Summary
El objetivo de este protocolo es manipular directamente los receptores del área tegmental ventral para estudiar su contribución a la liberación de dopamina de subsectores.
Abstract
La liberación de dopamina fásica (DA) desde el área tegmental ventral (VTA) al núcleo accumbens juega un papel fundamental en el procesamiento de recompensas y el aprendizaje por refuerzo. Comprender cómo las diversas entradas neuronales en la liberación de DA fásica de control VTA puede proporcionar una mejor imagen de los circuitos que controlan el procesamiento de recompensas y el aprendizaje por refuerzo. Aquí, describimos un método que combina infusiones de cánula intra-VTA de agonistas farmacológicos y antagonistas con liberación de DA fásica evocada por estimulación (infusión y estimulación combinadas, o CIS) medida por voltamperometría cíclica de exploración rápida in vivo (FSCV). Usando CIS-FSCV en ratas anestesiadas, se puede evocar una respuesta da fásica estimulando eléctricamente el VTA con un electrodo bipolar equipado con una cánula mientras se registra en el núcleo accumbens core. Los agonistas o antagonistas farmacológicos se pueden infundir directamente en el sitio de estimulación para investigar el papel específico de los receptores VTA en la conducción de la liberación de DA fásica. Un beneficio importante de CIS-FSCV es que la función del receptor VTA se puede estudiar in vivo, basándose en estudios in vitro.
Introduction
La liberación de dopamina fásica (DA) desde el área tegmental ventral (VTA) al núcleo accumbens (NAc) juega un papel vital en los comportamientos relacionados con la recompensa. Las neuronas VTA DA cambian de un disparo tónico (3-8 Hz) a un disparo en forma de ráfaga (>14 Hz)1, que produce la liberación fásica de DA en el NAc. El VTA expresa una variedad de receptores somatodendríticos que están bien posicionados para controlar el cambio de tónico a disparo de ráfaga2,3,4,5. Identificar cuál de estos receptores, y sus respectivas entradas, controla la liberación de DA fásico profundizará nuestra comprensión de cómo se organizan los circuitos relacionados con la recompensa. El propósito de la metodología descrita aquí, la infusión y estimulación combinadas con voltamperometría cíclica de exploración rápida (CIS-FSCV), es evaluar de manera rápida y robusta la funcionalidad de los receptores VTA para impulsar la liberación de DA fásica.
El término infusión y estimulación combinadas (CIS) se refiere a la manipulación farmacológica de los receptores en un grupo de neuronas (aquí el VTA) y la estimulación de esas neuronas para estudiar la función del receptor. En la rata anestesiada, estimulamos eléctricamente el VTA para evocar una gran señal de DA fásica (1-2 μM) en el núcleo de NAc, medida por voltamperometría cíclica de escaneo rápido (FSCV). Las infusiones de fármacos farmacológicos (es decir, agonistas/antagonistas de los receptores) en el sitio de estimulación se pueden utilizar para medir la función de los receptores VTA observando el cambio posterior en la liberación de DA fásica evocada. FSCV es un enfoque electroquímico que goza de una alta resolución espacial (50-100 μm) y temporal (10 Hz), y es muy adecuado para medir eventos DA fásicos relacionados con la recompensa6,7. Esta resolución es más fina que otras mediciones neuroquímicas in vivo, como la microdiálisis. Por lo tanto, en conjunto, CIS-FSCV es muy adecuado para evaluar la regulación del receptor VTA de la liberación de dopamina fásica.
Una forma común de investigar la función del receptor VTA es mediante el uso de una combinación de enfoques electrofisiológicos que abordan cómo esos receptores alteran la velocidad de disparo de las neuronas1,8. Estos estudios son muy valiosos para comprender qué receptores están involucrados en la conducción de la activación de DA tras la activación. Sin embargo, estos estudios solo pueden sugerir lo que podría suceder aguas abajo en el terminal del axón (es decir, la liberación de un neurotransmisor). CIS-FSCV se basa en estos estudios electrofisiológicos al responder cómo la salida de VTA de disparo de ráfaga, liberación de DA fásica, está regulada por receptores ubicados en dendritas VTA y cuerpos celulares. Por lo tanto, CIS-FSCV es muy adecuado para construir sobre estos estudios de electrofisiología. Como ejemplo, la activación del receptor nicotínico puede inducir la activación de ráfagas en el VTA9,y CIS-FSCV en la rata anestesiada se utilizó para demostrar que la activación del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) en el VTA también controla la liberación de DA fásica en el NAc10,11.
