Summary
בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל העכבר של כריתת כירורגית לא הושלמה של סרקומה של רקמה רכה עבור בדיקות (ניאו) שדון טיפולים.
Abstract
ניתוח הוא לעתים קרובות הטיפול הראשון עבור גידולים מוצקים רבים. עם זאת, התפרצויות מקומיות מתרחשות לעתים קרובות בעקבות הטיפול העיקרי הגידול, למרות הפסיקה או הניאו-שדון טיפולים. זה מתרחש כאשר שוליים כירורגי ללא מספיק גידול, וכתוצאה מכך תאים סרטניים שיורית. מנקודת מבט ביולוגית וחיסונית, ניתוח אינו אירוע null; סביבת הריפוי של הפצע ידוע כדי לגרום למסלולים הפרו-והאנטי-טוטגניים. כתוצאה מכך, דגמים פרה-קליניים לפיתוח תרופות שמטרתן למנוע התדרדרות מקומית צריך לשלב כריתת כירורגית כאשר בדיקות חדשות (ניאו) שדון טיפולים, כדי לדגמן את ההגדרות הקליניות בחולים שטופלו בניתוח.
כאן, אנו מתארים מודל העכבר של כריתת כירורגית שלא הושלמה של WEHI 164 סרקומה רקמה רכה המאפשר בדיקה של (ניאו) טיפולים והנמלה בקביעת תגובה ריפוי הפצע. במודל זה, 50% או 75% של הגידול מוסר, משאיר מאחורי רקמות סרטן באתרו כדי לדגמן מחלות שיורית גולמי לאחר הניתוח בסביבה הקלינית. מודל זה מאפשר טיפולים בדיקה בהקשר של ניתוח בעוד בהתחשב בתגובה ריפוי הפצע, אשר עשוי להשפיע על היעילות של הטיפול (ניאו) שדון טיפולים. כריתת כירורגית מלאה תוצאות לצמיחה מחודשת של הגידול בכל העכברים בהעדר טיפול שדון. הטיפול שדון עם המצור תוצאות מחסום לצמיחה מחודשת הגידול. מודל זה מתאים אפוא לבדיקת טיפולים בהקשר של ניתוח debulking ואת התגובה הקשורה שלה הפצע ריפוי והוא יכול להיות מורחב לסוגים אחרים של סרטן מוצק.
Introduction
ניתוח נשאר אפשרות הטיפול העיקרי עבור גידולים מוצקים רבים1, כולל סרקומה של רקמה רכה2,3. למרות שיפורים בטכניקות ניתוח סרטן, ושילובים עם (ניאו) שדון טיפולים, יש עדיין סיכון גבוה של התדרדרות סרטן גרורות בעקבות כריתת הגידול העיקרי4,5. ב סרקומה רקמת רך, הישנות להתרחש במיוחד locoregionally, באתר של ניתוח, וכתוצאה מכך תחלואה מוגברת תמותה. בהגדרה הקלינית, זה יכול להיות קשה להשיג שוליים רחבים מספיק (למשל, עקב אילוצים אנטומיים), וכתוצאה מכך כריתת שלמים והחזרה הגידול הבאים6. לחץ כירורגי והתהליך הבא של ריפוי הפצע ידועים ליצור מיקרו מדכאים הגידול מיקרוסביבתי חיוביות להישנות הגידול7,8. לכן, גילוי ופיתוח של טיפולים חדשים עבור סרקומה של רקמה רכה, בעיקר חיסוני, צריך לקחת באופן אידיאלי את התגובה הריפוי פצע כירורגי בחשבון.
