Summary
Denne protokol indfører en litografi-fri mikropatterning metode, der er enkel og tilgængelig for dem med en begrænset bioengineering baggrund. Denne metode udnytter tilpassede laser-cut stencils til mikromønster ekstracellulære matrix proteiner i en form af interesse for modulerende celle morfologier. Proceduren for mikropatterning påvises ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller afledt kardiomyocytter.
Abstract
Mikropatternrende teknikker har været meget anvendt i cellebiologi til at studere effekter af kontrollerende celleform og størrelse på celleskæbnebestemmelse ved enkeltcelleopløsning. Nuværende state-of-the-art enkelt celle mikropatterning teknikker involverer blød litografi og mikro-kontakt udskrivning, som er en kraftfuld teknologi, men kræver uddannet tekniske færdigheder og visse facilitet støtte i mikrofabrikation. Disse begrænsninger kræver en mere tilgængelig teknik. Her beskriver vi en simpel alternativ litografifri metode: stencil-baseret enkeltcellemønster. Vi leverer trin-for-trin procedurer, herunder stencil design, polyacrylamid hydrogel fabrikation, stencil-baseret protein inkorporering, og celle plating og kultur. Denne enkle metode kan bruges til at mønstre en matrix af så mange som 2.000 celler. Vi demonstrerer mønstret af kardiomyocytter afledt af enkelte humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) med forskellige celleformer, fra en 1:1 firkant til en 7:1 voksen kardiomyocyte-lignende rektangel. Denne stencil-baserede enkelt celle mønstre er litografi-fri, teknisk robust, praktisk, billig, og vigtigst tilgængelig for dem med en begrænset bioengineering baggrund.
Introduction
Fremkomsten af hiPSCs og den efterfølgende udvikling af protokoller for deres direkte differentiering i forskellige celletyper har gjort det muligt at studere udvikling og sygdom på et molekylært og patientspecifikt niveau, specielt ved hjælp af patientafledte iPSC-kardiomyocytter (iPSC-CMs) til model kardiomyopatier1,2. Men en væsentlig begrænsning til at studere udvikling og fysiologi ved hjælp af iPSC-systemet og andre in vitro-modeller er fraværet af et struktureret mikromiljø. In situ, celler er udsat for de begrænsninger af den ekstracellulære matrix (ECM), samt tilstødende celler. Den særlige biokemiske sammensætning og stivhed af disse mikromiljøer dikterer den rumlige fordeling af celler samt faktorer til rådighed for at deltage i cellevedhæftning. Dette påvirker til gengæld intracellulære signalveje, genekspression og celleskæbnebestemmelse. For eksempel, mikromønstret iPSC-CM i en voksen-lignende stang form har en betydeligt bedre kontraktile evne, calcium flow, mitokondrielle organisation, elektrofysiologi, og tværgående tubule dannelse3. Således er mikromiljøets egenskaber en integreret del af reguleringen af cellefunktioner.
Tidligere mikromønstreteknikker, der i høj grad var afhængige af fotolitografi (Figur 1A). I denne teknik, et lag af lysfølsom polymer, eller photoresist, er spundet på et fladt substrat fra opløsning til at danne en tynd film omkring 1 μm tyk. Dernæst er ultraviolet (UV) lys påføres på photoresist gennem en maske, der indeholder det ønskede mønster. Udsættelse for ultraviolet (UV) lys ændrer kemisk fotoresistved at ændre sin opløselighed i sin respektive udviklerløsning, overføre det ønskede mønster fra masken på substratet. Mange mikropatternrende metoder inkorporerer fotolitografi, da det giver nanometer til mikrometer-niveau kontrol over udformningen af cellemønstre. Men spindingen af fotoresisterer er meget følsom over for urenheder, fordi de mindste støvpartikler vil forstyrre spredningen af opløsningen til en tynd film. Fotolitografi skal derfor udføres i uforurenede anlæg, som er dyre at vedligeholde og kræver særlig ekspertise at udnytte. Desuden er de kemikalier, der anvendes i fotolitografi, ofte giftige for celler og kan denaturere vigtige biomolekyler. Således fotolitografi udgør betydelige hindringer for fremstilling af mikromønstre for bekvemme biologiske anvendelser.
