Summary
Målet med denne protokollen er å direkte manipulere ventrale tegmentale områdereseptorer for å studere deres bidrag til subsecond dopaminfrigjøring.
Abstract
Phasic dopamin (DA) frigjøring fra ventral tegmental området (VTA) til kjernen accumbens spiller en sentral rolle i belønning behandling og forsterkning læring. Å forstå hvordan de forskjellige nevroninngangene i VTA-kontrollens fasiske DA-utgivelse kan gi et bedre bilde av kretsene som styrer belønningsbehandling og forsterkningslæring. Her beskriver vi en metode som kombinerer intra-VTA cannula infusjoner av farmakologiske agonister og antagonister med stimulering-fremkalt fasisk DA-frigjøring (kombinert infusjon og stimulering, eller CIS) målt ved in vivo hurtigskanning syklisk voltammetri (FSCV). Ved hjelp av CIS-FSCV hos bedøvede rotter kan en fasisk DA-respons fremkalles ved å stimulere VTA elektrisk med en bipolar elektrode utstyrt med en kanyle mens du registrerer i kjernen av kjernen. Farmakologiske agonister eller antagonister kan infunderes direkte på stimuleringsstedet for å undersøke spesifikke VTA-reseptorers roller i å drive fasisk DA-frigjøring. En stor fordel med CIS-FSCV er at VTA-reseptorfunksjonen kan studeres in vivo, basert på in vitro-studier.
Introduction
Phasic dopamin (DA) frigjøring fra ventral tegmental området (VTA) til kjernen accumbens (NAc) spiller en viktig rolle i belønningsrelatert atferd. VTA DA nevroner bytter fra en tonic-lignende avfyring (3-8 Hz) til en burst-lignende avfyring (>14 Hz)1, som produserer fasisk DA-utgivelse i NAc. VTA uttrykker en rekke somatodendritiske reseptorer som er godt posisjonert for å kontrollere bryteren fra tonic til burst-firing2,3,4,5. Å identifisere hvilke av disse reseptorene, og deres respektive innganger, kontrollere fasisk DA-utgivelse, vil utdype vår forståelse av hvordan belønningsrelaterte kretser er organisert. Formålet med metodikken som er beskrevet her, kombinert infusjon og stimulering med hurtigskanning av syklisk voltammetri (CIS-FSCV), er å raskt og robust vurdere funksjonaliteten til VTA-reseptorer i å drive fasisk DA-frigjøring.
Begrepet kombinert infusjon og stimulering (CIS) refererer til farmakologisk manipulerende reseptorer på en gruppe nevroner (her VTA) og stimulerer disse nevronene til å studere reseptorens funksjon. I den bedøvede rotten stimulerer vi VTA elektrisk for å fremkalle et stort fasisk DA-signal (1-2 μM) i NAc-kjernen, målt ved hurtigskanning av syklisk voltammetri (FSCV). Infusjoner av farmakologiske legemidler (dvs. reseptoragonister/antagonister) på stimuleringsstedet kan brukes til å måle funksjonen til VTA-reseptorer ved å observere den påfølgende endringen i fremkalt fasisk DA-frigjøring. FSCV er en elektrokjemisk tilnærming som har både høy romlig (50-100 μm) og temporal (10 Hz) oppløsning, og er godt egnet til å måle belønningsrelaterte, fasiske DA-hendelser6,7. Denne oppløsningen er finere enn andre in vivo nevrokjemiske målinger, for eksempel mikrodialyse. Sammen er CIS-FSCV derfor velegnet til å vurdere VTA-reseptorregulering av fasisk dopaminfrigjøring.