המחקרים הקדם-קליניים ביותר עבור הטיפולים מתבצעים בתחילה באמצעות מודלים של העכבר בסינגנמית או xenotransplant שתלות, מבלי לשלב את הלחץ כירורגי תגובה ריפוי הפצע9,10. לכן, פיתחנו את העכבר תת עורית מודל סרקומה של רקמה רכה המשלב ניתוח כירורגי שלם. WEHI 164 תאים פיברוסרקומה מחוסנת תת-עורי, ופעם גידולים מבוססים, אנו מסירים 50-75% הגידול הגורפת (איור 1A-E). גידולים מחדש בעקביות לצמוח מתוך הגידול שנותר. מודל זה מאפשר בדיקת שפיטה טיפולים תוך בהתחשב בהשפעה של לחץ כירורגי וריפוי הפצע. מודלים כירורגיים דומים של כריתה לא שלמה שימשו במספר מחקרים על ידי מספר קבוצות ומצאו להיות בתוקף ואפקטיבי11,12,13. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של פרוטוקול זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בעלי חיים ששימשו בניסויים אלה התקבלו ממרכז המשאבים בעלי חיים (פרת ', אוסטרליה המערבית). בעלי חיים שמרו בתנאים הסטנדרטיים ללא הפתוגן במכון הארי פרקינס לחקר הרפואה ביוריאסוסס נורת ' מתקן (פרת ', אוסטרליה המערבית). כל הניסויים בוצעו בעקבות הפרוטוקול שאושר על ידי המכון לאתיקה בבעלי חיים של הארי פרקינס. עכברים BALB/c של 8-12 שבועות של גיל שימשו ניסויים אלה. קו התאים של WEHI 164 פיברוסרקומה התקבל מ-CellBank אוסטרליה (ווסטמיד).
1. חיסונים של תאים
- הכנת תאים ובעלי חיים
- ודא ששורת התאים נשמרת במדיה המומלצת. לדוגמה, לשמור WEHI 164 תא קו בשנת הזיכרון ברוזוול פארק (RPMI) 1640 בינונית בתוספת עם 2 מ"מ L-גלוטמין, 10% סרום שור העובר, 20 מ"מ HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL פניצילין, ו 100 μg/mL סטרפטומיצין.
הערה: בתאי המעבר לפחות 3 ועד 5 פעמים לאחר הסרתו מאחסון קריוגני. כדי להבטיח הכדאיות האופטימלית של התא, יש לפצל תאים כאשר הם בין 70-80% באמצעות החיבור. קווי הגידול תאים צריך להיבדק mycoplasma, כמו זיהום יכול לשנות את צמיחת התאים ולהשפיע על התגובה החיסונית ב vivo. - לגלח עכברים באגף הימני התחתון. באמצעות קוצץ המכונות
הערה: עכברים BALB/c הנשי, הגילאים בין 8-12 שבועות, של משקל רגיל (16 -22 גרם) שימשו בניסוי זה. - ביום החיסונים, הקציר של WEHI 164 תאים כאשר 70-80% הקשר על ידי טריסיזציה.
- משלחים את מדיום התרבות מצלוחיות התרבות של רקמת הרקמה ולאחר מכן מוסיפים תמיסת פוספט סטרילית באגירה (1x PBS), כדי להסיר את העקבות הנותרים של סרום שור עוברי (FBS).
- . מבחנות של תרבות הרקמה הוסיפו 3 מ ל של 0.05% טריפסין (לבקבוקון T75) ולאחר מכן מערבולת הבקבוקון כך שכל המשטח של הבקבוקון עם התאים מכוסה בטריפסין.
- מודדקת את הבקבוקון ב 37 ° c, 5%2 חממה עבור 3 דקות. בדוק את התאים באופן תקופתי, על ידי הקשה על צידי הבקבוקון כדי לראות אם תאים החוצה.
- הסר צלוחיות מאינקובטור של תרבות התא והוסף 5 מ ל של מדיה בתוספת FBS כדי לנטרל את טריפסין.
הערה: אין להשאיר את התאים בטריפסין יותר מהדרוש, שכן הדבר עלול לגרום נזק לתאים ולהוביל ליכולת היכולת להתאים לתאים נמוכים. - Pipet ההשעיה מספר פעמים כדי להשיג השעיה תא יחיד. העבר תא השעיה לצינור צנטריפוגה חרוט.
- גלולה בתאים על ידי ספינינג ב 350 x g עבור 3 דקות.
- רחץ את התאים שלוש פעמים ב-1x PBS.