I 1994 overvandt Whitesides og kolleger4 nogle af de udfordringer, der er forbundet med fotolitografi ved at være banebrydende for en samling af teknikker kaldet blød litografi. I blød litografi, en mikrostruktureret overflade lavet med polydimethylsiloxan (PDMS), en gennemsigtig, gummi-lignende materiale, bruges til at generere et mønster af ECM proteiner4. Fælles bløde litografiske teknikker omfatter microcontact udskrivning og microfluidic mønstre. Ved mikrokontaktudskrivning, som i øjeblikket er den mest populære bløde litografiske metode, overfører et PDMS-stempel belagt med ECM-proteiner materialet til en overflade på de områder, der berøres af stemplet (Figur 1B). I mikrofluidiske mønstre er mikrostrukturer konstrueret på en PDMS-overflade, således at der, når stemplet trykkes til et underlag, skabes et netværk af mikrokanaler, hvorigennem der kan leveres væsker til de ønskede områder (figur 1C)5. Blød litografi tilbyder flere fordele i forhold til fotolitografi. Når en master wafer er mikrofabrikeret, kan PDMS frimærker nemt replikeres uden yderligere beskæftigelse af renrumsfaciliteter. Hertil kommer, at fraværet af organiske opløsningsmidler i processen med blød litografi giver mulighed for udnyttelse af polymere materialer såsom polystyren, typisk anvendes i cellekultur. Endelig er mikromønstre ved hjælp af bløde litografiske metoder ikke begrænset til flade overflader. Således blød litografi øger tilgængeligheden og funktionaliteten af mikromønster fabrikation over fotolitografi6. Men blød litografi har betydelige ulemper. For eksempel er et indledende ætsningstrin, der bruger fotolitografi, stadig nødvendigt for at mikrofabrikere stemplet. Desuden er mikropatterning ved hjælp af et PDMS-stempel underlagt variationer i kvaliteten af proteinoverførsel på substratet6. Undgå disse uoverensstemmelser kræver optimering og konsistens i det tryk, der anvendes på PDMS stempel under proteinoverførsel, ellers deformation og forvrængning af funktionen størrelser af PDMS forme kan forekomme6. Der er også et stort problem med gentagne gange at bruge PDMS på grund af lille molekyle absorption7.
For at undgå at bruge bløde fotolitografi og PDMS frimærker, beskriver vi en stencil-baseret, litografi-fri enkelt celle mikropatterning metode, der overvinder mange af de forhindringer, der er forbundet med fotolitografi og blød litografi. I denne metode anvendes en polyacrylamidhydrogel som substrat til stencilbaseret ECM-proteininkorporering, hvilket giver mulighed for selektiv plettering af enkelte hiPSC-CMs. Denne teknik er yderst kompatibel med polymere materialer, der anvendes i klassiske cellekulturbetingelser. Desuden, med korrekt rengøring og vedligeholdelse, stencilerne kan genbruges og modstandsdygtige over for nedbrydning og protein absorption under mikrofabrikationsprocessen. Endelig er mønsterprocessen teknisk robust, billig, kan tilpasses og tilgængelig for dem uden specialiserede bioengineering færdigheder. Denne stencil-baserede mikropatterning teknik er blevet bredt udnyttet i vores seneste publikationer modellering varieret kardiomyopatier8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af negative mønster polyimid-baserede stencils
- Generer et mønster (Figur 2A) i .dxf-format ved hjælp af computerstøttet designsoftware (f.eks.
- Generer en cirkel (diameter = 22 mm) for at afgrænse stencilens kant.
- Tegn en udfyldt form eller det ønskede mønster.
- Medtag et chiralbogstav (f.eks.
BEMÆRK: Som et eksempel genereres en række firkanter og rektangler til at mønstre iPSC-CMs på enkeltcelle- og cellepar. Designfilerne er tilgængelige (se Supplerende filer). Grænsen for mikrofabrikationsopløsning er ~10 μm.
- Indsend designet til et mikrofabrikationsfirma til laserskåret polyimidfilm og fabrikerstencils (Figur 2B,C).
2. Fremstilling af sulfo-SANPAH-aliquots
BEMÆRK: Protokollen ændres fra Fischer et al.11.
- Brug en fugtbestandig papprøveopbevaringsboks (f.eks. 100 brønd, 10 x 10 rum til centrifugerør, mål: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Mærke det "navn/dato/sulfo-SANPAH 40 μL/rekonstitueret med 1.200 μL PBS".
- Mærk 50 mikrocentrifugerør (polypropylen, 1,5 ml) med et 'S' på låget.
- Der indtages 4 ml vandfri, ekstra tør dimethylsulfoxid (DMSO) og opløsningen filtreres ved hjælp af en membranfilterenhed (porestørrelse = 0,22 μm) i et sterilt konisk 15 ml-rør.
