Summary
Questo protocollo introduce un metodo di micromodellazione senza litografia che è semplice e accessibile a coloro che hanno un background di bioingegneria limitato. Questo metodo utilizza stencil personalizzati tagliati al laser per micropattern proteine a matrice extracellulare in una forma di interesse per la modulazione delle morfologie cellulari. La procedura per la micropatterning è dimostrata utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti.
Abstract
Le tecniche di micromodellazione sono state ampiamente utilizzate nella biologia cellulare per studiare gli effetti del controllo della forma e delle dimensioni delle cellule sulla determinazione del destino cellulare a risoluzione cellulare singola. Le attuali tecniche di micromodellazione a singola cellula all'avanguardia coinvolgono la litografia morbida e la stampa a microcontatto, che è una tecnologia potente, ma richiede competenze ingegneristiche addestrate e il supporto di alcune strutture nella microfabbricazione. Queste limitazioni richiedono una tecnica più accessibile. Qui, descriviamo un semplice metodo alternativo senza litografia: modellazione a cella singola basata su stencil. Forniamo procedure passo-passo tra cui la progettazione di stencil, la fabbricazione di idrogel poliacrilammide, l'incorporazione di proteine basate su stencil e la placcatura e la coltura cellulare. Questo semplice metodo può essere utilizzato per creare una matrice di ben 2.000 celle. Dimostriamo il modello di cardiomiociti derivati da singole cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) con forme cellulari distinte, da un quadrato 1:1 a un rettangolo adulto 7:1 cardiomiocito-come. Questo patterning a cella singola basato su stencil è privo di litografia, tecnicamente robusto, conveniente, poco costoso e, soprattutto, accessibile a coloro che hanno un background di bioingegneria limitato.
Introduction
L'avvento degli hiPSC e il successivo sviluppo di protocolli per la loro differenziazione diretta in diversi tipi di cellule hanno permesso di studiare lo sviluppo e la malattia a livello molecolare e specifico del paziente, in particolare utilizzando cardiomiociti iPSC derivati dal paziente (iPSC-CMs) per modellare cardiomiopatie1,2. Tuttavia, una delle principali limitazioni allo studio dello sviluppo e della fisiologia utilizzando il sistema iPSC e altri modelli in vitro è l'assenza di un microambiente strutturato. In situ, le cellule sono soggette ai vincoli della matrice extracellulare (ECM), così come le cellule vicine. La particolare composizione biochimica e la rigidità di questi microambienti dettano la distribuzione spaziale delle cellule e i fattori disponibili per l'adesione cellulare. Questo, a sua volta, influenza le vie di segnalazione intracellulare, l'espressione genica e la determinazione del destino cellulare. Ad esempio, iPSC-CM micromodellato in una forma di asta simile a un adulto ha una capacità contrattile significativamente migliore, flusso di calcio, organizzazione mitocondriale, elettrofisiologia e formazione trasversa-tubulo3. Pertanto, le proprietà del microambiente sono parte integrante della regolazione delle funzioni cellulari.
Le precedenti tecniche di micromodellazione si basavano fortemente sulla fotolitografia (Figura 1A). In questa tecnica, uno strato di polimero fotosensibile, o fotoresist, viene filato su un substrato piatto dalla soluzione per formare una pellicola sottile di circa 1 m di spessore. Successivamente, la luce ultravioletta (UV) viene applicata al fotoresist attraverso una maschera contenente il modello desiderato. L'esposizione alla luce ultravioletta (UV) altera chimicamente il fotoresist modificandone la solubilità nella rispettiva soluzione per sviluppatori, trasferendo il modello desiderato dalla maschera al substrato. Molti metodi di micropatterning incorporano la fotolitografia, in quanto conferisce il nanometro al controllo a livello di micrometro sulla progettazione dei modelli cellulari. Tuttavia, la rotazione del fotoresist è altamente sensibile alle impurità, perché le particelle di polvere più piccole interromperanno la diffusione della soluzione in una pellicola sottile. La fotolitografia deve pertanto essere effettuata in strutture non contaminate, che sono costose da mantenere e richiedono particolari competenze da utilizzare. Inoltre, le sostanze chimiche utilizzate nella fotolitografia sono spesso tossiche per le cellule e possono denaturare importanti biomolecole. Pertanto, la fotolitografia pone notevoli ostacoli alla fabbricazione di micromodelli per pratiche applicazioni biologiche.
