Summary
Ce protocole introduit une méthode de micropatterning sans lithographie qui est simple et accessible à ceux qui ont un fond limité de bioingénierie. Cette méthode utilise des pochoirs découpés au laser personnalisés pour micropatterniser les protéines de matrice extracellulaire dans une forme d’intérêt pour moduler les morphologies cellulaires. Le procédé pour le micropatterning est démontré utilisant les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites.
Abstract
Les techniques de micropatterning ont été largement utilisées dans la biologie cellulaire pour étudier les effets du contrôle de la forme et de la taille des cellules sur la détermination du destin cellulaire à la résolution d’une seule cellule. Les techniques actuelles de micropatterning à cellules uniques à la fine pointe de la technologie impliquent une lithographie douce et une impression micro-contact, qui est une technologie puissante, mais qui nécessite des compétences techniques de formation et un certain soutien aux installations en microfabrication. Ces limitations nécessitent une technique plus accessible. Ici, nous décrivons une méthode alternative simple sans lithographie : le modelage à cellule unique à base de pochoir. Nous fournissons des procédures étape par étape, y compris la conception de pochoir, la fabrication d’hydrogel de polyacrylamide, l’incorporation de protéine à base de pochoir, et le placage et la culture de cellules. Cette méthode simple peut être utilisée pour modeler un tableau de 2 000 cellules. Nous démontrons le modelage des cardiomyocytes dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’homme simple (hiPSC) avec des formes cellulaires distinctes, d’un carré de 1:1 à un rectangle adulte cardiomyocyte-like. Ce modèle à cellule unique à base de pochoir est sans lithographie, techniquement robuste, pratique, peu coûteux, et surtout accessible à ceux qui ont un fond limité de bioingénierie.
Introduction
L’avènement des hiPSC et le développement ultérieur de protocoles pour leur différenciation dirigée dans différents types de cellules ont permis d’étudier le développement et la maladie à un niveau moléculaire et spécifique au patient, en utilisant spécifiquement les cardiomyocytes iPSC dérivés du patient (iPSC-CMs) pour modéliser les cardiomyopathies1,2. Cependant, l’absence d’un microenvironnement structuré est une limitation majeure de l’étude du développement et de la physiologie à l’aide du système iPSC et d’autres modèles in vitro. In situ, les cellules sont soumises aux contraintes de la matrice extracellulaire (ECM), ainsi que des cellules voisines. La composition biochimique particulière et la rigidité de ces microenvironnements dictent la distribution spatiale des cellules aussi bien que les facteurs disponibles pour s’engager dans l’adhérence cellulaire. Ceci, à son tour, influence les voies de signalisation intracellulaires, l’expression des gènes, et la détermination du destin cellulaire. Par exemple, l’iPSC-CM micropatterned dans une forme adulte-comme la tige a une capacité contractile significativement meilleure, le flux de calcium, l’organisation mitochondriale, l’électrophysiologie, et la formation de transverse-tubule3. Ainsi, les propriétés du microenvironnement font partie intégrante de la régulation des fonctions cellulaires.
Les techniques précédentes de micropatterning reposaient fortement sur la photolithographie(figure 1A). Dans cette technique, une couche de polymère photosensible, ou photorésist, est filée sur un substrat plat de la solution pour former un film mince d’environ 1 m d’épaisseur. Ensuite, la lumière ultraviolette (UV) est appliquée sur le photorésist à l’adresse à l’intermédiaire d’un masque contenant le motif désiré. L’exposition à la lumière ultraviolette (UV) modifie chimiquement le photorésist en modifiant sa solubilité dans sa solution de développement respective, transférant le motif désiré du masque sur le substrat. De nombreuses méthodes de micropatterning intègrent la photolithographie, car elle confère le nanomètre au contrôle au niveau micromètre sur la conception des modèles cellulaires. Cependant, la rotation du photorésist est très sensible aux impuretés, parce que les plus petites particules de poussière perturberont la propagation de la solution dans un film mince. La photolithographie doit donc être effectuée dans des installations non contaminées, qui sont coûteuses à entretenir et nécessitent une expertise particulière à utiliser. En outre, les produits chimiques utilisés dans la photolithographie sont souvent toxiques pour les cellules et peuvent dénaturer des biomolécules importantes. Ainsi, la photolithographie pose des obstacles importants à la fabrication de micropatternes pour des applications biologiques pratiques.