En vanlig måte å undersøke VTA-reseptorfunksjonen på er ved å bruke en kombinasjon av elektrofysiologiske tilnærminger som adresserer hvordan disse reseptorene endrer avfyringshastigheten til nevroner1,8. Disse studiene er svært verdifulle for å forstå hvilke reseptorer som er involvert i å drive DA-avfyring ved aktivering. Imidlertid kan disse studiene bare foreslå hva som kan skje nedstrøms ved axonterminalen (dvs. frigjøring av en nevrotransmitter). CIS-FSCV bygger på disse elektrofysiologiske studiene ved å svare på hvordan utgangen av VTA burst-firing, phasic DA release, reguleres av reseptorer som ligger på VTA dendritter og cellelegemer. Dermed er CIS-FSCV godt egnet til å bygge på disse elektrofysiologistudiene. Som et eksempel kan nikotinreseptoraktivering indusere burst-firing i VTA9, og CIS-FSCV i bedøvelsesrotten ble brukt til å vise at nikotinisk acetylkolinreseptor (nAChR) aktivering i VTA også kontrollerer fasisk DA-utgivelse i NAc10,11.
Mekanistisk undersøkelse av fasisk DA-regulering studeres også ofte ved hjelp av skiver preparater sammen med bad påføring av legemidler. Disse studiene fokuserer ofte på presynaptisk regulering av phasic DA-frigjøring fra dopaminterminaler, da cellelegemene ofte fjernes fra skive12. Disse preparatene er verdifulle for å studere presynaptiske reseptoreffekter på dopaminterminaler, mens CIS-FSCV er bedre egnet til å studere somatodendritiske reseptoreffekter på dopaminnevroner, samt presynaptiske innganger til VTA. Dette skillet er viktig, fordi somatodendritisk reseptoraktivering i VTA kan ha en annen effekt enn NAc presynaptisk reseptoraktivering. Faktisk kan blokkering av dopaminerge presynaptiske nAChRs i NAc heve fasic dopamin frigjøring under burst-firing13, mens det motsatte er sant på VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV er en ideell tilnærming for å studere VTA-reseptorers evne til å regulere fasisk DA-frigjøring. Det er viktig at denne tilnærmingen utføres i en intakt rotte, enten bedøvet eller fri bevegelig. Denne tilnærmingen er egnet for akutte studier, for å studere reseptorfunksjon i baseline tilstand10,14 samt langsiktige studier som kan vurdere funksjonelle endringer i en reseptor etter legemiddeleksponering eller atferdsmanipulering11,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i henhold til National Institutes of Health (NIH) Guide for care and use of Laboratory Animals og ble godkjent av både Elizabethtown College og Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Denne protokollen er spesifikk for bedøvelse av rottepreparatet ved bruk av CIS-FSCV.
1. Presurgiske preparater
- Forberedelse av elektrodeløsning
- For å lage elektrodefyllingsløsningen, lag en løsning på 4 M kaliumacetat med 140 mM kaliumklorid16.
- Elektrode forberedelse
- Ved hjelp av vakuumsuging setter du inn en T-650 karbonfiber (7 μm i diameter) i en borosilikatglasskapillær (lengde = 100 mm, diameter = 1,0 mm, innvendig diameter = 0,5 mm).
- Når karbonfiberen er plassert inne i glasskapillæren, plasserer du glasskapillæren i en vertikal elektrodetrekker, med varmeelementet omtrent midt i kapillæren. Sett varmeren på 55 med magneten slått av.
- Etter at kapillæren er trukket, løft forsiktig den øvre kapillærholderen slik at elektrodens spiss ikke er omgitt av varmeelementet.
- Bruk skarp saks, kutt karbonfiberen som fortsatt forbinder de to delene av kapillæren. Dette vil resultere i to separate karbonfibermikroelektroder.
- Under et lett mikroskop kutter du forsiktig den eksponerte karbonfiberen med en skarp skalpell, slik at karbonfibrene strekker seg ca. 75-100 μm utover enden av glasset.
- Bruk et lysmikroskop, sørg for at elektroden er fri for sprekker langs kapillæren. Sørg også for at forseglingen, der karbonfiberen kommer ut av kapillæren, er vanskelig å legge merke til og fri for sprekker.
MERK: En god forsegling vil bidra til å redusere støy under opptak. Se publiserte studier17,18,19 for en mer detaljert protokoll.
- Referanse elektrode fabrikasjon
- Lodd en gullpinne til en 5 cm sølvtråd.