Nel 1994, Whitesides e colleghi4 hanno superato alcune delle sfide associate alla fotolitografia aprendo la strada a una raccolta di tecniche chiamate litografia morbida. Nella litografia morbida, una superficie microstrutturata realizzata con polidimetilsiloxane (PDMS), un materiale trasparente, simile alla gomma, viene utilizzata per generare un modello di proteine ECM4. Le tecniche litografiche morbide comuni includono la stampa a microcontatto e la modellazione microfluidica. Nella stampa a microcontatto, attualmente il metodo litografico morbido più diffuso, un timbro PDMS rivestito con proteine ECM trasferisce il materiale su una superficie alle aree contattate dal francobollo (Figura 1B). Nel patterning microfluidico, le microstrutture sono progettate su una superficie PDMS in modo che quando il timbro viene premuto su un substrato, viene creata una rete di microcanali, attraverso i quali i fluidi possono essere consegnati alle aree desiderate (Figura 1C)5. La litografia soft offre diversi vantaggi rispetto alla fotolitografia. Una volta che un wafer master è microfabbricato, i francobolli PDMS possono essere facilmente replicati senza ulteriore impiego di strutture per camere pulite. Inoltre, l'assenza di solventi organici nel processo di litografia morbida consente l'utilizzo di materiali polimerici come il polistirolo, tipicamente utilizzato nella coltura cellulare. Infine, la micropatterning con metodi litografici morbidi non è limitata alle superfici piatte. Così, la litografia morbida aumenta l'accessibilità e la funzionalità della fabbricazione di micropattern rispetto alla fotolitografia6. Tuttavia, la litografia morbida presenta svantaggi significativi. Ad esempio, una fase iniziale di incisione, utilizzando la fotolitografia, è ancora necessaria per microfabbricare il timbro. Inoltre, la micromodellazione con un timbro PDMS è soggetta a variazioni nella qualità del trasferimento di proteine sul substrato6. Evitare queste discrepanze richiede ottimizzazione e consistenza nella pressione applicata al timbro PDMS durante il trasferimento di proteine, altrimenti la deformazione e la distorsione delle dimensioni delle feature degli stampi PDMS possono verificarsi6. C'è anche una grande preoccupazione di utilizzare ripetutamente il PDMS a causa dell'assorbimento di piccole molecole7.
Per evitare l'uso di fotolitografia morbida e timbri PDMS, descriviamo un metodo di micropatterning a singola cellula basato su stencil e litografia che supera molti degli ostacoli associati alla fotolitografia e alla litografia morbida. In questo metodo, un idrogel di poliacrilammide viene utilizzato come substrato per l'incorporazione di proteine ECM a base di stencil, consentendo la placcatura selettiva di singoli hiPSC-CM. Questa tecnica è altamente compatibile con i materiali polimerici utilizzati nelle classiche condizioni di coltura cellulare. Inoltre, con una corretta pulizia e manutenzione, gli stencil sono riutilizzabili e resistenti alla degradazione e all'assorbimento delle proteine durante il processo di microfabbricazione. Infine, il processo di modellazione è tecnicamente robusto, economico, personalizzabile e accessibile a coloro che non hanno competenze di bioingegneria specializzate. Questa tecnica di micropatterning basato su stencil è stata ampiamente utilizzata nelle nostre recenti pubblicazioni modellando varie cardiomiopatie8,9,10.
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Protocol
1. Fabbricazione di stencil a base di poliimide a modello negativo
- Generare un pattern (Figura 2A) in formato .dxf utilizzando software di progettazione assistita da computer (ad esempio, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
- Generare un cerchio (diametro 22 mm) per delineare il bordo dello stencil.
- Disegnare una forma piena di pieni o il motivo desiderato.
- Includere una lettera chirale (ad esempio, R) per contrassegnare il lato anteriore degli stencil.
NOTA: Ad esempio, viene generata una matrice di quadrati e rettangoli per pattern iPSC-CMs a livelli a cella singola e a coppia di celle. I file di progettazione sono disponibili (vedere File supplementari). Il limite di risoluzione della microfabbricazione è di 10 m.