- Forbered en flydende nitrogen bad og dække med låget for at minimere fordampning af det flydende kvælstof.
- 50 mg sulfo-SANPAH opløses i 2 ml af den filtrerede DMSO.
- Vortex godt til fuldt ud at opløse sulfo-SANPAH i DMSO.
- 40 μL aliquots af sulfo-SANPAH-opløsningen fordeles i sterile 1,5 ml rør.
- Overfør rørene ind i kassen.
- Flash-fryse rørene i flydende nitrogen i 5 min.
- Opbevar aliquots ved -80 °C.
BEMÆRK: Aliquots kan bruges i op til 6 måneder uden nedsat effektivitet. Bestanden sulfo-SANPAH koncentration er 25 mg/ml eller 50,77 mM.
3. Sterilisering af værktøjer
- Autoklave to pincet, 24 glasdækselslips (22 x 22 mm, nr. 1 eller nr. 1,5), et barberblad og tre fnugfrie absorberende klude.
BEMÆRK: For at lave 12 hydrogelkonstruktioner er der behov for 24 glasdæksel. Der bør være to dækslips pr konstruktion. Det er tilrådeligt at forberede nogle ekstra coverslips. - Der anbringes to paraffinfilm (4 x 4 tommer) i en ethanolbestandiet plastkasse (f.eks. en 1.000 μL pipettespidskasse) og steriliseres i frisk 70% ethanol i mindst 15 minutter.
4. Fremstilling af polyacrylamid hydrogel prækursor opløsning
BEMÆRK: Protokollen ændres fra Lee et al.12.
- 125 mg aminoethylmethacrylat (AEM) opløses i 36,25 ml deioniseret vand i et 50 ml polypropylencentrifugerør ved vortexing.
- Til fremstilling af 50 ml 10 kPa polyacrylamidprækursoropløsning (8-0,15-15 mM), blandes 10 ml 40% acrylamidopløsning, 3,75 ml 2% bis-acrylamidopløsning og 36,25 ml AEM-opløsning fremstillet i trin 4.1 i et nyt 50 ml polypropylencentrifugerør.
BEMÆRK: Den endelige koncentration af prækursoropløsning er 8% acrylamid, 0,15% bis-acrylamid og 15 mM AEM, som blev målt til at have ~10 kPa stivhed ved atomkraftmikroskopi. Ifølge vævsanvendelser af interesse kan hydrogelens stivhed ændres ved at ændre forholdet mellem 40% acrylamid til 2% bis-acrylamidopløsningen. For eksempel giver 8% acrylamid-0,08% bis-acrylamid opløsning 3 kPa hydrogels; 8% acrylamid-0,48% bis-acrylamid opløsning giver 38 kPa hydrogels; 8% acrylamid-0,48% bis-acrylamid opløsning giver 60 kPa hydrogels. Det er tilrådeligt at bekræfte stivheden af hydrogels fremstillet af forløberen løsninger med ændrede nøgletal.
5. Forberedelse af fotoinitiatoropløsning
- For 1 ml 5% fotoinitiatoropløsning opløses først 50 mg 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone pulver i 700 μL 100% ethanol i et 1,5 ml polypropylencentrifugerør med låg.
BEMÆRK: 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone er ikke opløseligt i vand. Sørg for at opløse pulveret helt i ethanol ved vortexing. - Efter fuldstændig opløsning af 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone i ethanol ved vortexing tilsættes 300 μL fosfat-buffered saltvand (PBS) for et endeligt rumfang på 1 ml.
BEMÆRK: Den endelige koncentration af 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone opløsning er 5%. Den folierede 5% fotoinitiator opløsning er god i 4 uger ved 4 °C.
6. Forberedelse af kældermembranmatrixproteinopløsning
BEMÆRK: Kældermembranmatrix (Materialetabel) er et temperaturfølsomt materiale. Sørg for at arbejde på is med kølede pipettespidser og rør samt iskolde opløsninger. Et nyt lager af kældermembranmatrix skal optøes langsomt på is ved 4 °C natten over.
- Der fremstilles 200 μL kældermembranmatrixproteinopløsning pr. hydrogelkonstruktion. For 12 konstruktioner er der behov for 2,4 ml proteinopløsning i kælderen membranmatrix. Klargør 10% ekstra opløsning (f.eks. 2,6 ml).
