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परीक्षण के लिए अधूरा पुनः प्राप्त सॉफ्ट टिशू सारकोमा का एक माउस मॉडल (नियो) एडजुवेंट थेरेपी

Published: July 28, 2020 doi: 10.3791/60882
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2, 1,2, 2
1School of Biomedical Sciences, University of Western Australia, 2Telethon Kids Institute, University of Western Australia, 3College of Science, Health, Engineering and Education, Murdoch University

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम परीक्षण (नव) एडजुवेंट चिकित्सा के लिए नरम ऊतक सारकोमा के अधूरे सर्जिकल रिसेक्शन के माउस मॉडल का वर्णन करते हैं।

Abstract

सर्जरी अक्सर कई ठोस ट्यूमर के लिए पहला इलाज है। हालांकि, स्थानीय रिलेप्स अक्सर प्राथमिक ट्यूमर रीसेक्शन के बाद होते हैं, एडजुवेंट या नव-एडजुवेंट चिकित्सा के बावजूद। यह तब होता है जब सर्जिकल मार्जिन अपर्याप्त ट्यूमर मुक्त होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अवशिष्ट कैंसर कोशिकाएं होती हैं। जैविक और इम्यूनोलॉजिकल नजरिए से, सर्जरी एक शून्य घटना नहीं है; घाव भरने का वातावरण समर्थक और एंटी-ट्यूमरजनित रास्ते दोनों को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। नतीजतन, स्थानीय पतन को रोकने के उद्देश्य से दवा विकास के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल को सर्जरी के साथ इलाज किए गए रोगियों में नैदानिक सेटिंग्स को मॉडल करने के लिए नए (नव) एडजुवेंट चिकित्सा का परीक्षण करते समय सर्जिकल रिसेक्शन को शामिल करना चाहिए।

यहां, हम WEHI 164 नरम ऊतक सारकोमा के अधूरे सर्जिकल रिसेक्शन के एक माउस मॉडल का वर्णन करते हैं जो घाव भरने की प्रतिक्रिया की स्थापना में (नव) एडजुवेंट उपचारों के परीक्षण की अनुमति देता है। इस मॉडल में, ट्यूमर का 50% या 75% हटा दिया जाता है, जो नैदानिक सेटिंग में सर्जरी के बाद सकल अवशिष्ट रोग को मॉडल करने के लिए सीटू में कुछ कैंसर ऊतकों को पीछे छोड़ देता है। यह मॉडल सर्जरी के संदर्भ में परीक्षण उपचार की अनुमति देता है, जबकि घाव भरने की प्रतिक्रिया पर भी विचार करता है, जो (नव) एडजुवेंट उपचार की प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है। अपूर्ण सर्जिकल रिसेक्शन के परिणामस्वरूप एडुवेंट थेरेपी के अभाव में सभी चूहों में ट्यूमर का पुन: उत्पन्न पुनर्विकास होता है। चेकपॉइंट नाकाबंदी के साथ एडुवेंट उपचार के परिणामस्वरूप कम ट्यूमर पुनर्विकास होता है। इस प्रकार यह मॉडल डीबुलिंग सर्जरी और उससे जुड़े घाव उपचार प्रतिक्रिया के संदर्भ में उपचारों के परीक्षण के लिए उपयुक्त है और इसे अन्य प्रकार के ठोस कैंसर तक बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

सर्जरी कई ठोस ट्यूमर के लिए मुख्य उपचार विकल्प बनी हुई है1, जिसमें मुलायम ऊतक सारकोमा2,3शामिल हैं । कैंसर सर्जरी तकनीकों में सुधार के बावजूद, और (नव) एडजुवेंट चिकित्सा के साथ संयोजन, प्राथमिक ट्यूमर रेसेक्शन4,,5के बाद अभी भी कैंसर रिलेप्स और मेटास्टेसिस का एक उच्च जोखिम है। नरम ऊतक सारकोमा में, सर्जरी की साइट पर विशेष रूप से लोकोक्षेत्रीय रूप से होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप रुग्णता और मृत्यु दर में वृद्धि होती है। नैदानिक सेटिंग में, व्यापक पर्याप्त मार्जिन प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है (उदाहरण के लिए, शारीरिक बाधाओं के कारण), जिसके परिणामस्वरूप अधूरा रीसेक्शन और बाद में ट्यूमर पुनरावृत्ति6। सर्जिकल तनाव और घाव भरने की बाद की प्रक्रिया ट्यूमर पुनरावृत्ति 7,8के लिए अनुकूल इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट बनाने के लिए जानाजाताहै। इसलिए, नरम ऊतक सारकोमा, विशेष रूप से इम्यूनोथेरपी के लिए नए उपचारों की खोज और विकास, आदर्श रूप से सर्जिकल घाव उपचार प्रतिक्रिया को ध्यान में रखना चाहिए।

