Summary
Bu protokolde, yumuşak doku sarkomunun (neo) adjuvan tedavileri test etmek için tamamlanmamış cerrahi rezeksiyonunun fare modelini tanımladık.
Abstract
Cerrahi genellikle birçok katı tümörler için ilk tedavi yöntemidir. Ancak adjuvan veya neo-adjuvan tedavilere rağmen primer tümör rezeksiyonu sonrasında lokal nüksler sıklıkla ortaya çıkar. Bu cerrahi marjları yetersiz tümöriçermeyen oluşur, artık kanser hücreleri ile sonuçlanan. Biyolojik ve immünolojik açıdan bakıldığında, cerrahi boş bir olay değildir; yara iyileştirici ortamın hem pro- hem de anti-tümörijenik yolları indüklemesi bilinmektedir. Sonuç olarak, lokal nüksetmeyi önlemeye yönelik ilaç gelişimi için preklinik modeller, cerrahi ile tedavi edilen hastalarda klinik ayarları modellemek için yeni (neo) adjuvan tedavileri test ederken cerrahi rezeksiyonu da içine almalıdır.
Burada, bir yara iyileşmesi yanıtı ayarında (neo)adjuvan tedavilerin test edilmesine olanak sağlayan WEHI 164 yumuşak doku sarkomu eksik cerrahi rezeksiyon bir fare modeli açıklayın. Bu modelde, tümörün%50 veya %75'i çıkarılır, klinik ortamda ameliyat sonrası brüt kalıntı hastalığı nı modellemek için bazı kanser dokusu nu yerinde bırakır. Bu model aynı zamanda yara iyileşme yanıtı göz önünde bulundurularak cerrahi bağlamında test tedavileri sağlar, hangi etkinliğini etkileyebilir (neo)adjuvan tedaviler. Eksik cerrahi rezeksiyon, adjuvan tedavi nin yokluğunda tüm farelerde tümörün tekrarlanabilir şekilde yeniden büyümesi ile sonuçlanır. Kontrol noktası ablukası ile adjuvan tedavi tümör regrowth azaltılmış sonuçlanır. Bu model böylece debulking cerrahi ve ilişkili yara iyileşme yanıtı bağlamında terapiler test etmek için uygundur ve katı kanser diğer türleri için uzatılabilir.
Introduction
Cerrahi birçok katı tümörler için ana tedavi seçeneği olmaya devam etmektedir1, yumuşak doku sarkomu dahil2,3. Kanser cerrahisi teknikleri gelişmelere rağmen, ve kombinasyonları ile (neo)adjuvan tedaviler, hala kanser nüks ve metastaz primer tümör rezeksiyonu aşağıdaki yüksek bir risk var4,5. Yumuşak doku sarkomunda, nüksler özellikle lokoregionally, cerrahi yerinde meydana gelir ve morbidite ve mortalite artar. Klinik ortamda, yeterince geniş marjları elde etmek zor olabilir (örneğin, anatomik kısıtlamalar nedeniyle), eksik rezeksiyon ve sonraki tümör nüks neden6. Cerrahi stres ve yara iyileşme sonraki süreci tümör nüks için uygun bir immünsupresif tümör mikroenvironment oluşturmak için bilinmektedir7,8. Bu nedenle, yumuşak doku sarkomu için yeni tedavilerin keşfi ve geliştirilmesi, özellikle immünoterapiler, ideal olarak cerrahi yara iyileşme yanıtı dikkate almalıdır.