- השהה תאים מחדש ב-50 mL של PBS 1 x מעוקר ולשטוף את התאים על ידי השעיית תא ליטוף למעלה ולמטה. גלולה בתאים על ידי ספינינג ב 350 x g עבור 3 דקות.
- ומשהה את התאים מחדש ב -15 מ ל. של ערוץ 1-אקס סטרילי רוחצים את התאים על ידי השעיית תא ליטוף למעלה ולמטה. גלולה בתאים על ידי ספינינג ב 350 x g עבור 3 דקות.
- בדיוק 10 מ ל. של הערוץ החדש הסטרילי לשטוף את התאים כמו בשלב 1.1.4.2 ולהעביר כמות קטנה (כ 100 μL) של התא הבולם לצינור צנטריפוגה לספירה. גלולה בתאים על ידי ספינינג ב 350 x g עבור 3 דקות.
- קבע את מספר הטלפון באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריקון על-ידי שימוש בפעולת הומוציטוטומטר או במונה תאים אוטומטיים. השהה את התאים מחדש בערוץ 1 x מעוקר בריכוז של 5 x 106 תאים/mL. . שמור על השעיית תא בקרח
הערה: הכדאיות של תאים סרטניים צריך להיות שווה או מעל 80% כדי להבטיח גידול הגידול בגידולים.
- ודא ששורת התאים נשמרת במדיה המומלצת. לדוגמה, לשמור WEHI 164 תא קו בשנת הזיכרון ברוזוול פארק (RPMI) 1640 בינונית בתוספת עם 2 מ"מ L-גלוטמין, 10% סרום שור העובר, 20 מ"מ HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL פניצילין, ו 100 μg/mL סטרפטומיצין.
- חיסון תת עורי
- לערבב את ההשעיה התא ביסודיות למלא מזרק עם המחט של 26 G עם 100 μL של השעיה התא (5 x 105 תאים) סטרילי 1 x PBS. חזור על ערבול של תאים לפני טעינת המזרק הבא.
הערה: לשמור על התאים בקרח במהלך ההליך כדי לשמור על יכולת הקיום. - רסן את העכבר כראוי, ומבטיח גישה לאגף הימני התחתון. . מתת-עורי את העכבר על האגף הימני התחתון
הערה: ודא שהחיסון אינו נמצא בצפק על-ידי הרמת המחט מעט, שאמורה להיות גלויה מתחת לעור. גוש כמו בועה צריך להיווצר. מתחת לעור בעקבות החיסון - נטר עכברים כנדרש על ידי אישור האתיקה הישים ולבצע כריתת כירורגית כאשר הגידולים גדלו לגודל של כ 50 מ"מ2.
- לערבב את ההשעיה התא ביסודיות למלא מזרק עם המחט של 26 G עם 100 μL של השעיה התא (5 x 105 תאים) סטרילי 1 x PBS. חזור על ערבול של תאים לפני טעינת המזרק הבא.
2. כריתת כירורגית חלקית של הגידול
הערה: פרוטוקול זה דורש שני חוקרים; אחד עבור הליכים כירורגיים (מנתח), ואחר עבור ניטור העכבר (עוזר).
- כיוונון כירורגי
- ביום 12 פוסט החיסון, כאשר הגידולים הגיעו לגודל של כ 50 מ"מ2, עכברים מינון עם 100 μl (0.1 מ"ג/ק"ג) של בופרנורפין ספורטינג ראגה בעורף של הצוואר, 30 דקות לפני הניתוח.
- להגדיר את האזור כירורגי עם משטח חום מכוסה מעיל ספסל להגדיר חרוט האף עבור הרדמה. לעקר כלים כירורגיים לפני השימוש, ובין כל חיה באמצעות מעקר חרוז חום, המאפשר כלים להתקרר לפני השימוש. יש את הציוד הכירורגי הבאים נקי בהישג יד: כלורקסדין, ספוגית, גזה, ג'ל עיניים, שני מלקחיים מעוקל, מספריים, המוליך קליפ, מסיר קליפ, מילוי קליפ (איור 2A, 2b).