- Fest anoden til en metallbinders eller en annen leder, katoden på en pinne, og påfør en spenning (~2 V) mens bindersen og sølvtråden er nedsenket i 0,1 M HCl.
- Avslutt spenningen når et hvitt belegg (AgCl) vises på sølvtråden.
- Forbereder elektrode for implantasjon
- Lodd en gullpinne til en tynn isolert ledning (~ 10 cm i lengde, <0,50 mm diameter).
- Fjern ~5 cm isolasjon fra ledningen motsatt av gullpinnen.
- Fyll elektroden omtrent halvveis med elektrodeoppløsning.
- Sett isolert ledning inn i elektroden.
MERK: Ledningen skal komme i kontakt med karbonfiberen inne i elektroden.
2. Elektrodeimplantasjoner
- Gi voksne, mannlige, Sprague Dawley rotter (250-450 g) en intraperitoneal injeksjon (1,5 g/kg eller 1 ml/kg volum) på 0,5 g/ml uretan oppløst i steril saltvann. Start med en innledende uretandose på 1,0−1,2 g/kg. Hvis dyret fortsatt reagerer på den skadelige stimulustesten (haleklemme) 20 min etter administrering av uretan, administrer ytterligere 0,3-0,5 g/kg uretan i en totaldose på 1,5 g/kg.
MERK: Tilberedning av 0,5 g/ml uretanoppløsning, tilsett 10 g uretan til 10 g saltvann. Uretan er et kreftfremkallende middel og må håndteres med forsiktighet. Uretan er et viktig bedøvelsesmiddel, da det ikke endrer nivåene av dopamin, som andre bedøvelsesmidler som ketamin / xylazin og klorhydrat20,21. - Når dyret er dypt bedøvet og ikke reagerer på skadelige stimuli (f.eks. tåklemme), plasserer du det i den stereotaktiske rammen. Påfør oftalmisk smøremiddel på hvert øye av rotten.
MERK: Dette er en ikke-overlevelseskirurgi, men god aseptisk teknikk oppfordres. - Rengjør rottens hodebunn ved hjelp av en to-trinns skrubb (dvs. en iodopovidonskrubb etterfulgt av en 70% etanolskrubb; utfør med en 3-syklus repetisjon).
- Klipp bort hodebunnsvevet ved hjelp av steriliserte nål nese pinsett og kirurgisk saks. Fjern en betydelig mengde vev for å gi plass til de forskjellige implantasjonene som er skissert nedenfor.
- Rengjør skalleoverflaten forsiktig ved hjelp av steriliserte bomullsspissapplikatorer. Påfør deretter 2-3 dråper 3% hydrogenperoksid for å identifisere lambda og bregma.
- Bruk stereotaxic eller håndbor (1,0 mm, ~20 000 o/min), bor et hull med en diameter på 1,5 mm 2,5 mm fremre til bregmaen og 3,5 mm lateral til bregmaen. Delvis (omtrent halvveis, til den er godt på plass) implanterer en skrue (1,59 mm O.D., 3,2 mm lang) i dette hullet. Det anbefales å bruke steril saltvann for å skylle under boring for å forhindre termisk skade.
- For referanseelektroden borer du et hull med en diameter på 1,0 mm 1,5 mm og 3,5 mm lateral til bregmaen på venstre halvkule.
- Sett for hånd ~2 mm referansetråd inn i dette hullet, mens referanseledningen vikles rundt og under hodet på den implanterte skruen.
- Implanter skruen fullstendig, og fest referanseelektroden på plass.
- På høyre halvkule borer du et hull med en diameter på 1,5 mm 1,2 mm og 1,4 mm lateral til bregmaen.
- Fjern dura forsiktig ved hjelp av pinsett.
- For den stimulerende elektroden borer du et firkantet hull (2 mm fremre bakre, 5 mm medial-lateral) sentrert ved 5,2 mm bakre og 1,0 mm lateral til bregmaen.
- Bruk stereotaktiske armstenger til å senke den bipolare stimulerende elektroden/føringskanylen 5 mm under duraen. Ved blødning under implantasjon av elektroden, bruk sterile bomullspinne og gasbind for å minimere blødning.