Adjuvan tedaviler için en preklinik çalışmalar başlangıçta cerrahi stres ve yara iyileşme yanıtı dahil olmadan, subkutan singenik veya ksenotransplante fare modelleri kullanılarak yapılır9,10. Bu nedenle, eksik cerrahi rezeksiyon içeren bir sinjenik deri altı fare yumuşak doku sarkom modeli geliştirdik. WEHI 164 fibrosarkom hücreleri subkutan olarak aşılanır ve tümörler oluşturulduktan sonra tümör kütlesinin %50-75'ini çıkarıyoruz(Şekil 1A-E). Tümörler sürekli olarak kalan tümörden yeniden büyürler. Bu model cerrahi stres ve yara iyileşmesi nin etkisini göz önünde bulundurarak adjuvan tedavilerin test edilmesine olanak sağlar. Eksik rezeksiyon benzer cerrahi modeller çeşitli gruplar tarafından çalışmalarda bir dizi kullanılan ve tekrarlanabilir ve etkili olduğu bulunmuştur11,12,13. Burada, bu protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneylerde kullanılan hayvanlar Hayvan Kaynakları Merkezi'nden (Perth, Batı Avustralya) elde edilmiştir. Hayvanlar, Harry Perkins Tıbbi Araştırma Biyokaynakları Kuzey Tesisi'nde (Perth, Batı Avustralya) standart patojensiz koşullar altında muhafaza edildi. Tüm deneyler, Harry Perkins Tıbbi Araştırma Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan protokol sonrasında yapılmıştır. Bu deneylerde 8-12 haftalık BALB/c fareler kullanılmıştır. WEHI 164 fibrosarkom hücre hattı CellBank Avustralya (Westmead, NSW) elde edildi.
1. Hücrelerin aşılanması
- Hücre ve hayvanların hazırlanması
- Hücre hattının önerilen ortamda tutulmasından emin olun. Örneğin, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta 2 mM L-glutamin, 10% fetal sığır serumu, 20 mM HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomycin ile takviye wehi 164 hücre hattı korumak.
NOT: Gebe hücreler kriyojenik depodan çıkarıldıktan sonra en az 3 ve en fazla 5 kez. Optimum hücre canlılığı sağlamak için, hücreler% 70-80 arasında konfluent olduğunda bölünmelidir. Tümör hücre hatları mikoplazma için test edilmelidir, enfeksiyon hücre büyümesini değiştirebilir ve in vivo bağışıklık yanıtını etkileyebilir gibi. - Aşılamadan bir gün önce, sağ alt kanadında ki fareleri makas kullanarak tıraş edin.
NOT: Bu deneyde 8-12 haftalık, normal kiloda (16 -22 gram) dişi BALB/c fareler kullanılmıştır. - Aşılama gününde WEHI 164 hücrelerini %70-80 oranında trypsinizasyon la kapladığında hasat edin.
- Doku kültürü şişelerinden kültür ortamıaspire ve sonra steril fosfat tamponlu çözelti (1x PBS) ekleyin, fetal sığır serum (FBS) kalan izlerini kaldırmak için.
- Doku kültürü şişelerinden PBS aspire. %0,05 tripsin (T75 şişesi için) 3 mL ekleyin ve sonra şişeyi hücreli şişenin tüm yüzeyinin tripsin ile kaplanması için döndürün.
- Şişeyi 37 °C'de, %5 CO2 kuluçka makinesinde 3 dk.
- Hücre kültürü kuluçka gelen şişeleri çıkarın ve trypsin nötralize FBS ile desteklenen medya 5 mL ekleyin.
NOT: Bu hücrelere zarar verebilir ve düşük hücre canlılığı yol açabilir gibi, gerekli daha uzun tripsin hücreleri bırakmayın. - Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için pipet süspansiyonu birden çok kez. Hücre süspansiyonu konik santrifüj tüpüne aktarın.
- 3 dk için 350 x g iplik tarafından pelet hücreleri.
- Hücreleri 1x PBS'de üç kez yıkayın.
- Steril 1x PBS 50 mL hücreleri resuspend ve yukarı ve aşağı hücre süspansiyon pipetleme hücreleri yıkayın. 3 dk için 350 x g iplik tarafından pelet hücreleri.
- Steril 1x PBS'nin 15 mL'inde süpernatant ve resuspend hücreleri aspire edin. Hücre süspansiyonuna boru ile tutarak hücreleri yıkayın. 3 dk için 350 x g iplik tarafından pelet hücreleri.