एडजुवेंट चिकित्सा के लिए अधिकांश प्रीक्लिनिकल अध्ययन शुरू में सर्जिकल तनाव और घाव हीलिंग प्रतिक्रिया9,,10को शामिल किए बिना चमड़े के नीचे सिनेजेनिक या ज़ेनोट्रांसप्लांट माउस मॉडल का उपयोग करके किए जाते हैं। इसलिए, हमने अधूरा सर्जिकल रीसेक्शन को शामिल करते हुए एक सिनेजेनिक चमड़े के नीचे माउस सॉफ्ट टिश्यू सारकोमा मॉडल विकसित किया। WEHI 164 फाइब्रोसारकोमा कोशिकाओं को चमड़े के नीचे टीका लगाया जाता है, और एक बार ट्यूमर स्थापित हो जाने के बाद, हम ट्यूमर बल्क(चित्रा 1A-ई) का 50-75% निकालतेहैं। ट्यूमर लगातार शेष ट्यूमर से फिर से बढ़ता है। यह मॉडल सर्जिकल तनाव और घाव भरने के प्रभाव पर विचार करते हुए एडजुवंत चिकित्सा के परीक्षण के लिए अनुमति देता है। अपूर्ण रिसेक्शन के समान सर्जिकल मॉडलों का उपयोग कई समूहों द्वारा किए गए कई अध्ययनों में किया गया है और यह प्रजनन योग्य और प्रभावी पाया गया है11,12,13.13 यहां, हम इस प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं।

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Protocol

इन प्रयोगों में इस्तेमाल होने वाले जानवरों को एनिमल रिसोर्स सेंटर (पर्थ, वेस्टर्न ऑस्ट्रेलिया) से प्राप्त किया गया था। हैरी पर्किंस इंस्टीट्यूट ऑफ मेडिकल रिसर्च बायोरिसोर्स नॉर्थ फैसिलिटी (पर्थ, वेस्टर्न ऑस्ट्रेलिया) में स्टैंडर्ड पैथोजन-फ्री कंडीशन के तहत जानवरों को बनाए रखा गया । सभी प्रयोगों के रूप में हैरी पर्किंस इंस्टीट्यूट ऑफ मेडिकल रिसर्च एनिमल एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के बाद किया गया । इन प्रयोगों में 8-12 सप्ताह की उम्र के बाल्ब/सी चूहों का इस्तेमाल किया गया। WEHI 164 फाइब्रोसारकोमा सेल लाइन सेलबैंक ऑस्ट्रेलिया (वेस्टमीड, एनएसडब्ल्यू) से प्राप्त की गई थी।