- For hvert nyt parti/parti af kældermembranmatrixproteinopløsning skal fortyndingsforholdet optimeres. For første gang, test fortynding nøgletal på 1:10, 1:20, 1:40 for at finde fortynding sforhold, der giver de bedste kvaliteter for celle mønster.
BEMÆRK: Hvis kælderen membran matrix protein opløsning er for tyktflydende, vil det danne en gel på toppen af stencilen, og det er mere sandsynligt, at skrælle af, når du fjerner stencil. Hvis proteinopløsningen er for flydende, vil den trænge gennem stencilernes mønsterhuller, hvilket vil resultere i mønstre af dårlig kvalitet. - Fortynd et proteinmaterialeopløsning for kældermembranenpå is med iskolde Dulbeccos modificerede Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) medier eller 1x PBS til det optimerede fortyndingsforhold ovenfor. For eksempel fortyndes 120 μL af stamopløsningen i 2,4 ml DMEM/F12-medier (1:20) og holdes på is til senere brug.
7. Hydrogel fabrikation
- Anbring en UV-bænkelampe (365 nm, 4 mW/cm2)i en biologisk sikkerhedshætte.
- De steriliserede paraffinfilm anbringes fra trin 3.2, og tør dem helt under sterile forhold. Hvis paraffinfilmene ikke er helt tørre, skal du bruge et vakuumaspirationssystem til at fjerne eventuel resterende væske. Anbring seks autoklamerede dækseler fra trin 3.1 på hver paraffinfilm ved hjælp af de autokklamerede pincet.
- Der fremstilles UV-crosslinkacrylamidprækursoropløsning ved at fortynde 5% fotoinitiatoropløsning (trin 5.2) med polyacrylamidprækursoropløsning (trin 4.2) i et 50 ml polypropylencentrifugerør. For 5 ml UV-crosslinkbar polyacrylamidprækursoropløsning tilsættes 50 μL 5% fotoinitiatoropløsning til 5 ml polyacrylamidprækursoropløsning.
- Forløberen filtreres fra trin 7.3 ved hjælp af en 50 ml filterenhed med en porestørrelse på 0,22 μm til sterilisering.
BEMÆRK: Klargør altid frisk forløberopløsning. - Dispenser 200 μL polyacrylamidprækursoropløsning fra trin 7.4 på hver 22 x 22 mm glasdæksel i den paraffinfilmede petriskål og dækkes forsigtigt med en anden 22 x 22 mm glasdæksel på toppen til sandwich opløsningen imellem (Figur 3A).
BEMÆRK: Paraffinfilm bruges til at undgå spild og til at begrænse forløberopløsningen mellem dækslips. - Den dækslipholdignde petriskål anbringes fra trin 7.5 under UV-bænklampen, og polyacrylamidhydrogels nelyses i 5 min.
BEMÆRK: Hvis overfladen ikke er hvid, reducerer UV-absorbansen af overfladen fotokrydsbindingseffektiviteten. Dækningen af hvidt papir på den ikke-hvide overflade er vigtig for at minimere UV-intensitettab. For at beskytte mod UV-stråling skal lampen dækkes med aluminiumsfolie og bære UV-beskyttelsesbriller. - Fjern forsigtigt det ene dæksel fra det andet ved hjælp af et barberblad ved hjælp af gearing (Figur 3C).
BEMÆRK: Hydrogelen vil normalt holde sig til den øverste dæksel. Vær ekstra opmærksom, når du løsner dæksedlen fra den bløde hydrogel, fordi det sandsynligvis vil gå i stykker. - Fyld en engangs polypropylenbeholder med PBS. Hydrogel-coverslip kompositter overføres i en PBS-holdige reservoir til at skylle hydrogels i PBS i 5 min. Efter skylning skal hydrogelkonstruktionen placeres tilbage på paraffinfilmen i petriskålen.
8. Proteinbøjning
- Forbered en isspand og precool PBS.
BEMÆRK: For seks hydrogels er der behov for 1.200 μL kold PBS. - Tag sulfo-SANPAH-aliquot (1 hætteglas = 6 geler).
BEMÆRK: Om nødvendigt kan den anvendte mængde sulfo-SANPAH reduceres efter optimering. - Der tilsættes 1.200 μL kold PBS i et hætteglas med sulfo-SANPAH-aliquot, og der blandes ved pipettering op og ned.
- 200 μL sulfo-SANPAH udleveres på paraffinfolien i petriskålen og dækkes med hydrogeldækslip komposit med hydrogel, der kommer i kontakt med sulfo-SANPAH (Figur 3D).