- Steril 1x PBS'nin tam 10 mL'inde süpernatant ve resuspend hücreleri aspire edin. 1.1.4.2'deki gibi hücreleri yıkayın ve az miktarda (yaklaşık 100 μL) hücre süspansiyonunu saymak için bir santrifüj tüpüne aktarın. 3 dk için 350 x g iplik tarafından pelet hücreleri.
- Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak Trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücre numarasını belirleyin. Steril 1x PBS'deki hücreleri 5 x 106 hücre/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna buz da tut.
NOT: Tekrarlanabilir tümör büyümesini sağlamak için tümör hücrelerinin canlılığı %80'in üzerinde olmalıdır.
- Hücre hattının önerilen ortamda tutulmasından emin olun. Örneğin, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta 2 mM L-glutamin, 10% fetal sığır serumu, 20 mM HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomycin ile takviye wehi 164 hücre hattı korumak.
- Deri altı aşısı
- Hücre süspansiyonuna iyice karıştırın ve steril 1x PBS'de 100°L hücre süspansiyonu (5 x 105 hücre) ile 26 G iğneile şırınga doldurun. Bir sonraki şırıngayı yüklemeden önce hücrelerin karıştırılması tekrarlayın.
NOT: Canlılığı korumak için işlem boyunca hücreleri buzüzerinde tutun. - Fareyi uygun şekilde dizginler ve sağ alt kanadına erişimi sağlar. Fareyi alttan sol kanatta aşılama.
NOT: İğneyi hafifçe kaldırarak aşının peritonda olmadığından emin olun, deri altında görülmelidir. Aşılamadan sonra derinin altında kabarcık benzeri bir yumru oluşmalıdır. - Fareleri ilgili etik onayı gerektirdiği şekilde izleyin ve tümörler yaklaşık 50 mm2boyutuna büyüdüğünde cerrahi rezeksiyon yapın.
- Hücre süspansiyonuna iyice karıştırın ve steril 1x PBS'de 100°L hücre süspansiyonu (5 x 105 hücre) ile 26 G iğneile şırınga doldurun. Bir sonraki şırıngayı yüklemeden önce hücrelerin karıştırılması tekrarlayın.
2. Tümörün parsiyel cerrahi rezeksiyonu
NOT: Bu protokol İkİ araştırmacı gerektirir; biri cerrahi işlemler (CERRAH) ve diğeri fare izleme (ASSISTANT) için.
- Cerrahi kurulum
- Gün 12 post aşılama, tümörler yaklaşık 50 mm2boyutuna ulaştığında, 100 μL (0.1 mg /kg) buprenorfin s.c. ile doz fareler boyun scruff içinde, ameliyattan 30 dakika önce.
- Tezgah kat ile kaplı bir ısı yastığı ile cerrahi alan kurmak ve anestezi için bir burun konisi kurmak. Kullanmadan önce cerrahi araçları sterilize edin ve her hayvan arasında bir ısı boncuk sterilizatör kullanarak, araçları kullanmadan önce soğumasını sağlar. Aşağıdaki cerrahi ekipmanı temiz ve kolay ulaşılabilecek bir yerde bulunur: klorheksidin, bez, gazlı bez, göz jeli, iki kavisli çözgü, makas, klips aplikatör, klip sökücü, klips dolumları(Şekil 2A, 2B).
- Isıtma haznesini 37 °C'ye ısıtın ve geri kazanım için başka bir ısı yastığı ayarlayın(Şekil 2C). Sterilize edilmiş aletleri otoklavpedler gibi steril bir yüzeye yerleştirin.
- Anestezi
- Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve fareyi %4 izofluran (%100 oksijende %4 1 L/dk akış hızında% 4 oksijen) ile anestezi edin, ta ki solunum hızı dakikada yaklaşık 60 nefese (saniyede 1) yavaşlayana kadar (bu genellikle <1 dk).
NOT: Fareyi boğulma ve ölüme yol açabileceği sürece odada çok uzun süre bırakmayın. Aynı anda anestezi altında sadece bir fare var. - Fareyi ameliyat masasındaki ısı yastığına aktarın, burnu burun koniile fareyi yerleştirin ve anestezi durumunu %100 oksijende %100 oksijenle 0,5 L/dk. Anestezi derinliğinin korunmasını sağlamak için nefes alma hızını izleyin.