1. कोशिकाओं का टीका

  1. कोशिकाओं और जानवरों की तैयारी
    1. सुनिश्चित करें कि सेल लाइन अनुशंसित मीडिया में बनाए रखा गया है। उदाहरण के लिए, रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) में WEHI 164 सेल लाइन को बनाए रखें 1640 मध्यम पूरक 2 m L-ग्लूटामाइन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 20 mM HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg/mL stre sp
      नोट: क्रायोजेनिक भंडारण से हटाए जाने के बाद कम से कम 3 और 5 बार तक पैसेज कोशिकाएं। एक इष्टतम कोशिका व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं को विभाजित किया जाना चाहिए जब वे 70-80% के बीच हैं। ट्यूमर सेल लाइनों को माइकोप्लाज्मा के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, क्योंकि संक्रमण कोशिका के विकास को बदल सकता है और वीवो में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है।
    2. टीका लगाने से एक दिन पहले, कतरनी का उपयोग करके निचले दाहिने पार्श्व पर चूहों को शेव करें।
      नोट: महिला BALB/c चूहों, 8-12 सप्ताह के बीच आयु वर्ग के, सामांय वजन (16-22 ग्राम) के इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया ।
    3. टीका के दिन, फसल WEHI 164 कोशिकाओं जब 70-80% ट्राइपसिनाइजेशन द्वारा संकुचित।
      1. ऊतक संस्कृति फ्लास्क से संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और फिर भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के शेष निशान को हटाने के लिए बाँझ फॉस्फेट बफर समाधान (1x पीबीएस) जोड़ें।
      2. ऊतक संस्कृति फ्लास्क से पीबीएस को एस्पिरेट करें। 0.05% ट्राइप्सिन (T75 फ्लास्क के लिए) के 3 एमएल जोड़ें और फिर फ्लास्क को भंवर करें ताकि कोशिकाओं के साथ फ्लास्क की पूरी सतह ट्राइप्सिन द्वारा कवर की जा सके।
      3. फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर 3 मिनट के लिए करें। फ्लास्क के किनारों पर टैप करके कोशिकाओं को समय-समय पर जांचें ताकि यह देखा जा सके कि कोशिकाएं उखाड़ फेंकी गई हैं या नहीं।
      4. सेल कल्चर इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए एफबीएस के साथ पूरक मीडिया के 5 एमएल जोड़ें।
        नोट: कोशिकाओं को आवश्यक से अधिक समय तक ट्रिप्सिन में न छोड़ें, क्योंकि इससे कोशिकाओं को नुकसान पहुंच सकता है और कम कोशिका व्यवहार्यता हो सकती है।
      5. एक एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए कई बार पिपेट निलंबन। एक शंकुकेंद्रित ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण।
      6. 3 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर घूमते हुए पैलेट सेल।
    4. कोशिकाओं को 1x पीबीएस में तीन बार धोएं।
      1. 50 एमएल बाँझ 1x पीबीएस और वॉश सेल में सेल सस्पेंशन को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके रीसुस्पेंड सेल। 3 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर घूमते हुए पैलेट सेल।
      2. बाँझ 1x पीबीएस के 15 एमएल में सुपरनेट और रिसिपेंड कोशिकाओं को एस्पिरेट करें। कोशिका निलंबन को ऊपर और नीचे करके कोशिकाओं को धोएं। 3 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर घूमते हुए पैलेट सेल।
      3. बाँझ 1x PBS के ठीक 10 एमएल में सुपरनेट और रिसिम्प कोशिकाओं को एस्पिरेट करें। चरण 1.1.4.2 में कोशिकाओं को धोएं और गिनती के लिए एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन की एक छोटी राशि (लगभग 100 μL) स्थानांतरित करें। 3 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर घूमते हुए पैलेट सेल।
    5. हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन विधि का उपयोग करके सेल नंबर निर्धारित करें। 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर बाँझ 1x पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से पेंड करें । बर्फ पर सेल सस्पेंशन रखें।
      नोट: ट्यूमर कोशिकाओं की व्यवहार्यता प्रजनन योग्य ट्यूमर विकास सुनिश्चित करने के लिए बराबर या 80% से ऊपर होनी चाहिए।
  2. चमड़े के नीचे टीका
    1. सेल सस्पेंशन को अच्छी तरह से मिलाएं और बाँझ 1x पीबीएस में 100 माइक्रोन सेल सस्पेंशन (5 x 105 कोशिकाओं) के साथ 26 जी सुई के साथ एक सिरिंज भरें। अगली सिरिंज लोड करने से पहले कोशिकाओं का मिश्रण दोहराएं।
      नोट: व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर कोशिकाओं को रखें ।
    2. माउस को उचित रूप से नियंत्रित करें, निचले-दाएं पार्श्व तक पहुंच सुनिश्चित करें। माउस को शेव किए गए लोअर-राइट फ्लैंक पर चमड़े के रूप में टीका लगाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि टीका सुई को थोड़ा उठाने से पेरिटोनम में नहीं है, जो त्वचा के नीचे दिखाई देना चाहिए। टीका के बाद त्वचा के नीचे एक बुलबुले की तरह गांठ बनना चाहिए।
    3. लागू नैतिकता अनुमोदन के लिए आवश्यकतानुसार चूहों की निगरानी करें और जब ट्यूमर लगभग 50 मिमी2के आकार में हो गए हैं तो सर्जिकल रीसेक्शन करें।

2. ट्यूमर का आंशिक सर्जिकल रीसेक्शन

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए दो शोधकर्ताओं की आवश्यकता है; एक सर्जिकल प्रक्रियाओं (सर्जन) के लिए, और माउस निगरानी (सहायक) के लिए एक और।