MERK: Den bipolare stimulerende elektroden som brukes i denne metoden, er forhåndsmontert med en føringskanyle (Materialliste). Den indre kanylen som brukes sammen med dette elementet, skal skylles med pinnene på den bipolare stimulerende elektroden når den settes helt inn i føringskanylen. Dette vil tillate den indre kanylen å sitte direkte mellom stimulatorens to pinner, som sitter ca 1 mm fra hverandre. En lignende protokoll er beskrevet andre steder14. - Bruk stereotaktiske armstenger, senk karbonfibermikroelektroden 4 mm under dura. Denne plasseringen er på den mest dorsale delen av striatum.
- Koble referanseledningen og karbonfiberen til en potensiostat.
- Påfør en trekantet bølgeform (-0,4−1,3 V, 400 V/s) i 15 minutter ved 60 Hz, og igjen i 10 minutter ved 10 Hz.
MERK: Vanligvis, når du bruker bølgeformer på karbonfibermikroelektroder i hjernen, legges oksidgrupper til overflaten av karbonfiberen. Likevekt av denne reaksjonen må nås før opptak; ellers vil betydelig drift forekomme19. Ved å sykle elektroden ved høyere frekvenser (60 Hz) kan karbonfiberen oppnå likevekt raskere.
3. Optimalisering av karbonfiber og stimulerende elektrode/føringskanyleplasseringer
- Still inn stimulatoren til å produsere en bipolar elektrisk bølgeform, med en frekvens på 60 Hz, 24 pulser, 300 μA strøm og pulsbredde på 2 ms / fase.
- Senk stimulatoren forsiktig i trinn på 0,2 mm fra 5 mm til 7,8 mm under duraen. I hvert trinn stimulerer du VTA.
MERK: Ved flere dorsale dybder (5-6 mm) vil stimulering av hjernen vanligvis (~ 80% av tiden) føre til at rottens whiskers rykk. På ytterligere dybder vil whiskers slutte å rykke, som oppstår mellom 7,5-8,2 mm under dura. Når whiskers slutter å rykke, vil den stimulerende elektroden være nær eller ved VTA. Dette vil ikke forekomme hos hver rotte, og mangel på whisker rykninger bør ikke tas som et tegn på at den bipolare stimulerende elektroden / infusjonskanylen er feilplassert. Whisker rykninger kan ikke forekomme for alle bedøvelsesmidler (f.eks. isofluran). - Fortsett å senke den bipolare stimulerende elektroden/føringskanylen til en stimulering gir fasisk DA-frigjøring ved karbonfibermikroelektroden (for tiden i dorsal striatum).
MERK: DA-frigjøring i dorsal striatum vil ikke alltid forekomme hvis den bipolare elektroden er implantert i VTA, men observasjon av DA-frigjøring i dorsal striatum ved VTA-stimulering er vanligvis et godt tegn på at et godt signal vil bli observert i NAc-kjernen. - Senk karbonfibermikroelektroden til den er minst 6,0 mm under duraen. Dette er den mest dorsale delen av NAc-kjernen.
- Stimulere VTA og registrere toppen amplitude av DA-toppen.
- Senk eller hev mikroelekroden av karbonfiber på stedet som produserer den største DA-utgivelsen.
- Sørg for at toppen av DA-responsen er en klar oksidasjonstopp på 0,6 V og en reduksjonstopp på -0,2 V. Disse toppene indikerer DA.
4. Kombinasjonsinfusjon og stimulering FSCV-opptak
MERK: Figur 1 viser tidslinjen for opptak før og etter VTA-mikroinfusjon.
- Når karbonfiberen og stimulerende elektrode/føringskanyleplassering er optimalisert, stimulerer du i ~20−30 min.
MERK: Under de nåværende stimuleringsparametrene må du ikke stimulere mer enn én gang hvert tredje minutt, slik at du får vesikulær reloading22. - Etter å ha oppnådd en stabil baseline (<20% variasjon over fem stimuleringer), senk forsiktig den indre kanylen for hånd inn i føringskanylen som er forhåndsmontert i den bipolare stimulatoren.