- חמם את תא החימום עד 37 ° c והגדר משטח חום נוסף להתאוששות (איור 2ג). מניחים כלים מעקרים על משטח סטרילי כגון רפידות אוטוקלאויים.
- רדמה
- מניחים את העכבר בתא אינדוקציה ומייבשים את העכבר עם 4% isofלבין (4% ב-100% חמצן בקצב הזרימה של 1 L/min) עד קצב הנשימה מאט כ 60 נשימות לדקה (1 לשנייה) (זה בדרך כלל לוקח < 1 דקות).
הערה: אל תשאירו את העכבר בחדר יותר מדי זמן שעלול לגרום לחנק ולמוות. יש רק עכבר אחד. מתחת להרדמה בכל פעם - להעביר את העכבר על משטח החום על השולחן הניתוח, למקם את העכבר עם אפו בקונוס האף ולשמור על מצב ההרדמה עם 3-4% isofלוריאן ב 100% חמצן בקצב הזרימה של 0.5 L/min. נטר את קצב הנשימה כדי להבטיח שעומק ההרדמה יישמר.
הערה: המסייע חייב לפקח על הנשימה של העכבר לאורך הניתוח כדי להבטיח את רמת ההרדמה הנכונה נשמרת. הנמך את ריכוז ההרדמה אם הנשימה הופכת איטית מדי או מגדיל את הריכוז אם עומק ההרדמה שטחי מדי. אם העכבר מתחיל לנשום, להסיר את העכבר מחרוט האף, להקטין את הריכוז הרדמה, ולחכות עד הנשימה הנורמלי לפני הצבת על חרוט האף שוב. - בצע "צביטה בדיקה" ו "רפלקס המצמוץ בדיקה"14 כדי להבטיח כי העכבר מורדם לחלוטין לפני תחילת הניתוח.
הערה: התנועה של חלק כלשהו של העכבר היא אינדיקציה כי העכבר אינו מורדם לחלוטין. על החיה לקבל מיד הרדמה נוספת על ידי הגברת הריכוז ההרדמה. - לכסות את עיני העכבר עם כמות קטנה של ג'ל אופטלמולוגי כדי למנוע יובש בעין.
- מניחים את העכבר בתא אינדוקציה ומייבשים את העכבר עם 4% isofלבין (4% ב-100% חמצן בקצב הזרימה של 1 L/min) עד קצב הנשימה מאט כ 60 נשימות לדקה (1 לשנייה) (זה בדרך כלל לוקח < 1 דקות).
- ניתוח כירורגי (מנתח)
- לנגב את האזור כירורגי 3 פעמים עם כלורהקאיצין אלכוהוליים. באמצעות מלקחיים וזוג מספריים, לעשות חתך 1 ס מ ישר לאורך הצד החלק השני, 3 מ"מ הרחק הגידול (איור 3a, 3b).
הערה: סטנדרטיזציה החתך ל 1 ס מ בכל עכבר (באמצעות סרגל) מאפשר אפילו הערכה של ריפוי הפצע בין עכברים. איתור החתך 3 מ"מ הרחק מן הגידול מאפשר טיפול בלתי מוסרי בעקבות מוסר ללא דליפה מהפצע. - שימוש בפינצטה, למשוך את facia ואת רקמת שומן תת עורית בין הגידול לבין צפק. גידול תת עורית מחובר בדרך כלל לצד העור.
- פתח את הפצע על ידי החזקת בעדינות את העור על הנושא הגידול בצד באמצעות מלקחיים, ו "להפוך" את הגידול כך שהוא נראה מחוץ (איור 3ג, 3d).
הערה: החלק של הגידול להיות מעורפל צריך להיות הקרוב ביותר לפתח, יש מספיק עור כדי לסגור את הפצע. להיזהר לא לחתוך את העור בעת הסרת הגידול. - באמצעות זוג מספריים, לחתוך את קפסולת הגידול ממחצית להסיר, החל בבסיס הגידול הקרוב ביותר לפתח.