El examen mecanicista de la regulación fásica de la DA también se estudia comúnmente utilizando preparaciones de rebanadas junto con la aplicación de medicamentos en el baño. Estos estudios a menudo se centran en la regulación presináptica de la liberación de DA fásica de los terminales de dopamina, ya que los cuerpos celulares a menudo se eliminan de la rebanada12. Estas preparaciones son valiosas para estudiar los efectos de los receptores presinápticos en las terminales de dopamina, mientras que CIS-FSCV es más adecuado para estudiar los efectos de los receptores somatodendríticos en las neuronas dopaminérgicas, así como las entradas presinápticas al VTA. Esta distinción es importante, porque la activación del receptor somatodendrítico en el VTA puede tener un efecto diferente que la activación del receptor presináptico NAc. De hecho, el bloqueo de los nAChRs presinápticos dopaminérgicos en el NAc puede elevar la liberación de dopamina fásica durante la ráfaga13,mientras que lo contrario es cierto en VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV es un enfoque ideal para estudiar la capacidad de los receptores VTA para regular la liberación de DA fásica. Es importante destacar que este enfoque se puede realizar en una rata intacta, ya sea anestesiada o en movimiento libre. Este enfoque es adecuado para estudios agudos, para estudiar la función del receptor en su estado basal10,14, así como estudios a largo plazo que pueden evaluar cambios funcionales en un receptor después de la exposición al fármaco o la manipulación conductual11,15.
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Protocol
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por Elizabethtown College y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (IACUC). Este protocolo es específico para la preparación de ratas anestesiadas que utilizan CIS-FSCV.
1. Preparaciones prequirúrgicas
- Preparación de la solución de electrodos
- Para hacer la solución de relleno de electrodos, prepare una solución de acetato de potasio de 4 M con cloruro de potasio de 140 mM16.
- Preparación de electrodos
- Usando succión al vacío, inserte una fibra de carbono T-650 (7 μm de diámetro) en un capilar de vidrio de borosilicato (longitud = 100 mm, diámetro = 1.0 mm, diámetro interior = 0.5 mm).
- Una vez que la fibra de carbono se haya colocado dentro del capilar de vidrio, coloque el capilar de vidrio en un extractor de electrodo vertical, con el elemento de calor aproximadamente en el medio del capilar. Ajuste el calentador a 55 con el imán apagado.
- Después de tirar del capilar, levante con cuidado el soporte capilar superior para que la punta del electrodo no esté rodeada por el elemento calefactor.
- Usando tijeras afiladas, corta la fibra de carbono que todavía está conectando las dos piezas del capilar. Esto dará como resultado dos microelectrodos de fibra de carbono separados.
- Bajo un microscopio de luz, corte cuidadosamente la fibra de carbono expuesta con un bisturí afilado, de modo que la fibra de carbono se extienda aproximadamente 75-100 μm más allá del extremo del vidrio.
- Usando un microscopio de luz, asegúrese de que el electrodo esté libre de grietas a lo largo del capilar. También asegúrese de que el sello, donde la fibra de carbono sale del capilar, sea difícil de notar y esté libre de grietas.
NOTA: Un buen sello ayudará a reducir el ruido durante las grabaciones. Ver estudiospublicados 17,18,19 para un protocolo más detallado.
- Fabricación de electrodos de referencia
- Suelde un pasador de oro a un alambre de plata de 5 cm.
- Conecte el ánodo a un clip de metal u otro conductor, el cátodo a un pasador y aplique un voltaje (~ 2 V) mientras el clip y el cable plateado están sumergidos en 0.1 M HCl.