  1. सर्जरी सेटअप
    1. दिन 12 पोस्ट टीका, जब ट्यूमर लगभग 50 मिमी2के आकार तक पहुंच गए हैं, खुराक चूहों के साथ 100 माइक्रोन (0.1 मिलीग्राम/किलो) के साथ बुप्रेनोरफिन एससी गर्दन के स्क्रफ में, सर्जरी से 30 मिनट पहले।
    2. बेंच कोट के साथ कवर एक हीट पैड के साथ सर्जिकल क्षेत्र की स्थापना की और एनेस्थीसिया के लिए एक नाक शंकु की स्थापना की। उपयोग करने से पहले सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज करें, और प्रत्येक जानवर के बीच गर्मी मनका स्टरलाइजर का उपयोग करके, उपयोग से पहले उपकरणों को ठंडा करने की अनुमति देता है। निम्नलिखित सर्जिकल उपकरण साफ करें और आसान पहुंच के भीतर: क्लोरहेक्सीडीन, झाड़ू, धुंध, आंख जेल, दो घुमावदार संदंश, कैंची, क्लिप एप्लिकेटर, क्लिप रिमूवर, क्लिप रिफिल(चित्रा 2ए, 2B)।
    3. हीटिंग चैंबर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और रिकवरी के लिए एक और हीट पैड(चित्रा 2सी)स्थापित करें। एक बाँझ सतह जैसे ऑटोक्लेव पैड पर निष्फल उपकरण रखें।
  2. संज्ञाहरण
    1. माउस को इंडक्शन चैंबर में रखें और माउस को 4% आइसोफ्लाणे (1 एल/मिनट की प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में 4%) के साथ एनेस्थेटाइज करें, जब तक कि सांस लेने की दर लगभग 60 सांस प्रति मिनट (1 प्रति सेकंड) तक धीमी हो जाती है (यह आमतौर पर लेता है और एलटी; 1 मिनट)।
      नोट: माउस को बहुत लंबे समय तक कक्ष में न छोड़ें क्योंकि इससे श्वासावरोध और मृत्यु हो सकती है। एक समय में संज्ञाहरण के तहत केवल एक माउस होता है।
    2. सर्जरी टेबल पर हीट पैड पर माउस को स्थानांतरित करें, माउस को नाक शंकु में अपनी नाक के साथ रखें और 0.5 एल/मिनट की प्रवाह दर पर 100% ऑक्सीजन में 3-4% आइसोफ्लारेन के साथ एनेस्थेटिक स्थिति को बनाए रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि संज्ञाहरण की गहराई बनाए रखी जाए।
      नोट: सहायक को सर्जरी के दौरान माउस की सांस लेने की निगरानी करनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि संज्ञाहरण का सही स्तर बनाए रखा गया है। यदि श्वास बहुत धीमी हो जाती है या संज्ञाहरण की गहराई बहुत उथली है तो एनेस्थेटिक एकाग्रता को कम करें। यदि माउस हांफने लगता है, तो नाक शंकु से माउस को हटा दें, संवेदनाहारी एकाग्रता को कम करें, और नाक शंकु पर फिर से रखने से पहले सांस लेने तक प्रतीक्षा करें।
    3. सर्जरी शुरू करने से पहले माउस को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड करने के लिए "चुटकी टेस्ट" और "कॉर्नियल रिफ्लेक्स टेस्ट"14 करें।
      नोट: माउस के किसी भी हिस्से का आंदोलन एक संकेत है कि माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड नहीं है। एनेस्थेटिक एकाग्रता बढ़ाकर जानवर को तुरंत अतिरिक्त एनेस्थेटिक दिया जाना चाहिए।
    4. आंखों के सूखापन से बचने के लिए माउस की आंखों को थोड़ी मात्रा में नेत्र जेल से ढक दें।
  3. सर्जिकल प्रक्रिया (सर्जन)
    1. शराब ी क्लोरहेक्सीडीन के साथ 3 बार सर्जिकल क्षेत्र झाड़ू। संदंश और कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, पृष्ठीय पक्ष के साथ एक 1 सेमी सीधे चीरा बनाने के लिए, ट्यूमर से 3 मिमी दूर(चित्रा 3ए, 3B)।
      नोट: हर माउस में 1 सेमी तक चीरा का मानकीकरण (शासक का उपयोग करके) चूहों के बीच घाव भरने के आकलन के लिए भी अनुमति देता है। ट्यूमर से 3 मिमी दूर चीरा का पता लगाने के घाव से रिसाव के बिना बाद में इंट्राट्यूमोरल एडजुवेंट थेरेपी के लिए अनुमति देता है।
    2. चिमटी का उपयोग करना, ट्यूमर और पेरिटोनम के बीच फेसिया और चमड़े के नीचे फैटी ऊतक को दूर खींचें। चमड़े के नीचे ट्यूमर सामान्य रूप से त्वचा की ओर से जुड़ा हुआ है।
    3. चिमटी का उपयोग कर ट्यूमर असर पक्ष पर धीरे से त्वचा पकड़ द्वारा घाव खोलो, और "उलटा" ट्यूमर इतना है कि यह बाहर दिखाई दे रहा है(चित्रा 3सी, 3 डी)।