BEMÆRK: Sulfo-SANPAH er meget modtagelig for vand på grund af hydrolyse. Frisk tø fra -80 °C lige før brug. Rester må ikke genbruges eller genfryses. - Hydrogelen eksponeres for UV-lampen ved 365 nm, 4 mW/cm2 i 5 min for at aktivere sulfo-SANPAH.
BEMÆRK: Efter eksponering vil sulfo-SANPAH skifte fra orange til brun (Figur 3E). Hvis hydrogel bliver brun, indikerer det vellykket aktivering af phenylazide gruppen af sulfo-SANPAH og inkorporering af sulfo-SANPAH på hydrogel. Fortsæt direkte med trin 8.6−8.9 inden for højst 10 min, fordi aktiviteten af sulfo-SANPAH vil falde. - Genopfyld en engangs polypropylenbeholder med frisk PBS. Efter aktivering af sulfo-SANPAH overføres de aktiverede hydrogels, og hydrogelerne skylles hurtigt i et PBS-reservoir for at fjerne ubundet sulfo-SANPAH.
BEMÆRK: En lang vask kan resultere i lav proteinbøjningseffektivitet. - Efter en hurtig skylning anbringes de hydrogelmonterede dækselbånd på paraffinfilmen i petriskålene, og hydrogelerne skal forsigtigt duppe med sterile fnugfrie klude.
BEMÆRK: Den resterende PBS på toppen af hydrogel vil resultere i lækage af kælderen membran matrix protein opløsning gennem stencil, og tørring for omfattende vil føre til brud på hydrogel ved fjernelse af stencil på grund af for høj tilslutning til stencilen. - Placer stencilen oven på hydrogels og dup med autoclaved fnugfri klude for at sikre tæt forsegling mellem stencil og hydrogel (Figur 3F).
- Udlad forsigtigt 200 μL af den fortyndede kældermembranmatrixproteinopløsning, der er fremstillet fra trin 6.3 (Figur 3G) ovenpå. Lad det natten over i rugemaskinen (37 °C).
BEMÆRK: Når stencil-hydrogel kontakten er stram og kælderen membran matrix protein opløsning koncentration er optimal, kælderen membran matrix protein opløsning vil blive afsondret og forblive på toppen af stencilen (Figur 3H). Inkubationstiden kan reduceres ved optimering. Teoretisk set kan det reduceres ned til 30 min-2 h. - Den næste dag, overføre hydrogels til en 6 brønd plade og helt nedsænke dem i PBS.
BEMÆRK: Det anbefales at skrælle stencilen af med PBS nedsænkning over dækstagen for at forhindre rivning og stikning af hydrogelen til stencilen. - Fjern forsigtigt stencilen ved hjælp af autoclaved pincet uden at rive hydrogel. Resuspender godt med DMEM, returnere mønstrede hydrogels til rugemaskine, og lad dem natten over for at teste for enhver forurening.
- Hvis mediet forbliver klart, er hydrogels klar til at blive brugt til celleplettering. Optimer cellepletteringstætheden og inkubationstiden for at tillade vedhæftning af cellerne til de respektive anvendelser.
BEMÆRK: Til enkeltcellemønster af hiPSC-CMs, frø og inkubernatten over. Følgende celletal anbefales til såning: 30.000, 60.000 og 90.000 celler/brønd. Såning for mange celler fører til mere end én celle pr. mønster. En celle si anbefales at stamme ud ikke-enkelt celler før celle såning. - Den næste dag, observere celle vedhæftet fil og spredning, og ændre medierne for at slippe af med løsrevne celler.
9. Rengøring af de brugte stencils
- For at fjerne resterende matrixproteiner på de anvendte stencils nedsænkes stencilerne i enzymopløsning (Materialetabel) i 10 min ved 37 °C.
BEMÆRK: Enzymet skal vælges afhængigt af de anvendte matrixproteiner. For kollagen-rige matrix protein opløsning, bruge kollagen. En 10-15 min ultralydbehandling i enzymopløsning anbefales også. - Aspirere opløsningen og genopfyld med 10% blegemiddel. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl 3x med PBS.
