Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En mus modell av ofullständigt resected mjukvävnad Sarkom för testning (Neo) adjuvant terapier

Published: July 28, 2020 doi: 10.3791/60882

Summary

I detta protokoll beskriver vi en mus modell av ofullständiga kirurgiska samband av mjukdelar sarkom för testning (neo) adjuvant terapier.

Abstract

Kirurgi är ofta den första behandlingen för många fasta tumörer. Lokala återfall förekommer dock ofta efter primära tumör samband, trots adjuvant eller neo-adjuvant terapier. Detta inträffar när kirurgiska marginaler är otillräckligt tumörfria, vilket resulterar i kvarvarande cancerceller. Ur ett biologiskt och immunologiskt perspektiv är kirurgi inte en null-händelse; sårläkningsmiljön är känd för att inducera både pro- och anti-tumorigenic vägar. Som en följd av detta bör prekliniska modeller för läkemedelsutveckling som syftar till att förebygga lokala återfall innehålla kirurgiska samband vid testning av nya (neo)adjuvant terapier, att modellera de kliniska inställningarna hos patienter som behandlas med kirurgi.

Här beskriver vi en mus modell av ofullständiga kirurgiska samband av WEHI 164 mjukdelar sarkom som gör det möjligt att testa (neo) adjuvant terapier i inställningen av en sårläkning svar. I denna modell, 50% eller 75% av tumören avlägsnas, lämnar efter sig vissa cancervävnad in situ att modellera brutto kvarvarande sjukdom efter operation i den kliniska inställningen. Denna modell gör det möjligt att testa terapier i samband med kirurgi samtidigt som man överväger sårläkning svar, vilket kan påverka effekten av (neo) adjuvans behandlingar. Ofullständiga kirurgiska samband resulterar i reproducerbar återväxt av tumör i alla möss i avsaknad av adjuvant terapi. Adjuvant behandling med checkpoint blockad resulterar i minskad tumör återväxt. Denna modell är därför lämplig för att testa terapier i samband med debulking kirurgi och dess tillhörande sårläkning svar och kan utvidgas till andra typer av fast cancer.

Introduction

Kirurgi är fortfarande det viktigaste behandlingsalternativet för många solida tumörer1, inklusive mjukdelar sarkom2,3. Trots förbättringar i cancerkirurgi tekniker, och kombinationer med (neo)adjuvant terapier, det finns fortfarande en hög risk för cancer återfall och metastasering efter primära tumör samband4,5. I mjukdelar sarkom, återfall förekommer särskilt locoregionally, på platsen för kirurgi, vilket resulterar i ökad sjuklighet och dödlighet. I den kliniska inställningen kan det vara svårt att få tillräckligt stora marginaler (t.ex. på grund av anatomiska begränsningar), vilket resulterar i ofullständig samband och efterföljande tumör återkommer6. Kirurgisk stress och den efterföljande processen för sårläkning är kända för att skapa en immunsuppressiv tumör mikromiljö gynnsam för tumör återkommande7,8. Därför bör upptäckten och utvecklingen av nya terapier för mjukvävnad sarkom, särskilt immunterapier, helst ta hänsyn till kirurgiska sårläkning svar.

De flesta prekliniska studier för adjuvans terapier utförs ursprungligen med hjälp av subkutan syngeneic eller xenotransplant mus modeller, utan att införliva kirurgisk stress och sårläkning svar9,10. Därför utvecklade vi en syngeneic subkutan mus mjukvävnad sarkom modell som innehåller ofullständiga kirurgiska samband. WEHI 164 fibrosarkom celler är inokulerade subkutant, och när tumörer är etablerade, tar vi bort 50-75% av tumör bulk (Figur 1A-E). Tumörer ständigt åter växa från den återstående tumören. Denna modell möjliggör testning adjuvans terapier samtidigt som man överväger effekten av kirurgisk stress och sårläkning. Liknande kirurgiska modeller av ofullständig samband har använts i ett antal studier av flera grupper och befunnits vara reproducerbara och effektiva11,12,13. Här ger vi en detaljerad beskrivning av detta protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djur som används i dessa experiment erhölls från Animal Resource Centre (Perth, Western Australia). Djur bibehölls under standard patogen-fria förhållanden vid Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Western Australia). Alla experiment utfördes efter protokollet som godkänts av Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee. BALB/c möss på 8-12 veckor användes i dessa experiment. Den WEHI 164 fibrosarcoma cellinje erhölls från CellBank Australien (Westmead, NSW).