- Inviare il progetto a un'azienda di microfabbricazione per pellicola in poliimide tagliata al laser e stampi fabbricati (Figura 2B,C).
2. Preparazione di aliquote sulfo-SANPAH
NOTA: Il protocollo viene modificato da Fischer etal.
- Utilizzare una scatola di stoccaggio di campioni di cartone resistente all'umidità (ad esempio, 100 pozzetto, 10 x 10 spazi per tubi centrifuga, dimensioni: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Etichettarlo come "nome/data/sulfo-SANPAH 40/ricostituito con 1.200 L di PBS".
- Etichettare 50 tubi di microcentrifuga (polipropilene, 1,5 mL) con una 'S' sul coperchio.
- Prendere 4 mL di anidro, solforo dimetilo extra secco (DMSO) e filtrare sterile la soluzione utilizzando un'unità di filtro della membrana (dimensione del poro : 0,22 m) in un tubo conico sterile da 15 mL.
- Preparare un bagno di azoto liquido e coprire con il coperchio per ridurre al minimo l'evaporazione dell'azoto liquido.
- Sciogliere 50 mg di sulfo-SANPAH in 2 mL del DMSO filtrato.
- Vorticare bene per sciogliere completamente il sulfo-SANPAH nel DMSO.
- Distribuire 40 aliquote della soluzione sulfo-SANPAH in tubi sterili da 1,5 mL.
- Trasferire i tubi nella scatola.
- Congelare i tubi in azoto liquido per 5 min.
- Conservare gli aliquote a -80 gradi centigradi.
NOTA: Gli aliquote possono essere utilizzati per un massimo di 6 mesi senza una diminuzione dell'efficienza. La concentrazione di stock sulfo-SANPAH è di 25 mg/mL o 50,77 mM.
3. Sterilizzazione degli strumenti
- Autoclave due pinze, 24 bicchieri coverlips (22 x 22 mm, no. 1 o n. 1.5), una lama del rasoio e tre salviette assorbenti senza lafo.
NOTA: Per realizzare 12 costrutti di idrogel, sono necessari 24 coperchi di vetro. Dovrebbero essere presenti due coverlips per costrutto. Si consiglia di preparare alcuni coverlips di ricambio. - Mettere due pezzi di pellicola di paraffina (4 x 4 pollici) in una scatola di plastica resistente all'etanolo (ad esempio, una scatola di punta di 1.000 zL) e sterilizzarli in etanolo fresco del 70% per almeno 15 min.
4. Preparazione della soluzione precursore di idrogel di poliacrilammide
NOTA: il protocollo viene modificato da Lee etal.
- Sciogliere 125 mg di methacritillat aminoethyl (AEM) in 36,25 mL di acqua deionizzata in un tubo di centrifugazione in polipropilene da 50 mL mediante vortice.
- Per preparare 50 mL di 10 kPa polyacrylamide precursore (8–0,15–15 mM), mescolare 10 mL di 40% soluzione acrilamide, 3,75 mL di 2% soluzione bis-acrilamide e 36,25 mL della soluzione AEM preparata nel passaggio 4.1 in un nuovo tubo in polipropelica da 50 mL.
NOTA: La concentrazione finale della soluzione precursore è 8% acrilammide, 0.15% bis-acrilamide, e 15 mM AEM, che è stato misurato per avere 10 kPa rigidità dalla microscopia a forza atomica. Secondo le applicazioni tissutali di interesse, la rigidità dell'idrogel può essere alterata cambiando il rapporto tra il 40% di acrilammide e la soluzione del 2% di bis-acrilamide. Ad esempio, 8% soluzione acrilammide–0.08% bis-acrilamide produce 3 kPa idrogel; 8% soluzione di acrilammide–0.48% bis-acrilammide produce 38 kPa idrogels; 8% soluzione di acrilammide-0.48% bis-acrilammide produce 60 kPa idrogel. Si consiglia di confermare la rigidità degli idrogel riforniti dalle soluzioni precursori con rapporti alterati.