- Ta ytterligere 2-3 basislinjeopptak for å sikre at selve kanyleinnsettingen ikke forårsaket en endring i det fremkalte signalet. I noen tilfeller kan innsetting og fjerning av den interne kanylen forårsake skade på VTA. Hvis signalet endres drastisk i løpet av denne basisperioden (>20 %), må du ta ytterligere 3–4 opptak til grunnlinjen restabiliseres.
- Bruk en sprøytepumpe og mikrosyring, tilsett 0,5 μL oppløsning (f.eks. 0,9 % saltvann, N-metyl-D-aspartat [NMDA], (2R)-amino-5-fosfonovalerinsyre [AP5]) i VTA over en periode på 2 minutter.
- Etterfunksjon, la den indre kanylen stå i minst 1 min før fjerning.
MERK: Noen stoffer kan kreve å forlate den interne kanylen i lengre tid basert på stoffet kinetikk, og fjerning av den interne kanylen kan føre til at stoffet reiser opp gjennom den indre kanylen. Hvis det er bekymring, kan man forlate den interne kanylen i guidekanylen under hele innspillingen. Ellers kan opptaket begynne etter dette intervallet på 1 min. - Fortsett å registrere hver tredje min for å måle postinfusjonseffekter.
MERK: Hvis det ikke observeres en kontrollløsning og ingen effekt observeres, er det mulig å tilføre en gang til10. Hvis det er endret DA-frigjøring forårsaket av å sette inn den interne kanylen eller saltvannsinfusjonen, gjenoppretter signalet vanligvis til baseline innen 30 minutter.
5. Histologisk verifisering av elektrodeplassering
- På slutten av eksperimentet, lag en liten lesjon på opptaksstedet ved hjelp av karbonfibermikroelektroden.
- Hvis elektroden må bevares for postexperimentkalibrering, bruk deretter en wolframtråd plassert i en glasskapillær som stikker ut ~ 100 μm utover kapillærspissen. I dette tilfellet, løft elektroden fra hjernen, erstatt opptakselektroden med wolframelektroden, og senk den til samme dorsoventralkoordinat.
MERK: Karbonfiberen kan også brukes til å lesjon hjernen og vil gi en mer nøyaktig representasjon av plasseringen av opptaksstedet; Eksperimentet vil imidlertid miste evnen til å kalibrere disse elektrodene.
- Hvis elektroden må bevares for postexperimentkalibrering, bruk deretter en wolframtråd plassert i en glasskapillær som stikker ut ~ 100 μm utover kapillærspissen. I dette tilfellet, løft elektroden fra hjernen, erstatt opptakselektroden med wolframelektroden, og senk den til samme dorsoventralkoordinat.
- For å lesjon opptaksstedet, bruk spenning ved hjelp av en strømforsyning. Start på 1 V og øk med 1 V hver 10 s til 10 V er nådd.
- Avlivet dyret ved hjelp av en dødelig intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (150 mg / kg).
- Perfuse rotten ved hjelp av en 4% formalin løsning.
- Fjern hodet fra rotten ved hjelp av en skjerpet giljotin.
- Bruk rongeurs, fjern bindevevet og skallen rundt hjernen, og løsne hjernen forsiktig fra gjenværende vev.
- Oppbevar hjernen i 4% formalin i 1 dag og overfør den deretter til 30% sukrose.
MERK: Perfusjon med 4% formalin er ikke nødvendig for å se lesjonsstedet, men som en beste praksis vil det forbedre rekonstruksjonen av lesjonsstedet. - Lag 30 μm skiver i hjernen ved hjelp av en kryostat.
- Monter skivene på lysbilder og dekk med en dekselslipp.