1. Inokulering av celler

  1. Beredning av celler och djur
    1. Se till att cellinjen underhålls i det rekommenderade mediet. Till exempel, upprätthålla WEHI 164 cellinje i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium kompletteras med 2 mM L-glutamin, 10% fetala nötkreatur serum, 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/mL penicillin, och 100 μg/mL sptotremycin.
      OBS: Passageceller minst 3 och upp till 5 gånger efter att ha avlägsnats från kryogen förvaring. För att säkerställa en optimal cellbilabilitet bör cellerna delas upp när de är mellan 70-80% konfluent. Tumör cellinjer bör testas för mykoplasma, eftersom infektion kan förändra celltillväxt och påverka immunsvaret in vivo.
    2. En dag före inokulering, raka möss på den nedre högra flanken med hjälp av clippers.
      OBS: Hona BALB/c möss, i åldern 8-12 veckor, med normal vikt (16 -22 gram) användes i detta experiment.
    3. På dagen för inokulering, skörda WEHI 164 celler när 70-80% konfluent genom trypsinization.
      1. Sug upp odlingsmediet från vävnadsodlingsflaskorna och tillsätt sedan steril fosfatbuffrad lösning (1x PBS), för att avlägsna återstående spår av fetala bovinserum (FBS).
      2. Aspirera PBS från vävnadsodlingsflaskorna. Tillsätt 3 ml 0,05 % trypsin (för en T75-kolv) och snurra sedan kolven så att hela kolvens yta med celler täcks av trypsin.
      3. Inkubera kolven vid 37 °C,2 5% CO 2-inkubator i 3 min. Kontrollera cellerna regelbundet genom att knacka på kolvens sidor för att se om cellerna har lossnat.
      4. Ta bort kolvar från cellodlingskuvösen och tillsätt 5 ml media kompletterat med FBS för att neutralisera trypsin.
        OBS: Lämna inte cellerna i trypsin längre än nödvändigt, eftersom detta kan skada cellerna och leda till låg cellens livskraft.
      5. Pipet suspension flera gånger för att få en enda cell suspension. Överför cellfjädringen till ett koniskt centrifugrör.
      6. Pelletceller genom att snurra i 350 x g i 3 min.
    4. Tvätta cellerna tre gånger i 1x PBS.
      1. Resuspend celler i 50 ml sterila 1x PBS och tvätta celler genom pipettering cell suspension upp och ner. Pelletceller genom att snurra i 350 x g i 3 min.
      2. Sug upp supernatant- och återsuspendcellerna i 15 ml steril 1x PBS. Tvätta cellerna genom pipettering cell suspension upp och ner. Pelletceller genom att snurra i 350 x g i 3 min.
      3. Aspirera supernatant och resuspend celler i exakt 10 ml sterila 1x PBS. Tvätta cellerna som i steg 1.1.4.2 och överför en liten mängd (ca 100 μL) av cellfjädringen till ett centrifugrör för räkning. Pelletceller genom att snurra i 350 x g i 3 min.
    5. Bestäm cellnumret med hjälp av trypanblå uteslutningsmetod genom att antingen använda en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare. Resuspend celler i steril 1x PBS vid en koncentration av 5 x 106 celler/ml. Håll cellfjädringen på is.
      OBS: Tumörcellernas livskraft bör vara lika med eller över 80 % för att säkerställa reproducerbar tumörtillväxt.
  2. Subkutan inokulering
    1. Blanda cellfjädringen noggrant och fyll en spruta med en 26 G nål med 100 μl cellfjädring (5 x 105 celler) i steril 1x PBS. Upprepa blandning av celler innan du laddar nästa spruta.
      OBS: Håll cellerna på is under hela proceduren för att bibehålla lönsamheten.
    2. Håll fast musen på rätt sätt, vilket säkerställer åtkomst till den nedre högra flanken. Inokulera musen subkutant på den rakade nedre högra flanken.
      OBS: Se till att inympningen inte finns i bukhinnan genom att lyfta nålen något, vilket bör vara synligt under huden. En bubbla-liknande klump bör bildas under huden efter inokulering.
    3. Övervaka möss som krävs enligt tillämpligt etiskt godkännande och utför kirurgisk samband när tumörerna har vuxit till en storlek av ca 50 mm2.

