Summary
このプロトコルの目標は、直接腹側テグメンタル領域受容体を操作して、第二次ドーパミン放出への寄与を研究することです。
Abstract
腹側テグメンタル領域(VTA)から側坐核へのPhasicドーパミン(DA)放出は、報酬処理および強化学習において極めて重要な役割を果たす。VTA制御フェーシックDAリリースへの多様な神経入力を理解することは、報酬処理と強化学習を制御する回路のより良い画像を提供することができます。ここでは、インビボ高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)で測定した刺激誘発フェシクスDA放出(融合注入および刺激、またはCIS)を有する薬理学的アゴニストおよびアンタゴニストのVTAカニューレ内注入を組み合わせた方法を説明する。麻酔下ラットにCIS-FSCVを用い、カナンベン核の中で記録しながらカニューレを取り付けた双極電極でVTAを電気的に刺激することによって、フェースDA応答を誘発することができる。薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストは、刺激部位に直接注入して、Phasic DA放出を駆動する上での特定のVTA受容体の役割を調査することができる。CIS-FSCVの大きな利点は、VTA受容体機能がインビボで研究できることです, インビトロ研究に基づいて構築.
Introduction
腹側テグメンタル領域(VTA)から側坐核(NAc)への放出は報酬関連の行動において重要な役割を果たす。VTA DAニューロンは、強壮性の発火(3~8Hz)からバースト状の発火(>14Hz)1に切り替え、NAcでフェージDA放出を生み出します。VTAは、強壮剤からバースト焼成2、3、4、5への切り替えを制御するのに適した位置にある様々なソマト樹状受容体を発現する。これらの受容体のどれとそれぞれの入力を特定して、制御フェシカルDA放出は報酬関連回路がどのように組織されているかについての理解を深める。ここで説明する方法論の目的は、高速スキャン環状ボルタンメトリー(CIS-FSCV)との注入と刺激を組み合わせて、迅速かつ堅牢に駆動フェージックDA放出におけるVTA受容体の機能性を評価することである。
融合と刺激(CIS)を組み合わせた用語は、細胞のグループ(ここではVTA)上の受容体を薬理学的に操作し、それらのニューロンを刺激して受容体の機能を研究することを指します。麻酔ラットでは、高速スキャン環式ボルタンメトリー(FSCV)で測定したNAcコアに大きなフェージDA信号(1-2 μM)を呼び起こすためにVTAを電気的に刺激します。刺激部位における薬理学的薬剤(すなわち受容体アゴニスト/アンタゴニスト)の注入は、誘発されたフェースDA放出の後の変化を観察することによってVTA受容体の機能を測定するために使用することができる。FSCVは、高空間(50-100 μm)と時間(10Hz)の両方の解像度を楽しむ電気化学的アプローチであり、報酬関連のフェージックDAイベント6、7を測定するのに適しています。この解像度は、マイクロ透析などの他の生体内神経化学的測定よりも細かいものです。したがって、CIS-FSCVは、一緒に、フェースドーパミン放出のVTA受容体調節を評価するのに適している。
VTA受容体機能を調べる一般的な方法の1つは、それらの受容体がニューロン1,8の発火速度をどのように変化させるかを扱う電気生理学的アプローチの組み合わせを用いることである。これらの研究は、活性化時にDA発火を促進する際にどのような受容体が関与しているか理解する上で非常に貴重です。しかし,これらの研究は,軸索末端で下流に起こり得るものを示唆することしかできません(すなわち、神経伝達物質の放出)。CIS-FSCVは、VTAバースト焼成、フェーシックDA放出の出力がVTAデンドライトおよび細胞体上にある受容体によってどのように調節されているかに答えることによって、これらの電気生理学的研究に基づいています。したがって、CIS FSCVはこれらの電気生理学研究に基づいて構築するのに適しています。一例として、ニコチン受容体活性化はVTA9においてバースト発成を誘導することができ、そして麻酔ラットにおけるCIS-FSCVは、VTAにおけるニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)活性化もNAc10,11におけるフェージドDA放出を制御することを示すために使用された。