5. Preparazione della soluzione fotoinitiata
- Per 1 mL di soluzione fotoinitiatora del 5%, sciogliere 50 mg di 2-idrossie-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-metilpropiophenone polvere in 700 l una di 100% etanolo in un tubo di centrifuga di polipropilene da 1,5 ml con coperchio.
NOTA: 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone non è solubile in acqua. Assicurarsi di sciogliere completamente la polvere in etanolo vortice. - Dopo aver completamente sciolto il 2-idrossi-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-2-methylpropiophenone in etanolo mediante vortice, aggiungere 300 l di salina con buffer fosfato (PBS) per un volume finale di 1 mL.
NOTA: La concentrazione finale di 2-idrossi-4'-(2-idrossitorossi)-2-metilpropiophenone soluzione è 5%. La soluzione fotoinititore del 5% sventata è buona per 4 settimane a 4 gradi centigradi.
6. Preparazione della soluzione proteica della matrice della membrana del seminterrato
NOTA: La matrice della membrana del seminterrato (Tabella dei materiali) è un materiale sensibile alla temperatura. Assicurati di lavorare sul ghiaccio con punte e tubi di pipetta refrigerate e soluzioni ghiacciate. Un nuovo stock di matrice della membrana del seminterrato dovrebbe essere scongelato lentamente sul ghiaccio a 4 gradi durante la notte.
- Preparare 200 l di soluzione di proteina a matrice di membrana seminterrato per costrutto di idrogel. Per 12 costrutti, sono necessari 2,4 mL di soluzione proteica a matrice di membrana seminterrato. Preparare il 10% di soluzione extra (ad esempio, 2,6 mL).
- Per ogni nuova soluzione proteica a matrice di membrana del seminterrato, ottimizzare il rapporto di diluizione. Per la prima volta, prova i rapporti di diluizione di 1:10, 1:20, 1:40 per trovare il rapporto di diluizione che produce le migliori qualità per il patterning cellulare.
NOTA: Se la soluzione proteica della matrice della membrana del seminterrato è troppo viscosa, formerà un gel sopra lo stencil, ed è più probabile che si stacci quando si rimuove lo stencil. Se la soluzione proteica è troppo fluida, penetrerà attraverso i fori di pattern degli stencil, che si tradurrà in patterning di scarsa qualità. - Soluzione di stock proteico a matrice a membrana seminterrato diluito sul ghiaccio con supporti Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) del freddo-freddo o 1x PBS al rapporto di diluizione ottimizzato sopra riportato. Ad esempio, diluire 120 l della soluzione stock in 2,4 mL di supporti DMEM/F12 (1:20) e continuare a inseguire il ghiaccio per un uso successivo.
7. Fabbricazione idrogel
- Collocare una lampada da banco UV (365 nm, 4 mW/cm2)in un cofano di sicurezza biologico.
- Posizionare le pellicole di paraffina sterilizzate dal punto 3.2 e asciugarle completamente in condizioni sterili. Se le pellicole di paraffina non sono completamente asciutte, utilizzare un sistema di aspirazione a vuoto per rimuovere qualsiasi liquido residuo. Posizionare sei coverlips autoclaved dal punto 3.1 su ogni pellicola di paraffina utilizzando le pinze autoclaved.
- Preparare la soluzione precursore della poliacrilammide cross-link UV diluindo il 5% della soluzione fotoinititore (passaggio 5.2) con la soluzione precursore della poliacrilammide (passaggio 4.2) in un tubo di centrifugazione in polipropilene da 50 mL. Per 5 mL di soluzione precursore della poliacrilammide UV-crosscollegabile, aggiungere 50 -L di 5% di soluzione fotoinitificatore a 5 mL di soluzione precursore della poliacrilammide.
- Filtrare la soluzione precursore dal passaggio 7.3 utilizzando un'unità filtro da 50 mL con una dimensione dei pori di 0,22 m per la sterilizzazione.
NOTA: Prepara sempre la soluzione precursore fresca. - Distribuire 200 -L della soluzione precursore della poliacrilammide dal passo 7.4 su ogni coperchio di copertura di vetro 22 x 22 mm nella parabola Petri girata in paraffina e coprire con cura con un altro coperchio di vetro da 22 x 22 mm sulla parte superiore al sandwich la soluzione tra (Figura 3A).
