 ademhalingen per minuut (1 per seconde) (dit duurt meestal <1 min).
- Chirurgische ingreep (CHIRURG)
- Swab het chirurgische gebied 3 keer met alcoholische chloorhexidine. Met behulp van tangen en een schaar, maak een 1 cm rechte incisie langs de rugzijde, 3 mm afstand van de tumor (Figuur 3A, 3B).
OPMERKING: Het standaardiseren van de incisie tot 1 cm in elke muis (met behulp van een liniaal) maakt een gelijkmatige beoordeling van wondgenezing tussen muizen mogelijk. Het lokaliseren van de incisie op 3 mm afstand van de tumor zorgt voor latere intratumorale adjuvante therapie zonder lekkage van de wond. - Met behulp van pincet, weg te trekken de facia en onderhuids vetweefsel tussen de tumor en buikvlies. De onderhuidse tumor is normaal aan de huidzijde bevestigd.
- Open de wond door de huid voorzichtig op de tumorlagerzijde te houden met behulp van een pincet en "omkeren" de tumor, zodat deze buiten zichtbaar is(figuur 3C, 3D).
OPMERKING: Het gedeelte van de tumor dat moet worden gedebulkt moet het dichtst bij de opening zijn, om voldoende huid te hebben om de wond te sluiten. Wees voorzichtig niet om de huid te snijden bij het verwijderen van de tumor. - Met behulp van een schaar, snijd de tumor capsule uit de helft te verwijderen, te beginnen vanaf de basis van de tumor het dichtst bij de opening.
- Voor 50% debulk operatie, dwars door het midden van de tumor. Schep met gebogen tangen het gedeelte van de te verwijderen tumor op (50%); schep eventuele restanten uit het gedebulkte gebied op.
- Voor 75% debulk, het uitvoeren van een 50% tumor debulk als in deel 2.3.5 hierboven. Snijd vervolgens de helft van de resterende 50% van de tumor en schep 25% van de tumor, met behulp van gebogen tang zoals hierboven beschreven.
- Swab het chirurgische gebied 3 keer met alcoholische chloorhexidine. Met behulp van tangen en een schaar, maak een 1 cm rechte incisie langs de rugzijde, 3 mm afstand van de tumor (Figuur 3A, 3B).
- Het sluiten van de chirurgische site
- Plaats de resterende tumor terug onder de huid, en met behulp van tangen, trek de huid flappen samen en line-up van de huid langs de wond.
- Houd de huid bij elkaar op 5 mm van de rand van de wond en gebruik chirurgische clips om de wond te sluiten, beginnend aan de kant die het dichtst bij de tangen ligt. Breng zoveel clips aan als nodig is om ervoor te zorgen dat er geen onderliggend weefsel wordt blootgesteld. Over het algemeen worden drie tot vier clips toegepast met 2 mm tussenruimtes tussen clips.
OPMERKING: Als er geen clips goed worden toegepast, verwijdert u deze met een clipverwijderaar en vervangt u nieuwe clips.
- Herstel van muizen (ASSISTENT)
- Laat de muizen herstellen door ze in de warme (37 °C) verwarmingskamer te plaatsen.
- Plaats de kooi van de muis op het warmtekussen. Controleer de muizen in de verwarmingskamer totdat ze hersteld zijn van de verdoving (wakker en lopend) en zet de muizen vervolgens terug in de kooi. Laat de kooi nog 10 minuten op het warmtekussen staan, totdat de muizen actiever zijn geworden.
- Geef de muizen nat en zacht voedsel. Controleer de muizen 1 uur na de operatie voor herstel en zorg ervoor dat clips op hun plaats blijven. Zorg ervoor dat de kooi half aan/half van het warmtekussen staat, zodat dieren de temperatuur zelf kunnen regelen terwijl ze zonder toezicht zijn.
- Dosis muizen met 0,1 mg/kg buprenorfine (100 μL onderhuids in de scruff van de nek), 6-8 uur na de operatie (aan het eind van de dag). Monitor muizen vroeg de volgende ochtend en doseer muizen opnieuw met 0,1 mg/kg buprenorfine (100 μL onderhuids in de scruff van de nek). Geef meer nat voedsel als dat nodig is.