- Opbevares i 70% ethanol ved 4 °C indtil brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremstilling af stencils, der indeholder en række kvadrater eller rektangler, er blevet påvist (figur 4A). Efter denne protokol opnåede vi mønstrede matrixproteinøer (figur 4B og figur 5A) og celler (figur 4C). Koncentrationen af suboptimalmatrixproteinopløsning førte til suboptimalt mønstermønster (figur 5B). Det er vigtigt at bruge forsiden af stencilen. Hvis bagsiden af stencilen anvendes, øges størrelsen af matrixproteinøerne på grund af laserskæringens retning (Figur 6A,B). Mens bredden af de rektangulære mønstre ikke væsentligt ændre (Figur 6C), højden steg betydeligt, når du bruger bagsiden af stencilen, hvilket fører til en reduktion i det tilsigtede højde-bredde-forhold (Figur 6D,E). Vi anvendte stencil-baserede mønstre til silicium elastomer substrater (Figur 7). De mønstrede kardiomyocytter på siliciumelastomersubstrater blev visualiseret ved immuncytokemi af hjertetroponin T ved lav forstørrelse (figur 7A) og sarkomerprotein α-actinin ved høj forstørrelse (Figur 7B). Den stencil-baserede mønstre kunne også anvendes til mønster to kardiomyocytter side-by-side på hydrogels med forskellige stivheder. Som en demonstration viser vi kardiomyocytmønstret på fysiologisk relevant stivhed (figur 8A) og patologisk relevant stivhed (Figur 8B).
Figur 1: Skematisk af tre guld-standard mikropatterning strategier. (A) Fotolitografi. (B) Microcontact-udskrivning. (C) Mikrofluidisk mønster. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Arbejdsgang for design af stencils. (A) Den computer-assisteret design af stencilen. (B) Et repræsentativt fotografi af en laserskåret polyimidstencil. (C) Et repræsentativt mikroskopisk billede af en stencil. Det gule område repræsenterer polyimidstencilen, mens det lyseblå område repræsenterer en række laserskårne huller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fotografier af hydrogelfabrikationstrin. (A) Polyacrylamid hydrogel fabrikation ved at indklemte forløberen opløsning i mellem to dækslips. (B) UV-foto-krydsbinding af polyacrylamid hydrogels under UV-bænklampen. UV-lampen er dækket med aluminiumsfolie for brugerbeskyttelse. (C) Den foto-crosslinked e-hydrogel hentes ved at fjerne en dæksel på den ene side. (D) Hydrogelkonstruktionen er i kontakt med sulfo-SANPAH-opløsningen for at ændre hydrogelen for ECM-proteininkorporering. Før UV-aktivering er sulfo-SANPAH orange. (E) Efter UV-aktivering bliver sulfo-SANPAH brun, hvilket indikerer, at det aktiveres og indarbejdes på hydrogeloverfladen. (F) Efter at have dyppet hydrogelen med sterile fnugfrie klude for at fjerne overskydende vand, placeres stencilen på hydrogelen. (G) Kælder membran matrix protein opløsning er pipetted over stencil-hydrogel konstruktioner. (H) Hvis stencil-hydrogel kontakten er med succes stram, kælderen membran matrix protein opløsning vil forblive på toppen og vil ikke sive igennem. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mikromønster af kældermembranmatrixproteiner og humane inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CMs) med forskellige rektangulære former. (A) Mikroskopiske billeder af stencils, der indeholder laserskårne rektangler med forskellige højde-bredde-forhold (1:1, 4:1, 11:1). (B) Repræsentative billeder af immunbesaetmatrixproteinøer på hydrogelsubstrater. (C)Repræsentative billeder af hiPSC-CMs farves til kerner (cyan) og hjertetroponin T (magenta). Skalabar = 20 μm for paneler B og C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: ECM-proteinkoncentrationen spiller en væsentlig rolle i skabelsen af ordentlige mønstre. (A) Repræsentativt billede af en optimal koncentration med meget homogen fordeling af kældermembranmatrixproteiner i de enkelte mønstre. (B) Suboptimale matrixproteinmønstre på grund af lav koncentration, som forårsagede udsivning af matrixprotein uden for mønstrene og lave mængder matrixproteiner i mønstrene som bestemt af hvedekimagglutininfarvning. Skalabar = 20 μm for paneler A og B. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Stencil bivirkning. (A) Kælder membran matrix protein mønstre, når forsiden af stencilen blev brugt. (B) Kælder membran matrix protein mønstre, når bagsiden af stencilen blev brugt. Kvantificering af (C) bredde, (D) højde, (E) højde-bredde-forholdet for rektangulære kælder membran matrix protein øer. Grafen afbildes gennemsnitlig ± SEM. Statistikken beregnes ved ikke-parret student T-test. n.s. = ikke signifikant. = p < 0,0001. Skalabar = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Stencil-baseret mønstre på silicium elastomer substrat. (A) Et repræsentativt billede af enkeltcellemønstrede kardiomyocytter på siliciumelastomersubstrater, der er plettet af hjertemarkøren, hjertetroponin T (cTnT), ved lav forstørrelse. Skalabar = 300 μm. (B) En repræsentativ encellet kardiomyocyte, der farves af sarkomerprotein α-actinin ved høj forstørrelse. Skalabar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Mikromønster af hiPSC-CM'er på polyacrylamidhydrogels med forskellige stivheder. (A) 10 kPa, (B) 60 kPa. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Problem observeret | Mulig årsag | Løsning |
| 1.1 | Mønsterstørrelsen er større end forventet | Stenciler er spejlvendt | Medtag et chiralbogstav/en figur i stencildesignet for at angive stencilernes for- og bagside |
| 8.1 | Hydrogel frakturer ved peeling stencils | Hydrogel klæber til stencils | Rengøring af stencils |
| Tør ikke hydrogel for meget, før du lægger stencils | |||
| 8.13 | Vedhæftet celle er ikke optimalt | Forringet sulfo-SANPAH | Brug ny sulfo-SANPAH |
| Ineffektiv proteininkorporering | Forbered ny ECM proteinløsning | ||
| Gammel ECM proteinopløsning | |||
| 8.13 | Cellemønstre er ikke optimale | Kælder membran matrix protein opløsning spild over | Udfør immunfarvning ved hjælp af fluorophore-konjugeret anti mus IgG antistof eller hvedekim agglutinine at undersøge fordelingen af kælderen membran matrix protein opløsning på hydrogel |
| 8.13 | Mere end én celle på én plads | Ikke i enkelt celle suspension | Brug 40−70 μm cellesi til at få enkeltcellesuspension |
| Såningtæthed ikke optimal | Optimer såningstætheden fra 30 k til 90 k pr. ml |
Tabel 1: Retningslinjer for fejlfinding. Hyppige problemer, mulige årsager og mulige løsninger drøftes.
Supplerende filer. Klik her for at downloade filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en litografifri stencil-baseret mikromønstermetode, der muliggør effektiv mønstreaf klæbende celler. I denne protokol demonstrerer vi mønstret af hiPSC-CM'er i forskellige længde-til-bredde forhold ved mikropatternrende kældermembranmatrixproteinøer på polyacrylamidhydrogels med fysiologisk- eller patologisk relevante vævsstivheder eller siliciumbaserede elastomersubstrater. Denne metode er forholdsvis enkel og meget tilgængelig for alle forskere, herunder dem, der har ringe baggrund i fotolitografi og mikrofabrikation teknikker. Den beskrevne metode omgår betydelige udfordringer i forbindelse med generering af frimærker ved hjælp af blød litografi og overførsel af proteiner fra stempelforme til substrater, der er involveret i mikrokontaktudskrivningsteknikken. Denne protokol giver en arbejdsproces til 1) oprette specialdesignede stencils med et område og en figur af interesse på en omkostningseffektiv måde; 2) fremstille en hydrogel substrat med stivhed af interesse; og 3) effektivt konjugere ECM proteiner på hydrogel substrat.
Traditionelle bløde litografimetoder er blevet anvendt til at mønstre forskellige former for ECM-proteiner , herunder trekanter og stjerner på underlag af forskellige materialer såsom siliciumbaserede materialer og glasdækselslips13,14. I denne undersøgelse viser vi kun rektangulære mønstre i betragtning af den fysiologisk- og patologisk relevante form af kardiomyocytter. Vi mener, stencil-baserede mønstre af andre komplekse former kan arbejde, så længe den mindste funktion i formen ikke går ud over opløsningen (~ 10 μm). Med hensyn til substratmaterialer viser vi, at det stencilbaserede mønster kan anvendes på hydrogel (figur 2, figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 og figur 8) eller siliciumbaseret elastomersubstrat (figur 7). Den præsenterede metode virker ikke på substrater med minimal klæbeevne til polyimide materialer såsom vævkultur plast og glas dækslips, fordi den stramme forsegling mellem polyimid-baserede stencil og disse substrater ikke er opnået. For at muliggøre tæt forsegling er yderligere overflademodifikation påkrævet. Endelig viser vi, at metoden kan bruges til pålideligt at producere celleparmønstre på hydrogeler med forskellige stivheder (dvs. 10 kPa, 60 kPa) (Figur 8).