- Cese el voltaje una vez que aparezca una capa blanca (AgCl) en el cable de plata.
- Preparación del electrodo para la implantación
- Suelde un pasador de oro a un alambre aislado delgado (~ 10 cm de longitud, <0.50 mm de diámetro).
- Retire ~ 5 cm de aislamiento del cable opuesto al pasador de oro.
- Llene el electrodo aproximadamente hasta la mitad con solución de electrodo.
- Inserte un cable aislado en el electrodo.
NOTA: El cable debe hacer contacto con la fibra de carbono dentro del electrodo.
2. Implantes de electrodos
- Administrar a ratas Sprague Dawley adultas, machos (250-450 g) una inyección intraperitoneal (1,5 g/kg o 1 ml/kg de volumen) de 0,5 g/ml de uretano disuelto en solución salina estéril. Comience con una dosis inicial de uretano de 1.0−1.2 g/kg. Si el animal sigue respondiendo a la prueba de estímulo nocivo (pellizco de cola) 20 min después de la administración de uretano, administre 0,3-0,5 g/kg de uretano adicionales para una dosis total de 1,5 g/kg.
NOTA: Para la preparación de la solución de uretano de 0,5 g/ml, agregue 10 g de uretano a 10 g (~10 ml) de solución salina. El uretano es un carcinógeno y debe manejarse con cuidado. El uretano es un anestésico importante, ya que no altera los niveles de dopamina, al igual que otros anestésicos como la ketamina/xilazina y el cloral hidratado20,21. - Una vez que el animal esté profundamente anestesiado y no responda a estímulos nocivos (por ejemplo, pellizco del dedo del pie), colóquelo en el marco estereotáxico. Aplique lubricante oftálmico en cada ojo de la rata.
NOTA: Esta es una cirugía que no es de supervivencia, pero se recomienda una buena técnica aséptica. - Limpie el cuero cabelludo de la rata con un exfoliante de dos etapas (es decir, un exfoliante de yodopovidona seguido de un exfoliante de etanol al 70%; realice con una repetición de 3 ciclos).
- Corte el tejido del cuero cabelludo con pinzas de nariz de aguja esterilizadas y tijeras quirúrgicas. Retire una cantidad significativa de tejido para dejar espacio para los diversos implantes que se describen a continuación.
- Limpie suavemente la superficie del cráneo con aplicadores de punta de algodón esterilizados. Luego aplique 2-3 gotas de peróxido de hidrógeno al 3% para ayudar a identificar la lambda y el bregma.
- Usando un taladro estereotáxico o manual (1.0 mm, ~ 20,000 rpm), perfore un orificio de 1.5 mm de diámetro 2.5 mm anterior al bregma y 3.5 mm lateral al bregma. Implantar parcialmente (aproximadamente a mitad de camino, hasta que esté firmemente en su lugar) un tornillo (1,59 mm O.D., 3,2 mm de largo) en este orificio. Se recomienda usar solución salina estéril para regar durante la perforación para evitar lesiones térmicas.
- Para el electrodo de referencia, perfore un orificio de 1,0 mm de diámetro 1,5 mm anterior y 3,5 mm lateral al bregma, en el hemisferio izquierdo.
- A mano, inserte ~ 2 mm de alambre de referencia en este orificio, mientras envuelve el cable de referencia alrededor y debajo de la cabeza del tornillo implantado.
- Implante completamente el tornillo, fijando el electrodo de referencia en su lugar.
- En el hemisferio derecho, perfore un orificio de 1,5 mm de diámetro, 1,2 mm anterior y 1,4 mm lateral al bregma.
- Retire suavemente la duramadre con pinzas.
- Para el electrodo estimulante, perfore un orificio cuadrado (2 mm anterior-posterior, 5 mm medial-lateral) centrado en 5,2 mm posterior y 1,0 mm lateral al bregma.
- Usando las barras estereotácticas del brazo, baje la cánula de electrodo/guía estimulante bipolar 5 mm por debajo de la duramadre. En caso de sangrado durante la implantación del electrodo, use hisopos de algodón estériles y gasas para minimizar el sangrado.