En 1994, Whitesides et ses collègues4 ont surmonté certains des défis associés à la photolithographie en mettant en avant une collection de techniques appelées lithographie douce. Dans la lithographie douce, une surface microstructurée à base de polydimethylsiloxane (PDMS), un matériau transparent ressemblant à du caoutchouc, est utilisée pour générer un modèle de protéines ECM4. Les techniques lithographiques douces courantes comprennent l’impression de microcontacts et le modelage microfluidique. Dans l’impression microcontactique, actuellement la méthode lithographique douce la plus populaire, un timbre PDMS recouvert de protéines ECM transfère le matériau sur une surface des zones contactées par le timbre(figure 1B). Dans le modelage microfluidique, les microstructures sont conçues sur une surface PDMS de telle sorte que lorsque le timbre est pressé sur un substrat, un réseau de microcanaux, par lequel les fluides peuvent être livrés aux zones désirées, est créé (figure 1C)5. La lithographie douce offre plusieurs avantages sur la photolithographie. Une fois qu’une plaquette de maître est microfabriquée, les timbres PDMS peuvent facilement être reproduits sans autre emploi d’installations de salle blanche. En outre, l’absence de solvants organiques dans le processus de lithographie douce permet l’utilisation de matériaux polymériques tels que le polystyrène, généralement utilisé dans la culture cellulaire. Enfin, le micropatterning utilisant des méthodes lithographiques douces n’est pas limité aux surfaces plates. Ainsi, la lithographie douce augmente l’accessibilité et la fonctionnalité de la fabrication de micropatternes par rapport à la photolithographie6. Cependant, la lithographie douce a des inconvénients significatifs. Par exemple, une première étape de gravure, à l’aide de la photolithographie, est toujours nécessaire pour microfabriquer le timbre. En outre, le micropatterning à l’aide d’un timbre PDMS est sujet à des variations dans la qualité du transfert de protéines sur le substrat6. Éviter ces écarts nécessite une optimisation et une cohérence de la pression exercée sur le timbre PDMS lors du transfert de protéines, sinon la déformation et la distorsion des tailles de fonctionnalités des moules PDMS peuvent se produire6. Il ya aussi une préoccupation majeure de l’utilisation répétée de la PDMS en raison de l’absorption de petites molécules7.
Pour éviter d’utiliser la photolithographie douce et les timbres PDMS, nous décrivons une méthode de micropatterning à cellule unique sans lithographie au pochoir qui surmonte bon nombre des obstacles associés à la photolithographie et à la lithographie douce. Dans cette méthode, un hydrogel en polyacrylamide est utilisé comme substrat pour l’incorporation de protéines ECM à base de pochoir, permettant un placage sélectif de hiPSC-CMs simples. Cette technique est hautement compatible avec les matériaux polymères utilisés dans des conditions de culture cellulaire classique. En outre, avec un nettoyage et un entretien adéquats, les pochoirs sont réutilisables et résistants à la dégradation et à l’absorption des protéines pendant le processus de microfabrication. Enfin, le processus de modelage est techniquement robuste, peu coûteux, personnalisable et accessible à ceux qui n’ont pas de compétences spécialisées en bioingénierie. Cette technique de micropatterning à base de pochoir a été largement utilisée dans nos publications récentes modélisant des cardiomyopathies variées8,9,10.
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Protocol
1. Fabrication de pochoirs à base de polyimide à motif négatif
- Générer un modèle (figure 2A) en format .dxf à l’aide d’un logiciel de conception assisté par ordinateur (p. ex., AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
- Générer un cercle (diamètre de 22 mm) pour délimiter la bordure du pochoir.
- Dessinez une forme solide ou le motif désiré.
- Inclure une lettre chiral (p. ex., R) pour marquer le côté avant des pochoirs.
REMARQUE : À titre d’exemple, un éventail de carrés et de rectangles est généré pour modeler les iPSC-CM aux niveaux d’une seule cellule et de paire cellulaire. Les fichiers de conception sont disponibles (voir Fichiers supplémentaires). La limite de résolution de microfabrication est de 10 m.
- Soumettez la conception à une société de microfabrication à des films en polyimide découpés au laser et à la fabrication de pochoirs(figure 2B,C).
2. Préparation des aliquots sulfo-SANPAH
REMARQUE : Le protocole est modifié à partir de Fischer et coll.11.
- Utilisez une boîte de rangement d’échantillons de carton résistante à l’humidité (p. ex., 100 puits, 10 x 10 espaces pour les tubes à centrifugeuses, dimensions : 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Étiquetez-le « nom/date/sulfo-SANPAH 40 L/reconstitué avec 1 200 L de PBS ».
- Étiqueter 50 tubes de microcentrifuge (polypropylène, 1,5 ml) avec un «S» sur le couvercle.
- Prenez 4 ml de sulfoxide de diméthyle anhydre et extra sec (DMSO) et filtrer stérile la solution à l’aide d’une unité de filtre à membrane (taille de pore à 0,22 m) dans un tube conique stérile de 15 ml.