フェシカルDA規制の機械検査はまた、薬物の浴用途と一緒にスライス製剤を使用して一般的に研究されています.これらの研究は、多くの場合、細胞体がスライス12から除去されるようにドーパミン末端からのフェジーカルDA放出のシナプス前調節に焦点を当てる。これらの調製物はドーパミン末端に対するシナプス前受容体の効果を研究するのに価値があるのに対し、CIS-FSCVは、ドーパミンニューロンに対するソマトデン化受容体の効果、ならびにVTAへのシナプス前の入力を研究するのに適している。この区別は重要であり、VTAにおけるソマト樹状受容体活性化は、NAcシナプス前受容体活性化とは異なる効果を有し得るからである。実際、NAcにおけるドーパミン作動性シナプス前nAChRsを遮断すると、バースト焼成13中にパシズムドーパミン放出を上昇させることができるが、その反対はVTAソマトデンドリックnAChDrcnAChRs10,11に当てはまる。
CIS FSCVは、VTA受容体がフェースDA放出を調節する能力を研究するための理想的なアプローチです。重要なことに、このアプローチは、麻酔または自由移動のいずれか、無傷のラットで行うことができます。このアプローチは急性期研究に適し、そのベースライン状態10、14の受容体機能を研究するとともに、薬物暴露後または行動操作11、15の後の受容体の機能的変化を評価できる長期研究を行う。
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Protocol
すべての実験は、国立衛生研究所(NIH)実験動物のケアと使用ガイドに従って行われ、エリザベスタウン・カレッジとイェール大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)の両方によって承認されました。このプロトコルは、CIS-FSCVを利用する麻酔ラット調製に固有のものです。
1. 術前の準備
- 電極溶液調製
- 電極バックフィル溶液を作るために、140 mM塩化カリウム16で4M酢酸カリウムの溶液を調製する。
- 電極準備
- 真空吸引を使用して、T-650炭素繊維(直径7μm)をホウケイ酸ガラスキャピラリー(長さ=100mm、直径=1.0mm、内径=0.5mm)に挿入します。
- カーボンファイバーをガラスキャピラリーの内部に配置したら、ガラスキャピラリーを垂直電極引き手に入れ、熱要素をキャピラリーの真ん中に入れます。磁石をオフにしてヒーターを55に設定します。
- 毛細管を引っ張った後、電極の先端が発熱体で囲まれないように上の毛細管ホルダーを慎重に上げる。
- 鋭利なはさみを使用して、キャピラリーの2つの部分をまだ接続している炭素繊維をカットします。これにより、2つの別々の炭素繊維マイクロ電極が生じる。
- 光顕微鏡下で、露出した炭素繊維を鋭いメスで丁寧に切断し、ガラスの端を越えて約75〜100μmの炭素繊維が伸びるようにします。
- 軽顕微鏡を使用して、電極に毛細血管に沿った亀裂がないことを確認してください。また、炭素繊維が毛細血管から出るシールが気づきにくく、亀裂がないようにしてください。
メモ:シールが良いと、録音中のノイズを低減できます。詳細なプロトコルについては、発表された研究17、18、19を参照してください。
- 参照電極製作
- 5 cmの銀線に金のピンをはんだ。
- アノードを金属製のクリップまたは他の導体に取り付け、カソードをピンに取り付け、0.1 M HClに水没させながら電圧(~2V)を印加します。
- 銀線に白色のコーティング(AgCl)が現れたら電圧を止める。
- 埋め込み用電極の準備
- 薄い絶縁ワイヤー(長さ10cm、直径0.50mm<)に金ピンをはんだ付けする。
- 金ピンとは反対側のワイヤーから絶縁体の〜5cmを取り除きます。
- 電極溶液をほぼ半分に充填します。
- 絶縁線を電極に挿入します。
メモ:ワイヤは電極内部の炭素繊維と接触する必要があります。
2. 電極注入
- 無菌生理食糸に溶解した0.5g/mLウレタンの腹腔内注射(1.5g/kgまたは1mL/kg量)の成人、オス、スプレイグ・ドーレーラット(250-450g)を与える。1.0-1.2 g/kgの初期ウレタン線量から始めます。ウレタン投与後20分間、有害刺激試験(テールピンチ)に対して動物が反応する場合は、1.5 g/kgの総用量で0.3-0.5 g/kgウレタンを追加投与する。