NOTA: El electrodo estimulante bipolar utilizado en este método está preequipado con una cánula guía (Tabla de Materiales). La cánula interna utilizada con este artículo debe enjuagarse con las puntas del electrodo estimulante bipolar cuando se inserta completamente en la cánula guía. Esto permitirá que la cánula interna se sitúe directamente entre las dos puntas del estimulador, que se encuentran a aproximadamente 1 mm de distancia. Un protocolo similar se describe en otra parte14. - Usando las barras estereotácticas del brazo, baje el microelectrodo de fibra de carbono 4 mm por debajo de la duramadre. Esta ubicación se encuentra en la porción más dorsal del cuerpo estriado.
- Conecte el cable de referencia y la fibra de carbono a un potenciostato.
- Aplique una forma de onda triangular (-0.4−1.3 V, 400 V/s) durante 15 min a 60 Hz, y nuevamente durante 10 min a 10 Hz.
NOTA: Por lo general, al aplicar formas de onda a microelectrodos de fibra de carbono en el cerebro, se agregan grupos de óxido a la superficie de la fibra de carbono. El equilibrio de esta reacción debe alcanzarse antes de la grabación; de lo contrario se producirá una deriva significativa19. El ciclo del electrodo a frecuencias más altas (60 Hz) permite que la fibra de carbono alcance el equilibrio más rápido.
3. Optimización de la fibra de carbono y estimulación de las ubicaciones de los electrodos / cánulas guía
- Configure el estimulador para que produzca una forma de onda eléctrica bipolar, con una frecuencia de 60 Hz, 24 pulsos, corriente de 300 μA y ancho de pulso de 2 ms/ fase.
- Baje suavemente el estimulador en incrementos de 0,2 mm de 5 mm a 7,8 mm por debajo de la duramadre. En cada incremento, estimule el VTA.
NOTA: A más profundidades dorsales (5-6 mm), la estimulación del cerebro típicamente (~ 80% del tiempo) hará que los bigotes de la rata se contraigan. A más profundidades, los bigotes dejarán de temblar, lo que ocurre entre 7.5 y 8.2 mm por debajo de la duramadre. Cuando los bigotes dejan de temblar, el electrodo estimulante estará cerca o en el VTA. Esto no ocurrirá en todas las ratas, y la falta de espasmos del bigotes no debe tomarse como una señal de que la cánula de electrodo / infusión estimulante bipolar está fuera de lugar. Es posible que no se produzcan espasmos en el bigotes de todos los anestésicos (por ejemplo, isoflurano). - Continúe bajando la cánula de electrodo/guía estimulante bipolar hasta que una estimulación produzca una liberación de DA fásica en el microelectrodo de fibra de carbono (actualmente en el cuerpo estriado dorsal).
NOTA: La liberación de DA en el cuerpo estriado dorsal no siempre ocurrirá si el electrodo bipolar se implanta en el VTA, pero la observación de la liberación de DA en el estriado dorsal tras la estimulación del VTA suele ser una buena señal de que se observará una buena señal en el núcleo NAc. - Baje el microelectrodo de fibra de carbono hasta que esté al menos 6,0 mm por debajo de la duramadre. Esta es la parte más dorsal del núcleo NAc.
- Estimule el VTA y registre la amplitud máxima del pico DA.
- Bajar o elevar el microelectrodo de fibra de carbono en el sitio que produce la mayor liberación de DA.
- Asegúrese de que el pico de la respuesta DA sea un pico de oxidación claro a 0.6 V y un pico de reducción a -0.2 V. Estos picos son indicativos de DA.
4. Infusión combinada y estimulación FSCV registro
NOTA: La Figura 1 muestra la línea de tiempo para grabar antes y después de la microinfusión de VTA.
- Una vez que se haya optimizado la ubicación de la fibra de carbono y la cánula guía / electrodo estimulante/ guía, estimule durante ~ 20-30 min.