NOTA: la pellicola di paraffina viene utilizzata per evitare fuoriuscite e per limitare la soluzione precursore tra i copricopertine. - Posizionare il piatto Petri contenente il coperchio dal punto 7.5 sotto la lampada da banco UV e fotopolimerizzare gli idrogel poliacrilamina per 5 min (Figura 3B).
NOTA: Se la superficie non è bianca, l'assorbimento UV della superficie riduce l'efficienza fotocrosslinking. La copertura del white paper sulla superficie non bianca è importante per ridurre al minimo la perdita di intensità UV. Per proteggersi dalle radiazioni UV, coprire la lampada con un foglio di alluminio e indossare occhiali di protezione UV. - Staccare con attenzione una copertura scivolare fuori dall'altra utilizzando una lama di rasoio con un'azione di leva (Figura 3C).
NOTA: L'idrogel di solito si attacca al coperchio superiore. Prestare particolare attenzione quando si stacca il coperchio dall'idrogel morbido, perché è probabile che si rompa. - Riempire un serbatoio di polipropilene usa e getta con PBS. Trasferire i compositi idrogel-coverslip in un serbatoio contenente PBS per sciacquare gli idrogel in PBS per 5 min. Dopo il risciacquo, riporre il costrutto idrogel sulla pellicola di paraffina nella parabola Petri.
8. coniugazione proteica
- Preparare un secchio di ghiaccio e precool PBS.
NOTA: Per sei idrogel, sono necessari 1.200 l di PBS freddo. - Estrarre il sulfo-SANPAH aliquota (1 fiala e 6 gel).
NOTA: se necessario, la quantità di sulfo-SANPAH utilizzata può essere ridotta dopo l'ottimizzazione. - Aggiungere 1.200 l di PBS freddo in una fiala di solfi-SANPAH e mescolare con la pipista su e giù.
- Distribuisci 200 - L di sulfo-SANPAH sulla pellicola di paraffina nella parabola di Petri e copri con il composito idrogel-coverslip con idrogel che contatta il sulfo-SANPAH (Figura 3D).
NOTA: Sulfo-SANPAH è molto suscettibile all'acqua a causa dell'idrolisi. Appena scongelato da -80 gradi centigradi prima dell'uso. Non riutilizzare o ricongelare gli avanzi. - Esporre l'idrogel alla lampada UV a 365 nm, 4 mW/cm2 per 5 min per attivare sulfo-SANPAH.
NOTA: dopo l'esposizione, il sulfo-SANPAH cambierà da arancione a marrone (Figura 3E). Se l'idrogel diventa marrone, indica la corretta attivazione del gruppo fenile azide di sulfo-SANPAH e l'incorporazione di sulfo-SANPAH sull'idrogel. Procedere direttamente con i passaggi da 8,6 a 8,9 entro un massimo di 10 min, perché l'attività di sulfo-SANPAH diminuirà. - Rifornire un serbatoio di polipropilene usa e getta con PBS fresco. Dopo l'attivazione di sulfo-SANPAH, trasferire gli idrogel attivati e sciacquare rapidamente gli idrogel in un serbatoio PBS per rimuovere il solfo-SANPAH non associato.
NOTA: Un lavaggio lungo può comportare una bassa efficienza di coniugazione proteica. - Dopo un rapido risciacquo, posizionare le coperture attaccate all'idrogel sulla pellicola di paraffina nei piatti Petri e tamponare con cura gli idrogel con salviette sterili senza lamino.
NOTA: Il PBS rimanente sulla parte superiore dell'idrogel si tradurrà in perdite della soluzione di proteina matrice di membrana seminterrato attraverso lo stencil, e l'essiccazione troppo estesa porterà alla rottura dell'idrogel al momento della rimozione dello stencil a causa di un'aderenza troppo elevata allo stencil. - Posizionare lo stencil sopra gli idrogel e dab con salviette autoclaved senza laminetta per garantire una tenuta stretta tra lo stencil e l'idrogel (Figura 3F).
- Eroga con cura 200 - L della soluzione dissoluta della proteina a matrice della membrana del seminterrato preparata dal passo 6.3 (Figura 3G) in cima. Lasciare per una notte nell'incubatrice (37 gradi centigradi).