注:0.5 g/mLウレタン溶液の調製のために、10gのウレタンを10g(〜10 mL)の生理食音に加えます。ウレタンは発がん性物質であり、注意して取り扱う必要があります。ウレタンは、ドーパミンのレベルを変化させないように重要な麻酔薬であり、ケタミン/キシラジンおよびクロラルハイドレート20,21などの他の麻酔薬と同様に。 - 動物が深く麻酔され、有害な刺激(例えば、つま先ピンチ)に反応しない場合は、ステレオタキシックフレームに置きます。ラットの各眼に眼用潤滑剤を塗布する。
注:これは非生存手術ですが、良い無菌技術が奨励されています。 - 2段階のスクラブを使用してラットの頭皮を洗浄します(すなわち、ヨドポビトンスクラブに続いて70%エタノールスクラブを行い、3サイクルの繰り返しで実行します)。
- 滅菌針鼻ピンセットと手術用はさみを使用して頭皮組織を切り取ります。以下に概説する様々な移植のためのスペースを作るために、かなりの量の組織を取り除きます。
- 滅菌綿の先端アプリケーターを使用して、頭蓋骨の表面を静かにきれいにします。次に、λとブレグマを識別するために、過酸化水素3%の2〜3滴を適用します。
- ステレオタキシックドリルまたはハンドドリル(1.0 mm、〜20,000 rpm)を使用して、直径1.5mmの穴をブレグマに2.5mm、横に3.5mmの横に掘削します。部分的に(中途半端に、しっかりと所定の位置に入るまで)、この穴にネジ(1.59 mm O.D.、長さ3.2mm)を埋め込みます。熱損傷を防ぐために掘削中に灌漑するために滅菌生理布を使用することをお勧めします。
- 参照電極の場合、直径1.0mmの穴を左半球のブレグマに1.5mmの前部と3.5mmの横に開きます。
- この穴には、約2mmのリファレンスワイヤを挿入し、インプラントねじの頭の周りと下に参照ワイヤを巻き付けます。
- ネジを完全に埋め込み、参照電極を所定の位置に固定します。
- 右半球では、直径1.5mmの穴を前部1.2mm、横1.4mmの横に掘削します。
- ピンセットを使用して硬膜をそっと取り除きます。
- 刺激電極の場合は、5.2mm後方に中央に5.2mm、横1.0mmの方角をブレグマに中心とする正方形の穴(2mm前側後部、5mm内側内側)を掘削します。
- 立体性アームバーを使用して、双極刺激電極/ガイドカニューレを硬膜下5mm下げます。電極の移植中に出血した場合は、滅菌綿棒とガーゼを使用して出血を最小限に抑えます。
注:この方法で使用されるバイポーラ刺激電極はガイドカニューレ(材料表)を備えています。このアイテムで使用される内部カニューレは、ガイドカニューレに完全に挿入された場合、バイポーラ刺激電極のプロングで洗い流す必要があります。これにより、内部カニューレは、約1mm離れた刺激器の2つのプロングの間に直接座ることができます。同様のプロトコルは、他の場所で説明されています 14. - 定位アームバーを使用して、炭素繊維マイクロ電極を硬膜下4mm下げる。この場所は、線条体の最も後ろの部分にあります。
- リファレンスワイヤと炭素繊維をポテンショスタットに接続します。
- 60 Hzで15分間、10分間、10 Hzで10分間、三角波(-0.4−1.3 V、400 V/s)を適用します。
注:通常、脳内の炭素繊維微小電極に波形を適用する場合、酸化物基が炭素繊維の表面に添加されます。この反応の平衡は、記録する前に到達する必要があります。それ以外の場合は、有意なドリフトが発生します19.より高い周波数(60 Hz)で電極をサイクリングすることで、炭素繊維はより高速に平衡を達成することができます。
3. 炭素繊維の最適化と電極/ガイドカニューレの位置の活性化
- 60 Hz、24パルス、300μA電流、パルス幅2ms/位相の周波数で、バイポーラ電気波形を生成するように刺激器を設定します。
- 刺激装置を、5mmから7.8mmまで0.2mmずつ徐に下げます。各増分で、VTAを刺激します。