NOT: YARDIMCI anestezinin doğru düzeyde tutulmasını sağlamak için ameliyat boyunca farenin nefesini izlemelidir. Nefes alma çok yavaş olursa anestezi konsantrasyonu düşürün veya anestezi derinliği çok sığ ise konsantrasyonu artırmak. Fare nefes almaya başlarsa, fareyi burun konisinden çıkarın, anestezi konsantrasyonunu azaltın ve burun konisini tekrar koymadan önce nefes inin normale dönmesini bekleyin. - Farenin ameliyata başlamadan önce tamamen anestezi olduğundan emin olmak için "çimdik testi" ve "kornea refleks testi"14 yapın.
NOT: Farenin herhangi bir bölümünün hareketi, farenin tam olarak anestezili olmadığının bir göstergesidir. Anestezi konsantrasyonu artırılarak hayvana hemen ek anestezi verilmelidir. - Göz kuruluğu önlemek için göz kuruluğu az miktarda göz ile farenin gözlerini kaplayın.
- Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve fareyi %4 izofluran (%100 oksijende %4 1 L/dk akış hızında% 4 oksijen) ile anestezi edin, ta ki solunum hızı dakikada yaklaşık 60 nefese (saniyede 1) yavaşlayana kadar (bu genellikle <1 dk).
- Cerrahi işlem (CERRAHİ)
- Cerrahi bölgeyi alkollü klorheksidin le 3 kez temizler. Forceps ve makas bir çift kullanarak, dorsal tarafı boyunca 1 cm düz kesi yapmak, tümörden 3 mm uzaklıkta(Şekil 3A, 3B).
NOT: Kesinin her farede 1 cm'ye kadar standartlaştırılması (cetvel kullanarak) fareler arasındaki yara iyileşmesinin bile değerlendirilmesine olanak sağlar. Kesinin tümörden 3 mm uzakta bulunması, yaradan sızmadan sonraki intratümöral adjuvan tedaviye olanak sağlar. - Cımbız kullanarak, tümör ve periton arasında facia ve deri altı yağ dokusu çekin. Deri altı tümör normalde deri tarafına takılır.
- Yarayı, cımbız kullanarak tümörün yan tarafındaki deriyi hafifçe tutarak açın ve tümörü dışarıda görülebilmesi için "ters çevirin"(Şekil 3C, 3D).
NOT: Tümörün debulked edilecek bölümü, yarayı kapatmak için yeterli cilde sahip olmak için açıklığa en yakın olmalıdır. Tümörü çıkarırken cildi kesmemeye dikkat edin. - Makas bir çift kullanarak, kaldırmak için yarısından tümör kapsülü kesip, açılışa en yakın tümörün tabanından başlayarak.
- %50 debulk cerrahisi için, tümörün ortasından kes. Kavisli forceps kullanarak, tümör ünkikini çıkarılacak kısmı kepçe (%50);
- %75 debulk için, yukarıdaki bölüm 2.3.5 olarak% 50 tümör debulk gerçekleştirin. Daha sonra tümörün kalan % 50'sinin yarısını kesip tümörün %25'ini kepçelerler, yukarıda açıklandığı gibi kavisli forcep'ler kullanarak.
- Cerrahi bölgeyi alkollü klorheksidin le 3 kez temizler. Forceps ve makas bir çift kullanarak, dorsal tarafı boyunca 1 cm düz kesi yapmak, tümörden 3 mm uzaklıkta(Şekil 3A, 3B).
- Cerrahi alanın kapatılması
- Kalan tümörü derinin altına geri yerleştirin ve forceps kullanarak deri fleplerini bir araya getirin ve yara boyunca deriyi hizalayın.
- Yaranın kenarından 5 mm kadar deriyi bir arada tutun ve çersepse en yakın olan taraftan başlayarak yarayı kapatmak için cerrahi klipsler kullanın. Hiçbir altta yatan doku maruz olduğundan emin olmak için gerektiği kadar klips uygulayın. Genellikle, klipsler arasında 2 mm boşluklar ile üç ila dört klips uygulanır.