2. Partiell kirurgisk resektion av tumören

OBS: Detta protokoll kräver två forskare; en för kirurgiska ingrepp (SURGEON) och en annan för musövervakning (ASSISTANT).

  1. Kirurgi setup
    1. Dag 12 post inokulering, när tumörer har nått en storlek på cirka 50 mm2, dos möss med 100 μL (0,1 mg/kg) av buprenorfin s.c. i scruff i halsen, 30 minuter före operationen.
    2. Ställ in operationsområdet med en värmedyna täckt med bänkkappa och sätt upp en noskon för anestesi. Sterilisera kirurgiska verktyg före användning, och mellan varje djur med hjälp av en värme pärla autoklav, vilket gör att verktyg för att svalna före användning. Ha följande kirurgiska utrustning ren och inom räckhåll: klorhexidin, kompress, gasväv, ögongel, två böjda pincett, sax, klämma applikator, klipp remover, klipppåfyllningar (Figur 2A, 2B).
    3. Värm värmekammaren till 37 °C och sätt upp en annan värmedyna för återhämtning (figur 2C). Placera steriliserade verktyg på en steril yta som autoklaverade kuddar.
  2. Anestesi
    1. Placera musen i induktionskammaren och söva musen med 4% isofluran (4% i 100% syre med en flödeshastighet på 1 L/min) tills andningshastigheten saktar till cirka 60 andetag per minut (1 per sekund) (detta tar vanligtvis <1 min).
      OBS: Lämna inte musen i kammaren för länge eftersom det kan leda till kvävning och död. Ha bara en mus under narkos åt gången.
    2. Överför musen till värmemattan på operationsbordet, placera musen med näsan i noskonen och upprätthålla bedövningstillståndet med 3-4% isofluran i 100% syre med en flödeshastighet på 0,5 L/min. Kontrollera andningsfrekvensen för att säkerställa att djupet av anestesi bibehålls.
      OBS: ASSISTENTen måste övervaka andningen av musen under hela operationen för att säkerställa att rätt anestesinivå bibehålls. Sänk bedövningskoncentrationen om andningen blir för långsam eller öka koncentrationen om anestesidjupet är för grunt. Om musen börjar flämta, ta bort musen från noskonen, minska bedövningskoncentrationen och vänta tills andningen normaliseras innan du placerar på noskonen igen.
    3. Utför en "nypa test" och "hornhinnans reflex test"14 för att säkerställa att musen är helt sövd innan du påbörjar operation.
      OBS: Förflyttning av någon del av musen är en indikation på att musen inte är helt sövd. Djuret bör omedelbart ges ytterligare bedövningsmedel genom att öka bedövningskoncentrationen.
    4. Täck musens ögon med en liten mängd oftalmisk gel för att undvika ögontorrhet.
  3. Kirurgiskt ingrepp (KIRURG)
    1. Svabb operationsområdet 3 gånger med alkoholhaltig klorhexidin. Använd pincett och en sax, gör ett 1 cm rakt snitt längs ryggsidan, 3 mm från tumören (figur 3A, 3B).
      OBS: Standardisering snittet till 1 cm i varje mus (med hjälp av en linjal) möjliggör en jämn bedömning av sårläkning mellan möss. Lokalisera snittet 3 mm bort från tumören möjliggör efterföljande intratumoral adjuvant terapi utan läckage från såret.
    2. Använd pincett, dra bort facia och subkutan fettvävnad mellan tumör och bukhinnan. Den subkutana tumören är normalt fäst vid hudsidan.
    3. Öppna såret genom att försiktigt hålla huden på tumörbärande sidan med hjälp av pincett, och "invertera" tumören så att den syns utanför (figur 3C, 3D).
      OBS: Den del av tumör som skall avbukta bör vara närmast öppningen, att ha tillräckligt med hud för att stänga såret. Var noga med att inte skära huden när du tar bort tumören.
    4. Med hjälp av en sax, skär bort tumörkapseln från hälften för att ta bort, från basen av tumören närmast öppningen.