注:より多くの後ろの深さ(5-6 mm)では、脳の刺激は通常(時間の80%程度)ラットのウィスカーをぴくぴくさせます。さらに深さで、ウィスカーは硬膜の下7.5-8.2 mmの間で起こるぴくぴくを止めます。ウィスカーがぴくぴくしなくなると、刺激電極はVTAの近くまたは近くにあります。これはすべてのラットで発生するものではなく、ウィスカーのけいれんの欠如は、双極性刺激電極/注入カニューレが見当違いであることを示すものとして取られるべきではありません。すべての麻酔薬(例えば、イオブルラン)に対してウィスカーのけいれんが起こるわけではない。 - 刺激が炭素繊維微小電極(現在は側側線条体)でフェジックDA放出を生じるまで、バイポーラ刺激電極/ガイドカニューレを下げ続ける。
注:双極性電極がVTAに埋め込まれた場合、後回線でのDA放出は必ずしも起こるわけではありませんが、VTA刺激時のDA放出の観察は、通常、NAcコアに良好な信号が観察されることを示す良好な兆候です。 - 炭素繊維マイクロ電極を、硬膜の下に6.0mm以上になるまで下げてください。これはNAcコアの最も後ろ側の部分です。
- VTAを刺激し、DAピークのピーク振幅を記録します。
- DA放出が最も大きい部位で炭素繊維マイクロ電極を下げるか、または上げる。
- DA応答のピークが0.6Vでの明確な酸化ピーク、-0.2 Vでの還元ピークであることを確認してください。これらのピークはDAを示しています。
4. 組み合わせ注入と刺激FSCV記録
注: 図 1 は、VTA マイクロインフュージョンの前後の記録のタイムラインを示しています。
- 炭素繊維と刺激電極/ガイドカニューレの位置が最適化されたら、〜20〜30分の刺激を与えます。
注:現在の刺激パラメータの下で、22の静脈リローディングを可能にするために、3分ごとに1回以上刺激しないでください。 - 安定したベースライン(5回の刺激に対して<20%の変動)を達成した後、バイポーラ刺激器にプリフィットされたガイドカニューレに手で内側のカニューレを穏やかに下げる。
- カニューレ挿入自体が呼び起こされる信号に変化を起こさないように、さらに2-3のベースライン録音を取ります。場合によっては、内部カニューレの挿入と取り外しがVTAに損傷を与える可能性があります。このベースライン期間(>20%)で信号が大幅に変化した場合は、ベースラインが再び不安定になるまで3~4の記録を追加します。
- シリンジポンプとマイクロシリンジを使用して、0.5 μLの溶液(例えば、0.9%生理食い、N-メチル-D-アスパラギン酸[NMDA]、(2R)-アミノ-5-ホスホノ球酸[AP5])を2分にわたってVTAに注入する。
- 注入後、除去する前に少なくとも1分間、内カニューレを残す。
注:一部の薬物は、薬物の動態に基づいてより長い時間、内部カニューレを残すことを必要とし、内部カニューレの除去は、薬物が内部カニューレを通って戻って移動する可能性があります。懸念がある場合は、記録全体の間にガイドカニューレに内部カニューレを残すことができます。それ以外の場合は、この 1 分間隔の後に録画を開始できます。 - 3分ごとに記録を続けて、輸液後の効果を測定します。
注:制御溶液を注入し、効果が見られない場合は、2回目の10を注入することが可能です。内部カニューレまたは生理食糸の挿入によって起こされるDA放出が変化した場合、シグナルは通常30分以内にベースラインに回復する。
5. 電極配置の組織学的検証
- 実験の最後に、炭素繊維マイクロ電極を用いて記録部位に小さな病変を作る。
- 実験後のキャリブレーションのために電極を保存する必要がある場合は、キャピラリー先端を越えて約100μm突出したガラスキャピラリーに配置されたタングステン線を使用してください。この場合、脳から電極を上げ、記録電極をタングステン電極に置き換え、それを同じドーソベントラ座標に下げる。
注:炭素繊維は、同様に脳を病変するために使用することができ、記録部位のより正確な表現を提供します。しかし、実験者はこれらの電極を較正する能力を失うことになる。
- 実験後のキャリブレーションのために電極を保存する必要がある場合は、キャピラリー先端を越えて約100μm突出したガラスキャピラリーに配置されたタングステン線を使用してください。この場合、脳から電極を上げ、記録電極をタングステン電極に置き換え、それを同じドーソベントラ座標に下げる。
- 記録部位を病変するには、電源を使用して電圧を印加する。1Vから始めて、10 Vに達するまで10 sごとに1 Vずつ増加します。
- ペントバルビタールの致死的な腹腔内注射(150mg/kg)を使用して動物を安楽死させる。