      नोट: ट्यूमर के खंड को खोलने के निकटतम होना चाहिए, घाव को बंद करने के लिए पर्याप्त त्वचा होनी चाहिए। ध्यान रहे कि ट्यूमर निकालते समय त्वचा को न काटें।
    4. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, आधे से ट्यूमर कैप्सूल को हटाने के लिए काट, खोलने के निकटतम ट्यूमर के आधार से शुरू ।
    5. 50% डेबुल सर्जरी के लिए, ट्यूमर के बीच में कटौती। घुमावदार संदंश का उपयोग करके, ट्यूमर के खंड को हटाने के लिए स्कूप करें (50%); डिबुलक्ड क्षेत्र से किसी भी अवशेष को स्कूप करें।
    6. 75% डिबुल्क के लिए, ऊपर के भाग 2.3.5 के रूप में 50% ट्यूमर डिबुल करें। फिर ट्यूमर के आधे शेष 50% में कटौती करें और ऊपर वर्णित घुमावदार संदंश का उपयोग करके ट्यूमर के 25% को स्कूप करें।
  4. सर्जिकल साइट को बंद करना
    1. शेष ट्यूमर को त्वचा के नीचे वापस रखें, और संदंश का उपयोग करके, त्वचा को एक साथ खींचें और घाव के साथ त्वचा को लाइन करें।
    2. घाव के किनारे से त्वचा को 5 मिमी एक साथ रखें, और घाव को बंद करने के लिए सर्जिकल क्लिप का उपयोग करें, जो संदंश के निकटतम पक्ष पर शुरू होता है। कोई अंतर्निहित ऊतक उजागर किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए जरूरत के रूप में कई क्लिप लागू होते हैं । आम तौर पर, क्लिप के बीच 2 मिमी अंतराल के साथ तीन से चार क्लिप लागू होते हैं।
      नोट: यदि कोई क्लिप अच्छी तरह से लागू नहीं है, तो इसे क्लिप रिमूवर का उपयोग करके निकालें और नई क्लिप के साथ बदलें।
  5. चूहों की वसूली (सहायक)
    1. चूहों को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) हीटिंग कक्ष में डालकर ठीक होने दें।
    2. माउस के पिंजरे को हीट पैड पर रखें। हीटिंग कक्ष में चूहों की निगरानी करें जब तक कि वे संवेदनाहारी (जाग और चलने) से बरामद न हो जाएं और फिर चूहों को वापस पिंजरे में डाल दें। पिंजरे को एक और 10 मिनट के लिए हीट पैड पर छोड़ दें, जब तक कि चूहे अधिक सक्रिय न हो जाएं।
    3. चूहों को गीला और मुलायम भोजन दें। वसूली के लिए सर्जरी के 1 घंटे बाद चूहों की निगरानी करें और यह सुनिश्चित करें कि क्लिप जगह में रहें। सुनिश्चित करें कि पिंजरे पर आधा है/आधा गर्मी पैड से जानवरों को स्वयं को विनियमित तापमान जबकि उपेक्षित की अनुमति है ।
    4. खुराक चूहों के साथ 0.1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन (गर्दन के स्क्रफ में 100 माइक्रोन चमड़े के साथ), सर्जरी के बाद 6-8 घंटे (दिन के अंत में)। अगले सुबह चूहों की निगरानी करें, और चूहों को फिर से 0.1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन (गर्दन के स्क्रफ में 100 माइक्रोन चमड़े के साथ) खुराक दें। जरूरत के हिसाब से ज्यादा गीला खाना दें।
    5. अगले सात दिनों तक रोजाना चूहों की निगरानी करें। क्लिप रिमूवर का उपयोग करके सात दिनों के बाद क्लिप हटाई जा सकती है।
  6. एडजुवंत या नियोडजुवेंट उपचार
    1. ब्याज के उपचार के आधार पर, किसी भी समय (नव) एडजुवेंट थेरेपी के साथ चूहों पेरि-ऑपरेटिव का इलाज करें।
    2. उदाहरण के लिए, टीका के बाद 15 दिन पर एंटी-सीटीएलए-4 इंट्रापेरिटोनली (आईएपी) की 100 माइक्रोग्राम की एक खुराक के साथ चूहों का इलाज करें, या टीका के बाद दिन में 200 माइक्रोन एंटी-पीडी-1 आईपी की तीन खुराक के साथ।
  7. प्रायोगिक नियंत्रण
    1. सूजन/घाव भरने के प्रभावों का आकलन करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करते समय, निम्नलिखित नियंत्रण समूहों का उपयोग करने पर विचार करें: 1) नो-सर्जरी नियंत्रण (उपचार अभी भी इंट्राट्यूमोरली प्रशासित किया जा सकता है); 2) शाम सर्जरी नियंत्रण: त्वचा में एक शल्य चीरा बनाया जाता है; ट्यूमर में हेरफेर और उजागर किया जाता है, लेकिन कोई ट्यूमर ऊतक नहीं हटाया जाता है; घाव क्लिप के साथ बंद कर दिया है।