NOT: Herhangi bir klip iyi uygulanmazsa, klip sökücü kullanarak çıkarın ve yeni klipler ile değiştirin.
- Farelerin kurtarılması (YARDIMCI)
- Farelerin ılık (37 °C) ısıtma odasına koyarak toparlanmalarına izin verin.
- Farenin kafesini ısı yastığına yerleştirin. Onlar anestezi (uyanık ve yürüyüş) kurtarıldı ve daha sonra kafesiçine fareler geri koymak kadar ısıtma odasında fareler izleyin. Fareler daha aktif hale gelene kadar kafesi ısı yastığında 10 dakika daha bekletin.
- Farelere ıslak ve yumuşak yiyecekler verin. Kurtarma için ameliyattan 1 saat sonra fareleri izleyin ve klipslerin yerinde kalmasını sağlayın. Hayvanların gözetimsizken sıcaklığı kendi kendine düzenlemelerine izin vermek için kafesin ısı yastığının yarısı açık/yarım olduğundan emin olun.
- 0.1 mg/kg buprenorfin (boyun scruffin 100 μL subkutan), ameliyattan sonra 6-8 saat (günün sonunda) ile doz fareler. Fareleri ertesi sabah erken saatlerde izleyin ve fareleri tekrar 0.1 mg/kg buprenorfin (boyun scruff'unda 100 μL subkutan olarak) doza. Gerektiği gibi daha fazla ıslak gıda verin.
- Önümüzdeki yedi gün boyunca fareleri her gün izleyin. Klipsöküc kullanılarak klipler yedi gün sonra kaldırılabilir.
- Adjuvan veya neoadjuvan tedavi
- Fareleri herhangi bir zamanda (neo)adjuvan tedavi ile perioperatif olarak tedavi edin, ilgi tedavisine bağlı olarak.
- Örneğin, aşıdan sonra 15 gün boyunca 100 μg anti-CTLA-4 intraperitoneally (yani) veya aşılama dan sonra 15, 17 ve 19.
- Deneysel kontroller
- Bu modeli inflamasyon/yara iyileşmesinin etkilerini değerlendirmek için kullanırken, aşağıdaki kontrol gruplarını kullanmayı düşünün: 1) Ameliyatsız kontrol (tedaviler hala intratümörel olarak uygulanabilir); 2) Sham cerrahi kontrolü: Deride cerrahi kesi yapılır; tümör manipüle edilir ve maruz kalır, ancak tümör dokusu çıkarılır; yara klipslerle kapatılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
50 mm2 boyutunda tümör büyümesi kısmi debulk için ideal bir boyut. 50 mm2 tümörün tamamlanmamış cerrahi rezeksiyonu adjuvan immünoterapi yokluğunda tümörlerin %100 (n=5) tekrarlanabilir rebüyüme ile sonuçlanır(Şekil 4A). Daha sonra modeli kontrol noktası molekülleri Sitotoksik T Lenfosit İlişkili Protein 4 (CTLA-4) ve Programlı Ölüm Reseptörü 1 (PD-1) karşı antikorlar kullanarak adjuvan immünoterapileri test etmek için kullandık. Anti-CTLA-4 veya anti-PD-1 ile farelerin tedavisi sırasıyla %80 ve %25 (grup başına n=4-5) bir kür oranı ile sonuçlandı(Şekil 4B, 4C). Anti-PD-1 ile yanıt daha fazla yanıt oranını artırmak için yeni kombinasyonları test etmek için bir fırsat sağlar.