- עבור 50% ניתוח בצובר, לחתוך באמצע הגידול. באמצעות מלקחיים מעוקל, לאסוף את הקטע של הגידול להיות מוסר (50%); לאסוף את כל שרידי האזור מעורפל.
- עבור 75% debulk, לבצע 50% הגידול debulk כמו בחלק 2.3.5 לעיל. ואז לחתוך במחצית הנותרים 50% של הגידול וסקופ 25% של הגידול, באמצעות מלקחיים מעוקל כמתואר לעיל.
- לנגב את האזור כירורגי 3 פעמים עם כלורהקאיצין אלכוהוליים. באמצעות מלקחיים וזוג מספריים, לעשות חתך 1 ס מ ישר לאורך הצד החלק השני, 3 מ"מ הרחק הגידול (איור 3a, 3b).
- סגירת האתר הכירורגי
- מניחים את הגידול הנותר בחזרה מתחת לעור, ושימוש מלקחיים, למשוך את מדפים העור יחד, קו את העור לאורך הפצע.
- להחזיק את העור יחד 5 מ"מ מקצה הפצע, ולהשתמש בקליפים כירורגיים כדי לסגור את הפצע, החל בצד הקרוב ביותר מלקחיים. החלת פריטים רבים ככל הנדרש כדי להבטיח שרקמת הבסיס אינה חשופה. באופן כללי, שלושה עד ארבעה קליפים מוחלים עם מרווחים של 2 מ"מ בין קליפים.
הערה: אם פריטים כלשהם אינם מוחלים היטב, הסר אותו באמצעות מסיר קליפ והחלף בקליפים חדשים.
- שחזור של עכברים (עוזר)
- הניחו לעכברים להתאושש על ידי הכנסתו לחדר החימום החם (37 ° c).
- מניחים את כלוב העכבר על משטח החום. לנטר את העכברים בתא החימום עד שהם התאושש הרדמה (ער והליכה) ולאחר מכן להחזיר את העכברים בחזרה לכלוב. השאירו את הכלוב על משטח החימום למשך 10 דקות נוספות, עד שהעכברים יהפכו לפעילים יותר.
- תנו לעכברים מזון רך ורטוב. לנטר את העכברים 1 שעה לאחר הניתוח להחלמה ולהבטיח שקליפים יישארו במקומם. ודא כי הכלוב הוא חצי על/מחצית משטח החום כדי לאפשר לבעלי חיים לווסת את הטמפרטורה העצמית בזמן ללא השגחה.
- מינון עכברים עם 0.1 mg/ק"ג בופרנורפין (100 μl תת-עורי בתוך הצוואר), 6-8 שעות לאחר הניתוח (בסוף היום). הצג עכברים מוקדם בבוקר למחרת, ועכברים מינון שוב עם 0.1 mg/ק"ג בופרנורפין (100 μl תת-עורי בתוך העורף של הצוואר). תנו עוד מזון רטוב כנדרש.
- נטר עכברים מדי יום. במשך שבעת הימים הבאים ניתן להסיר קליפים לאחר שבעה ימים באמצעות מסיר הקליפים.
- שפיטה או טיפול בנאודון
- לטפל בעכברים פרי-בשיתוף עם (ניאו) טיפול הפסיקה בכל זמן נתון, בהתאם לטיפול בריבית.
- לדוגמה, להתייחס עכברים עם מנה אחת של 100 μg של anti-CTLA-4 intraperitoneally (כיתה) ביום 15 לאחר החיסון, או עם שלוש מנות של 200 μg anti-PD-1 כז ביום 15, 17 ו 19 לאחר החיסון.