- Monitor muizen dagelijks voor de komende zeven dagen. Clips kunnen na zeven dagen worden verwijderd met behulp van de clipverwijderaar.
- Adjuvante of neoadjuvante behandeling
- Behandel muizen peri-operatief met (neo)adjuvante therapie op een bepaald moment, afhankelijk van de behandeling van belang.
- Behandel bijvoorbeeld muizen met één dosis van 100 μg anti-CTLA-4 intraperitoneally (i.p.) op dag 15 na inenting, of met drie doses van 200 μg anti-PD-1 i.p. op dag 15, 17 en 19 na inenting.
- Experimentele controles
- Bij het gebruik van dit model om de effecten van ontsteking/wondgenezing te beoordelen, overweeg dan het gebruik van de volgende controlegroepen: 1) No-surgery control (behandelingen kunnen nog steeds intratumorally worden toegediend); 2) Sham chirurgie controle: Een chirurgische incisie wordt gemaakt in de huid; de tumor wordt gemanipuleerd en blootgesteld, maar er wordt geen tumorweefsel verwijderd; de wond wordt afgesloten met clips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tumorgroei tot een grootte van 50 mm2 is een ideale grootte voor gedeeltelijke debulk. De onvolledige chirurgische resectie van 50 mm2 tumoren resulteert in 100% (n=5) reproduceerbare hergroei van de tumoren bij afwezigheid van adjuvante immunotherapie (figuur 4A). Vervolgens gebruikten we het model om adjuvante immunotherapieën te testen met behulp van antilichamen tegen checkpointmoleculen Cytotoxisch T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4) en Programmed Death Receptor 1 (PD-1). Behandeling van muizen met anti-CTLA-4 of anti-PD-1 resulteerde in een genezingspercentage van respectievelijk 80% en 25% (n=4-5 per groep)(figuur 4B, 4C). De respons met anti-PD-1 biedt de mogelijkheid om nieuwe combinaties te testen om de respons verder te verbeteren.
Figuur 1: Schematisch diagram van gedeeltelijke chirurgische resectie van de tumor. (A) BALB/c muizen worden ingeënt met 5 x 105 WEHI-164 cellen op de rechter rechterflank. (B) Wanneer de tumor 50 mm2bereikt, kan de operatie beginnen. (C) De tumor wordt gedeeltelijk gereseceerd (50 % getoond). (D) De chirurgische site is afgesloten met clips. (E) Adjuvante therapie kan intraveneus, intraperitoneally (getoond) of intratumoraal in het wondgebied worden toegediend. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van de opgezette operatie. (A) Een hele afbeelding van de operatie opgezet met de chirurgische instrumenten (vermeld in stap 2.1) en de verdovingsmachine. (B) Een momentopname afbeelding van de chirurgische tabel met alle materialen binnen handbereik. (C) Een verwarmingskamer en een verwarmingsmat voor het terugwinnen van de muis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve foto's van gedeeltelijke tumor debulk techniek. (A) Een volledig verdoofde muis met een tumor van 50 mm2 in grootte voor de operatie. (B) Incisieplaats op 3 mm afstand van de tumor; 1 cm incisie. (C-D) Opening van de wond door de huid voorzichtig op de tumorlagerkant te houden met behulp van een pincet, en de tumor "om te keren" zodat deze buiten zichtbaar is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Tumorhergroei na onvolledige tumorresectie en immunotherapie. (A) Tumorhergroei curven van gedeeltelijk gereseceerde WEHI-164 tumoren bij afwezigheid van adjuvante immunotherapie. (B-C) Tumorgroei na een operatie en adjuvante behandeling met anti-CTLA-4(B)of anti-PD1(C). De stippellijn geeft de dag van de operatie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij bieden een protocol voor een muismodel van onvolledige chirurgische resectie van weke delen sarcoom om peri-operatieve therapieën te testen. We hebben ook gestandaardiseerd de chirurgische incisie om beoordeling van wondgenezing tussen muizen na de behandeling mogelijk te maken.