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Representative Results

50 मिमी2 के आकार के लिए ट्यूमर विकास आंशिक डेबुल्क के लिए एक आदर्श आकार है। 50 मिमी2 ट्यूमर के अधूरे सर्जिकल रीसेक्शन के परिणामस्वरूप एडजुवेंट इम्यूनोथेरेपी(चित्रा 4ए)की अनुपस्थिति में ट्यूमर का प्रजनन योग्य पुनर्विकास होता है। हमने अगले मॉडल का उपयोग चेकपॉइंट अणुओं साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट एसोसिएटेड प्रोटीन 4 (सीटीएलए-4) और प्रोग्राम्ड डेथ रिसेप्टर 1 (पीडी-1) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके एडजुवेंट इम्यूनोथेरपी का परीक्षण करने के लिए किया। एंटी-सीटीएलए-4 या एंटी-पीडी-1 के साथ चूहों के उपचार के परिणामस्वरूप क्रमशः 80% और 25% (एन = 4-5 प्रति समूह) की इलाज दर(चित्रा 4बी, 4 सी)। एंटी-पीडी-1 के साथ प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया दर को और बेहतर बनाने के लिए उपन्यास संयोजनों का परीक्षण करने का अवसर प्रदान करती है।

Figure 1
चित्रा 1: ट्यूमर के आंशिक सर्जिकल रीसेक्शन का योजनाबद्ध आरेख। (A)BALB/c चूहों को निचले दाहिने पार्श्व पर 5 x 105 WEHI-164 कोशिकाओं के साथ टीका लगाया जाता है । (ख)जब ट्यूमर 50 एमएम2तक पहुंच जाता है तो सर्जरी शुरू हो सकती है। (ग)ट्यूमर आंशिक रूप से पुनः प्राप्त किया जाता है (50% दिखाया गया है)। (घ)सर्जिकल साइट क्लिप के साथ बंद कर दिया है । (ई)एडजुवेंट थेरेपी को घाव क्षेत्र में नसों के साथ, इंट्रापेरिटेली (दिखाया गया) या इंट्राट्यूमोरली प्रशासित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सर्जरी की प्रतिनिधि छवियां स्थापित की गई। (क)सर्जरी की एक पूरी छवि शल्य चिकित्सा उपकरण (चरण 2.1 में सूचीबद्ध) और संवेदनाहारी मशीन दिखा। (ख)सर्जिकल टेबल की एक स्नैपशॉट छवि एक आसान पहुंच के भीतर सभी सामग्रियों को दिखा रही है । (ग)माउस वसूली के लिए एक हीटिंग चैंबर और एक हीटिंग पैड । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आंशिक ट्यूमर debulk तकनीक के प्रतिनिधि चित्र। (क)सर्जरी से पहले आकार में 50 मिमी 2 के ट्यूमर के साथ एक पूरीतरह से एनेस्थेटाइज्ड माउस। (ख)चीरा साइट ट्यूमर से 3 मिमी दूर; 1 सेमी चीरा। (सी-डी) चिमटी का उपयोग कर धीरे से ट्यूमर असर पक्ष पर त्वचा पकड़ द्वारा घाव के उद्घाटन, और "उलटा" ट्यूमर इतना है कि यह बाहर दिखाई दे रहा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अधूरा ट्यूमर रीसेक्शन और इम्यूनोथेरेपी के बाद ट्यूमर पुनर्विकास। (A)एडजुवेंट इम्यूनोथेरेपी के अभाव में आंशिक रूप से पुनः प्राप्त WEHI-164 ट्यूमर के ट्यूमर पुनर्विकास घटता है। (बी-सी) एंटी-सीटीएलए-4(बी)या एंटी-पीडी1(सी)के साथ सर्जरी और एडजुवेंट उपचार के बाद ट्यूमर पुनर्विकास। बिंदीदार रेखा सर्जरी के दिन को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हम पेरी-ऑपरेटिव उपचारों का परीक्षण करने के लिए नरम ऊतक सारकोमा के अधूरे सर्जिकल रिसेक्शन के माउस मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हमने उपचार के बाद चूहों के बीच घाव भरने के आकलन की अनुमति देने के लिए सर्जिकल चीरा को भी मानकीकृत किया है।

ट्यूमर प्लेसमेंट इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। हमने चूहों पर न्यूनतम बोझ के साथ ट्यूमर साइट और स्थानीय उपचारों के प्रशासन तक आसान सर्जिकल पहुंच की अनुमति देने के लिए एक चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल का विकल्प चुना है। यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि ट्यूमर चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में बढ़ते हैं न कि पेरिटोनम के भीतर, जिसके परिणामस्वरूप अप्रत्याशित रुग्णता और मृत्यु हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल के लिए ट्यूमर सेल लाइन चुनते समय, हम सलाह देते हैं कि वीवो में उगाए जाने वाले कोशिकाएं एक ठोस द्रव्यमान (जैसे, WEHI-164 मॉडल) के बजाय एक अर्ध-ठोस द्रव्यमान (जैसे बी 16 मॉडल) बनाती हैं क्योंकि इसे तकनीकी रूप से आंशिक रूप से फिर से काटना मुश्किल होता है। इसके अलावा, यदि ट्यूमर त्वचा के माध्यम से विकसित होना शुरू होता है (आमतौर पर 100 मिमी 2 से बड़े ट्यूमर मेंदेखा जाताहै), तो त्वचा परिगलित हो सकती है और सर्जरी के बाद अच्छी तरह से ठीक नहीं हो सकती है। आकार में 50 मिमी2 तक पहुंचने के बाद हमने ट्यूमर को डीबुलिंग करके इस समस्या को दूर कर दिया है।

के रूप में हमारे मॉडल चिकित्सा पर घाव भरने के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम एक नियंत्रण का प्रस्ताव/ नियंत्रण अनछुए ट्यूमर, या नकली सर्जरी जो केवल त्वचा चीरा, ट्यूमर के जोखिम, और आंशिक ट्यूमर debulk के बिना घाव बंद हो जाएगा हो सकता है । इस नकली नियंत्रण समूह का उपयोग उपचार परिणाम पर आंशिक डिबुल्क से सर्जरी-प्रेरित सूजन और घाव उपचार के प्रभाव को समझते समय किया जा सकता है।