- Préparer un bain d’azote liquide et couvrir avec le couvercle pour minimiser l’évaporation de l’azote liquide.
- Dissoudre 50 mg de sulfo-SANPAH dans 2 ml du DMSO filtré.
- Vortex bien pour dissoudre complètement le sulfo-SANPAH dans le DMSO.
- Distribuez des aliquots de 40 L de la solution sulfo-SANPAH dans des tubes stériles de 1,5 mL.
- Transférer les tubes dans la boîte.
- Geler flash les tubes dans de l’azote liquide pendant 5 min.
- Rangez les aliquots à -80 oC.
REMARQUE : Les aliquots peuvent être utilisés jusqu’à 6 mois sans efficacité diminuée. La concentration de sulfo-SANPAH de stock est de 25 mg/mL ou 50,77 mM.
3. Stérilisation des outils
- Autoclavez deux forceps, 24 housses en verre (22 x 22 mm, no 1 ou no 1.5), une lame de rasoir et trois lingettes absorbantes sans peluche.
REMARQUE : Pour faire 12 constructions d’hydrogel, 24 couvertures en verre sont nécessaires. Il devrait y avoir deux reprises par construction. Il est conseillé de préparer des coverlips de rechange. - Placer deux morceaux de film de paraffine (4 x 4 pouces) dans une boîte en plastique résistante à l’éthanol (p. ex., une boîte à pipette de 1 000 l) et les stériliser dans de l’éthanol frais de 70 % pendant au moins 15 minutes.
4. Préparation de la solution précurseur de l’hydrogel en polyacrylamide
REMARQUE : Le protocole est modifié à partir de Lee et coll.12.
- Dissoudre 125 mg de méthacrylate aminoéthyl (AEM) dans 36,25 ml d’eau déionisée dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 50 mL par vortexing.
- Pour préparer 50 ml de solution précurseur en polyacrylamide de 10 kPa (8 à 0,15 à 15 mM), mélanger 10 ml de solution d’acrylamide de 40 %, 3,75 mL de solution bis-acrylamide de 2 % et 36,25 ml de la solution AEM préparée à l’étape 4.1 dans un nouveau tube de centrifugeuse en polypropylène de 50 mL.
REMARQUE : La concentration finale de la solution précurseur est de 8 % d’acrylamide, de 0,15 % de bis-acrylamide et de 15 mM AEM, qui a été mesurée pour avoir une rigidité de 10 kPa par microscopie de force atomique. Selon les applications tissulaires d’intérêt, la rigidité de l’hydrogel peut être modifiée en changeant le rapport de l’acrylamide de 40% à la solution de 2% bis-acrylamide. Par exemple, 8 % d’acrylamide à 0,08 % de solution bis-acrylamide donne 3 kPa hydrogels; 8 % d’acrylamide à 0,48 % de solution bis-acrylamide donne 38 kPa hydrogels; 8% d’acrylamide à 0,48% de solution bis-acrylamide donne 60 kPa hydrogels. Il est conseillé de confirmer la rigidité des hydrogels fabriqués à partir des solutions précurseurs avec des rapports modifiés.
5. Préparation de la solution photoinitiator
- Pour 1 mL de solution de photoinitiator de 5 %, dissoudre d’abord 50 mg de 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-poudre de méthylpropiophenone dans 700 L d’éthanol de 100% dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 1,5 mL avec couvercle.
REMARQUE : 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone n’est pas soluble dans l’eau. Assurez-vous de dissoudre complètement la poudre dans l’éthanol en vortexing. - Après avoir complètement dissous le 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone en éthanol par vortexing, ajouter 300 l de saline tamponnée de phosphate (PBS) pour un volume final de 1 mL.
REMARQUE : La concentration finale de la solution 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone est de 5%. La solution de photoinitiator déjouée de 5% est bonne pendant 4 semaines à 4 oC.
6. Préparation de la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol
REMARQUE : La matrice de membrane de sous-sol(tableau des matériaux) est un matériau sensible à la température. Assurez-vous de travailler sur la glace avec des pointes et des tubes de pipette réfrigérés ainsi que des solutions glacées. Un nouveau stock de matrice de membrane de sous-sol devrait être décongelé lentement sur la glace à 4 oC pendant la nuit.
- Préparer 200 L de solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol par construction d’hydrogel. Pour 12 constructions, 2,4 ml de solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol sont nécessaires. Préparer une solution supplémentaire de 10 % (p. ex., 2,6 ml).
- Pour chaque nouveau lot /lot de solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol, optimisez le rapport de dilution. Pour la première fois, testez des rapports de dilution de 1:10, 1:20, 1:40 pour trouver le rapport de dilution qui donne les meilleures qualités pour le modelage cellulaire.