Tumor plaatsing is een belangrijk onderdeel van dit protocol. We hebben gekozen voor een onderhuids tumormodel om gemakkelijke chirurgische toegang tot de tumorsite en toediening van lokale therapieën mogelijk te maken met minimale belasting voor de muizen. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de tumoren groeien in de onderhuidse ruimte en niet binnen het buikvlies, wat kan leiden tot onverwachte morbiditeit en mortaliteit.
Bij het kiezen van een tumorcellijn voor dit protocol adviseren wij dat de cellen wanneer ze in vivo worden gekweekt, een vaste massa vormen (bijvoorbeeld WEHI-164-model), in plaats van een semi-vaste massa (zoals het B16-model) omdat het technisch moeilijk is om gedeeltelijk te resecteren. Bovendien, als de tumor begint te groeien door de huid (meestal gezien in tumoren groter dan 100 mm2), debulking wordt niet aanbevolen als de huid kan necrotisch worden en niet goed genezen na de operatie. We hebben dit probleem overwonnen door tumoren te debulking zodra ze 50 mm2 groot zijn.
Aangezien ons model kan worden gebruikt om het effect van wondgenezing op de therapie te beoordelen, stellen we een controle/schijngroep voor als vergelijking. De controle kan worden ongewijzigde tumor, of schijnoperatie die alleen de huid incisie, blootstelling van de tumor, en wondsluiting zonder gedeeltelijke tumor debulk zou hebben. Deze sham controle groep kan worden gebruikt bij het onderscheiden van het effect van chirurgie-geïnduceerde ontsteking en wondgenezing van de gedeeltelijke debulk op de behandeling resultaat.
Voor een succesvolle gedeeltelijke debulking operatie, sommige technische punten moeten worden overwogen. Een belangrijk aspect is de juiste implantatie en groei van de tumor. Tumoren moeten worden geïmplanteerd op de rechterflank, weg van het achterbeen. Tumoren die te dicht bij het achterbeen worden geïmplanteerd, kunnen hun vermogen om te lopen verstoren en kunnen resulteren in extra kracht op de clips waardoor ze loskomen. Bovendien is consistentie in de tumorgrootte van cruciaal belang om variabiliteit in het relatieve percentage debulking te voorkomen. We kozen ervoor om een operatie uit te voeren met tumoren met een grootte van 50 mm2,om een operatie technisch eenvoudig te maken, hoewel we van plan zijn dat gedeeltelijke resectie op kleinere tumoren haalbaar is. Om inconsistentie in tumorgrootte te voorkomen, moet de gebruikte cellijn worden doorgegangerd volgens de juiste standaard celkweektechnieken en moet de onderzoeker adequaat worden opgeleid in de juiste tumorinentingstechniek. Bij de uitbreiding van dit protocol naar andere onderhuidse tumormodellen zijn de fysieke kenmerken van de tumor van belang. Zo ontdekten we dat cellijnen die aanleiding geven tot zachte, gelatineachtige tumoren (bijvoorbeeld M3-9-M rhabdomyosarcoom en B16 melanoom15)technisch uitdagend zijn om te debulkenen.
Er zijn ook technische punten die moeten worden overwogen tijdens de operatie. Muizen moeten voldoende verdoofd worden om beweging tijdens de procedure te voorkomen. Afgezien van de bedrieger die onvoldoende verdoofde muizen zullen verdragen, kan elke beweging van muizen tijdens de procedure de chirurgische resectie moeilijk maken, wat resulteert in variabiliteit in de grootte van tumor verwijderd tussen muizen. Bovendien moet de ademhalingsfrequentie van de muis zorgvuldig worden gecontroleerd tijdens de operatie De isofluraanconcentratie moet worden aangepast om de juiste diepte van anesthesie te behouden. Daarom is een assistent altijd nodig tijdens de chirurgische ingreep om de ademhaling tijdens de operatie te controleren en om een adequaat niveau van anesthesie te garanderen. De grootte van de incisie moet consistent zijn om variabiliteit in de wondgenezingsrespons te voorkomen. We ontdekten dat een incisie van 1-1,5 cm voldoende is voor tumordebulking, met een minimale kans op wonddehiscence.