सफल आंशिक डिबुलिंग सर्जरी के लिए, कुछ तकनीकी बिंदुओं पर विचार करने की आवश्यकता है। एक महत्वपूर्ण पहलू ट्यूमर का सही प्रत्यारोपण और विकास है। ट्यूमर को पिछले पैर से दूर निचले-दाएं पार्श्व पर प्रत्यारोपित करने की आवश्यकता है। ट्यूमर है कि भी पिछले पैर के करीब प्रत्यारोपित कर रहे है उनके चलने की क्षमता के साथ हस्तक्षेप कर सकते है और उंहें ढीला आने के कारण क्लिप पर अतिरिक्त बल में परिणाम कर सकते हैं । इसके अलावा, ट्यूमर के आकार में स्थिरता के क्रम में debulking के सापेक्ष प्रतिशत में परिवर्तनशीलता से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । हम ट्यूमर है कि ५० मिमी2का आकार है के साथ सर्जरी करने के लिए चुना है, सर्जरी तकनीकी रूप से सीधा बनाने के लिए, हालांकि हम परिकल्पना है कि छोटे ट्यूमर पर आंशिक resection संभव है । ट्यूमर के आकार में विसंगति को रोकने के लिए, इस्तेमाल किया सेल लाइन के लिए उचित मानक सेल संस्कृति तकनीकों के बाद पारित होने की जरूरत है, और शोधकर्ता को पर्याप्त रूप से उचित ट्यूमर टीका तकनीक में प्रशिक्षित करने की जरूरत है । जब अन्य चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल के लिए इस प्रोटोकॉल का विस्तार, ट्यूमर की शारीरिक विशेषताओं के महत्व के हैं। उदाहरण के लिए, हमने पाया कि कोशिका रेखाएं जो नरम, जिलेटिन ट्यूमर (जैसे, M3-9-M rhabdomyosarcoma, और B16 मेलानोमा15)को जन्म देती हैं, तकनीकी रूप से debulk करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं ।

ऐसे तकनीकी बिंदु भी हैं जिन पर सर्जरी के दौरान विचार करने की जरूरत है। प्रक्रिया के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए चूहों को पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड करने की आवश्यकता है। इसके अलावा कि अपर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड चूहों सहना होगा, प्रक्रिया के दौरान चूहों के किसी भी आंदोलन शल्य चिकित्सा resection मुश्किल बना सकते हैं, चूहों के बीच हटा ट्यूमर के आकार में परिवर्तनशीलता में जिसके परिणामस्वरूप । इसके अलावा, सर्जरी के दौरान माउस श्वसन दर की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए आइसोफलुरेन एकाग्रता को संज्ञाहरण की उचित गहराई बनाए रखने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। इसलिए, सर्जरी के दौरान सांस लेने की दर की निगरानी करने के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान एक सहायक की हमेशा आवश्यकता होती है, और संज्ञाहरण का पर्याप्त स्तर सुनिश्चित करने के लिए। घाव उपचार प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता से बचने के लिए चीरा का आकार लगातार होना चाहिए। हमने पाया कि ट्यूमर डीबुलिंग के लिए 1-1.5 सेमी चीरा पर्याप्त है, जिसमें घाव की कम से कम संभावना है।

आंशिक resection के हमारे मॉडल अवशिष्ट रोग की नकल सर्जरी के बाद शेष के रूप में कई ठोस ट्यूमर के नैदानिक सेटिंग में देखा और खाते में सर्जिकल घाव भरने के प्रभाव को ध्यान में रखते हुए पारंपरिक सिनेजीनिक माउस मॉडल पर लाभ प्रदान करता है । इसके अलावा, सर्जरी के मौजूदा पारंपरिक मॉडलों ने पूर्ण ट्यूमर रीसेक्शन का उपयोग किया है, जिसके परिणामस्वरूप हमेशा ट्यूमर पुनरावृत्ति16नहीं होती है। अन्य शोधकर्ताओं ने इस विधि की मजबूती को रेखांकित करते हुए अन्य कैंसर सेल लाइनों11,12,,13का उपयोग करके आंशिक रीसेक्शन मॉडल का सफलतापूर्वक उपयोग किया है।, इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया है कि आंशिक resection, लेकिन पूरा resection नहीं, सुरक्षात्मक विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा स्मृति में हुई जब adjuvant चिकित्सा12 जो अवशिष्ट ट्यूमर से एंटीजन के हठ के लिए जिंमेदार ठहराया गया था दिया जाता है ।

इस मॉडल को चिकित्सा पर सूजन और घाव भरने के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हमारा डिबुलिंग दृष्टिकोण नैदानिक स्थितियों जैसा दिखता है जहां सर्जरी (R2 resection) के बाद सकल अवशिष्ट रोग पीछे छोड़ दिया जाता है, बजाय सूक्ष्म अवशिष्ट रोग (R1 अवशिष्ट) के साथ स्थूल पूर्ण resection । उदाहरण के लिए, आक्रामक नरम ऊतक सारकोमा में सर्जिकल रिसेक्शन सकारात्मक मार्जिन में परिणाम कर सकते हैं जब ट्यूमर नसों, धमनियों या आसन्न अंगों जैसे महत्वपूर्ण संरचनाओं के बगल में स्थित है, जो17व्यापक मार्जिन के साथ पूर्ण resection को पहले से ही रोकता है। 13सूक्ष्म सकारात्मक मार्जिन के परिणामस्वरूप रिसेक्शन के लिए सर्जरी मॉडल प्रकाशित किए गए हैं । हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग चिकित्सा पर घाव भरने की प्रतिक्रिया के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जब स्थूल अवशिष्ट रोग मौजूद होता है।