NOTA: Bajo los parámetros de estimulación actuales, no estimule más de una vez cada 3 min, para permitir la recarga vesicular22. - Después de lograr una línea de base estable (variación del <20% en cinco estimulaciones), baje suavemente la cánula interna a mano en la cánula guía que está preajustada en el estimulador bipolar.
- Tome 2-3 registros de referencia adicionales para asegurarse de que la inserción de la cánula en sí no causó un cambio en la señal evocada. En algunos casos, la inserción y extracción de la cánula interna puede causar daño al VTA. Si la señal cambia drásticamente durante este período de referencia (>20%), entonces tome 3-4 registros adicionales hasta que la línea de base se restabilice.
- Usando una bomba de jeringa y microjeringa, infundir 0.5 μL de solución (por ejemplo, solución salina al 0.9%, N-metil-D-aspartato [NMDA], (2R)-amino-5-ácido fosfonovalerico [AP5]) en el VTA durante un período de 2 minutos.
- Después de la infusión, deje la cánula interna durante al menos 1 minuto antes de la extracción.
NOTA: Algunos medicamentos pueden requerir abandonar la cánula interna durante más tiempo en función de la cinética de la droga, y la eliminación de la cánula interna puede hacer que la droga viaje de nuevo a través de la cánula interna. Si hay preocupación, se podría dejar la cánula interna en la cánula guía durante la totalidad de la grabación. De lo contrario, la grabación puede comenzar después de este intervalo de 1 minuto. - Continúe grabando cada 3 minutos para medir los efectos posteriores a la infusión.
NOTA: Si se infunde una solución de control y no se observa ningún efecto, es posible infundir una segunda vez10. Si hay una liberación alterada de DA causada por la inserción de la cánula interna o la infusión salina, la señal generalmente se recupera a la línea de base dentro de los 30 minutos.
5. Verificación histológica de la colocación del electrodo
- Al final del experimento, cree una pequeña lesión en el sitio de grabación utilizando el microelectrodo de fibra de carbono.
- Si el electrodo debe conservarse para la calibración posterior al experimento, use un cable de tungsteno colocado en un capilar de vidrio que sobresalga ~ 100 μm más allá de la punta capilar. En este caso, levante el electrodo del cerebro, reemplace el electrodo de grabación con el electrodo de tungsteno y bájelo a la misma coordenada dorsoventral.
NOTA: La fibra de carbono también se puede usar para lesionar el cerebro y proporcionará una representación más precisa de la ubicación del sitio de grabación; sin embargo, el experimentador perderá la capacidad de calibrar estos electrodos.
- Si el electrodo debe conservarse para la calibración posterior al experimento, use un cable de tungsteno colocado en un capilar de vidrio que sobresalga ~ 100 μm más allá de la punta capilar. En este caso, levante el electrodo del cerebro, reemplace el electrodo de grabación con el electrodo de tungsteno y bájelo a la misma coordenada dorsoventral.
- Para lesionar el sitio de grabación, aplique voltaje usando una fuente de alimentación. Comience a 1 V y aumente en 1 V cada 10 s hasta que se alcancen los 10 V.
- Eutanasiar al animal mediante una inyección intraperitoneal letal de pentobarbital (150 mg/kg).
- Perfunda la rata usando una solución de formalina al 4%.
- Retire la cabeza de la rata con una guillotina afilada.
- Usando rongeurs, retire el tejido conectivo y el cráneo que rodea el cerebro, y desaloje suavemente el cerebro de cualquier tejido restante.
- Almacene el cerebro en formalina al 4% durante 1 día y luego transfiéralo al 30% de sacarosa.
NOTA: La perfusión con formalina al 4% no es necesaria para ver el sitio de la lesión, aunque como mejor práctica mejorará la reconstrucción del sitio de la lesión. - Cree rebanadas de 30 μm del cerebro usando un criostato.
- Monte las rodajas en diapositivas y cúbralas con un resbalón de cubierta.
- Denote la ubicación de la lesión del microelectrodo de fibra de carbono y la ubicación de la cánula de estimulación / infusión bipolar utilizando un microscopio de luz.