REMARQUE : Si la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol est trop visqueuse, elle formera un gel au-dessus du pochoir, et elle est plus susceptible de décoller enlevant le pochoir. Si la solution protéique est trop fluide, elle pénétrera à travers les trous de motif des pochoirs, ce qui se traduira par un mauvais modelage de qualité. - Diluer la solution de stock de protéines de matrice de membrane du sous-sol sur la glace avec le milieu modifié de du mélange d’aigles modifiés F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco à la glace au rapport de dilution optimisé ci-dessus. Par exemple, diluer 120 l’un de la solution de stock dans 2,4 ml de support DMEM/F12 (1:20) et garder sur la glace pour une utilisation ultérieure.
7. Fabrication d’Hydrogel
- Placer une lampe de banc UV (365 nm, 4 mW/cm2) dans une hotte biologique de sécurité.
- Placez les films de paraffine stérilisés de l’étape 3.2 et séchez complètement dans des conditions stériles. Si les films de paraffine ne sont pas complètement secs, utilisez un système d’aspiration sous vide pour éliminer tout liquide résiduel. Placez six reprises autoclaved de l’étape 3.1 sur chaque film de paraffine à l’aide des forceps autoclaved.
- Préparer la solution précurseur en polyacrylamide UV-crosslinkable en diluer la solution de photoinitiator de 5 % (étape 5.2) avec la solution précurseur en polyacrylamide (étape 4.2) dans un tube de centrifugeuse en polypropylène de 50 mL. Pour 5 ml de solution précurseur en polyacrylamide transversal UV, ajoutez 50 L de solution de photoinitiator à 5 mL de solution précurseur de polyacrylamide.
- Filtrer la solution précurseur à partir de l’étape 7.3 à l’aide d’une unité de filtre de 50 ml avec une taille de pore de 0,22 m pour la stérilisation.
REMARQUE : Préparez toujours une solution de précurseurs frais. - Dispensez 200 L de solution précurseur en polyacrylamide de l’étape 7.4 sur chaque glissière en verre de 22 x 22 mm dans le plat De Petri filmé paraffine et couvrez soigneusement avec un autre couvre-verre de 22 x 22 mm sur le dessus pour sandwich la solution entre les deux (figure 3A).
REMARQUE : Le film de paraffine est utilisé pour éviter les déversements et pour confiner la solution précurseur entre les reprises. - Placez le plat Petri contenant des housses de l’étape 7.5 sous la lampe de banc UV et photopolymerize les hydrogels en polyacrylamide pendant 5 min(figure 3B).
REMARQUE : Si la surface n’est pas blanche, l’absorption UV de la surface réduit l’efficacité du photocrosslinking. La couverture du livre blanc sur la surface non blanche est importante pour minimiser la perte d’intensité UV. Pour se protéger contre les rayons UV, recouvrir la lampe de papier d’aluminium et portez des lunettes de protection UV. - Détachez soigneusement une couverture glisser de l’autre à l’aide d’une lame de rasoir par action de levier(figure 3C).
REMARQUE : L’hydrogel s’en tiendra habituellement au coverlip supérieur. Faites attention supplémentaire lorsque vous détachez le coverlip de l’hydrogel mou, car il est susceptible de se briser. - Remplissez un réservoir jetable de polypropylène avec PBS. Transférer les composites hydrogel-coverslip dans un réservoir contenant des PBS pour rincer les hydrogels dans PBS pendant 5 min. Après le rinçage, placez la construction d’hydrogel sur le film de paraffine dans le plat Petri.
8. Conjugaison de protéines
- Préparer un seau à glace et un précool PBS.
REMARQUE : Pour six hydrogels, 1 200 L de PBS froid sont nécessaires. - Sortez l’aliquot sulfo-SANPAH (1 flacon et 6 gels).
REMARQUE : Si nécessaire, la quantité de sulfo-SANPAH utilisée peut être réduite après optimisation. - Ajouter 1 200 l de PBS froid dans une fiole d’aliquot sulfo-SANPAH et mélanger en tuyautant de haut en bas.
- Dispensez 200 L de sulfo-SANPAH sur le film de paraffine dans le plat Petri et couvrez-le de l’hydrogel-coverslip composite avec hydrogel contactant sulfo-SANPAH (figure 3D).
REMARQUE : Le sulfo-SANPAH est très sensible à l’eau en raison de l’hydrolyse. Dégelez fraîchement à partir de -80 oC juste avant l’utilisation. Ne réutilisez pas ou ne recongelez pas les restes. - Exposez l’hydrogel à la lampe UV à 365 nm, 4 mW/cm2 pendant 5 min pour activer le sulfo-SANPAH.