Ons model van gedeeltelijke resectie bootst resterende ziekte na na een operatie zoals te zien in de klinische setting van vele vaste tumoren en biedt voordelen ten opzichte van traditionele syngeneic muismodellen door rekening te houden met het effect van chirurgische wondgenezing. Bovendien hebben bestaande traditionele operatiemodellen volledige tumorresectie gebruikt, wat niet altijd resulteert in tumorrecidief16. Andere onderzoekers hebben met succes gebruik gemaakt van gedeeltelijke resectie modellen met behulp van andere kankercellijnen11,12,13, ondermaats de robuustheid van deze methode. Bovendien is aangetoond dat gedeeltelijke resectie, maar niet volledige resectie, resulteerde in beschermend anti-tumor immuungeheugen wanneer adjuvante therapie12 wordt gegeven, wat werd toegeschreven aan de persistentie van antigenen uit de resttumor.
Dit model is ontworpen om het effect van ontsteking en wondgenezing op de therapie te bestuderen. Onze debulking benadering lijkt klinisch op klinische situaties waarin de bruto restziekte wordt achtergelaten na de operatie (R2 resectie), in plaats van macroscopisch volledige resectie met microscopische restziekte (R1 resectie). Chirurgische resectie in invasieve weke delen sarcoom kan bijvoorbeeld leiden tot positieve marges wanneer de tumor zich naast kritieke structuren zoals zenuwen, slagaders of aangrenzende organen bevindt, waardoor volledige resectie met brede marges17wordt uitgewten. Chirurgie modellen voor resectie resulterend in microscopische positieve marges zijn gepubliceerd13; ons protocol kan worden gebruikt om het effect van de wondgenezingsreactie op de therapie te bestuderen wanneer macroscopische restziekte aanwezig is.
Een beperking van ons model is dat het geen aanleiding geeft tot verre terugval en micrometastase, wat gebruikelijk is na een operatie in vaste tumoren zoals borstkanker of alvleesklierkanker. Andere chirurgie modellen, zoals de murine borstkanker model 4T118,19,20 of murine modellen van de novoborstkanker metastase21 zijn beter geschikt om systemische terugval te onderzoeken na lokale resectie. Een andere beperking is dat dit protocol is voor onderhuidse modellen en dus niet mogelijk beoordeling van weefsel-specifieke pathologie. Hiervoor zijn orthotopische tumormuismodellen geschikt7,22,23. Echter, orthotopische modellen zijn uitdagender en meestal te betrekken grotere bedriegpost voor muizen, en zijn meer omslachtig en kostbaar22. Onderhuidse modellen zijn zeer geschikt om de effecten van (neo-)adjuvante therapieën, systemisch of lokaal, op lokale kanker terugval te beoordelen, op een kosteneffectieve en relatief hoge doorvoerwijze met minimale impost voor de dieren.
De onvolledige gedeeltelijke resectie zoals beschreven in dit protocol is nuttig voor het testen van adjuvante therapieën terwijl chirurgische wondgenezing als factor, een variabele die vaak over het hoofd wordt gezien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen onthullingen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Sock het aan Sarcoma! Stichting, de Australische en Nieuw-Zeelandse Sarcoma Association, de Children's Leukemie & Cancer Research Foundation en Perpetual Philanthropy. W.J.L wordt ondersteund door een Simon Lee Fellowship en een onderzoeksbeurs van de National Health and Medical Research Council, en de Cancer Council WA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
References
- Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).
- Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).
- Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma. Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).
- Smith, H. G., et al. Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma. British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).
- Uramoto, H., Tanaka, F. Recurrence after surgery in patients with NSCLC. Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).
- Stojadinovic, A., et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).
- Krall, J. A., et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).
- Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86 (2018).
- Predina, J. D., et al. Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment. American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
- Khong, A., et al. The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40. BMC Cancer. 14, 969 (2014).
- Broomfield, S., et al. Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy. Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).
- Predina, J. D., et al. A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation. Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).
- Predina, J., et al. Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).
- Endo, M., Lin, P. P. Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma. Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37 (2018).
- Liu, J., et al. Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease. Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).
- Park, C. G., et al. Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases. Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).
- Tai, L. H., et al. A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies. Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).
- Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