Şekil 1: Tümörün kısmi cerrahi rezeksiyonunun şematik diyagramı. (A) BALB/c fareler sağ alt kanadında 5 x 105 WEHI-164 hücreleri ile aşılanır. (B) Tümör 50 mm2'yeulaştığında ameliyat başlayabilir. (C) Tümör kısmen rezeke edilir (%50 gösterilmiştir). (D) Cerrahi bölge klipslerle kapatılır. (E) Adjuvan tedavi, intravenöz, intraperitoneal (gösterilmiştir) veya yara bölgesinde intratümöral olarak uygulanabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ameliyatın temsili görüntüleri hazırlanır. (A) Cerrahi araçları (adım 2.1'de listelenen) ve anestezi makinesini gösteren bir ameliyat görüntüsü. (B) Cerrahi tablonun kolay ulaşılabilecek tüm malzemeleri gösteren anlık görüntüsü. (C) Fare geri kazanımı için ısıtma odası ve ısıtma yastığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kısmi tümör debulk tekniğinin temsili resimleri. (A) Ameliyat tan önce 50 mm2 büyüklüğünde tümörlü tamamen anestezili bir fare. (B) Tümörden 3 mm uzaklıkta kesi bölgesi; 1 cm'lik kesi. (C-D) Yaranın, cımbız kullanarak tümörün yan tarafındaki deriyi hafifçe tutarak açılması ve tümörün dışarıda görülebilmesi için "ters çevrilme". Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tamamlanmamış tümör rezeksiyonu ve immünoterapi sonrası tümör rebüyümesi. (A) Adjuvan immünoterapi yokluğunda kısmen rezeke edilmiş WEHI-164 tümörlerinin tümör rebüyüme eğrileri. (B-C) Ameliyat sonrası tümör regrowth ve anti-CTLA-4 (B) veya anti-PD1 (C) ile adjuvan tedavi. Noktalı çizgi ameliyat gününü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz perioperatif tedavileri test etmek için yumuşak doku sarkomu eksik cerrahi rezeksiyon bir fare modeli için bir protokol sağlar. Ayrıca tedavi sonrası fareler arasında yara iyileşmesinin değerlendirilmesine olanak sağlamak için cerrahi kesi standardize edildi.
Tümör yerleşimi bu protokolün önemli bir parçasıdır. Biz fareler üzerinde en az yük ile tümör bölgesi ve lokal tedavilerin uygulanması kolay cerrahi erişim sağlamak için bir deri altı tümör modeli tercih ettik. Tümörlerin periton içinde değil de deri altı uzamda büyümesini sağlamak da önemlidir, bu da beklenmeyen morbidite ve mortaliteye neden olabilir.
Bu protokol için bir tümör hücre hattı seçerken, invivo yetiştirilen hücrelerin kısmen rezeksiyonu teknik olarak zor olduğu için yarı katı bir kütle (B16 modeli gibi) yerine katı bir kütle (örneğin, WEHI-164 modeli) oluşturmalarını tavsiye ederiz. Buna ek olarak, tümör deri yoluyla büyümeye başlarsa (genellikle 100 mm2'denbüyük tümörlerde görülür), deri nekrotik hale gelebilir ve ameliyattan sonra iyi iyileşmez gibi debulking tavsiye edilmez. Bu problemi, tümörlerin 50 mm2 boyutuna ulaştıklarında debulking yaparak üstesinden geldik.
Modelimiz yara iyileşmesinin tedavi üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabildiği için karşılaştırma olarak bir kontrol/sham grubu öneriyoruz. Kontrol değiştirilmemiş tümör olabilir, ya da sadece deri insizyonu olurdu sahte cerrahi, tümörün maruz kalma, ve kısmi tümör debulk olmadan yara kapanması. Bu sahte kontrol grubu, cerrahi kaynaklı inflamasyon ve kısmi debulk dan yara iyileşmesinin tedavi sonucu üzerindeki etkisini fark ederken kullanılabilir.