REMARQUE : Après exposition, le sulfo-SANPAH passera de l’orange au brun(figure 3E). Si l’hydrogel devient brun, il indique l’activation réussie du groupe d’azide de phényl de sulfo-SANPAH et l’incorporation de sulfo-SANPAH sur l’hydrogel. Procédez directement aux étapes 8.6-8.9 dans un maximum de 10 min, parce que l’activité du sulfo-SANPAH diminuera. - Réapprovisionnez un réservoir de polypropylène jetable avec un PBS frais. Après l’activation de sulfo-SANPAH, transférer les hydrogels activés et rincer rapidement les hydrogels dans un réservoir PBS pour enlever le sulfo-SANPAH non lié.
REMARQUE : Un long lavage peut entraîner une faible efficacité de conjugaison en protéines. - Après un rinçage rapide, placez les housses hydrogel-attachées sur le film de paraffine dans les plats De Petri et tamponnez soigneusement les hydrogels avec des lingettes stériles sans peluches.
REMARQUE : Le PBS restant au-dessus de l’hydrogel entraînera une fuite de la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol par le pochoir, et le séchage trop largement mènera à la rupture de l’hydrogel à l’enlèvement du pochoir en raison de l’adhésion trop élevée au pochoir. - Placez le pochoir sur les hydrogels et tamponnez avec des lingettes autoclavées sans peluche pour assurer l’étanchéité serrée entre le pochoir et l’hydrogel(figure 3F).
- Distribuez soigneusement 200 L de la solution diluée de protéine de matrice de membrane de sous-sol préparée à partir de l’étape 6.3(figure 3G) sur le dessus. Laissez toute la nuit dans l’incubateur (37 oC).
REMARQUE : Lorsque le contact pochoir-hydrogel est serré et que la concentration de la solution de protéine de matrice de membrane du sous-sol est optimale, la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol sera séquestrée et restera au-dessus du pochoir(figure 3H). Le temps d’incubation peut être réduit lors de l’optimisation. Théoriquement, il peut être réduit à 30 min-2 h. - Le lendemain, transférer les hydrogels dans une plaque de 6 puits et les immerger pleinement dans PBS.
REMARQUE : Il est recommandé de décoller le pochoir avec l’immersion PBS sur le coverlip pour empêcher la déchirure et le collage de l’hydrogel au pochoir. - Retirez soigneusement le pochoir à l’aide de pinces autoclavées sans déchirer l’hydrogel. Bien s’occuper du DMEM, remettre les hydrogels à motifs à l’incubateur et les laisser toute nuit pour vérifier toute contamination.
- Si les médias restent clairs, les hydrogels sont prêts à être utilisés pour le placage cellulaire. Optimiser la densité de placage cellulaire et le temps d’incubation pour permettre l’adhérence des cellules pour des applications respectives.
REMARQUE : Pour le modèle à cellule unique des sm-CPS, semences et incubations pendant la nuit. Les numéros cellulaires suivants sont recommandés pour l’ensemencement : 30 000, 60 000 et 90 000 cellules/puits. L’ensemencement de trop de cellules conduit à plus d’une cellule par modèle. Une passoire cellulaire est recommandée pour filtrer les cellules non simples avant l’ensemencement cellulaire. - Le lendemain, observez l’attachement et la propagation des cellules, et modifiez les médias pour se débarrasser des cellules détachées.
9. Nettoyage des pochoirs usagés
- Pour éliminer les protéines de matrice résiduelle sur les pochoirs usagés, submergez les pochoirs en solution enzymatique(Tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 oC.
REMARQUE : L’enzyme doit être sélectionnée en fonction des protéines de matrice utilisées. Pour la solution de protéines de matrice riche en collagène, utilisez le collagène. Un ultrasonication de 10 à 15 min dans la solution enzymatique est également recommandé. - Aspirer la solution et le reconstituer avec 10% d’eau de Javel. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
- Rincer 3x avec PBS.
- Conserver dans 70% d’éthanol à 4 oC jusqu’à utilisation.