- Angi plasseringen av karbonfibermikroelektrodlesjonen og bipolar stimulator/infusjonskanyleplassering ved hjelp av et lett mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CIS-FSCV ble brukt til å studere funksjonen til VTA N-metyl-D-aspartatreseptorer (NMDAR), nikotiniske acetylkolinreseptorer (nAChRs) og muskariniske acetylkolinreseptorer (mAChRs) i drivende fasisk DA-frigjøring i NAc-kjernen. Figur 2 viser representative data for en negativ kontroll, infusjon av 0,9 % saltvann, før (baseline) og 9 min postinfusjon (saltvann). Figur 2 viser et fargeplott med potensial på y-aksen, tid på x-aksen og strøm (representert som falsk farge) på z-aksen, nåværende versus tidsspor (IvT), samt et syklisk voltammogram tatt på det meste fremkalte respons for å demonstrere at analytten som måles tilsvarer DA. Som forventet endret ikke saltvannsinfusjon den stimulerte fasiske DA-frigjøringen.
For å demonstrere at CIS-FSCV kan produsere toveis effekter ved bruk av agonister og antagonister, sammenlignet vi effekten av infusjon av NMDAR-agonisten, NMDA (500 ng; Figur 3A) til NMDAR-antagonisten, AP5 (1 μg; Figur 3B). Infusjon av NMDA ga en robust økning i stimulert fasisk DA-frigjøring (figur 3A, 9 min etter infusjon) mens NMDAR-konkurransemotstanderen AP5 (1 μg) ga en robust reduksjon (Figur 3B, 9 min etter infusjon). For å demonstrere nytten av CIS-FSCV ved hjelp av antagonister som retter seg mot forskjellige klasser av acetylkolinreseptorer, sammenlignet vi effekten av infusjon av den ikke-selektive, ikke-konkurrerende nAChR-antagonisten mecamylamin (3 μg; Figur 4A) og det ikke-selektive, konkurransedyktige mAChR-antagonisten skopolamin (67 μg; Figur 4B). Begge legemidlene ga robuste reduksjoner i stimulert fasisk DA-frigjøring (figur 4, 9 min postinfusjon). Et sammendrag av resultatene fra figur 2, figur 3og figur 4 replottes i figur 5, der grunnlinjeperioden er gjennomsnittet over fem stimuleringer og legemiddelperioden vises som en prosentandel av basisgjennomsnittet.
Figur 1: Tidslinje for opptak før og etter VTA-mikroinfusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative farge- og IvT-plott av baseline (venstre) og saltvannsinfusjon (høyre) på stimulert fasisk DA-frigjøring i NAc-kjernen i en enkelt mannlig Sprague Dawley-rotte. Blå stolpe representerer stimulering. Basisopptaket skjer ved t = 0, før den interne kanylen ble plassert i føringskanylen i den bipolare stimulatoren. Saltvannsopptaket ble tatt 9 min (t = 9) postinfusjon. Sykliske voltammogram-innsett tilsvarer toppen av IvT-tomtene, og viser en toppoksidasjon ved 0,6 V og toppreduksjon ved -0,2 V, noe som indikerer DA. Ingen endring i stimulert fremkalt frigjøring bør observeres etter saltvanns VTA-infusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekter av infusjon av NMDAR-agonisten (NMDA) og antagonisten (AP5). (A) Representative farge- og IvT-plott av baseline (venstre) og 500 ng NMDAR agonistinfusjon (høyre) på stimulert fasisk DA-frigjøring i NAc-kjernen i en enkelt mannlig Sprague Dawley rotte. NMDA infusjon økt stimulert fasisk DA-utgivelse (opptak tatt 9 min postinfusjon). (B) Representative farge- og IvT-plott av baseline (venstre) og 1 μg nmdar antagonist (2R)-amino-5-fosfonovalerinsyre (AP5) infusjon (høyre) på stimulert fasisk DA-frigjøring i NAc-kjernen i en enkelt mannlig Sprague Dawley rotte. AP5 infusjon redusert stimulert phasic DA utgivelse (opptak tatt 9 min postinfusjon). Grunnlinjeopptakene forekom ved t = 0, før den interne kanylen ble plassert i føringskanylen i den bipolare stimulatoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekter av infusjon av mekatymin og skopolamin. (A) Representative farge- og IvT-plott av baseline (venstre) og 3 μg av den