    5. För 50% debulk kirurgi, skär över mitten av tumören. Med hjälp av böjda pincett, skopa upp den del av tumören som ska tas bort (50%); skopa upp eventuella rester från det debulked området.
    6. För 75% debulk, utför en 50% tumör debulk som i del 2.3.5 ovan. Skär sedan i hälften av de återstående 50% av tumör och skopa upp 25% av tumören, med hjälp av böjda pincett som beskrivs ovan.
  4. Stänga operationsområdet
    1. Placera den återstående tumören tillbaka under huden, och med hjälp av pincett, dra huden klaffar tillsammans och rada upp huden längs såret.
    2. Håll ihop huden 5 mm från sårets kant och använd kirurgiska klämmor för att stänga såret, med början på den sida som ligger närmast pincetten. Applicera så många klipp som behövs för att säkerställa att ingen underliggande vävnad exponeras. I allmänhet används tre till fyra klipp med 2 mm mellanrum mellan klämmorna.
      Om några klipp inte är väl tillämpade tar du bort den med en klippborttagningsapparat och ersätter med nya klipp.
  5. Återvinning av möss (ASSISTENT)
    1. Låt mössen återhämta sig genom att sätta dem i den varma (37 °C) värmekammaren.
    2. Placera musens bur på värmeplattan. Övervaka mössen i värmekammaren tills de har återhämtat sig från bedövningen (vaken och gående) och sätt sedan tillbaka mössen i buren. Låt buren på värmeplattan i ytterligare 10 minuter, tills mössen har blivit mer aktiva.
    3. Ge mössen våt och mjuk mat. Övervaka mössen 1 timme efter operationen för återhämtning och se till att klämmorna finns kvar. Se till att buren är halv på/halva av värmedynan så att djuren kan självreglera temperaturen utan uppsikt.
    4. Dosmöss med 0,1 mg/kg buprenorfin (100 μL subkutant i halsen), 6-8 timmar efter operationen (i slutet av dagen). Övervaka möss tidigt följande morgon och dosmöss igen med 0,1 mg/kg buprenorfin (100 μL subkutant i halsen). Ge mer våt mat efter behov.
    5. Övervaka möss dagligen under de kommande sju dagarna. Klipp kan tas bort efter sju dagar med hjälp av klippborttagningsapparaten.
  6. Adjuvant eller neoadjuvant behandling
    1. Behandla möss perioperativt med (neo)adjuvant terapi vid varje given tidpunkt, beroende på behandling av intresse.
    2. Behandla till exempel möss med en dos på 100 μg anti-CTLA-4 intraperitonealt (i.p.) dag 15 efter inokulering, eller med tre doser på 200 μg anti-PD-1 i.p. dag 15, 17 och 19 efter inokulering.
  7. Experimentella kontroller
    1. När du använder denna modell för att bedöma effekterna av inflammation/sårläkning, överväg att använda följande kontrollgrupper: 1) Ingen kirurgi kontroll (behandlingar kan fortfarande administreras intratumorally); 2) Sham kirurgi kontroll: Ett kirurgiskt snitt görs i huden; tumören manipuleras och exponeras, men ingen tumörvävnad avlägsnas; såret stängs med klämmor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tumörtillväxt till en storlek på 50 mm2 är en idealisk storlek för partiell debulk. Ofullständiga kirurgiska samband av 50 mm2 tumörer resulterar i 100% (n = 5) reproducerbar återväxt av tumörer i avsaknad av adjuvant immunterapi (Figur 4A). Vi använde därefter modellen för att testa adjuvans immunterapier med antikroppar mot checkpoint molekyler Cytotoxiska T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4) och Programmerad Death Receptor 1 (PD-1). Behandling av möss med anti-CTLA-4 eller anti-PD-1 resulterade i en härdningsfrekvens på 80% respektive 25 % (n=4-5 per grupp) (figur 4B, 4C). Svaret med anti-PD-1 ger en möjlighet att testa nya kombinationer för att förbättra svarsfrekvensen ytterligare.