- 4%ホルマリン溶液を使用してラットを浸透させます。
- 鋭利なギロチンを使用してラットから頭部を取り除きます。
- ロンガを使用して、脳を取り巻く結合組織と頭蓋骨を取り除き、残りの組織から脳を静かに取り除きます。
- 脳を4%ホルマリンに1日間保存し、それを30%スクロースに移す。
注:4%ホルマリンを灌流することは病変部位を見る必要はないが、ベストプラクティスとしては病変部位の再建を改善する。 - クライオスタットを使用して脳の30 μmのスライスを作成します。
- スライドにスライスを取り付け、カバースリップで覆います。
- 光顕微鏡を用いた炭素繊維微小電極病変及びバイポーラ刺激/注入カニューレの位置を示す。
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Representative Results
CIS-FSCVは、NAcコアにおけるフェスジカルDA放出を駆動するVTA N-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)、ニコチン性アセチルコリン受容体(nACHRs)、ムスカリン性アセチルコリン受容体(mACHRs)の機能を研究するために使用されました。 図2 は、陰性対照の代表的なデータを示し、生理食糸0.9%の注入、前(ベースライン)および9分のポストインフュージョン(生理食糸)を示す。 図2 は、Y軸上のポテンシャル、X軸上の時間、Z軸上の電流(偽色として表される)、電流対時間トレース(IvT)、および測定された分析物がDAに対応することを実証するためにピーク呼び出し応答で撮影された周期的なボルタンモグラムを示しています。予想通り、生理食動注入は刺激されたフェシカルDA放出を変えなかった。
CIS-FSCVがアゴニストおよびアンタゴニストを使用する場合に双方向効果を生じることができることを実証するために、NMDARアゴニストNMDA(500 ng;図3A)をNMDARアンタゴニスト、AP5(1μg;図3B)。NMDAの注入は刺激されたフェスIc DA放出の強い増加を生じさせた(図3A、注入後9分)NMDAR競合アンタゴニストAP5(1μg)は、強い減少を生み出した(図3B、注入後9分)。アセチルコリン受容体の異なるクラスを標的とするアンタゴニストを用いたCIS-FSCVの有用性を実証するために、非選択的で非競争力のないnAChRアンタゴニストメカミルミン(3μg;;図4A)と非選択的で、競合性のmAChR拮抗者スコポラミン(67 μg;図4B)。両方の薬剤は、刺激されたフェス的なDA放出の強い減少を生じさせた(図4、9分の注入後)。図2、図3、および図4の結果の要約は、5回の刺激でベースライン期間が平均化され、薬物期間がベースライン平均の割合として表示される図5に再描画されています。
図1:VTAマイクロインフュージョン前後の記録用のタイムラインこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単一の雄のスプレイグ・ドーレーラットにおけるNAcコアにおける刺激されたフェージックDA放出に対するベースライン(左)および生理食物(車両)注入(右)の代表的な色とIvTプロット。 青いバーは刺激を表します。ベースライン記録はt = 0で起こり、内部カニューレがバイポーラ刺激器のガイドカニューレに置かれる前である。生理食糸記録は9分(t=9)後注入を取った。環式ボルタンモグラムインセットは、IvTプロットのピークに対応し、0.6Vでのピーク酸化と-0.2Vでのピーク還元を示し、DAを示す。刺激誘発放出の変化は、生理食前VTA注入後に観察されてはならない。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:NMDARアゴニスト(NMDA)およびアンタゴニスト(AP5)の注入の影響。(A)単一の雄のスプレイグ・ドーレーラットにおけるNAcコアにおける刺激されたフェージックDA放出に対するベースライン(左)および500ngのベースライン(左)および500ngの代表的な色およびIvTプロット。NMDA注入は刺激されたフェシカルDA放出を増加させた(記録は9分のポストインディションを取った)。