हमारे मॉडल की एक सीमा यह है कि यह दूर पतन और माइक्रोमेटास्टेसिस को जन्म नहीं देता है, जो स्तन कैंसर या अग्नाशय के कैंसर जैसे ठोस ट्यूमर में सर्जरी के बाद आम है। अन्य सर्जरी मॉडल, जैसे कि मुरीन स्तन कैंसर मॉडल 4T118,,19,,20 या डी नोवो स्तन कैंसरमेटास्टेसिस21 के मुरीन मॉडल स्थानीय रिसेक्शन के बाद प्रणालीगत पतन की जांच करने के लिए बेहतर अनुकूल हैं। एक और सीमा यह है कि यह प्रोटोकॉल चमड़े के नीचे मॉडल के लिए है और इस प्रकार ऊतक-विशिष्ट विकृति के मूल्यांकन की अनुमति नहीं देता है। इस उद्देश्य के लिए, ऑर्थोटोपिक ट्यूमर माउस मॉडल उपयुक्त7,22,,23हैं।, हालांकि, ऑर्थोटोपिक मॉडल अधिक चुनौतीपूर्ण होते हैं और आमतौर पर चूहों के लिए अधिक इम्पोस्ट शामिल होते हैं, और अधिक श्रमसाध्य और महंगे22होते हैं। चमड़े के नीचे मॉडल अच्छी तरह से (नव)adjuvant चिकित्सा के प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुकूल हैं, या तो व्यवस्थित या स्थानीय रूप से, स्थानीय कैंसर पतन पर, एक लागत प्रभावी और अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट तरीके से जानवरों के लिए ंयूनतम चौकी के साथ ।

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित अपूर्ण आंशिक रिसेक्शन एक कारक के रूप में सर्जिकल घाव उपचार को शामिल करते हुए एडजुवेंट उपचारों के परीक्षण के लिए उपयोगी है, एक चर जिसे अक्सर अनदेखा किया जाता है।

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Disclosures

कोई खुलासा नहीं।

Acknowledgments

यह काम सारकोमा के लिए सॉक से अनुदान द्वारा समर्थित है! फाउंडेशन, ऑस्ट्रेलियन और न्यूजीलैंड सारकोमा एसोसिएशन, चिल्ड्रन ल्यूकेमिया एंड कैंसर रिसर्च फाउंडेशन और परपेचुअल परोपकार। W.J.L एक साइमन ली फैलोशिप और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद से एक अनुसंधान फैलोशिप, और कैंसर परिषद WA द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 gauge 0.5 mL insulin syringe Becton Dickinson, Australia 326769 None
2-Mercaptoethanol Life Technologies Australia Pty Ltd 21985023 None
Anaestetic gas machine Darvall Vet, Australia SKU: 2848 None
Anti-CTLA-4 BioXcell, USA BE0164 None
Anti-PD-1 BioXcell, USA BP0273 None
Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL RB healthcare UK Limited, UK 55175 Prescription order
Chlorhexidine Surgical Scrub 4% Perigo Australia, Australia CHL01449F(scrub None
Fetal Bovine serum CellSera, Australia AU-FBS-PG None
Forceps Fine 10.5 cm Surgical house, Western Australia CC74110 None
Forceps Fine 12 cm Serrated Surgical house, Western Australia CC74212 None
Forceps Halsted 14 cm Surgical house, Western Australia CD01114 None
Heating chamber Datesand Ltd, UK Mini-Thermacage None
HEPES (1M) Life Technologies Australia Pty Ltd 15630080 None
Isoflurane Henry Schein Animal Health, Australia SKU: 29405 Prescription order
Lubricating Eye Ointment Alcon n/a None
Penicillin/streptomycin 1000X Life Technologies Australia Pty Ltd 15140122 None
Phosphate Buffered Solution 10x Life Technologies Australia Pty Ltd 70013-032 None
Reflex 7mm Clips Able scientific, Australia AS59038 None
Reflex 7mm Wound Clip Applicator Able scientific, Australia AS59036 None
Reflex Wound Clip Remover Able scientific, Australia AS59037 None
Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit Darvall Vet, Australia #7885 None
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine Life Technologies Australia Pty Ltd 21870092 None
Scissors Iris STR 11 cm Surgical house, Western Australia KF3211 None
Scissors Iris STR 9 cm Surgical house, Western Australia JH4209 None
Small Induction Chamber Darvall Vet, Australia SKU: 9630 None
TrypLE express 1x Life Technologies Australia Pty Ltd 12604-021 None
Germinator 500 Glass Bead Sterilizer Cellpoint Scientific Inc., USA 5-1460-DK

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References

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परीक्षण के लिए अधूरा पुनः प्राप्त सॉफ्ट टिशू सारकोमा का एक माउस मॉडल (नियो) एडजुवेंट थेरेपी
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Rwandamuriye, F. X., Weston, B. J.,… More

Rwandamuriye, F. X., Weston, B. J., Johns, T. G., Lesterhuis, W. J., Zemek, R. M. A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies. J. Vis. Exp. (161), e60882, doi:10.3791/60882 (2020).

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