NOTA: Quando il contatto stencil-idrogel è stretto e la concentrazione di soluzione proteica matrice della membrana seminterrato è ottimale, la soluzione proteica matrice della membrana seminterrato sarà sequestrato e rimanere in cima allo stencil (Figura 3H). Il tempo di incubazione può essere ridotto al momento dell'ottimizzazione. Teoricamente, può essere ridotto a 30 min-2 h. - Il giorno successivo, trasferire gli idrogel su una piastra 6 e immergerli completamente in PBS.
NOTA: Si consiglia di staccare lo stencil con immersione PBS sopra il coperchio per evitare strappi e attacchi dell'idrogel allo stencil. - Rimuovere con attenzione lo stencil utilizzando una pinzetta autoclaved senza strappare l'idrogel. Risospendere bene con DMEM, restituire gli idrogel a motivi geometrici all'incubatrice e lasciarli durante la notte per verificare eventuali contaminazioni.
- Se il supporto rimane chiaro, gli idrogel sono pronti per essere utilizzati per la placcatura cellulare. Ottimizzare la densità di placcatura cellulare e il tempo di incubazione per consentire l'adesione delle cellule per le rispettive applicazioni.
NOTA: Per la modellazione a cella singola di hiPSC-CMs, seme e incubazione durante la notte. I seguenti numeri di cella sono consigliati per il seeding: 30.000, 60.000 e 90.000 celle/bene. Semina di troppe cellule porta a più di una cella per modello. Si raccomanda un colino cellulare per filtrare le cellule non singole prima della semina cellulare. - Il giorno dopo, osservare l'attaccamento e la diffusione delle cellule, e cambiare i media per sbarazzarsi di cellule staccate.
9. Pulizia degli stencil usati
- Per rimuovere le proteine a matrice residua sugli stencil usati, immergi gli stencil in soluzione enzimatica (Tabella dei materiali) per 10 min a 37 gradi centigradi.
NOTA: L'enzima deve essere selezionato a seconda delle proteine della matrice utilizzate. Per la soluzione proteica matrice ricca di collagene, utilizzare collagenae. Un 10-15 min ultrasonicazione in soluzione enzimatica è anche raccomandato. - Aspirare la soluzione e ricostituire con 10% candeggina. Incubare per 10 min a temperatura ambiente.
- Risciacquare 3x con PBS.
- Conservare nel 70% di etanolo a 4 gradi centigradi fino all'uso.
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Representative Results
È stata dimostrata la fabbricazione di stencil contenenti una matrice di quadrati o rettangoli (Figura 4A). Seguendo questo protocollo, abbiamo ottenuto isole di proteine a matrice modellata (Figura 4B e Figura 5A) e celle (Figura 4C). La concentrazione di soluzione proteica a matrice non ottimale ha portato a patterning non ottimale (Figura 5B). È fondamentale utilizzare il lato anteriore dello stencil. Se viene utilizzato il lato posteriore dello stencil, la dimensione delle isole di proteine della matrice aumenta a causa della direzione del taglio laser (Figura 6A,B). Mentre la larghezza dei modelli rettangolari non è cambiata in modo significativo (Figura 6C), l'altezza è notevolmente aumentata quando si utilizza il lato posteriore dello stencil, portando a una riduzione delle proporzioni previste (Figura 6D,E). Abbiamo applicato patterning basati su stencil ai substrati di elastomer in silicio (Figura 7). I cardiomiociti modellati sui substrati di elastomia di silicio sono stati visualizzati dall'immunocitochimica della troponina cardiaca T a bassa frequenza (Figura 7A) e dalla proteina sarerica di z-actinina ad alta ingrandimento (Figura 7B). Il patterning basato su stencil potrebbe anche essere applicato per patternare due cardiomiociti fianco a fianco su idrogel con rigidità diverse. Come dimostrazione, mostriamo il patterning cardiomiocita sulla rigidità fisiologicamente rilevante (Figura 8A) e rigidità patologicamente rilevante (Figura 8B).