- שולטת ניסויית
- בעת שימוש במודל זה כדי להעריך את ההשפעות של דלקת/הפצע ריפוי, לשקול שימוש בקבוצות הביקורת הבאות: 1) אין בקרת כירורגיה (הטיפולים עדיין ניתן לניהול intrאטומורתי); 2) שליטה בניתוח המנתח: חתך כירורגי נעשה בעור; הגידול הוא מניפולציות חשוף, אבל לא רקמת הגידול מוסר; הפצע סגור עם קליפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גידול בגודל של 50 mm2 הוא גודל אידיאלי עבור debulk חלקי. הניתוח הכירורגי ללא שלמות של 50 mm2 גידולים תוצאות ב 100% (n = 5) לצמיחה מחודשת של גידולים בהעדר הטיפול חיסוני שדון (איור 4א). הפעם הבאה השתמשו במודל כדי לבחון את הטיפול החיסוני שימוש בנוגדנים נגד מולקולות המחסום ציטוטוקסיים חלבון משויך לימפוציטים 4 (CTLA-4) וקולטן מוות מתוכנת 1 (PD-1). טיפול בעכברים עם anti-CTLA-4 או anti-PD-1 הביא שיעור הריפוי של 80% ו 25% (n = 4-5 לכל קבוצה), בהתאמה (איור 4ב, 4c). התגובה עם anti-PD-1 מספק הזדמנות לבדוק שילובים רומן כדי לשפר את קצב התגובה יותר.
איור 1: תרשים סכמטי של כריתת כירורגית חלקית של הגידול. (A) עכברים balb/c מחוסן עם 5 x 105 wehi-164 תאים באגף הימני התחתון. (ב) כאשר הגידול מגיע 50 מ"מ2, הניתוח יכול להתחיל. (ג) הגידול הוא resected חלקית (50% המוצג). (ד) האתר הכירורגי סגור עם קליפים. (ה) טיפול באיקטנט יכול להינתן, באופן מintraperitoneally (מוצג) או בלתי מוסרי באזור הפצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמויות הייצוגיות של הניתוח הוגדרו. (א) תמונה שלמה של הניתוח להגדיר להראות את הכלים כירורגי (מפורטים בשלב 2.1) ואת מכונת ההרדמה. (ב) תמונת תמונה של הטבלה הכירורגית המציגה את כל החומרים בהישג יד. (ג) חדר חימום ומשטח חימום להתאוששות העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות הנציג של הטכניקה החלקית בצובר הגידול. (א) עכבר מורדם לחלוטין עם גידול של 50 מ"מ2 בגודל לפני הניתוח. (ב) חתך באתר 3 מ"מ מן הגידול; . חתך של 1 ס מ (C-D) פתיחת הפצע על ידי החזקת העור בעדינות על צד הגידול הנושא באמצעות מלקחיים, ו "היפוך" הגידול, כך שהוא נראה בחוץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: לצמיחה מחודשת של הגידול בעקבות הגידול הבלתי מושלם טיפול חיסוני. (A) לצמיחה מחודשת של הגידול עקומות של חלקי ושלום-164 גידולים בהעדר הטיפול חיסוני שדון. (B-C) גידול לצמיחה מחודשת לאחר ניתוח ושדון טיפול עם anti-CTLA-4 (ב) או ANTI-PD1 (ג). הקו המנוקד מעיד על יום הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מספקים פרוטוקול עבור מודל העכבר של כריתת כירורגית שלא הושלמה של סרקומה רקמת רך לבדוק טיפולים פרי-פעיל. אנו גם מתוקננת את החתך כירורגי כדי לאפשר הערכה של ריפוי הפצע בין עכברים בעקבות הטיפול.
הצבת הגידול היא חלק חשוב. בפרוטוקול הזה בחרתי מודל גידול תת עורי כדי לאפשר גישה כירורגית קלה לאתר הגידול וניהול של טיפולים מקומיים עם נטל מינימלי על העכברים. חשוב גם להבטיח כי גידולים לצמוח בחלל תת עורית ולא בתוך צפק, אשר יכול לגרום לתחלואה בלתי צפויה תמותה.
בעת בחירת קו תאים של הגידול עבור פרוטוקול זה, אנו מייעצים כי התאים כאשר גדלו ב vivo form מסה מוצק (למשל, WEHI-164 מודל), במקום מסה חצי מוצק (כגון מודל B16) כפי שהוא מבחינה טכנית קשה לכרות חלקית. בנוסף, אם הגידול מתחיל לגדול דרך העור (לראות בדרך כלל בגידולים גדולים מ 100 מ"מ2), debulking אינו מומלץ כמו העור עלול להפוך נקרוטיק ולא לרפא היטב לאחר הניתוח. יש לנו להתגבר על בעיה זו על ידי debulking גידולים ברגע שהם מגיעים 50 mm2 בגודל.