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Representative Results
CIS-FSCV se utilizó para estudiar la función de los receptores VTA N-metil-D-aspartato (NMDAR), los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) y los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChRs) en la conducción de la liberación de DA fásica en el núcleo de NAc. La Figura 2 muestra datos representativos para un control negativo, infusión de solución salina al 0,9%, antes (basal) y 9 min después de la infusión (solución salina). La Figura 2 muestra una gráfica de color con potencial en el eje y, tiempo en el eje x y corriente (representada como color falso) en el eje z, trazas de corriente versus tiempo (IvT), así como un voltammograma cíclico tomado en la respuesta evocada pico para demostrar que el analito medido corresponde a DA. Como era de esperar, la infusión salina no alteró la liberación de DA fásica estimulada.
Para demostrar que CIS-FSCV puede producir efectos bidireccionales cuando se usan agonistas y antagonistas, se compararon los efectos de la infusión del agonista NMDAR, NMDA (500 ng; Figura 3A) al antagonista NMDAR, AP5 (1 μg; Figura 3B). La infusión de NMDA produjo un aumento robusto en la liberación de DA fásica estimulada(Figura 3A,9 min después de la infusión) mientras que el antagonista competitivo NMDAR, AP5 (1 μg), produjo una disminución robusta(Figura 3B,9 min después de la infusión). Para demostrar la utilidad de CIS-FSCV utilizando antagonistas que se dirigen a diferentes clases de receptores de acetilcolina, se compararon los efectos de la infusión del antagonista no selectivo y no competitivo de nAChR mecamilamina (3 μg; Figura 4A) y el antagonista no selectivo y competitivo mAChR escopolamina (67 μg; Figura 4B). Ambos fármacos produjeron disminuciones robustas en la liberación de DA fásica estimulada(Figura 4,9 min postinfusión). Un resumen de los resultados de la Figura 2, la Figura 3y la Figura 4 se retrazan en la Figura 5,donde el período de referencia se promedia en cinco estimulaciones y el período de la droga se muestra como un porcentaje del promedio de referencia.
Figura 1: Línea de tiempo para grabar antes y después de la microinfusión de VTA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Color representativo y gráficos ivT de la infusión basal (izquierda) y salina (vehículo) (derecha) en la liberación de DA fásica estimulada en el núcleo NAc en una sola rata macho Sprague Dawley. La barra azul representa la estimulación. El registro basal ocurre en t = 0, antes de que la cánula interna se colocara en la cánula guía en el estimulador bipolar. El registro salino se tomó 9 min (t = 9) después de la infusión. Los recuadros de voltammograma cíclico corresponden al pico de las gráficas IvT, mostrando un pico de oxidación a 0,6 V y una reducción máxima a -0,2 V, indicativo de DA. No se debe observar ningún cambio en la liberación evocada estimulada después de la infusión de VTA salina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos de la infusión del agonista NMDAR (NMDA) y antagonista (AP5). (A) Color representativo y gráficos IvT de la línea de base (izquierda) y 500 ng de la infusión de agonistas NMDAR (derecha) en la liberación de DA fásica estimulada en el núcleo de NAc en una sola rata macho Sprague Dawley. La infusión de NMDA aumentó la liberación de DA fásica estimulada (registro tomado 9 min después de la infusión). (B) Diagramas representativos de color e IvT de la línea de base (izquierda) y 1 μg del antagonista NMDAR (2R)-amino-5-ácido fosfonovalerico (AP5) infusión (derecha) en la liberación de DA fásica estimulada en el núcleo de NAc en una sola rata macho Sprague Dawley. La infusión de AP5 redujo la liberación de DA fásica estimulada (registro tomado 9 min después de la infusión). Los registros basales ocurrieron en t = 0, antes de que la cánula interna se colocara en la cánula guía en el estimulador bipolar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos de la infusión de mecamilamina y escopolamina. (A) Color representativo y gráficos IvT de la infusión basal (izquierda) y 3 μg del antagonista nicotínico no selectivo del receptor nicotínico de acetilcolina mecamilamina (MEC) (derecha) en la liberación de DA fásica estimulada en el núcleo NAc en una sola rata macho Sprague Dawley. (B) Color representativo y gráficos IvT de la infusión basal (izquierda) y 67 μg del antagonista del receptor muscarínico muscarínico no selectivo escopolamina (SCOP) (derecha) en la liberación de DA fásica estimulada en el núcleo NAc en una sola rata macho Sprague Dawley. El registro basal ocurrió en t = 0, antes de que la cánula interna se colocara en la cánula guía en el estimulador bipolar. Las grabaciones MEC y SCOP se tomaron 9 minutos después de la infusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resumen de los datos que muestra los efectos de los medicamentos a lo largo del tiempo. El período previo a la perfusión (basal) se promedió en cinco estimulaciones, y el período posterior a la infusión (a partir de t = 3) se presenta como un porcentaje del valor basal. A los 9 min después de la infusión, observamos que la señal de DA evocada fue del 103% del valor basal después de la infusión salina, del 196% después de la infusión de NMDA, del 18% después de la infusión de AP5, del 49% después de la infusión de MEC y del 43% después de la infusión de SCOP. n = 1 por condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
CIS-FSCV ofrece una oportunidad única para investigar los mecanismos del receptor VTA subyacentes a la liberación de DA fásica. Hay dos pasos críticos para garantizar una grabación adecuada. En primer lugar, se debe lograr un registro de referencia estable, con poca deriva en la señal DA evocada. Una forma importante de aumentar la probabilidad de establecer una grabación estable es asegurarse de que el electrodo haya tenido suficiente tiempo para circular tanto a 60 Hz como a 10 Hz (generalmente 15 minutos a 60 Hz y 10 minutos a 10 Hz). A medida que la fibra de carbono se recicla, la fibra de carbono en sí se oxida y se graba, disminuyendo el área de superficie pero produciendo nueva superficie para la adsorción de dopamina23. Esto puede conducir a un aumento en la sensibilidad a la DA. Por lo tanto, uno podría ver un ligero aumento en la liberación de dopamina estimulada con el tiempo en el experimento debido a este aumento del grabado, en lugar de cualquier manipulación farmacológica. Además, comenzar una grabación dentro de los 90 a 120 minutos de la anestesia inicial aumentará la probabilidad de una grabación estable durante largos períodos de tiempo. Como tal, a medida que la rata se acerca a la muerte por anestesia, es típico que la liberación de DA evocada disminuya lentamente.
El segundo paso crítico en este procedimiento es asegurarse de que la cánula de infusión se inserte suavemente en el electrodo estimulante bipolar. Las barras de brazo estereotáxicas pueden moverse si se ejerce demasiada presión mientras se inserta la cánula interna, y como resultado, la señal de dopamina puede aumentar o disminuir artificialmente, ya que el sitio de estimulación puede ser diferente. Si hay un cambio significativo en la señal evocada después de la inserción de la cánula, se debe establecer un nuevo período de referencia. Además, si hay una liberación alterada de DA causada por la inserción de la cánula interna o la infusión del vehículo, la señal generalmente se recupera a la línea de base dentro de los 30 minutos. Si hubiera alteraciones extensas en la liberación de DA a la infusión del vehículo, la velocidad o el volumen de perfusión podrían reducirse. Los investigadores también pueden realizar un registro adicional después de insertar la cánula interna antes de la infusión para evaluar si la inserción de la cánula en sí puede alterar la liberación. Relacionadamente, es importante verificar que la infusión ocurrió y que no hay bloqueo de la cánula interna. Una forma de hacerlo es hacer una pequeña burbuja en el tubo de infusión y marcarla con un bolígrafo o marcador. La burbuja debe estar más lejos del marcador después de la infusión. Otra forma de asegurarse de que la infusión se produjo correctamente es encender la bomba de infusión después de que la cánula interna se haya eliminado del cerebro, y si todavía se está formando solución en la punta, es probable que se haya producido una infusión exitosa.