Figura 1: Schema di tre strategie di micromodellazione gold-standard. (A) Fotolitografia. (B) Stampa microcontatto. (C) Modelli microfluidici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: flusso di lavoro di progettazione di stencil. (A) La progettazione assistita dal computer dello stencil. (B) Una fotografia rappresentativa di uno stencil in poliimide tagliato a laser. (C) Un'immagine microscopica rappresentativa di uno stencil. L'area gialla rappresenta lo stencil di poliimide, mentre l'area azzurra rappresenta una matrice di fori tagliati al laser. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fotografie delle fasi di fabbricazione dell'idrogel. (A) Fabbricazione di idrogel di poliacrilammide inserendo la soluzione precursore tra due copricapi. (B) Fotocrossismo UV di idrogel di poliacrilammide sotto la lampada da banco UV. La lampada UV è ricoperta di lamina di alluminio per la protezione dell'utente. (C) L'idrogel foto-crosslinked viene recuperato staccando un coperchio su un lato. (D) Il costrutto idrogel è in contatto con la soluzione sulfo-SANPAH per modificare l'idrogel per l'incorporazione di proteine ECM. Prima dell'attivazione UV, il sulfo-SANPAH è arancione. (E) Dopo l'attivazione UV, sulfo-SANPAH diventa marrone, indicando che è attivato e incorporato sulla superficie dell'idrogel. (F) Dopo aver tamponato l'idrogel con salviette sterili senza lamino per rimuovere l'acqua in eccesso, lo stencil viene posizionato sull'idrogel. (G) La soluzione proteica a matrice della membrana del seminterrato viene condotta sui costrutti stencil-idrogel. (H) Se il contatto stencil-idrogel è stretto con successo, la soluzione proteica matrice della membrana seminterrato rimarrà in cima e non scorrerà attraverso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Micropatterning delle proteine della matrice della membrana del seminterrato e dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CMs) con diverse forme rettangolari. (A) Immagini microscopiche di stencil contenenti rettangoli tagliati al laser con proporzioni diverse (1:1, 4:1, 11:1). (B) Immagini rappresentative delle isole proteiche a matrice immunostaina su substrati idrogel. (C) Immagini rappresentative di hiPSC-CMs macchiate per nuclei (ciano) e troponina cardiaca T (magenta). Barra di scala: 20 m per i pannelli B e C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: La concentrazione di proteine ECM svolge un ruolo essenziale nella generazione di modelli adeguati. (A) Immagine rappresentativa di una concentrazione ottimale con distribuzione molto omogenea delle proteine della matrice della membrana del seminterrato nei singoli modelli. (B) Modelli di proteine a matrice non ottimali dovuti alla bassa concentrazione, che ha causato la fuoriuscita di proteine matriciali al di fuori dei modelli e basse quantità di proteine matriciali all'interno dei modelli, come determinato dalla colorazione agglutinina germinale del frumento. Barra di scala: 20 m per i pannelli A e B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Effetto collaterale dello stencil. (A) Modelli di proteine della matrice della membrana del seminterrato quando è stato utilizzato il lato anteriore dello stencil. (B) Modelli di proteina della matrice della membrana del seminterrato quando è stato utilizzato il lato posteriore dello stencil. Quantificazione della larghezza di (C),(D)dell'altezza , (E) proporzioni delle isole rettangolari di proteine della matrice della membrana seminterrato. Il grafico è tracciato in media: le statistiche SEM. Vengono calcolate dal test T degli studenti non accoppiato. n.s. non è significativo. p < 0.0001. Barra di scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Modellazione basata su stencil su substrato di elastomero di silicio. (A) Un'immagine rappresentativa dei cardiomiociti a singola cellula su substrati di elastomia di silicio macchiati dal marcatore cardiaco, troponina cardiaca T (cTnT), a basso ingrandimento. Barra di scala (B) Un cardiomiocito rappresentativo a singola cellula macchiato dalla proteina sarcomerica di z-actinina ad alto ingrandimento. Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Micropatterning di hiPSC-CMs su idrogel di poliacrilammide con rigidità diverse. (A) 10 kPa, (B) 60 kPa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Passo | Problema osservato | Possibile motivo | Soluzione |
| 1.1 | La dimensione del modello è più grande del previsto | Stencil capovolto | Includere una lettera/forma chirale nella struttura dello stencil per indicare il lato anteriore e posteriore degli stencil |
| 8.1 | Fratture da idrogel quando si sbucciano gli stencil | Hydrogel si attacca agli stencil | Pulizia degli stencil |
| Non asciugare troppo l'idrogel prima di mettere gli stencil | |||
| 8.13 | L'allegato della cella non è ottimale | Basso-SANPAH degradato | Utilizzare il nuovo sulfo-SANPAH |
| Incorporazione proteica inefficiente | Preparare una nuova soluzione proteica ECM | ||
| Vecchia soluzione proteica ECM | |||
| 8.13 | La modellazione delle cellule non è ottimale | La soluzione proteica a matrice di membrana del seminterrato si riversa | Eseguire l'immunostaining utilizzando anticorpo IgG antitopo coniugato anti fluoroforo o agglutinina germi di grano per esaminare la distribuzione della soluzione proteica della matrice della membrana seminterrato su idrogel |
| 8.13 | Più di una cella su uno slot | Non in sospensione a cella singola | Usa il colino a celle da 40-70 m per avere una sospensione a cella singola |
| Densità di seeding non ottimale | Ottimizzare la densità di seeding da 30 k a 90 k per mL |
Tabella 1: linee guida per la risoluzione dei problemi. Vengono discussi problemi frequenti, possibili motivi e potenziali soluzioni.