Figure 1
Figur 1: Schematiska diagram av partiell kirurgiska samband av tumör. (A)BALB/c möss inokuleras med 5 x 105 WEHI-164 celler på den nedre högra flanken. (B) När tumören når 50 mm2kan operationen påbörjas. (C) Tumören är delvis resected (50% visas). (D)Operationsområdet är stängt med klämmor. (E)Adjuvant behandling kan administreras, intravenöst, intraperitoneally (visas) eller intratumorally i sårområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa bilder av den operation som inrättats. (A)En hel bild av den operation som inrättats som visar de kirurgiska verktygen (som anges i steg 2.1) och bedövningsmaskinen. (B)En ögonblicksbild bild av operationsbordet som visar alla material inom räckhåll. (C)En värmekammare och en värmedyna för musåtervinning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa bilder av partiell tumör debulk teknik. (A) En helt sövd mus med en tumör på 50 mm2 i storlek före operation. (B)Snittplats 3 mm bort från tumören; 1 cm snitt. (C-D) Öppning av såret genom att försiktigt hålla huden på tumörbärande sidan med hjälp av pincett, och "invertera" tumören så att den är synlig utanför. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Tumör återväxt efter ofullständiga tumör samband och immunterapi. (A) Tumör återväxt kurvor av delvis resected WEHI-164 tumörer i avsaknad av adjuvant immunterapi. (B-C) Tumöråterväxt efter operation och adjuvansbehandling med anti-CTLA-4 (B) eller anti-PD1 (C). Den streckade linjen anger operationsdagen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi tillhandahåller ett protokoll för en mus modell av ofullständiga kirurgiska samband av mjukvävnad sarkom att testa peri-operativa terapier. Vi standardiserade också det kirurgiska snittet för att möjliggöra bedömning av sårläkning mellan möss efter behandling.

Tumör placering är en viktig del av detta protokoll. Vi har valt en subkutan tumör modell för att möjliggöra enkel kirurgisk tillgång till tumör platsen och administrering av lokala terapier med minimal börda på möss. Det är också viktigt att se till att tumörerna växer i det subkutana utrymmet och inte inom bukhinnan, vilket kan resultera i oväntad sjuklighet och dödlighet.

När du väljer en tumör cellinje för detta protokoll, rekommenderar vi att cellerna när odlas in vivo bildar en fast massa (t.ex. WEHI-164 modell), snarare än en halvfast massa (såsom B16-modellen) eftersom det är tekniskt svårt att delvis resect. Dessutom, om tumören börjar växa genom huden (vanligtvis ses i tumörer större än 100 mm2), rekommenderas inte debulking eftersom huden kan bli nekrotisk och inte läka långt efter operationen. Vi har övervunnit detta problem genom att debulking tumörer när de når 50 mm2 i storlek.

Eftersom vår modell kan användas för att bedöma effekten av sårläkning på terapi, föreslår vi en kontroll / bluff grupp som en jämförelse. Kontrollen kan vara oförändrad tumör, eller skenkirurgi som bara skulle ha huden snitt, exponering av tumör, och sår stängning utan partiell tumör debulk. Denna bluff kontrollgrupp kan användas när urskilja effekten av kirurgi-inducerad inflammation och sårläkning från partiell debulk på behandling resultatet.