Başarılı kısmi debulking cerrahisi için bazı teknik noktaların göz önünde bulundurulması gerekir. Önemli bir yönü doğru implantasyon ve tümörün büyümesidir. Tümörlerin sağ alt kanadına, arka bacaktan uzağa yerleştirilmesi gerekir. Arka bacağa çok yakın yerleştirilen tümörler yürüme yeteneklerini etkileyebilir ve klipslerde ekstra güç kullanılmasına neden olabilir. Buna ek olarak, tümör boyutunda tutarlılık debulking göreli yüzdesi değişkenlik önlemek için önemlidir. Biz 50 mm2boyutunda tümörler ile cerrahi yapmak için seçtim , teknik olarak basit ameliyat yapmak için, biz küçük tümörler üzerinde kısmi rezeksiyon mümkün olduğunu öngörmek rağmen. Tümör boyutunda tutarsızlığı önlemek için, kullanılan hücre hattı uygun standart hücre kültürü teknikleri aşağıdaki geçit olması gerekir, ve araştırmacı uygun tümör aşılama tekniği yeterli eğitimli olması gerekir. Bu protokolü diğer subkutan tümör modellerine genişletirken tümörün fiziksel özellikleri önemlidir. Örneğin, yumuşak, jelatinimsi tümörlere (örneğin, M3-9-M rabdomiyosarkom ve B16 melanom15)yol açan hücre hatlarının teknik olarak debulk için zor olduğunu bulduk.
Ameliyat sırasında göz önünde bulundurulması gereken teknik noktalar da vardır. İşlem sırasında hareket etmeyi önlemek için farelerin yeterince anesteziye tabi tutulmalıdır. Yetersiz anestezili farelerin dayanacağı impost dışında, işlem sırasında farelerin herhangi bir hareketi cerrahi rezeksiyonu zorlaştırabilir ve fareler arasında çıkarılan tümörün boyutunda değişkenlik sağlar. Buna ek olarak, fare solunum hızı dikkatle ameliyat sırasında izlenmelidir Isoflurane konsantrasyonu anestezi uygun derinliği korumak için ayarlanmalıdır. Bu nedenle, bir asistan her zaman cerrahi işlem sırasında ameliyat sırasında solunum hızını izlemek için gereklidir, ve anestezi yeterli düzeyde sağlamak için. Yara iyileşmesi yanıtında değişkenliği önlemek için kesi büyüklüğü tutarlı olmalıdır. 1-1.5 cm'lik bir kesinin tümör debulking için yeterli olduğunu ve yara dehiscence şansının en düşük olduğunu bulduk.
Kısmi rezeksiyon modelimiz, birçok solid tümörün klinik ortamında görüldüğü gibi ameliyat sonrası kalan artık hastalığı taklit eder ve cerrahi yara iyileşmesinin etkisini göz önünde bulundurarak geleneksel singenik fare modellerine göre avantaj lar sunar. Buna ek olarak, cerrahi mevcut geleneksel modeller her zaman tümör nüks16neden olmaz tam tümör rezeksiyonu, kullandık. Diğer araştırmacılar başarıyla diğer kanser hücresi hatları kullanarak kısmi rezeksiyon modelleri kullanmış11,12,13, Bu yöntemin sağlamlığı altını çizerek. Ayrıca, bu kısmi rezeksiyon, ancak tam olmayan rezeksiyon, koruyucu anti-tümör bağışıklık belleği ile sonuçlanan gösterilmiştir zaman adjuvan tedavi verildiğinde12 hangi kalıntı tümör antijenlerin kalıcılığı atfedilen.
Bu model tedavi üzerinde inflamasyon ve yara iyileşmesi etkisini incelemek için tasarlanmıştır. Debulking yaklaşımımız klinik olarak, mikroskobik kalıntı hastalığı (R1 rezeksiyonu) ile makroskopik olarak tam rezeksiyon yerine, ameliyat sonrası brüt kalıntı hastalığın geride bırakıldığı klinik durumlara (R2 rezeksiyonu) benzer. Örneğin, invaziv yumuşak doku sarkomu cerrahi rezeksiyon tümör sinirler, arterler veya komşu organlar gibi kritik yapıların yanında bulunan zaman pozitif marjları neden olabilir, geniş marjları ile tam rezeksiyon engelleyen17. Mikroskobik pozitif kenarlara neden olan rezeksiyon için cerrahi modeller yayınlanmıştır13; protokolümüz, makroskopik kalıntı hastalığı mevcut olduğunda yara iyileşmesi yanıtının tedavi üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.