כמו המודל שלנו ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעה של ריפוי הפצע על הטיפול, אנו מציעים קבוצת שליטה/מזויף כהשוואה. השליטה עשויה להיות גידול ללא שליטה, או ניתוח מזויף אשר היה רק את החתך העור, חשיפה של הגידול, וסגירת הפצע בלי גידול חלקי בכמות. קבוצה זו השליטה המזויף יכול לשמש כאשר הבחנה את ההשפעה של דלקת מושרה בניתוח וריפוי הפצע מתוך החלק החלקי על תוצאות הטיפול.
עבור ניתוח מוצלח debulking חלקית, כמה נקודות טכניות צריך להיחשב. היבט חשוב הוא השרשה והצמיחה הנכונים של הגידול. גידולים צריך להיות מושתל על האגף הימני התחתון, הרחק הרגל האחוריות. גידולים כי הם מושתל קרוב מדי הרגל האחוריות יכול להפריע היכולת שלהם ללכת ויכול לגרום לכוח נוסף על הקליפים הגורמים להם לבוא רופף. בנוסף, עקביות בגודל הגידול הוא קריטי כדי למנוע השתנות באחוז היחסי של debulking. בחרנו לבצע ניתוח עם גידולים שיש להם בגודל של 50 מ"מ2, כדי להפוך ניתוח מבחינה טכנית פשוטה, למרות שאנו מצופה כי כריתה חלקית על גידולים קטנים הוא ריאלי. כדי למנוע חוסר עקביות בגודל הגידול, קו התא המשמש להיות החוצה בעקבות טכניקות התקן המתאים לתרבות התא, והחוקר צריך להיות מאומן כראוי בטכניקת הגידול המתאים. כאשר הארכת פרוטוקול זה לדגמי גידולים תת עורית אחרים, המאפיינים הפיזיים של הגידול הם בעלי חשיבות. לדוגמה, מצאנו כי קווי התא שנותנים להצמיח רך, גידולי ז'לטין (למשל, M3-9-M הרדויוסרקומה, ו B16 מלנומה15) הם מאתגרים מבחינה טכנית כדי debulk.
ישנן גם נקודות טכניות שצריכות להיחשב במהלך הניתוח. עכברים צריכים להיות מורדם כראוי כדי למנוע תנועה במהלך ההליך. מלבד האימפוסט כי עכברים כראוי להרדמה יהיה לסבול, כל תנועה של עכברים במהלך ההליך יכול להפוך את ההסרה כירורגית קשה, וכתוצאה מכך השונות בגודל של הגידול הוסר בין עכברים. בנוסף, שיעור הנשימה של העכבר צריך להיות מפוקח בקפידה במהלך הניתוח הריכוז Isofלאנה צריך להיות מותאם כדי לשמור על עומק מתאים של הרדמה. לכן, המסייע תמיד נדרש במהלך הניתוח כדי לפקח על קצב הנשימה במהלך הניתוחים, וכדי להבטיח רמת הרדמה נאותה. גודל החתך צריך להיות עקבי כדי למנוע השתנות בתגובה ריפוי הפצע. מצאנו כי חתך 1-1.5 ס מ מספיקה עבור debulking הגידול, עם סיכוי מינימלי של הפצע ביטול.
המודל שלנו של כריתה חלקית מחקה מחלות שיורית שנותרו לאחר הניתוח כפי שנראה בהגדרה הקלינית של גידולים מוצקים רבים ומציע יתרונות על מודלים העכבר syngeneic המסורתית על ידי לקיחת בחשבון את ההשפעה של ריפוי פצע כירורגי. בנוסף, הדגמים המסורתיים הקיימים של הניתוח השתמשו כריתת הגידול המלא, אשר לא תמיד גורם להישנות הגידול16. חוקרים אחרים השתמשו בהצלחה במודלים כריתה חלקית באמצעות שורות תאים אחרים של סרטן11,12,13, הבקיע את החוסן של שיטה זו. יתר על כן, זה הוכח כי כריתה חלקית, אך לא כריתה מלאה, הביא הגנה נגד הגידול בזיכרון החיסונית כאשר הטיפול לדון מקבל12 אשר יוחסו התמדה של אנטיגנים מן הגידול שיורית.