I protokollen er det mest kritiske trin optimering af ECM-proteinkoncentrationen (protokolafsnit 6). Målet med dette trin er at finde den optimale koncentration af ECM-protein, der er tyktflydende nok til at hæmme proteinopløsningen til at sive gennem hullerne i stencilen, men ikke for koncentreret, for at undgå gelering (Figur 5). Denne stencil-baserede metode begrænser ikke typen af ECM-protein. Selv om tyktflydende ECM protein opløsning er mere tilbøjelige til at bo på toppen af stencilen, en mindre tyktflydende protein kan også anvendes. Et krav er at sikre, at overfladen af stencilog PA hydrogel er tørre nok til at danne en relativ stabil hydrofob grænseflade. I denne demonstration, kælder membran matrix protein blev brugt, fordi det er tyktflydende og egnet til dyrkning hiPSC-CMs. Andre ECM-proteiner kan dog sandsynligvis anvendes (f.eks. fibronectin, gelatine, kollagen, laminin).
Ud over optimering af ECM-proteinopløsningen for hver given anvendelse er det afgørende at skabe en ordentlig forsegling mellem stencilen og hydrogeloverfladen for at opnå et præcist mønster med ECM-proteinet. Fordi overdreven tørring kan føre til brud af hydrogel, er det vigtigt ikke at overtørre stencilen. Disse trin (dvs. at placere stencil en hydrogel samt forsigtigt pealing det ud bagefter) kræver en vis praksis. Etablering af en optimal håndteringsprocedure for hver given tilstand vil også undgå at have hydrogel enpind til stencilerne. Med denne optimering, submicron skala laser forbrændinger forårsaget af fejl i laserskæring vil ikke i væsentlig grad påvirke teknikken med hensyn til hydrogel skader.
Et andet vigtigt skridt er at bruge forsiden af stencilen, når du placerer stencilen på hydrogelsubstratet. Vi fandt, at brugen af hver side har en effekt på substratet, formentlig på grund af laserskæring (Figur 6). En anbefaling, når du for første gang skal mønstre celler i en bestemt størrelse eller form, er at generere en optimeringsstencil. Stencil-design funktioner ikke nødvendigvis svarer til den endelige mønstrede celle størrelser. Vi anbefaler, at der genereres en optimeringsstencil, der indeholder et forløb af funktionsstørrelser. Vi har udarbejdet en tabel med en liste over potentielle problemer og mulige løsninger til at hjælpe med fejlfinding (tabel 1).
Det er ikke nødvendigt at anvende det samme mikrofabrikationsfirma, der er nævnt i dette manuskript. Nøglerne til præcis generation af stencilen er strålediameteren af laseren og tykkelsen af stencilfilmen, i vores tilfælde polyimid (50 μm). Vi mener, at en laser lab udstyret med en passende laser kunne generere stencil med et par skridt, optimering laser intensitet, tilpasning og andre variabler. Selv om vi kun har arbejdet med én virksomhed, er der mange tilgængelige virksomheder, der udfører præcision laserskæring.
En begrænsning til denne metode er opløsning. Mens fotolitografi kan opnå nanoskala opløsning, stencil-baseret mønster opløsning er begrænset til opløsningen af laser-skæring af polyimid stencils, som til dato er normalt på skalaen af et par mikron (~ 10 μm). Da den gennemsnitlige cellestørrelse er over 10 μm, kan opløsningen dog generelt anvendes på ethvert enkelt cellemønster.
Sammenfattende giver denne metode alsidige platforme til at studere celle-ECM interaktioner, undersøge cellestruktur-funktion korrelation, og mange andre applikationer. Vi mener, at denne protokol vil gavne mange biomedicinske forskere og lette enkeltcelleundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af postdoc-stipendium fra Stanford Child Health Research Institute (CHRI) og National Institute of Health (1F32HL142205-01) til S.L. NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), Stanford Cardiovascular Institute, Hoffmann and Schroepfer Foundation og Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W. , priser fra National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) og Tobaksrelateret Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) til J.C.W. American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) til H.Y. og Hengstberger-stipendium til T.S. Vi takker Dr. Andrew Olsen fra Stanford Neuroscience Microscopy Service på støtte af konfokal billeddannelse af den mikromønstrede hiPSC-CM. Vi takker H.Y. for første stencil design, fabrikation, enkelt celle mikropatterning af iPSC-CM på polyacrylamid hydrogel belagt coverslip, og indledende konfokal billeddannelse af sarcomere struktur af enkelt celle mikromønstret iPSC-CMs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