ikke-selektive nikotinske acetylkolinreseptorantagonisten mecamylamin (MEC) infusjon (høyre) på stimulert fasisk DA-frigjøring i NAc-kjernen i en enkelt mannlig Sprague Dawley-rotte. (B) Representative farge- og IvT-plott av baseline (venstre) og 67 μg av den ikke-selektive muskariniske acetylkolinreseptoren antagonist skopolamin (SCOP) infusjon (høyre) på stimulert fasisk DA-frigjøring i NAc-kjernen i en enkelt mannlig Sprague Dawley rotte. Grunnlinjeopptaket skjedde ved t = 0, før den interne kanylen ble plassert i føringskanylen i den bipolare stimulatoren. MEC- og SCOP-opptak ble tatt 9 min postinfusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Datasammendrag som viser legemiddeleffekter over tid. Preinfusjonsperioden (baseline) ble gjennomsnittet over fem stimuleringer, og postinfusjonsperioden (fra t = 3) presenteres som en prosentandel av baseline. Ved 9 min postinfusjon observerte vi at det fremkalte DA-signalet var 103% av baseline etter saltvannsinfusjon, 196% etter NMDA-infusjon, 18% etter AP5-infusjon, 49% etter MEC-infusjon og 43% etter SCOP-infusjon. n = 1 per betingelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CIS-FSCV gir en unik mulighet til å undersøke VTA-reseptormekanismer som ligger til grunn for fasisk DA-utgivelse. Det er to kritiske trinn for å sikre riktig opptak. For det første må en stabil basislinjeopptak oppnås, med liten drift i det fremkalte DA-signalet. En viktig måte å øke sannsynligheten for å etablere et stabilt opptak er å sikre at elektroden har hatt god tid til å sykle på både 60 Hz og 10 Hz (vanligvis 15 min ved 60 Hz og 10 min ved 10 Hz). Etter hvert som karbonfiberen blir syklet, oksiderer karbonfiberen seg selv, og blir etset, reduserer overflatearealet, men produserer ny overflate for dopamin adsorpsjon23. Dette kan føre til en økning i følsomheten for DA. Dermed kan man se en liten økning i stimulert dopaminfrigjøring over tid i forsøket på grunn av denne økte etsingen, i stedet for noen farmakologisk manipulasjon. I tillegg vil det å starte et opptak innen 90 til 120 minutter med innledende anestesi øke sannsynligheten for et stabilt opptak over lange perioder. Som sådan, som rotten nærmer seg døden fra anestesi, er det typisk for den fremkalte DA-utgivelsen å avta sakte.
Det andre kritiske trinnet i denne prosedyren er å sikre at infusjonskanylen settes forsiktig inn i den bipolare stimulerende elektroden. De stereotaktiske armbarene kan bevege seg hvis for mye trykk plasseres mens du setter inn den indre kanylen, og som et resultat kan dopaminsignalet kunstig øke eller redusere, da stimuleringsstedet kan være annerledes. Hvis det er en betydelig endring i fremkalt signal etter kanyleinnsetting, bør det etableres en ny basisperiode. Videre, hvis det er endret DA-frigjøring forårsaket av å sette inn den interne kanylen eller kjøretøyinfusjonen, gjenoppretter signalet vanligvis til baseline innen 30 minutter. Skulle det være omfattende endringer i DA-frigjøring til kjøretøyinfusjon, kan infusjonshastigheten eller volumet reduseres. Etterforskere kan også utføre et ekstra opptak etter å ha satt inn den interne kanylen før infusjonen for å vurdere om innsetting av kanylen selv kan endre frigjøring. Relatert er det viktig å verifisere at infusjonen skjedde, og at det ikke er noen blokade av den indre kanylen. En måte å gjøre dette på er å lage en liten boble i infusjonsslangen, og merk dette med en penn eller markør. Boblen skal være lenger unna markøren etter infusjon. En annen måte å sikre at infusjonen skjedde riktig er å slå på infusjonspumpen etter at den indre kanylen er fjernet fra hjernen, og hvis det fortsatt dannes oppløsning på spissen, har det sannsynligvis oppstått en vellykket infusjon.