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Representative Results
La fabrication de pochoirs contenant un tableau de carrés ou de rectangles a été démontrée(figure 4A). À la suite de ce protocole, nous avons obtenu des îles protéinées à matrice à motifs(figure 4B et figure 5A) et des cellules(figure 4C). La concentration de la solution de protéine de matrice sous-optimale a mené à un modelage sous-optimal(figure 5B). Il est essentiel d’utiliser le côté avant du pochoir. Si l’arrière du pochoir est utilisé, la taille des îles protéinées de matrice augmente en raison de la direction de la coupe laser(figure 6A,B). Bien que la largeur des modèles rectangulaires n’ait pas changé de façon significative(figure 6C), la hauteur a considérablement augmenté lors de l’utilisation du côté arrière du pochoir, ce qui a entraîné une réduction du rapport d’aspect prévu(figure 6D,E). Nous avons appliqué des motifs à base de pochoir sur des substrats d’élastomères de silicium(figure 7). Les cardiomyocytes à motifs sur les substrats d’élastomères de silicium ont été visualisés par immunocytochemistry de la troponine cardiaque T à faible grossissement(figure 7A) et la protéine sarcomerique ' 'actinin à grossissement élevé (figure 7B). Le modèle à base de pochoir pourrait également être appliqué au modèle deux cardiomyocytes côte à côte sur les hydrogels avec des raideurs différents. En démonstration, nous montrons le modèle cardiomyocyte sur la rigidité physiologiquement pertinente(figure 8A) et la rigidité pathologiquement pertinente(figure 8B).
Figure 1 : Schéma de trois stratégies de micropatterning de qualité or. (A) Photolithographie. (B) Impression microcontact. (C) Motif microfluidique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Flux de travail de conception de pochoirs. (A) La conception assistée par ordinateur du pochoir. (B) Une photographie représentative d’un pochoir en polyimide découpé au laser. (C) Une image microscopique représentative d’un pochoir. La zone jaune représente le pochoir de polyimide, tandis que la zone bleu clair représente un tableau de trous découpés au laser. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Photographies des étapes de fabrication d’hydrogel. (A) Fabrication d’hydrogel polyacrylamide en sandwich la solution précurseur entre deux coverslips. (B) UV photo-crosslinking des hydrogels de polyacrylamide sous la lampe de banc UV. La lampe UV est recouverte de papier d’aluminium pour la protection de l’utilisateur. (C) L’hydrogel photo-crosslinked est récupéré en détachant un coverlip d’un côté. (D) La construction d’hydrogel est en contact avec la solution sulfo-SANPAH pour modifier l’hydrogel pour l’incorporation de protéines ECM. Avant l’activation UV, le sulfo-SANPAH est orange. (E) Après l’activation UV, le sulfo-SANPAH devient brun, ce qui indique qu’il est activé et incorporé sur la surface de l’hydrogel. (F) Après avoir tamponné l’hydrogel avec des lingettes stériles sans peluche pour enlever l’excès d’eau, le pochoir est placé sur l’hydrogel. (G) La solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol est pipetted au-dessus des constructions de pochoir-hydrogel. (H) Si le contact pochoir-hydrogel est serré avec succès, la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol restera sur le dessus et ne s’infiltrera pas à travers. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Micropatterning des protéines de matrice de membrane de sous-sol et cardiomyocytes pluripotents induits par l’homme de cellules souches (hiPSC-CMs) avec différentes formes rectangulaires. (A) Images microscopiques de pochoirs contenant des rectangles découpés au laser avec différents rapports d’aspect (1:1, 4:1, 11:1). (B) Images représentatives des îles immunostachées de protéine de matrice sur des substrats hydrogel. (C) Images représentatives de hiPSC-CMs tachés pour les noyaux (cyan) et la troponine cardiaque T (magenta). Barre d’échelle de 20 m pour les panneaux B et C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : La concentration de protéines ECM joue un rôle essentiel dans la génération de modèles appropriés. (A) Image représentative d’une concentration optimale avec une distribution très homogène des protéines de matrice de membrane de sous-sol dans les modèles simples. (B) Modèles de protéines de matrice sous-optimales en raison de la faible concentration, qui a causé des fuites de protéines de matrice en dehors des modèles et de faibles quantités de protéines de matrice dans les modèles déterminés par la coloration d’agglutinine germe de blé. Barre d’échelle de 20 m pour les panneaux A et B. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Effet secondaire au pochoir. (A) Modèles de protéines de matrice de membrane de sous-sol lorsque le côté avant du pochoir a été employé. (B) Modèles de protéines de matrice de membrane de sous-sol quand le côté arrière du pochoir a été employé. Quantification de (C) largeur, (D) hauteur, (E) rapport d’aspect des îles rectangulaires de matrice de membrane de sous-sol. Le graphique est tracé moyen - SEM. Les statistiques sont calculées par test T étudiant non appréré. n.s. - pas significatif. p et lt; 0,0001. Barre d’échelle de 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Motifs à base de pochoir sur substrat d’élastomère de silicium. (A) Une image représentative des cardiomyocytes à motifs à cellule unique sur les substrats d’élastomères de silicium tachés par le marqueur cardiaque, la troponine cardiaque T (cTnT), à faible grossissement. Barre d’échelle de 300 m (B) Un cardiomyocyte représentatif à motif unique taché par des protéines sarcomériques et de l’actinine à un grossissement élevé. Barre d’échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Micropatterning de hiPSC-CMs sur des hydrogels en polyacrylamide avec des rigidités différentes. (A) 10 kPa, (B) 60 kPa. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Étape | Problème observé | Raison possible | Solution |
| 1.1 | La taille du modèle est plus grande que prévu | Le pochoir est renversé | Inclure une lettre/forme chirérale dans la conception du pochoir pour indiquer le côté avant et arrière des pochoirs |
| 8.1 | Fractures d’Hydrogel lors de l’épluchage des pochoirs | Hydrogel s’en tient aux pochoirs | Nettoyage des pochoirs |
| Ne pas sécher l’hydrogel trop avant de mettre des pochoirs | |||
| 8.13 | L’attachement cellulaire est sous-optimal | Sulfo-SANPAH dégradé | Utiliser de nouveaux sulfo-SANPAH |
| Incorporation inefficace de protéines | Préparer une nouvelle solution de protéines ECM | ||
| Vieille solution de protéine ECM | |||
| 8.13 | Le modelage cellulaire est sous-optimal | La solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol renverse au-dessus | Effectuez l’immunostaining à l’aide d’anticorps anticon souris IgG ou agglutinine germinale de blé épuré pour examiner la distribution de la solution de protéine de matrice de membrane de sous-sol sur l’hydrogel |
| 8.13 | Plus d’une cellule sur une fente | Pas en suspension cellulaire unique | Utilisez une passoire cellulaire de 40 à 70 m pour avoir une suspension à cellule unique |
| Densité d’ensemencement n’est pas optimale | Optimiser la densité d’ensemencement de 30 k à 90 k par mL |
Tableau 1 : Lignes directrices de dépannage. Des problèmes fréquents, des raisons possibles et des solutions potentielles sont discutés.
Fichiers supplémentaires. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger des fichiers.
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Discussion
Nous décrivons une méthode de micropatterning sans sténographie qui permet un modelage efficace des cellules adhérentes. Dans ce protocole, nous démontrons le modelage des hiPSC-CMs dans différents rapports longueur-largeur par micropatterning îles de protéine de matrice de membrane de sous-sol sur des hydrogels polyacrylamide avec des rigidités physiologiques ou pathologiquement pertinentes de tissu ou des substrats d’élastomère à base de silicium. Cette méthode est relativement simple et très accessible à tous les chercheurs, y compris ceux qui ont peu d’expérience dans la photolithographie et les techniques de microfabrication. La méthode décrite contourne les défis importants associés à la génération de timbres à l’aide de la lithographie douce et au transfert de protéines des moules de timbres aux substrats d’intérêt impliqués dans la technique d’impression de microcontact. Ce protocole fournit un flux de travail à 1) créer des pochoirs conçus sur mesure avec une zone et une forme d’intérêt d’une manière rentable; 2) fabriquer un substrat hydrogel avec la rigidité de l’intérêt; et 3) conjuguer efficacement les protéines ECM sur le substrat hydrogel.
Des méthodes traditionnelles de lithographie douce ont été utilisées pour modeler diverses formes de protéines ECM, y compris des triangles et des étoiles sur des substrats de différents matériaux tels que les matériaux à base de silicium et les couvertures de verre13,14. Dans cette étude, nous ne démontrons que des modèles rectangulaires donnés à la forme physiologique et pathologiquement pertinente des cardiomyocytes. Nous croyons que le modèle au pochoir d’autres formes complexes peut fonctionner aussi longtemps que la plus petite caractéristique de la forme ne va pas au-delà de la résolution (10 m). En ce qui concerne les matériaux de substrat, nous démontrons que le modelage à base de pochoir peut être appliqué sur l’hydrogel(figure 2, figure 3, figure 4, figure 5, figure 6 et figure 8) ou substrat d’élastomère à base de silicium(figure 7). La méthode présentée ne fonctionne pas sur les substrats avec un adhésive minimal aux matériaux polyimides tels que les plastiques de culture tissulaire et les couvertures de verre parce que l’étanchéité serrée entre le pochoir à base de polyimide et ces substrats n’est pas atteint. Pour permettre l’étanchéité serrée, d’autres modifications de surface sont nécessaires. Enfin, nous montrons que la méthode peut être utilisée pour produire de façon fiable des motifs de paires cellulaires sur des hydrogels avec des rigidités différentes (c.-à-d., 10 kPa, 60 kPa) (figure 8).