CIS-FSCV se puede adaptar para estudiar los receptores VTA tanto en animales sin comportamiento como entrenados para estudiar los cambios en la función del receptor a lo largo del tiempo11. CIS-FSCV también se puede modificar para medir 5-HT y norepinefrina (NE)24,25. CIS-FSCV también es muy adecuado para experimentos de comportamiento despierto y se puede integrar con enfoques optogenéticos26,27. Es importante tener en cuenta que los eventos de liberación evocados eléctricamente son distintos de los eventos de liberación transitoria que a menudo se observan en estudios de movimiento libre, y con menos frecuencia en la preparación anestesiada. Los eventos de liberación transitoria, por ejemplo, pueden no ser necesariamente impulsados por la despolarización directa de las neuronas dopaminérgicas, a diferencia de los eventos de liberación evocados eléctricamente28. Como tal, la actividad neuronal fásica podría ser disociable de los eventos de liberación de dopamina detectados a través de FSCV. Además, se ha demostrado que la liberación de DA evocada ópticamente difiere de los eventos de liberación de DA evocados eléctricamente. Una comparación reciente entre la estimulación evocada óptica y eléctricamente ha revelado que la estimulación evocada eléctricamente produce una regulación multisináptica de la liberación de DA fásica, mientras que la estimulación evocada ópticamente puede limitar la estimulación a circuitos más específicos29.
Algunos enfoques recientes han empleado métodos optogenéticos y fluorescentes para investigar los circuitos subyacentes a la dinámica rápida de la dopamina in vivo30. Por ejemplo, un trabajo reciente de Sun y sus colegas mostró que la estimulación optogenética de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra produce elevaciones rápidas de DA en el cuerpo estriado, medidas a través de la expresión de sensores DA basados en la activación del receptor acoplado a proteína G (GRABDA)30. Los enfoques combinados de optogenética y fluorescencia podrían usarse para estimular o inhibir entradas aferentes específicas al VTA mientras se mide la liberación de DA en el NAc. CIS-FSCV no puede estimular los aferentes tan específicamente como la estimulación optogenética, pero tiene la ventaja de que puede abordar preguntas sobre los receptores presinápticos y postsinápticos dentro del VTA. Si bien tanto los enfoques fluorescentes como FSCV tienen suficiente resolución temporal (subsecón) y sensibilidad a DA (1-10 nM) para medir de manera comparable los cambios en la liberación de DA fásica30,31, una ventaja que FSCV puede tener sobre el monitoreo fluorescente de DA fásico in vivo es que no se requieren manipulaciones genéticas para el registro. De hecho, un experimento CIS-FSCV se puede completar en cuestión de horas, mientras que los enfoques combinados de optogenética y fluorescencia requieren suficiente tiempo (semanas) para una expresión suficiente utilizando construcciones virales.
Un beneficio clave de CIS-FSCV es que la regulación específica del receptor VTA de la liberación de DA fásica se puede estudiar en el cerebro intacto, basándose en otros estudios in vivo que miden las propiedades electrofisiológicas de las neuronas VTA o estudios in vitro que evalúan la regulación presináptica de la liberación de DA fásica3,12. Una advertencia de CIS-FSCV es que estas grabaciones deben hacerse en un área relativamente rica en DA. Esto se debe a dos razones: Primero, hay algunos límites a la sensibilidad FSCV, que solo puede detectar concentraciones de DA en el rango nanomolar y por encima de6,19. En segundo lugar, FSCV tiene problemas para disociar la norepinefrina de DA, porque sus voltamogramas cíclicos son casi idénticos. Por lo tanto, estos estudios pueden limitarse a evaluar áreas con DA alta, como algunas partes de la corteza prefrontal medial, NAc, estriado y el tubérculo olfativo32. Los estudios futuros podrían emplear algunos de los avances de los enfoques FSCV que permiten una mejor discriminación entre DA y NE, así como otros neurotransmisores electroactivos como la adenosina33 y la serotonina12.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por Elizabethtown College (R.J.W, M.L. y L.M.), por una beca de posgrado de NSF (R.J.W.) y por la Escuela de Medicina de Yale (N.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. Borland, L. M., Michael, A. C. , CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton, FL. (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker's Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