För framgångsrik partiell debulking kirurgi, vissa tekniska punkter måste beaktas. En viktig aspekt är korrekt implantation och tillväxt av tumören. Tumörer måste implanteras på den nedre högra flanken, bort från bakbenet. Tumörer som implanteras för nära bakbenet kan störa deras förmåga att gå och kan resultera i extra kraft på klippen orsakar dem att lossna. Dessutom är konsekvens i tumörstorlek avgörande för att undvika variationer i den relativa andelen av debulking. Vi valde att utföra kirurgi med tumörer som har en storlek på 50 mm2, att göra kirurgi tekniskt enkelt, även om vi räknar med att partiell samband på mindre tumörer är genomförbart. För att förhindra inkonsekvens i tumörstorlek måste den använda cellinjen passages enligt lämpliga standardcellodlingstekniker, och forskaren måste tränas tillräckligt i rätt tumörinokuulationsteknik. När utvidga detta protokoll till andra subkutan tumör modeller, de fysiska egenskaperna hos tumören är av betydelse. Till exempel fann vi att cellinjer som ger upphov till mjuka, gelatinösa tumörer (t.ex., M3-9-M rhabdomyosarcoma och B16 melanom15) är tekniskt utmanande att debulk.

Det finns också tekniska punkter som måste beaktas under operationen. Möss måste sövas tillräckligt för att förhindra rörelse under proceduren. Bortsett från bedragaren som otillräckligt sövda möss kommer att uthärda, kan varje rörelse av möss under förfarandet göra den kirurgiska samband svårt, vilket resulterar i variationer i storleken på tumör bort mellan möss. Dessutom bör mus andningsfrekvens övervakas noggrant under operation Isoflurankoncentration bör justeras för att upprätthålla lämpligt djup av anestesi. Därför behövs alltid en assistent under det kirurgiska ingreppet för att övervaka andningsfrekvensen under operationen, och för att säkerställa en tillräcklig nivå av anestesi. Storleken på snittet måste vara konsekvent för att undvika variationer i sårläkning svar. Vi fann att en 1-1,5 cm snitt är tillräcklig för tumör debulking, med en minimal chans att sår dehiscence.

Vår modell av partiell samband härmar resterande sjukdom kvar efter kirurgi som ses i den kliniska inställningen av många solida tumörer och erbjuder fördelar jämfört med traditionella syngeneic mus modeller genom att ta hänsyn till effekten av kirurgiska sårläkning. Dessutom har befintliga traditionella modeller av kirurgi använt komplett tumör samband, vilket inte alltid resulterar i tumör återkommande16. Andra forskare har framgångsrikt använt partiell samband modeller med hjälp av andra cancer cellinjer11,12,13, understryker robustheten i denna metod. Dessutom har det visats att partiell samband, men inte fullständig samband, resulterade i skyddande anti-tumör immun minne när adjuvant terapi ges12 som tillskrevs ihållande antigener från resterande tumör.

Denna modell är utformad för att studera effekten av inflammation och sårläkning på terapi. Vår debulking strategi liknar kliniskt kliniska situationer där brutto resterande sjukdom är kvar efter kirurgi (R2 samband), snarare än makroskopiskt komplett samband med mikroskopiska kvarvarande sjukdom (R1 samband). Till exempel, kirurgiska samband i invasiv mjukdelar sarkom kan resultera i positiva marginaler när tumören ligger bredvid kritiska strukturer såsom nerver, artärer eller intilliggande organ, utesluter fullständig samband med breda marginaler17. Kirurgi modeller för resektion som resulterar i mikroskopiska positiva marginaler har publicerats13; vårt protokoll kan användas för att studera effekten av sårläkning svar på terapi när makroskopiska kvarvarande sjukdom är närvarande.

En begränsning av vår modell är att det inte ger upphov till avlägsna återfall och mikrometer, vilket är vanligt efter operation i fasta tumörer såsom bröstcancer eller cancer i bukspottskörteln. Andra kirurgi modeller, såsom murine bröstcancer modell 4T118,19,20 eller murine modeller av de novobröstcancer metastasering21 är bättre lämpade att undersöka systemisk återfall efter lokala samband. En annan begränsning är att detta protokoll är för subkutana modeller och därmed inte tillåter bedömning av vävnadsspecifik patologi. För detta ändamål, orthotopic tumör mus modeller är lämpliga7,22,23. Men orthotopic modeller är mer utmanande och vanligtvis innebär större bedragare till möss, och är mer mödosamma och kostsamma22. Subkutana modeller är väl lämpade att bedöma effekterna av (neo-) adjuvans terapier, antingen systemiskt eller lokalt, på lokala cancer återfall, på ett kostnadseffektivt och relativt hög genomströmning sätt med minimal bedragare till djuren.