Dans le protocole, l’étape la plus critique est l’optimisation de la concentration de protéines ECM (article 6 du protocole). L’objectif de cette étape est de trouver la concentration optimale de protéines ECM qui est assez visqueuse pour inhiber la solution protéique pour s’infiltrer à travers les trous du pochoir, mais pas trop concentré, pour éviter la gélification(figure 5). Cette méthode à base de pochoir ne limite pas le type de protéine ECM. Bien que la solution visqueuse protéine ECM soit plus susceptible de rester au sommet du pochoir, une protéine moins visqueuse peut également être utilisée. L’une des exigences consiste à s’assurer que les surfaces du pochoir et de l’hydrogel de PA sont suffisamment sèches pour former une interface hydrophobe relativement stable. Dans cette démonstration, la protéine de matrice de membrane de sous-sol a été employée parce qu’elle est visqueuse et appropriée pour la culture hiPSC-CMs. Cependant, d’autres protéines ECM peuvent probablement être utilisées (p. ex., fibronectine, gélatine, collagène, laminine).
En plus de l’optimisation de la solution de protéine ECM pour chaque application donnée, la génération d’un joint approprié entre le pochoir et la surface de l’hydrogel est cruciale pour obtenir un modèle précis avec la protéine ECM. Parce que le séchage excessif peut conduire à la rupture de l’hydrogel, il est essentiel de ne pas trop détaire le pochoir. Ces étapes (c.-à-d. placer le pochoir sur l’hydrogel ainsi que le piéaliser doucement par la suite) nécessitent une certaine pratique. L’établissement d’une procédure de manipulation optimale pour chaque condition donnée évitera également d’avoir le bâton d’hydrogel aux pochoirs. Avec cette optimisation, les brûlures laser à l’échelle submicron causées par des failles dans la coupe au laser n’affecteront pas considérablement la technique en ce qui concerne les dommages hydrogel.
Une autre étape importante consiste à utiliser l’avant du pochoir lors de la mise du pochoir sur le substrat hydrogel. Nous avons constaté que l’utilisation de chaque côté a un effet sur le substrat, probablement en raison de la coupe au laser(figure 6). Une recommandation lors de la modelage des cellules dans la taille ou la forme spécifique pour la première fois est de générer un pochoir d’optimisation. Les caractéristiques de conception de pochoir ne correspondent pas nécessairement à la taille finale des cellules à motifs. Nous vous recommandons de générer un pochoir d’optimisation qui contient un gradient de tailles d’entités. Nous avons préparé un tableau énumérant les problèmes potentiels et les solutions possibles pour aider au dépannage(tableau 1).
Il n’est pas nécessaire d’utiliser la même société de microfabrication mentionnée dans ce manuscrit. Les clés de la génération précise du pochoir sont le diamètre du faisceau du laser et l’épaisseur du film au pochoir, dans notre cas, le polyimide (50 m). Nous croyons qu’un laboratoire laser équipé d’un laser approprié pourrait générer le pochoir avec quelques étapes, optimisant l’intensité laser, l’alignement, et d’autres variables. Bien que nous n’ayons travaillé qu’avec une seule entreprise, il existe de nombreuses entreprises disponibles qui effectuent la découpe laser de précision.
Une limitation à cette méthode est la résolution. Bien que la photolithographie puisse atteindre une résolution à l’échelle nanométrique, la résolution de modèles à base de pochoir se limite à la résolution de la coupe au laser des pochoirs de polyimide, qui à ce jour est généralement à l’échelle de quelques microns (10 m). Néanmoins, étant donné que la taille moyenne des cellules est supérieure à 10 m, la résolution s’applique généralement à tout modèle cellulaire unique.
En résumé, cette méthode fournit des plates-formes polyvalentes pour étudier les interactions cellules-ECM, examiner la corrélation structure-fonction cellulaire, et de nombreuses autres applications. Nous croyons que ce protocole profitera à de nombreux chercheurs biomédicaux et facilitera les études sur les cellules individuelles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une bourse postdoctorale du Stanford Child Health Research Institute (CHRI) et du National Institute of Health (1F32HL142205-01) à S.L, le NIH Office of Director’s Pioneer Award (LM012179-03), l’American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), le Stanford Cardiovascular Institute, la Hoffmann and Schroepfer Foundation et la Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W , prix de l’Institut national de la santé (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) et Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) à J.C.W, l’American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST340106) à H.Y, et la bourse Hengstberger à T.S. Nous remercions le Dr Andrew Olsen du Stanford Neuroscience Microscopy Service pour le soutien de l’imagerie confocienne du hiPSC-CM micropatternisé. Nous remercions H.Y. pour la première conception de pochoir, fabrication, micropatterning à cellule unique d’iPSC-CM sur le coverlip enrobé d’hydrogel de polyacrylamide, et l’imagerie confocale préliminaire de la structure de sarcomere des iPSC-CM micropatterned à cellule unique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
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