(B)NMDAR拮抗薬のベースラインの代表的な色およびIvTプロット(左)および1μg(2R)-アミノ-5-ホスホノソ球酸(AP5)注入(右)を単一の雄のスプレイグドーレーラットでNAcコアで刺激されたフェージックDA放出にする。AP5注入は刺激されたフェーシックDA放出を減らした(記録は9分のポストインフュージョンを取った)。ベースライン記録はt = 0で起こり、その前に、バイポーラ刺激器のガイドカニューレにカニューレが入れられた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: メカミルアミンおよびスコポラミンの注入の影響.(A)非選択的なニコチン性アセチルコリン受容体アンタゴニストメカミルアミン(MEC)注入(右)のベースラインの代表的な色およびIvTプロット(左)(右)を単一の雄のスプレイグドーレーラットにおけるNAcコア中の刺激されたフェージックDA放出に対する。(B)非選択的ムスカリン性アセチルコリン受容体拮抗薬スコポラミン(SCOP)注入(右)のベースラインの代表的な色およびIvTプロット(左)を単一の雄のスプレイグドーレーラットでNAcコアで刺激されたフェージックDA放出に対する。ベースライン記録はt = 0で起こり、その前に、バイポーラ刺激器のガイドカニューレにカニューレが入った。MECおよびSCOPの記録は、9分のポストインフュージョンを撮影した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:経時の薬物効果を示すデータ要約。 5回の刺激で前注入期間(ベースライン)を平均し、そして、注入後の期間(t=3から開始)は、ベースラインの割合として提示される。9分のポストインテインでは、呼び起こされるDAシグナルが生理食前注入後のベースラインの103%、NMDA注入後196%、AP5注入後18%、MEC注入後49%、SCOP注入後43%であった。n = 条件ごとに 1。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
CIS-FSCVは、Phasic DA放出の基礎となるVTA受容体機構を調査するユニークな機会を提供します。適切な記録を確実にするためには、2つの重要なステップがあります。まず、安定したベースライン記録を達成する必要があります。安定した記録を確立する可能性を高める重要な方法は、電極が60 Hzと10 Hzの両方でサイクルするのに十分な時間を持っていることを確認することです(通常、60 Hzでは15分、10 Hzで10分)。炭素繊維が循環するに当たって、炭素繊維自体が酸化し、エッチングされ、表面積を減少させるが、ドーパミン吸着用の新たな表面を作り出す。これは、DAに対する感度の増加につながることができます。したがって、薬理学的操作ではなく、このエッチングの増加による実験での刺激ドパミン放出のわずかな増加が見られる可能性があります。さらに、最初の麻酔の90〜120分以内に記録を開始すると、長期間にわたって安定した記録の可能性が高まります。したがって、ラットが麻酔で死に近づくにつれて、呼び起こされるDA放出がゆっくりと減少することが典型的である。
この手順の第2の重要なステップは、注入カニューレがバイポーラ刺激電極に穏やかに挿入されることを確実にすることです。立体性アームバーは、内部カニューレを挿入する際に圧力が大きすぎると動き、その結果、刺激部位が異なることがあるため、ドーパミン信号が人為的に増加または減少する可能性があります。カニューレ挿入後に呼び起こされる信号に大きな変化がある場合は、新しいベースライン期間を確立する必要があります。また、内部カニューレまたは車両注入を挿入することによって起こされるDA放出が変更された場合、信号は通常30分以内にベースラインに回復する。DAリリースで車両の注入に大きな変化が発生した場合、注入速度または体積を低減することができます。研究者はまた、カニューレ自体の挿入が放出を変更することができるかどうかを評価するために注入の前に内部カニューレを挿入した後、追加の記録を行うことができる。関連して、注入が発生し、内部カニューレの封鎖がないことを確認することが重要です。これを行う1つの方法は、注入管に小さな泡を作り、ペンやマーカーでこれをマークすることです。泡は、注入後のマーカーから遠く離れている必要があります。注入が適切に発生したことを確認するもう一つの方法は、内部カニューレが脳から取り除かれた後に注入ポンプをオンにすることです。
CIS-FSCVは、行動的にナイーブおよび訓練された動物の両方でVTA受容体を研究し、時間11にわたる受容体機能の変化を研究するように適応することができる。CIS-FSCVは、5-HTおよびノルエピネフリン(NE)24、25を測定するために変更することもできます。CIS FSCVは、目覚め、行動実験に非常に適しており、光遺伝学的アプローチ26、27と統合することができます。電気的に誘発された放出事象は、自由移動研究でしばしば観察される一時的な放出事象とは異なり、麻酔薬ではあまり頻繁に起こっていないことに注意することが重要である。一時的な放出イベントは、例えば、電気的に誘発された放出事象28とは異なりドーパミンニューロンの直接脱分極によって駆動されるとは限らない。したがって、フェース神経活動は、FSCVを介して検出されたドーパミン放出事象との解離性を有する可能性がある。また、光学的に呼び起こされるDA放出は、電気的に誘発されたDA放出イベントとは異なることを示している。近年、光学的刺激と電気的に誘発された刺激の比較により、電気的に誘発された刺激は、フェジードDA放出の多シナプス調節を生じるのに対し、光学的に誘発された刺激は刺激をより特異的な回路29に制限することが明らかになっている。
いくつかの最近のアプローチは、生体内30の急速なドーパミンダイナミクスの回路の基礎となる回路を調査するために光遺伝学的および蛍光法を採用している。例えば、Sunたちの最近の研究は、実質的なニグラ中のドーパミンニューロンの光遺伝学的刺激が、Gタンパク質共役受容体活性化ベースDA(GRABDA)センサ30の発現を介して測定されるように、線条体におけるDAの急速な上昇を生じることを示した。光遺伝学的アプローチと蛍光アプローチを組み合わせることで、NAcでDA放出を測定しながら、VTAへの特定のアフェレンス入力を刺激または阻害することができます。CIS-FSCVは、特に光遺伝学的刺激としては、アッフェレントを刺激することはできませんが、VTA内のシナプス前および心内の感覚的受容体に関する質問に対処できるという利点があります。蛍光性およびFSCVのアプローチの両方が、Pa放出30,31の変化を比較可能に測定するのに十分な時間分解能(1-10 nM)とDA(1-10 nM)に対する感受性を有するが、FSCVが生体内のフェシックDAの蛍光モニタリングよりも高い利点を有し得る利点の1つは、記録に遺伝子操作が必要な点ではないということである。実際、CIS-FSCV実験は数時間以内に完了することができるのに対し、光遺伝学的アプローチと蛍光アプローチを組み合わせるには、ウイルス構築物を用いた十分な発現に十分な時間(数週間)が必要である。
CIS-FSCVの主な利点は、フェージックDA放出の特異的VTA受容体調節が無傷の脳で研究できることであり、VTAニューロンの電気生理学的特性を測定するか、またはPhasic DA放出のシナプス前調節を評価するインビトロ研究を構築する他のインビボ研究に基づいて構築する3,12。CIS-FSCVの注意点の1つは、これらの録音は比較的DAが豊富なエリアで行わなければならないということです。これは2つの理由からである:まず、ナノモル範囲と6,19以上のDA濃度しか検出できないFSCV感度にはいくつかの制限がある。第二に、FSCVは、その環状ボルタンモグラムがほぼ同一であるため、DAからノルエピネフリンの解離に問題があります。したがって、これらの研究は、内側前頭前野の一部、NAc、線条体、および嗅覚結核32のような高DAを有する領域を評価することに限定され得る。将来の研究は、DAとNEの間のより良い差別を可能にするFSCVアプローチの一部を採用することができるかもしれない, だけでなく、アデノシン33とセロトニンなどの他の電気活性神経伝達物質12.
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
エリザベスタウン・カレッジ(R.J.W,M.L.,L.M.),NSF大学院フェローシップ(R.J.W.),イェール大学医学部(N.A.)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
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