CIS-FSCV kan tilpasses for å studere VTA-reseptorer hos både atferdsmessig naive og trente dyr for å studere endringer i reseptorfunksjon over tid11. CIS-FSCV kan også endres for å måle 5-HT og noradrenalin (NE)24,25. CIS-FSCV er også svært egnet for våken, atferdseksperimenter og kan integreres med optogenetiske tilnærminger26,27. Det er viktig å merke seg at elektrisk fremkalte utgivelseshendelser skiller seg fra forbigående utgivelseshendelser som ofte observeres i frittgående studier, og sjeldnere i bedøvelsespreparatet. Forbigående frigjøringshendelser, for eksempel, kan ikke nødvendigvis være drevet av direkte depolarisering av dopamin nevroner i motsetning til elektrisk fremkalte frigjøringshendelser28. Som sådan kan fasisk nevral aktivitet være dissosierbar fra dopaminfrigjøringshendelsene som oppdages via FSCV. Videre har optisk fremkalt DA-utgivelse vist seg å avvike fra elektrisk fremkalte DA-utgivelseshendelser. En nylig sammenligning mellom optisk og elektrisk fremkalt stimulering har vist at elektrisk fremkalt stimulering gir multisynaptisk regulering av fasisk DA-frigjøring, mens optisk fremkalt stimulering kan begrense stimulering til mer spesifikke kretser29.
Noen nylige tilnærminger har brukt optogenetiske og fluorescerende metoder for å undersøke kretsene som ligger til grunn for rask dopamindynamikk i vivo30. For eksempel viste nyere arbeid av Sun og kolleger at optogenetisk stimulering av dopamin nevroner i substantia nigra produserer raske forhøyede DA i striatum, målt via uttrykk for G-protein koblet reseptoraktiveringsbaserte DA (GRABDA) sensorer30. Kombinerte optogenetiske og fluorescenstilnærminger kan brukes til å stimulere eller hemme spesifikke afferente innganger til VTA mens du måler DA-frigjøring i NAc. CIS-FSCV kan ikke stimulere afferentene så spesifikt som optogenetisk stimulering, men det har en fordel ved at den kan ta opp spørsmål om presynaptiske og postsynaptiske reseptorer i VTA. Mens både fluorescerende og FSCV tilnærminger har tilstrekkelig tidsoppløsning (subsecond) og følsomhet for DA (1-10 nM) for å måle endringer i phasic DA release30,31,en fordel FSCV kan ha over fluorescerende overvåking av phasic DA in vivo er at ingen genetiske manipulasjoner er nødvendig for registrering. Faktisk kan et CIS-FSCV-eksperiment fullføres i løpet av timer, mens kombinerte optogenetiske og fluorescens tilnærminger krever tilstrekkelig tid (uker) for tilstrekkelig uttrykk ved hjelp av virale konstruksjoner.
En viktig fordel med CIS-FSCV er at spesifikk VTA-reseptorregulering av phasic DA-frigjøring kan studeres i den intakte hjernen, og bygger på andre in vivo-studier som enten måler de elektrofysiologiske egenskapene til VTA-nevroner eller in vitro-studier som evaluerer presynaptisk regulering av fasisk DA-frigjøring3,12. En advarsel til CIS-FSCV er at disse opptakene må gjøres i et relativt DA-rikt område. Dette er av to grunner: For det første er det noen grenser for FSCV-følsomhet, som bare kan oppdage DA-konsentrasjoner i nanomolarområdet og over6,19. For det andre har FSCV problemer med å dissosiere noradrenalin fra DA, fordi deres sykliske voltammogrammer er nesten identiske. Dermed kan disse studiene være begrenset til å vurdere områder med høy DA, for eksempel noen deler av medial prefrontal cortex, NAc, striatum og olfaktorisk tuberkel32. Fremtidige studier kan være i stand til å bruke noen av fremskrittene FSCV tilnærminger som muliggjør bedre diskriminering mellom DA og NE, samt andre elektroaktive nevrotransmittere som adenosin33 og serotonin12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av Elizabethtown College (R.J.W, M.L., og L.M.), av et NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) og av Yale School of Medicine (N.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