מודל זה נועד ללמוד את ההשפעה של דלקת וריפוי הפצע על הטיפול. הגישה debulking שלנו קלינית דומה למצבים קליניים בהם מחלה שיורית ברוטו היא נשארה מאחור לאחר הניתוח (R2 כריתה), ולא כריתת מאקרובסטית מלאה עם מחלת שיורית מיקרוסקופיים (כריתה R1). לדוגמה, כריתת כירורגית ב סרקומה של רקמה רכה פולשנית יכול לגרום שוליים חיוביים כאשר הגידול ממוקם ליד מבנים קריטיים כגון עצבים, עורקים או איברים סמוכים, מקלה על כריתה מלאה עם שוליים רחבים17. מודלים כירורגיה לניתוח וכתוצאה מכך פורסמו שוליים חיוביים מיקרוסקופיים13; הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי ללמוד את ההשפעה של תגובה ריפוי הפצע על הטיפול כאשר מחלת שיורית מאקרוסקופי קיים.
מגבלה של המודל שלנו היא כי הוא אינו מעורר התדרדרות מרחוק ו micrometaאוסטזיס, אשר נפוץ לאחר ניתוח בגידולים מוצקים כגון סרטן השד או סרטן הלבלב. מודלים אחרים ניתוח, כגון סרטן השד murine מודל 4t118,19,20 או מודלים murine שלסרטן החלבשל דה נובו גרורות21 מתאים יותר לחקור התדרדרות מערכתית לאחר כריתת המקומי. מגבלה נוספת היא כי פרוטוקול זה הוא למודלים תת עורית ולכן אינו מאפשר הערכה של פתולוגיה ספציפית לרקמות. למטרה זו, מודלים של עכבר הגידול אורתוטופית מתאימים7,22,23. עם זאת, מודלים אורתוטופית מאתגרת יותר, ובדרך כלל כרוכים ביותר לעכברים, והם מפרך ויקרים יותר22. מודלים תת עורית מתאימים היטב כדי להעריך את ההשפעות של (ניאו-) שדון טיפולים, או מערכתית או מקומית, על התדרדרות סרטן מקומי, באופן חסכוני ובדרך-התפוקה גבוהה יחסית עם impost מינימלי לבעלי חיים.
הניתוח החלקי השלם כפי שמתואר בפרוטוקול זה הוא שימושי לבדיקת טיפולים הפסיקה תוך שילוב ריפוי פצע כירורגי כגורם, משתנה אשר לעתים קרובות מתעלמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין הגילויים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מתוך גרב זה סרקומה! קרן, האוסטרלי, ניו זילנד האגודה סרקומה, לוקמיה לילדים & הקרן לחקר הסרטן ופילנתרופיה נצחית. W. J. L נתמך על ידי מלגת סימון לי ומלגת מחקר מבית החולים הלאומי לחקר הרפואה, ואת המועצה לסרטן WA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
References
- Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).
- Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).
- Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma. Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).
- Smith, H. G., et al. Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma. British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).
- Uramoto, H., Tanaka, F. Recurrence after surgery in patients with NSCLC. Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).
- Stojadinovic, A., et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).
- Krall, J. A., et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).
- Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86 (2018).
- Predina, J. D., et al. Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment. American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
- Khong, A., et al. The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40. BMC Cancer. 14, 969 (2014).
- Broomfield, S., et al. Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy. Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).
- Predina, J. D., et al. A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation. Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).
- Predina, J., et al. Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).
- Endo, M., Lin, P. P. Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma. Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37 (2018).
- Liu, J., et al. Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease. Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).
- Park, C. G., et al. Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases. Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).
- Tai, L. H., et al. A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies. Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).
- Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