Modelimizin bir sınırlama uzak nüks ve mikrometastaz, meme kanseri veya pankreas kanseri gibi katı tümörlerde cerrahi sonrası yaygın olan neden değildir. Diğer cerrahi modeller, gibi murine meme kanseri modeli 4T118,19,20 veya de novo meme kanserimetastazımurine modelleri21 lokal rezeksiyon sonrası sistemik nüks araştırmak için daha uygundur. Bir diğer sınırlama da bu protokolün deri altı modeller için olması ve dolayısıyla dokuya özgü patolojinin değerlendirilmesini sağlamamasıdır. Bu amaçla ortotopik tümör fare modelleriuygundur 7,22,23. Ancak, ortotopik modeller daha zorlu ve genellikle fareler için daha fazla impost içerir ve daha zahmetli ve pahalı22. Deri altı modeller de etkilerini değerlendirmek için uygundur (neo-)adjuvan tedavilerin, sistemsel ya da lokal, yerel kanser nüks, bir maliyet-etkin ve nispeten yüksek iş yapma şekilde hayvanlara en az impost ile.
Bu protokolde belirtildiği gibi eksik parsiyel rezeksiyon, adjuvan tedavilerin test edilmesinde yararlıdır ve cerrahi yara iyileşmesini bir faktör olarak içerir, bu değişken genellikle gözden kaçırılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklama yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Sarcoma için Çorap gelen hibe tarafından desteklenir! Vakfı, Avustralya ve Yeni Zelanda Sarkomu Derneği, Çocuk Lösemi ve Kanser Araştırma Vakfı ve Sürekli Hayırseverlik. W.J.L Simon Lee Bursu ve Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi bir araştırma bursu tarafından desteklenir ve Kanser Konseyi WA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
References
- Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).
- Haas, R. L., et al. Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas. Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).
- Brennan, M. F., Antonescu, C. R., Moraco, N., Singer, S. Lessons learned from the study of 10,000 patients with soft tissue sarcoma. Annals of Surgery. 260 (3), 416-421 (2014).
- Smith, H. G., et al. Patterns of disease relapse in primary extremity soft-tissue sarcoma. British Journal of Surgery. 103 (11), 1487-1496 (2016).
- Uramoto, H., Tanaka, F. Recurrence after surgery in patients with NSCLC. Translational Lung Cancer Research. 3 (4), 242-249 (2014).
- Stojadinovic, A., et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Annals of Surgery. 235 (3), 424-434 (2002).
- Krall, J. A., et al. The systemic response to surgery triggers the outgrowth of distant immune-controlled tumors in mouse models of dormancy. Science Translational Medicine. 10 (436), (2018).
- Bakos, O., Lawson, C., Rouleau, S., Tai, L. H. Combining surgery and immunotherapy: turning an immunosuppressive effect into a therapeutic opportunity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 86 (2018).
- Predina, J. D., et al. Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment. American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. American Journal of Pathology. 170 (3), 793-804 (2007).
- Khong, A., et al. The efficacy of tumor debulking surgery is improved by adjuvant immunotherapy using imiquimod and anti-CD40. BMC Cancer. 14, 969 (2014).
- Broomfield, S., et al. Partial, but not complete, tumor-debulking surgery promotes protective antitumor memory when combined with chemotherapy and adjuvant immunotherapy. Cancer Research. 65 (17), 7580-7584 (2005).
- Predina, J. D., et al. A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation. Cancer Biology & Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , Chapter 20, Unit 20-21 (2001).
- Predina, J., et al. Changes in the local tumor microenvironment in recurrent cancers may explain the failure of vaccines after surgery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (5), E415-E424 (2013).
- Endo, M., Lin, P. P. Surgical margins in the management of extremity soft tissue sarcoma. Chinese Clinical Oncology. 7 (4), 37 (2018).
- Liu, J., et al. Improved Efficacy of Neoadjuvant Compared to Adjuvant Immunotherapy to Eradicate Metastatic Disease. Cancer Discovery. 6 (12), 1382-1399 (2016).
- Park, C. G., et al. Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases. Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).
- Tai, L. H., et al. A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies. Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).
- Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