Ofullständiga partiell samband som beskrivs i detta protokoll är användbart för att testa adjuvant terapier samtidigt införliva kirurgiska sårläkning som en faktor, en variabel som ofta förbises.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga avslöjanden.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från Sock det till Sarkom! Foundation, Australian and New Zealand Sarcoma Association, Children's Leukemia & Cancer Research Foundation och Perpetual Philanthropy. W.J.L stöds av en Simon Lee Fellowship och en forskningsstipendium från National Health and Medical Research Council, och Cancer Council WA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 gauge 0.5 mL insulin syringe Becton Dickinson, Australia 326769 None
2-Mercaptoethanol Life Technologies Australia Pty Ltd 21985023 None
Anaestetic gas machine Darvall Vet, Australia SKU: 2848 None
Anti-CTLA-4 BioXcell, USA BE0164 None
Anti-PD-1 BioXcell, USA BP0273 None
Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL RB healthcare UK Limited, UK 55175 Prescription order
Chlorhexidine Surgical Scrub 4% Perigo Australia, Australia CHL01449F(scrub None
Fetal Bovine serum CellSera, Australia AU-FBS-PG None
Forceps Fine 10.5 cm Surgical house, Western Australia CC74110 None
Forceps Fine 12 cm Serrated Surgical house, Western Australia CC74212 None
Forceps Halsted 14 cm Surgical house, Western Australia CD01114 None
Heating chamber Datesand Ltd, UK Mini-Thermacage None
HEPES (1M) Life Technologies Australia Pty Ltd 15630080 None
Isoflurane Henry Schein Animal Health, Australia SKU: 29405 Prescription order
Lubricating Eye Ointment Alcon n/a None
Penicillin/streptomycin 1000X Life Technologies Australia Pty Ltd 15140122 None
Phosphate Buffered Solution 10x Life Technologies Australia Pty Ltd 70013-032 None
Reflex 7mm Clips Able scientific, Australia AS59038 None
Reflex 7mm Wound Clip Applicator Able scientific, Australia AS59036 None
Reflex Wound Clip Remover Able scientific, Australia AS59037 None
Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit Darvall Vet, Australia #7885 None
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine Life Technologies Australia Pty Ltd 21870092 None
Scissors Iris STR 11 cm Surgical house, Western Australia KF3211 None
Scissors Iris STR 9 cm Surgical house, Western Australia JH4209 None
Small Induction Chamber Darvall Vet, Australia SKU: 9630 None
TrypLE express 1x Life Technologies Australia Pty Ltd 12604-021 None
Germinator 500 Glass Bead Sterilizer Cellpoint Scientific Inc., USA 5-1460-DK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).
  2. Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).
  3. Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma. Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).
  4. Smith, H. G., et al. Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma. British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).
  5. Uramoto, H., Tanaka, F. Recurrence after surgery in patients with NSCLC. Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).
  6. Stojadinovic, A., et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).
  7. Krall, J. A., et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).
  8. Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86 (2018).
  9. Predina, J. D., et al. Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment. American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).
  10. Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
  11. Khong, A., et al. The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40. BMC Cancer. 14, 969 (2014).
  12. Broomfield, S., et al. Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy. Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).
  13. Predina, J. D., et al. A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation. Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).
  14. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  15. Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).
  16. Predina, J., et al. Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).
  17. Endo, M., Lin, P. P. Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma. Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37 (2018).
  18. Liu, J., et al. Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease. Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).
  19. Park, C. G., et al. Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases. Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).
  20. Tai, L. H., et al. A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies. Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).
  21. Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  22. Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
  23. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).

Tags

Medicin mjukdelar sarkom perioperativ kirurgisk samband mus modell debulking kirurgi
En mus modell av ofullständigt resected mjukvävnad Sarkom för testning (Neo) adjuvant terapier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rwandamuriye, F. X., Weston, B. J.,More

Rwandamuriye, F. X., Weston, B. J., Johns, T. G., Lesterhuis, W. J., Zemek, R. M. A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies. J. Vis. Exp. (161), e60882, doi:10.3791/60882 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter