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Neuroscience

फास्ट-स्कैन साइक्लिक वोल्टामेट्री (सीआईएस-एफएससीवी) के साथ संयुक्त जलसेक और उत्तेजना फेसिक डोपामाइन के वेंट्रल टेगमेंटल एरिया रिसेप्टर विनियमन का आकलन करने के लिए

Published: April 23, 2020 doi: 10.3791/60886
Automatic Translation
1, *1, *1, 2,3
1Department of Psychology, Elizabethtown College, 2Department of Psychiatry, Yale University, 3Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सीधे वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र रिसेप्टर्स में हेरफेर करना है ताकि वे सबसेकंड डोपामाइन रिलीज में उनके योगदान का अध्ययन कर सके।

Abstract

वेंट्रल टेगमेंटल एरिया (वीटीए) से नाभिक एक्यूबेन्स को फेसिक डोपामाइन (डीए) रिलीज इनाम प्रसंस्करण और सुदृढीकरण सीखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वीटीए नियंत्रण फेसिक डीए रिलीज में विविध न्यूरोनल इनपुट कैसे समझते हैं, सर्किटरी की एक बेहतर तस्वीर प्रदान कर सकते हैं जो इनाम प्रसंस्करण और सुदृढीकरण सीखने को नियंत्रित करता है। यहां, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो उत्तेजना-पैदा किए गए फेसिक डीए रिलीज (संयुक्त जलसेक और उत्तेजना, या सीआईएस) के साथ औषधीय एगोनिस्टों और विरोधी के इंट्रा-वीटीए कैनुला इन्फ्यूजन को जोड़ती है, जैसा कि वीवो फास्ट-स्कैन चक्रीय वोल्टैममेट्री (एफएससीवी) में मापा जाता है। एनेस्थेटाइज्ड चूहों में सीआईएस-एफएससीवी का उपयोग करके, नाभिक एक्यूबेन्स कोर में रिकॉर्डिंग करते समय एक कैनुला के साथ लगे द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड के साथ वीटीए को विद्युत रूप से उत्तेजित करके एक चरणबद्ध डीए प्रतिक्रिया पैदा की जा सकती है। औषधीय agonists या विरोधी चरणबद्ध डीए रिलीज ड्राइविंग में विशिष्ट वीटीए रिसेप्टर्स की भूमिकाओं की जांच करने के लिए उत्तेजना स्थल पर सीधे संचार किया जा सकता है । सीआईएस-एफएससीवी का एक बड़ा लाभ यह है कि वीटीए रिसेप्टर फ़ंक्शन का अध्ययन वीवो में किया जा सकता है, इन विट्रो अध्ययनों का निर्माण किया जा सकता है।

Introduction

फेसिक डोपामाइन (डीए) वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र (वीटीए) से नाभिक एक्यूबेन्स (एनी) को जारी करना इनाम से संबंधित व्यवहार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वीटीए दा न्यूरॉन्स एक टॉनिक जैसी फायरिंग (3-8 हर्ट्ज) से एक फट-फायरिंग (>14 हर्ट्ज)1में स्विच करते हैं, जो एनएसी में फेसिक डीए रिलीज का उत्पादन करता है । वीटीए विभिन्न प्रकार के सोमाटोडेंडिटिक रिसेप्टर्स को व्यक्त करता है जो टॉनिक से फट-फायरिंग 2 , 3,4 ,5तक स्विच कोनियंत्रितकरने के लिए अच्छीतरहसे तैनात हैं। इन रिसेप्टर्स में से कौन सा पहचान, और उनके संबंधित आदानों, नियंत्रण phasic दा रिलीज कैसे इनाम से संबंधित circuitry आयोजित किया जाता है की हमारी समझ गहरा होगा । यहां वर्णित पद्धति का उद्देश्य, तेजी से स्कैन साइक्लिक वोल्टैममेट्री (सीआईएस-एफएससीवी) के साथ संयुक्त जलसेक और उत्तेजना, चरणबद्ध डीए रिलीज को चलाने में वीटीए रिसेप्टर्स की कार्यक्षमता का जल्दी और मजबूती से आकलन करना है।

संयुक्त जलसेक और उत्तेजना (सीआईएस) शब्द न्यूरॉन्स (यहां वीटीए) के एक समूह पर औषधीय रूप से हेरफेर रिसेप्टर्स को संदर्भित करता है और रिसेप्टर के कार्य का अध्ययन करने के लिए उन न्यूरॉन्स को उत्तेजित करता है। एनेस्थेटाइज्ड चूहे में, हम वीटीए को एनएसी कोर में एक बड़े फेसिक डीए सिग्नल (1-2 माइक्रोनएम) पैदा करने के लिए विद्युत रूप से उत्तेजित करते हैं, जैसा कि फास्ट-स्कैन चक्रीय वोल्टैममेट्री (एफएससीवी) द्वारा मापा जाता है। उत्तेजना स्थल पर औषधीय दवाओं (यानी, रिसेप्टर एगोनिस्ट/विरोधी) के इन्फ्यूजन का उपयोग बाद में हुए फेसिक डीए रिलीज में बाद में हुए परिवर्तन को देखकर वीटीए रिसेप्टर्स के कार्य को मापने के लिए किया जा सकता है। एफएससीवी एक इलेक्ट्रोकेमिकल दृष्टिकोण है जो उच्च स्थानिक (50-100 माइक्रोन) और अस्थायी (10 हर्ट्ज) संकल्प दोनों प्राप्त करता है, और इनाम से संबंधित, फेसिक डीए घटनाओं6, 7को मापने के लिए अच्छीतरहसे अनुकूल है। यह संकल्प वीवो न्यूरोकेमिकल मापों में अन्य की तुलना में बेहतर है, जैसे माइक्रोडायलिसिस। इस प्रकार, एक साथ, सीआईएस-एफएससीवी फेसिक डोपामाइन रिलीज के वीटीए रिसेप्टर विनियमन का आकलन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

वीटीए रिसेप्टर कार्य की जांच करने का एक सामान्य तरीका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोणों के संयोजन का उपयोग करना है जो यह पता लगाते हैं कि वे रिसेप्टर्स न्यूरॉन्स 1,8की गोलीबारी दर को कैसेबदलतेहैं । इन अध्ययनों को समझने में अत्यधिक मूल्यवान है जो रिसेप्टर्स सक्रियण पर दा फायरिंग ड्राइविंग में शामिल हैं । हालांकि, ये अध्ययन केवल यह सुझाव दे सकते हैं कि एक्सॉन टर्मिनल (यानी, न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई) पर डाउनस्ट्रीम क्या हो सकता है। सीआईएस-एफएससीवी इन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों पर इस बात का जवाब देकर बनाता है कि वीटीए फट-फायरिंग, फेसिक डीए रिलीज का आउटपुट वीटीए डेंड्राइट्स और सेल निकायों पर स्थित रिसेप्टर्स द्वारा कैसे विनियमित किया जाता है। इस प्रकार, सीआईएस-एफएससीवी इन इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययनों पर निर्माण करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। एक उदाहरण के रूप में, निकोटीन रिसेप्टर सक्रियण वीटीए9में फट-फायरिंग को प्रेरित कर सकता है, और एनेस्थेटाइज्ड चूहे में सीआईएस-एफएससीवी का उपयोग यह दिखाने के लिए किया गया था कि वीटीए में निकोटीन एसीटिलकोलिन रिसेप्टर (एनसीएएचआर) सक्रियण भी एनएसी10, 11में फेसिक डीए रिलीज कोनियंत्रितकरता है।

फेसिक डीए विनियमन की मशीनी परीक्षा भी आमतौर पर दवाओं के स्नान आवेदन के साथ टुकड़ा तैयारी का उपयोग कर अध्ययन किया जाता है। ये अध्ययन अक्सर डोपामाइन टर्मिनलों से फेसिक डीए रिलीज के प्रेसिनैप्टिक नियमन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, क्योंकि सेल निकायों को अक्सर स्लाइस12से हटा दिया जाता है। ये तैयारी डोपामाइन टर्मिनलों पर प्रेसिनैप्टिक रिसेप्टर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान हैं, जबकि सीआईएस-एफएससीवी डोपामाइन न्यूरॉन्स पर सोमाटोडेंडिट रिसेप्टर प्रभावों का अध्ययन करने के साथ-साथ वीटीए के लिए प्रेसिनैप्टिक इनपुट के लिए बेहतर अनुकूल है। यह अंतर महत्वपूर्ण है, क्योंकि वीटीए में सोमाटोडेंड्रिटिक रिसेप्टर एक्टिवेशन का एनएएसी प्रेसिनैप्टिक रिसेप्टर एक्टिवेशन की तुलना में अलग प्रभाव हो सकता है। दरअसल, एनएसी में डोपामिनेर्गिक प्रेसिनैप्टिक एनएएचआर अवरुद्ध फट-फायरिंग13के दौरान फेसिक डोपामाइन रिलीज को ऊंचा कर सकते हैं, जबकि इसके विपरीत वीटीए सोमाटोडेन्ड्रिक 10,11में सच है।

सीआईएस-एफएससीवी चरणबद्ध डीए रिलीज को विनियमित करने के लिए वीटीए रिसेप्टर्स की क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण है। महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण को एक अक्षुण्ण चूहे में किया जा सकता है, या तो एनेस्थेटाइज्ड या मुफ्त चलती है। यह दृष्टिकोण तीव्र अध्ययनों के लिए उपयुक्त है, अपने बेसलाइन राज्य10, 14में रिसेप्टर फ़ंक्शन का अध्ययन करने के साथ-साथदीर्घकालिक अध्ययन जो दवा जोखिम या व्यवहार हेरफेर11, 15के बाद रिसेप्टर में कार्यात्मक परिवर्तनों का आकलन कर सकते हैं।

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Protocol

सभी प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) गाइड के अनुसार आयोजित किया गया और दोनों एलिजाबेथटाउन कॉलेज और येल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया । यह प्रोटोकॉल सीआईएस-एफएससीवी का उपयोग करने की एनेस्थेटाइज्ड चूहा तैयारी के लिए विशिष्ट है।

1. प्रेग्नेंसी की तैयारी

  1. इलेक्ट्रोड समाधान तैयारी
    1. इलेक्ट्रोड बैकफिल समाधान बनाने के लिए, 140 m पोटेशियम क्लोराइड16के साथ 4 एम पोटेशियम एसीटेट का समाधान तैयार करें।
  2. इलेक्ट्रोड तैयारी
    1. वैक्यूम सक्शन का उपयोग करके, एक टी-650 कार्बन फाइबर (व्यास में 7 माइक्रोन) को बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (लंबाई = 100 मिमी, व्यास = 1.0 मिमी, व्यास = 0.5 मिमी के अंदर) डालें।
    2. एक बार कार्बन फाइबर ग्लास केशिका के अंदर रखा गया है, एक ऊर्ध्वाधर इलेक्ट्रोड पुलर में कांच केशिका जगह है, मोटे तौर पर केशिका के बीच में गर्मी तत्व के साथ । चुंबक बंद कर दिया के साथ 55 करने के लिए हीटर सेट करें।
    3. केशिका को खींचने के बाद, ऊपरी केशिका धारक को ध्यान से उठाएं ताकि इलेक्ट्रोड की नोक हीटिंग तत्व से घिरा न रहे।
    4. तेज कैंची का उपयोग करके, कार्बन फाइबर को काटें जो अभी भी केशिका के दो टुकड़ों को जोड़ रहा है। इसके परिणामस्वरूप दो अलग-अलग कार्बन फाइबर माइक्रोइलेक्ट्रोड होंगे।
    5. एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से एक तेज स्केलपेल के साथ उजागर कार्बन फाइबर में कटौती, ताकि कार्बन फाइबर ग्लास के अंत से परे लगभग 75-100 माइक्रोन फैली हुई है।
    6. एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड केशिका के साथ दरारों से मुक्त है। यह भी सुनिश्चित करें कि सील, जहां कार्बन फाइबर केशिका से बाहर निकलता है, नोटिस करना मुश्किल है और दरारों से मुक्त है।
      नोट: एक अच्छा सील रिकॉर्डिंग के दौरान शोर को कम करने में मदद करेगा। अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए17,18,19 प्रकाशित अध्ययन देखें।
  3. संदर्भ इलेक्ट्रोड निर्माण
    1. मिलाप एक 5 सेमी चांदी के तार के लिए एक सोने की पिन।
    2. एक धातु कागज क्लिप या अन्य कंडक्टर, एक पिन करने के लिए कैथोड के लिए एनोड संलग्न है, और एक वोल्टेज (~ 2 वी) लागू करते हैं, जबकि कागज क्लिप और चांदी के तार 0.1 एम एचसीएल में डूबे हुए हैं।
    3. एक बार एक सफेद कोटिंग (AgCl) चांदी के तार पर दिखाई देता है वोल्टेज बंद करो ।
  4. प्रत्यारोपण के लिए इलेक्ट्रोड तैयार करना
    1. मिलाप एक पतली अछूता तार (लंबाई में ~ 10 सेमी, <0.50 मिमी व्यास) के लिए एक सोने की पिन।
    2. सोने की पिन के विपरीत तार से ~5 सेमी इन्सुलेशन निकालें।
    3. इलेक्ट्रोड समाधान के साथ लगभग आधे रास्ते को भरें।
    4. इलेक्ट्रोड में इंसुलेटेड वायर डालें।
      नोट: तार इलेक्ट्रोड के अंदर कार्बन फाइबर के साथ संपर्क करना चाहिए ।

2. इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण

  1. वयस्क, पुरुष, स्प्राग डावले चूहों (250−450 ग्राम) को एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन (1.5 ग्राम/किलो या 1 एमएल/किलोग्राम मात्रा) 0.5 ग्राम/एमएल यूरिनरी को बाँझ खारे में भंग कर दें। 1.0−1.2 ग्राम/किलो की प्रारंभिक यूरेथेन खुराक के साथ शुरू करें। यदि जानवर अभी भी यूरिथेन प्रशासन के बाद 20 मिनट हानिकारक उत्तेजना परीक्षण (पूंछ चुटकी) के लिए उत्तरदायी है, तो 1.5 ग्राम/किलो कुल खुराक के लिए अतिरिक्त 0.3−0.5 ग्राम/
    नोट: 0.5 ग्राम/ एमएल यूरेथेन समाधान तैयार करने के लिए, खारा के 10 ग्राम (~ 10 एमएल) में 10 ग्राम मूत्रेथेन जोड़ें। यूरेथेन एक कैंसरजन है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। यूरेथेन एक महत्वपूर्ण एनेस्थेटिक है, क्योंकि यह डोपामाइन के स्तर को नहीं बदलता है, जैसा कि अन्य एनेस्थेटिक्स जैसे केटामाइन/जाइलाज़ीन और क्लोरल हाइड्रेट20, 21करते हैं।
  2. एक बार जब जानवर गहराई से एनेस्थेटाइज्ड हो जाता है और हानिकारक उत्तेजनाओं (जैसे, टोप चुटकी) के लिए उत्तरदायी नहीं होता है, तो इसे स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखें। चूहे की प्रत्येक आंख पर नेत्र स्नेहक लगाएं।
    नोट: यह एक गैर अस्तित्व सर्जरी है, लेकिन अच्छी aseptic तकनीक को प्रोत्साहित किया जाता है ।
  3. दो चरण के स्क्रब (यानी, एक आयोडोपोविडोन स्क्रब के बाद 70% इथेनॉल स्क्रब का उपयोग करके चूहे की खोपड़ी को साफ करें; 3 चक्र पुनरावृत्ति के साथ प्रदर्शन करें)।
  4. निष्फल सुई नाक चिमटी और सर्जिकल कैंची का उपयोग कर खोपड़ी ऊतक को काट लें। नीचे उल्लिखित विभिन्न प्रत्यारोपण के लिए जगह बनाने के लिए ऊतक की एक महत्वपूर्ण राशि निकालें।
  5. निष्फल कपास टिप एप्लिकेटर का उपयोग करके खोपड़ी की सतह को धीरे-धीरे साफ करें। इसके बाद लैम्ब्डा और ब्रेग्मा की पहचान करने में मदद करने के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड की 2−3 बूंदें लगाएं।
  6. एक स्टीरियोटैक्सिक या हैंड ड्रिल (1.0 मिमी, ~ 20,000 आरपीएम) का उपयोग करके, ब्रेग्मा के लिए 1.5 मिमी व्यास छेद 2.5 मिमी पूर्वकाल और ब्रेग्मा में 3.5 मिमी पार्श्व ड्रिल करें। आंशिक रूप से (आधे रास्ते के बारे में, जब तक यह जगह में मजबूती से है) इस छेद में एक पेंच (१.५९ मिमी O.D., ३.२ मिमी लंबा) प्रत्यारोपण । थर्मल चोट को रोकने के लिए ड्रिलिंग करते समय सिंचाई के लिए बाँझ नमकीन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  7. संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए, बाएं गोलार्द्ध में 1.0 मिमी व्यास छेद 1.5 मिमी पूर्वकाल और ब्रेग्मा में 3.5 मिमी पार्श्व ड्रिल करें।
  8. हाथ से, इस छेद में संदर्भ तार के ~ 2 मिमी डालें, जबकि संदर्भ तार के चारों ओर और प्रत्यारोपित पेंच के सिर के नीचे लपेटकर।
  9. पूरी तरह से पेंच प्रत्यारोपण, जगह में संदर्भ इलेक्ट्रोड नीचे लगाए ।
  10. सही गोलार्द्ध में, ब्रेग्मा में 1.5 मिमी व्यास छेद 1.2 मिमी पूर्वकाल और 1.4 मिमी पार्श्व ड्रिल करें।
  11. चिमटी का उपयोग करते हुए धीरे-धीरे ड्यूरा को हटा दें।
  12. उत्तेजक इलेक्ट्रोड के लिए, एक वर्ग छेद (2 मिमी पूर्वकाल-पीछे, 5 मिमी मध्य-पार्श्व) ड्रिल करें जो 5.2 मिमी पीछे और 1.0 मिमी पार्श्व में केंद्रित है।
  13. स्टीरियोटैक्टिक आर्म बार का उपयोग करके, ड्यूरा के नीचे द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड/गाइड कैनुला 5 मिमी कम करें। इलेक्ट्रोड के प्रत्यारोपण के दौरान रक्तस्राव के मामले में, रक्तस्राव को कम करने के लिए बाँझ कपास झाड़ू और धुंध का उपयोग करें।
    नोट: इस विधि में उपयोग किए जाने वाले द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड को गाइड कैनुला(सामग्री की तालिका) केसाथ प्रीफिट किया जाता है। इस आइटम के साथ उपयोग किए जाने वाले आंतरिक कैनुला को गाइड कैनुला में पूरी तरह से डाले जाने पर द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड पर शूल के साथ फ्लश किया जाना चाहिए। यह आंतरिक कैनुला को उत्तेजक के दो शूल के बीच सीधे बैठने की अनुमति देगा, जो लगभग 1 मिमी अलग बैठते हैं। इसी तरह का एक प्रोटोकॉल कहीं और14वर्णित है ।
  14. स्टीरियोटैक्टिक आर्म बार का उपयोग करके, कार्बन फाइबर माइक्रोइलेक्ट्रोड को ड्यूरा के नीचे 4 मिमी कम करें। यह स्थान स्ट्राटम के सबसे पृष्ठीय भाग में है।
  15. संदर्भ तार और कार्बन फाइबर को एक शक्तिशाली रूप से कनेक्ट करें।
  16. 60 हर्ट्ज पर 15 मिनट के लिए और फिर 10 हर्ट्ज पर 10 मिनट के लिए त्रिकोणीय तरंग रूप (-0.4−1.3 वी, 400 V/s) लागू करें।
    नोट: आमतौर पर, मस्तिष्क में कार्बन फाइबर माइक्रोइलेक्ट्रोड के लिए तरंग रूपों को लागू करते समय, ऑक्साइड समूहों को कार्बन फाइबर की सतह में जोड़ा जाता है। इस प्रतिक्रिया का संतुलन रिकॉर्डिंग से पहले पहुंचा जाना चाहिए; अन्यथा महत्वपूर्ण बहाव19हो जाएगा . उच्च आवृत्तियों (60 हर्ट्ज) पर इलेक्ट्रोड को साइकिल चलाने से कार्बन फाइबर तेजी से संतुलन प्राप्त करने में मदद करता है।

3. कार्बन फाइबर का अनुकूलन और उत्तेजक इलेक्ट्रोड/गाइड कैनुला स्थानों

  1. 60 हर्ट्ज, 24 दालों, 300 μa वर्तमान, और 2 एमएस/
  2. धीरे-धीरे 0.2 मिमी की वेतन वृद्धि में उत्तेजक को 5 मिमी से कम करके ड्यूरा से 7.8 मिमी तक कम करें। प्रत्येक वेतन वृद्धि पर, वीटीए को प्रोत्साहित करें।
    नोट: अधिक पृष्ठीय गहराई (5−6 मिमी) पर, मस्तिष्क की उत्तेजना आमतौर पर (~ 80% समय) चूहे की मूंछ को झटकने का कारण बनती है। आगे की गहराई में, मूंछ हिलना बंद हो जाएगी, जो ड्यूरा के नीचे 7.5−8.2 मिमी के बीच होती है। जब मूंछ हिलना बंद हो जाती है, तो उत्तेजक इलेक्ट्रोड वीटीए के पास या उस पर होगा। यह हर चूहे में नहीं होगा, और मूंछ हिल की कमी एक संकेत है कि द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड/जलसेक cannula गलत है के रूप में नहीं लिया जाना चाहिए । मूंछ हिल सभी एनेस्थेटिक्स (जैसे, आइसोफ्लोरे) के लिए नहीं हो सकता है।
  3. जब तक एक उत्तेजना कार्बन फाइबर माइक्रोइलेक्ट्रोड (वर्तमान में पृष्ठीय स्ट्राटम में) में फेसिक डीए रिलीज पैदा नहीं करती है तब तक द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड/गाइड कैनुला को कम करना जारी रखें।
    नोट: पृष्ठीय स्ट्राटम में डीए रिलीज हमेशा नहीं होगा यदि बाइपोलर इलेक्ट्रोड वीटीए में प्रत्यारोपित किया जाता है, लेकिन वीटीए उत्तेजना पर पृष्ठीय स्ट्राटम में डीए रिलीज का अवलोकन आमतौर पर एक अच्छा संकेत है कि एनैक कोर में एक अच्छा संकेत देखा जाएगा।
  4. कार्बन फाइबर माइक्रोइलेक्ट्रोड को तब तक कम करें जब तक कि यह ड्यूरा से कम से कम 6.0 मिमी न हो जाए। यह एनएसी कोर का सबसे पृष्ठीय हिस्सा है।
  5. वीटीए को उत्तेजित करें और डीए चोटी के शिखर आयाम को रिकॉर्ड करें।
  6. सबसे कम या साइट है कि सबसे बड़ी डीए रिलीज का उत्पादन पर कार्बन फाइबर माइक्रोइलेक्ट्रोड बढ़ा ।
  7. सुनिश्चित करें कि डीए प्रतिक्रिया का शिखर 0.6 वी पर एक स्पष्ट ऑक्सीकरण शिखर और -0.2 वी पर एक कमी चोटी है। ये चोटियां डीए के संकेत हैं।

4. संयोजन जलसेक और उत्तेजना एफएससीवी रिकॉर्डिंग

नोट: चित्रा 1 वीटीए माइक्रोइनफ्यूजन से पहले और बाद में रिकॉर्डिंग के लिए समय रेखा दिखाता है।

  1. एक बार कार्बन फाइबर और उत्तेजक इलेक्ट्रोड/गाइड कैनुला स्थान को अनुकूलित किया गया है, ~ 20−30 मिनट के लिए उत्तेजित करें।
    नोट: वर्तमान उत्तेजना मापदंडों के तहत, हर 3 मिनट में एक बार से अधिक किसी को उत्तेजित न करें, वेसिकुलर रीलोडिंग22के लिए अनुमति दें।
  2. एक स्थिर आधार रेखा (पांच उत्तेजनाओं पर <20% भिन्नता) प्राप्त करने के बाद, आंतरिक कैनुला को धीरे-धीरे गाइड कैनुला में हाथ से कम करें जो द्विध्रुवी उत्तेजक में पूर्वीकृत है।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त 2−3 बेसलाइन रिकॉर्डिंग लें कि कैनुला प्रविष्टि ने पैदा किए गए संकेत में बदलाव नहीं किया। कुछ मामलों में, आंतरिक कैनुला को सम्मिलित करना और हटाने से वीटीए को नुकसान हो सकता है। यदि इस बेसलाइन अवधि (>20%) पर सिग्नल में भारी परिवर्तन होता है, तो बेसलाइन को फिर से खत्म होने तक अतिरिक्त 3−4 रिकॉर्डिंग लें।
  4. एक सिरिंज पंप और माइक्रोसिरिंग का उपयोग करके, 2 मिनट की अवधि में वीटीए में 0.5 माइक्रोन का समाधान (उदाहरण के लिए, 0.9% खारा, एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट [एनएमडीए], (2R- अमीनो-5-फॉस्फोनोलेरिक एसिड [एपी5]) का संचार करें।
  5. पोस्टइनफ्यूजन, हटाने से पहले कम से कम 1 मिनट के लिए आंतरिक कैनुला छोड़ दें।
    नोट: कुछ दवाओं को दवा काइनेटिक्स के आधार पर लंबे समय तक आंतरिक कैनुला छोड़ने की आवश्यकता हो सकती है, और आंतरिक कैनुला को हटाने से दवा आंतरिक कैनुला के माध्यम से वापस यात्रा कर सकती है। यदि चिंता है, तो कोई रिकॉर्डिंग की संपूर्णता के दौरान गाइड कैनुला में आंतरिक कैनुला छोड़ सकता है। अन्यथा, इस 1 मिनट के अंतराल के बाद रिकॉर्डिंग शुरू हो सकती है।
  6. पोस्टिनफ्यूजन प्रभावों को मापने के लिए हर 3 मिनट रिकॉर्डिंग जारी रखें।
    नोट: यदि नियंत्रण समाधान को बढ़ावा देना है, और कोई प्रभाव नहीं देखा जाता है, तो दूसरी बार10का संचार करना संभव है। यदि आंतरिक कैनुला या खारा जलसेक डालने के कारण डीए रिलीज बदल जाता है, तो संकेत आमतौर पर 30 मिनट के भीतर बेसलाइन पर ठीक हो जाता है।

5. इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट का हिस्टोलॉजिकल सत्यापन

  1. प्रयोग के अंत में, कार्बन फाइबर माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करके रिकॉर्डिंग साइट पर एक छोटा सा घाव बनाएं।
    1. यदि इलेक्ट्रोड को पोस्टएक्सपेरमेंट अंशांकन के लिए संरक्षित किया जाना चाहिए, तो एक ग्लास केशिका में रखे टंगस्टन तार का उपयोग करें जो केशिका टिप से परे ~ 100 माइक्रोन फैला हुआ है। इस मामले में, मस्तिष्क से इलेक्ट्रोड उठाएं, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को टंगस्टन इलेक्ट्रोड से बदलें, और इसे एक ही डोरसोवेंट्रल समन्वय में कम करें।
      नोट: कार्बन फाइबर मस्तिष्क के रूप में अच्छी तरह से घाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और रिकॉर्डिंग साइट के स्थान का एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व प्रदान करेगा; हालांकि, प्रयोगकर्ता इन इलेक्ट्रोड को कैलिब्रेट करने की क्षमता खो देगा।
  2. रिकॉर्डिंग साइट को घाव करने के लिए, बिजली की आपूर्ति का उपयोग करके वोल्टेज लागू करें। 1 वी से शुरू करें और 10 वी तक पहुंचने तक हर 10 एस में 1 वी बढ़ाएं।
  3. पेंटोबार्बिटल (150 मिलीग्राम/किलो) के घातक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके जानवर को इच्छामृत्यु दें।
  4. 4% फॉर्मेलिन समाधान का उपयोग करके चूहे को पर्फ्यूज करें।
  5. एक तेज गिलोटिन का उपयोग करके चूहे से सिर निकालें।
  6. रोंगर्स का उपयोग करके, मस्तिष्क के आसपास के संयोजी ऊतक और खोपड़ी को हटा दें, और मस्तिष्क को किसी भी शेष ऊतक से धीरे-धीरे उखाड़ दें।
  7. मस्तिष्क को 1 दिन के लिए 4% फॉर्मेलिन में स्टोर करें और फिर इसे 30% सुक्रोज में स्थानांतरित करें।
    नोट: घाव साइट को देखने के लिए 4% फॉर्मेलिन के साथ परफ्यूजन आवश्यक नहीं है, हालांकि एक सर्वोत्तम अभ्यास के रूप में यह घाव साइट के पुनर्निर्माण में सुधार करेगा।
  8. क्रायोस्टेट का उपयोग करके मस्तिष्क के 30 माइक्रोन स्लाइस बनाएं।
  9. स्लाइड्स पर स्लाइस माउंट और एक कवर पर्ची के साथ कवर ।
  10. एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कार्बन फाइबर माइक्रोइलेक्ट्रोड घाव और द्विध्रुवी उत्तेजक/जलसेक कैनुला स्थान के स्थान को निरूपित करें।

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Representative Results

सीआईएस-एफएससीवी का उपयोग एनसी कोर में फेसिक डीए रिलीज को चलाने में वीटीए एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट रिसेप्टर्स (एनएमडार), निकोटीनिक एसीटिल्कोलिन रिसेप्टर्स (एनएएचआरएस), और मस्केरिनिक एसीटिलकोलिन रिसेप्टर्स (एमएएचआरएस) के कार्य का अध्ययन करने के लिए किया गया था। चित्रा 2 एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है, ०.९% खारा के अर्क, पहले (बेसलाइन) और 9 मिनट के बाद जलसेक (खारा) । चित्रा 2 वाई-एक्सिस पर क्षमता के साथ एक रंग साजिश दिखाता है, एक्स-एक्सिस पर समय, और वर्तमान (झूठे रंग के रूप में प्रतिनिधित्व) जेड-एक्सिस, वर्तमान बनाम समय निशान (आईवीटी) पर, साथ ही चोटी पर लिए गए एक चक्रीय वोल्टामोग्राम ने यह प्रदर्शित करने के लिए प्रतिक्रिया पैदा की कि विश्लेषण मापा डीए से मेल खाती है। जैसा कि उम्मीद थी, खारा जलसेक उत्तेजित फेसिक डीए रिलीज को नहीं बदल पाया।

यह प्रदर्शित करने के लिए कि सीआईएस-एफएससीवी अगोनिस्ट और विरोधी का उपयोग करते समय द्विदिशात्मक प्रभाव पैदा कर सकता है, हमने एनएमएमडार एगोनिस्ट, एनएमडीए (500 एनजी) के जलसेक के प्रभावों की तुलना की; चित्रा 3ए)NMDAR विरोधी, AP5 (1 μg; चित्रा 3बी)। एनएमडीए के जलसेक ने उत्तेजित फेसिक डीए रिलीज(चित्रा 3ए,9 मिनट जलसेक के बाद) में एक मजबूत वृद्धि का उत्पादन किया, जबकि एनएमएमडार प्रतिस्पर्धी विरोधी, एपी 5 (1 माइक्रोन) ने एक मजबूत कमी(चित्रा 3बी,9 मिनट जलसेक के बाद) का उत्पादन किया। एसिटिलकोलिन रिसेप्टर्स के विभिन्न वर्गों को लक्षित करने वाले विरोधी का उपयोग करके सीआईएस-एफएससीवी की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हमने गैर-चयनात्मक, गैर-प्रतिस्पर्धी nAChR विरोधी mecamylamine (3 माइक्रोन) के अर्क के प्रभावों की तुलना की; चित्रा 4ए)और गैर-निर्वाचक, प्रतिस्पर्धी mAChR विरोधी स्कोपोलामाइन (67 माइक्रोन; चित्रा 4बी)। दोनों दवाओं ने उत्तेजित फेसिक डीए रिलीज(चित्रा 4, 9मिनट पोस्टिनफ्यूजन) में मजबूत कमी का उत्पादन किया। चित्रा 2, चित्रा 3और चित्रा 4के परिणामों का सारांश चित्रा 5में पुनर्प्रादा है, जहां बेसलाइन अवधि पांच उत्तेजनाओं से अधिक औसत है और दवा अवधि बेसलाइन औसत के प्रतिशत के रूप में प्रदर्शित की जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: वीटीए माइक्रोइनफ्यूजन से पहले और बाद में रिकॉर्डिंग के लिए टाइमलाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बेसलाइन के प्रतिनिधि रंग और आईवीटी भूखंड (बाएं) और खारा (वाहन) जलसेक (दाएं) एक पुरुष स्प्राग डावले चूहे में एनएसी कोर में उत्तेजित फेसिक डीए रिलीज पर। ब्लू बार उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करता है। बेसलाइन रिकॉर्डिंग टी = 0 पर होती है, इससे पहले कि आंतरिक कैनुला को बाइपोलर उत्तेजक में गाइड कैनुला में रखा गया था। खारा रिकॉर्डिंग 9 मिनट (टी = 9) पोस्टइनफ्यूजन लिया गया था । साइक्लिक वोल्टमोग्राम इनसेट आईवीटी भूखंडों के शिखर के अनुरूप है, जो 0.6 वी पर पीक ऑक्सीकरण और -0.2 वी पर पीक कमी दिखाता है, जो डीए का संकेत है। खारा वीटीए जलसेक के बाद उत्तेजित पैदा रिलीज में कोई परिवर्तन नहीं देखा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एनएमएमडार एगोनिस्ट (एनएमडीए) और विरोधी (एपी 5) के अर्क के प्रभाव। (A)बेसलाइन के प्रतिनिधि रंग और आईवीटी भूखंड (बाएं) और एनएमएमदार एगोनिस्ट इन्फ्यूजन (दाएं) के 500 एनजी ने एक पुरुष स्प्राग डावले चूहे में एनएसी कोर में उत्तेजित फेसिक डीए रिलीज पर। एनएमडीए जलसेक ने उत्तेजित फेसिक डीए रिलीज (रिकॉर्डिंग 9 मिनट पोस्टिनफ्यूजन लिया) में वृद्धि की। (B)बेसलाइन के प्रतिनिधि रंग और आईवीटी भूखंड (बाएं) और एनएमएमदार विरोधी (2R) के 1 माइक्रोन-अमीनो-5-फॉस्फोनोलेलेरिक एसिड (एपी5) जलसेक (दाएं) एक पुरुष स्प्राग डावले चूहे में एनएसी कोर में उत्तेजित फेसिक डीए रिलीज पर । AP5 जलसेक कम उत्तेजित phasic DA रिलीज (रिकॉर्डिंग 9 मिनट के बाद जलसेक लिया) । बेसलाइन रिकॉर्डिंग टी = 0 पर हुई, इससे पहले कि आंतरिक कैनुला को बाइपोलर उत्तेजक में गाइड कैनुला में रखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मेकैमामाइन और स्कोपोलामाइन के अर्क के प्रभाव। (ए)बेसलाइन के प्रतिनिधि रंग और आईवीटी भूखंड (बाएं) और एक ही पुरुष स्प्रा डागुएले रैट में एनएसी कोर में उत्तेजित फेसिक डीए रिलीज पर नॉनसेलिटिव निकोटीक एसीटिलकोलिन रिसेप्टर एंटीगोनिस्ट मीकामिलामाइन (एमईसी) इन्फ्यूजन (दाएं) के 3 माइक्रोन । (ख)बेसलाइन के प्रतिनिधि रंग और आईवीटी भूखंड (बाएं) और एक ही पुरुष स्प्राग डावले रैट में एनएसी कोर में उत्तेजित फेसिक डीए रिलीज पर नॉनसिलिटिक एसीटिलकोलिन रिसेप्टर विरोधी स्कोपोलामाइन (दाएं) के 67 माइक्रोन। बेसलाइन रिकॉर्डिंग टी = 0 पर हुई, इससे पहले कि आंतरिक कैनुला को द्विध्रुवी उत्तेजक में गाइड कैनुला में रखा गया था। एमईसी और स्कोप रिकॉर्डिंग 9 मिनट के बाद जलसेक लिया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: समय के साथ दवा प्रभाव दिखा डेटा सारांश। पूर्व-जलसेक अवधि (बेसलाइन) पांच उत्तेजनाओं पर औसत थी, और पोस्टिनफ्यूजन अवधि (टी = 3 से शुरू) को बेसलाइन के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। 9 मिनट के बाद जलसेक में, हमने देखा कि खारा जलसेक के बाद पैदा दा सिग्नल 103% बेसलाइन था, एनएमडीए जलसेक के बाद 196%, एपी5 जलसेक के बाद 18%, एमईसी जलसेक के बाद 49% और स्कोप जलसेक के बाद 43% था। n = 1 प्रति शर्त। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सीआईएस-एफएससीवी चरणबद्ध डीए रिलीज में अंतर्निहित वीटीए रिसेप्टर तंत्र की जांच करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। उचित रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करने के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, एक स्थिर बेसलाइन रिकॉर्डिंग प्राप्त किया जाना चाहिए, पैदा दा संकेत में थोड़ा बहाव के साथ । एक स्थिर रिकॉर्डिंग स्थापित करने की संभावना को बढ़ाने का एक महत्वपूर्ण तरीका यह सुनिश्चित करना है कि इलेक्ट्रोड को 60 हर्ट्ज और 10 हर्ट्ज दोनों में चक्र के लिए बहुत समय लगा है (आमतौर पर 60 हर्ट्ज पर 15 मिनट, और 10 हर्ट्ज पर 10 मिनट)। जैसे ही कार्बन फाइबर को साइकिल किया जा रहा है, कार्बन फाइबर स्वयं ऑक्सीकरण करता है, और नक़्क़ाशीदार हो जाता है, सतह क्षेत्र को कम करता है लेकिन डोपामाइन सोखने के लिए नई सतह का उत्पादन करता है23। इससे डीए के प्रति संवेदनशीलता बढ़ सकती है। इस प्रकार, किसी भी औषधीय हेरफेर के बजाय, इस वृद्धि हुई नक़्क़ाशी के कारण प्रयोग में समय के साथ उत्तेजित डोपामाइन रिलीज में मामूली वृद्धि देख सकते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रारंभिक संज्ञाहरण के 90 से 120 मिनट के भीतर एक रिकॉर्डिंग शुरू करने से लंबे समय तक स्थिर रिकॉर्डिंग की संभावना बढ़ जाएगी। जैसे, चूहा संज्ञाहरण से मौत के करीब है, यह पैदा दा रिलीज के लिए धीरे से कम करने के लिए विशिष्ट है ।

इस प्रक्रिया में दूसरा महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि जलसेक कैनुला को धीरे-धीरे द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड में डाला जाए। आंतरिक कैनुला डालने के दौरान बहुत अधिक दबाव रखा जाता है, और परिणामस्वरूप, डोपामाइन संकेत कृत्रिम रूप से बढ़ सकता है या कम हो सकता है, क्योंकि उत्तेजना साइट अलग हो सकती है। यदि कैनुला प्रविष्टि के बाद पैदा किए गए संकेत में महत्वपूर्ण परिवर्तन होता है, तो एक नई आधारभूत अवधि स्थापित की जानी चाहिए। इसके अलावा, यदि आंतरिक कैनुला या वाहन जलसेक डालने के कारण डीए रिलीज बदल जाता है, तो सिग्नल आमतौर पर 30 मिनट के भीतर बेसलाइन पर ठीक हो जाता है। वहां वाहन जलसेक के लिए डीए रिलीज में व्यापक परिवर्तन होना चाहिए, जलसेक दर या मात्रा कम किया जा सकता है । जांचकर्ता यह आकलन करने के लिए जलसेक से पहले आंतरिक कैनुला डालने के बाद एक अतिरिक्त रिकॉर्डिंग भी कर सकते हैं कि क्या कैनुला का सम्मिलन ही रिलीज को बदल सकता है। संबंधित रूप से, यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण है कि जलसेक हुआ, और आंतरिक कैनुला की कोई नाकाबंदी नहीं है। ऐसा करने का एक तरीका जलसेक ट्यूबिंग में एक छोटा सा बुलबुला बनाना है, और इसे पेन या मार्कर के साथ चिह्नित करना है। जलसेक के बाद बुलबुला मार्कर से आगे दूर होना चाहिए। यह सुनिश्चित करने का एक और तरीका है कि जलसेक ठीक से हुआ आंतरिक कैनुला मस्तिष्क से हटा दिया गया है के बाद जलसेक पंप चालू करना है, और यदि अभी भी टिप पर समाधान बन रहा है, तो एक सफल जलसेक होने की संभावना है।

सीआईएस-एफएससीवी को समय11के साथ रिसेप्टर समारोह में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए व्यवहार रूप से भोले और प्रशिक्षित जानवरों दोनों में वीटीए रिसेप्टर्स का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सीआईएस-एफएससीवी को 5-एचटी और नोरेपाइनफ्रीन (एनई)24, 25को मापने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। सीआईएस-एफएससीवी जाग, व्यवहार प्रयोगों के लिए भी अत्यधिक उपयुक्त है और इसे ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण26,27के साथ एकीकृत किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विद्युत रूप से पैदा की गई रिलीज की घटनाएं अक्सर मुक्त-चलती अध्ययनों में देखी जाने वाली क्षणिक रिलीज घटनाओं से अलग होती हैं, और कम बार एनेस्थेटाइज्ड तैयारी में होती हैं। क्षणिक रिलीज की घटनाओं, उदाहरण के लिए, जरूरी नहीं कि विद्युत रूप से पैदा की रिहाई की घटनाओं28के विपरीत डोपामाइन न्यूरॉन्स के प्रत्यक्ष deध्रुवीकरण से प्रेरित हो सकता है । जैसे, चरणबद्ध तंत्रिका गतिविधि एफएससीवी के माध्यम से पाए गए डोपामाइन रिलीज की घटनाओं से अलग हो सकती है। इसके अलावा, ऑप्टिकली पैदा डीए रिलीज के लिए विद्युत पैदा डीए रिलीज की घटनाओं से अलग दिखाया गया है । ऑप्टिकली और विद्युत रूप से पैदा की गई उत्तेजना के बीच हाल ही में की गई तुलना से पता चला है कि विद्युत रूप से पैदा की गई उत्तेजना फेसिक डीए रिलीज के मल्टीसाइनैप्टिक विनियमन का उत्पादन करती है, जबकि ऑप्टिकल रूप से पैदा की गई उत्तेजना उत्तेजना को अधिक विशिष्ट सर्किट29तक सीमित कर सकती है।

हाल के कुछ दृष्टिकोणों ने वीवो30में सर्किटरी अंतर्निहित रैपिड डोपामाइन गतिशीलता की जांच करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक और फ्लोरोसेंट तरीकों को नियोजित किया है। उदाहरण के लिए, सूर्य और सहयोगियों द्वारा हाल के काम से पता चला है कि सब्स्तानटिया निग्रा में डोपामाइन न्यूरॉन्स की ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना स्ट्राटम में डीए की तेजी से ऊंचाई पैदा करती है, जैसा कि जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर-एक्टिवेशन-आधारित डीए (ग्रैबडीए)सेंसर30की अभिव्यक्ति के माध्यम से मापा जाता है । संयुक्त ऑप्टोजेनेटिक और फ्लोरेसेंस दृष्टिकोण का उपयोग एनएसी में डीए रिलीज को मापने के दौरान वीटीए के लिए विशिष्ट अफरेंशक आदानों को प्रोत्साहित या बाधित करने के लिए किया जा सकता है। सीआईएस-एफएससीवी विशेष रूप से ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के रूप में afferents को उत्तेजित नहीं कर सकता है, लेकिन यह एक फायदा है कि यह वीटीए के भीतर प्रेसिनैप्टिक और पोस्टसिनैप्टिक रिसेप्टर्स के बारे में सवालों का समाधान कर सकता है। जबकि फ्लोरोसेंट और एफएससीवी दोनों दृष्टिकोणों में पर्याप्त अस्थायी संकल्प (सबसेकंड) और डीए (1-10 एनएम) के प्रति संवेदनशीलता है ताकि चरणबद्ध डीए रिलीज30,31में परिवर्तन को तुलनात्मक रूप से माप सकें, एक लाभ एफएससीवी के पास वीवो में फेसिक डीए की फ्लोरोसेंट निगरानी हो सकती है कि रिकॉर्डिंग के लिए कोई जोड़तोड़ आनुवंशिकी की आवश्यकता नहीं है। दरअसल, सीआईएस-एफएससीवी प्रयोग को घंटों के भीतर पूरा किया जा सकता है, जबकि संयुक्त ऑप्टोजेनेटिक और फ्लोरेसेंस दृष्टिकोणों को वायरल संरचनाओं का उपयोग करके पर्याप्त अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त समय (सप्ताह) की आवश्यकता होती है।

सीआईएस-एफएससीवी का एक प्रमुख लाभ यह है कि फेसिक डीए रिलीज के विशिष्ट वीटीए रिसेप्टर विनियमन का अध्ययन अक्षुण्ण मस्तिष्क में किया जा सकता है, वीवो अध्ययनों में अन्य पर निर्माण किया जा सकता है जो या तो वीटीए न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को मापते हैं या विट्रो अध्ययन में जो फेसिक डीए रिलीज3,12के प्रेसिनैप्टिक नियमन का मूल्यांकन करते हैं। सीआईएस-एफएससीवी की एक चेतावनी यह है कि ये रिकॉर्डिंग अपेक्षाकृत डीए-समृद्ध क्षेत्र में की जानी चाहिए। यह दो कारणों से है: पहला, एफएससीवी संवेदनशीलता की कुछ सीमाएं हैं, जो केवल नैनोमोल्लर रेंज में और6,19से ऊपर डीए सांद्रता का पता लगा सकती हैं। दूसरा, एफएससीवी को डीए से नोरेपाइनफ्रीन को अलग करने में परेशानी होती है, क्योंकि उनके चक्रीय वोल्टामोग्राम लगभग समान होते हैं। इस प्रकार, ये अध्ययन उच्च डीए वाले क्षेत्रों का आकलन करने तक सीमित हो सकते हैं, जैसे कि मध्यपूर्व प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स, एनएसी, स्ट्राटम और घ्राण ट्यूबरकल32के कुछ हिस्से। भविष्य के अध्ययन कुछ अग्रिमों को नियोजित करने में सक्षम हो सकते हैं एफएससीवी दृष्टिकोण जो डीए और एनई के बीच बेहतर भेदभाव के साथ-साथ अन्य इलेक्ट्रोएक्टिव न्यूरोट्रांसमीटर जैसे एडेनोसाइन33 और सेरोटोनिन12के बीच बेहतर भेदभाव की अनुमति देते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

काम एलिजाबेथटाउन कॉलेज (आरजेडब्ल्यू, एमएल, और एल.M) द्वारा समर्थित था, एक एनएसएफ ग्रेजुएट फैलोशिप (आरजेडब्ल्यू) द्वारा और येल स्कूल ऑफ मेडिसिन (एनए) द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electrode Filling Solution/Supplies
Micropipette World Precision Instruments MF286-5 (28 gauge)
Potassium Acetate Sigma 236497-100G
Potassium Chloride Sigma P3911-25G
Electrode Supplies
Carbon fiber Thornel T650
Electrode puller Narishige International PE-22 Note: horizontal pullers can be used as well
Glass capillary A-M systems 626000
Insulated wires for electrodes Weico Wire and Cable Incorporated UL 1423 Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire
Light Microscope (for viewing and cutting electrode) Fischer Scientific M3700
Pin Phoenix Enterprises HWS1646 To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage
Putty Alcolin 23922-1003 Used to place electrode on while cutting the carbon fiber
Scalpal Blade World Precision Instruments 500239 For cutting carbon fiber to the apprpriate length
Silver Wire Sigma 327026-4G
FSCV Hardware/Software
Faraday Cage U-Line H-3618 (36" x 24" x 42")
Potentiostat Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Stimulating electrode PlasticsOne MS303/2-A/SPC when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
TarHeel HDCV Software University of North Carolina-Chapel Hill - https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI breakout box Univ. of N. Carolina, Electronics Facility https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI power supply Univ. of N. Carolina, Electronics Facility https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
Stimulator Hardware
Neurolog stimulus isolator Digitimer Ltd. DS4 Neurolog 800A
Infusion/Stimulation Supplies
Infusion Pump New Era Syringe Pump NE-300
Internal Cannula PlasticsOne C315I/SPC INTERNAL 33GA
Microliter Syringe Hamilton 80308
Tubing PlasticsOne C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50
Surgical Supplies
Cannula Holder Kopf Instruments 1776 P-1
Cotton Tip Applicators Vitality Medical 806
Electrode Holder Kopf Instruments 1770
Heating Pad Kent Scientific RT-0501
Povidone Iodine Vitality Medical 29906-004
Screws Stoelting Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 1.59 mm O.D., 3.2 mm long
Silver wire reference with AgCl InVivo Metric E255A
Square Gauze Vitality Medical 441408
Stereotax Kopf Instruments Model 902 (Dual Arm Bar)
Histological Supplies
Formulin Sigma 1004960700
Power supply BK Precision 9110
Sucrose Sigma 80497
Tungsten microelectrode MicroProbes WE30030.5A3
Drugs for infusions
((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma Aldrich A5282
N-methyl-D-aspartate Sigma Aldrich M3262
Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) Sigma Aldrich M9020
Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) Sigma Aldrich S0929

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न्यूरोसाइंस अंक 158 डोपामाइन वेंट्रल टेगमेंटल एरिया न्यूक्लियस एक्यूबेन्स चूहा फास्ट-स्कैन साइक्लिक वोल्टामेट्री निकोटीनिक रिसेप्टर्स एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट रिसेप्टर्स मस्केरिनिक रिसेप्टर्स
फास्ट-स्कैन साइक्लिक वोल्टामेट्री (सीआईएस-एफएससीवी) के साथ संयुक्त जलसेक और उत्तेजना फेसिक डोपामाइन के वेंट्रल टेगमेंटल एरिया रिसेप्टर विनियमन का आकलन करने के लिए
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