File supplementari. Fare clic qui per scaricare i file.
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Discussion
Descriviamo un metodo di micropatterning basato su stencil privo di litografia che consente un patterning efficace delle cellule aderenti. In questo protocollo, dimostriamo la modellazione di hiPSC-CMs in diversi rapporti lunghezza-larghezza micropatternndo le isole proteiche della matrice della membrana seminterrato su idrogel di policritilmide con rigidità dei tessuti fisiologicamente o patologicamente rilevanti o substrati elastomeri a base di silicio. Questo metodo è relativamente semplice e altamente accessibile a tutti i ricercatori, compresi quelli che hanno poca esperienza in fotolitografia e tecniche di microfabbricazione. Il metodo descritto elude le sfide significative associate alla generazione di francobolli utilizzando la litografia morbida e al trasferimento di proteine da stampi per francobolli a substrati di interesse coinvolti nella tecnica di stampa dei microcontatti. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro per 1) creare stencil progettati su misura con un'area e una forma di interesse in modo conveniente; 2) fabbricare un substrato idrogel con la rigidità di interesse; e 3) coniugare in modo efficiente le proteine ECM sul substrato di idrogel.
I metodi tradizionali di litografia morbida sono stati utilizzati per la modellazione di varie forme di proteine ECM, tra cui triangoli e stelle su substrati di diversi materiali come materiali a base di silicio e coperchi in vetro13,14. In questo studio, dimostriamo solo modelli rettangolari data la forma fisiologicamente e patologicamente rilevante dei cardiomiociti. Crediamo che la modellazione basata su stencil di altre forme complesse possa funzionare finché la caratteristica più piccola della forma non va oltre la risoluzione (10 m). Per quanto riguarda i materiali da substrato, viene illustrato che la modellinatura basata su stencil può essere applicata su idrogel (Figura 2, Figura 3, Figura 5, Figura 6 e Figura 8) o substrato di esomero basato sul silicio (Figura 7). Il metodo presentato non funziona su substrati con aderenza minima ai materiali di poliimide come le plastiche della coltura dei tessuti e i copriocchiali in vetro perché la tenuta stretta tra lo stencil a base di poliimide e questi substrati non è raggiunta. Per abilitare la tenuta stretta, è necessaria un'ulteriore modifica della superficie. Infine, mostriamo che il metodo può essere utilizzato per produrre in modo affidabile modelli di coppie di cellule su idrogel con rigidità diverse (cioè, 10 kPa, 60 kPa) (Figura 8).
Nel protocollo, il passo più critico è l'ottimizzazione della concentrazione di proteine ECM (sezione 6 del protocollo). L'obiettivo di questo passaggio è quello di trovare la concentrazione ottimale di proteina ECM che è abbastanza viscosa da inibire la soluzione proteica per insidicarsi attraverso i fori dello stencil, ma non troppo concentrato, per evitare la gelazione (Figura 5). Questo metodo basato su stencil non limita il tipo di proteina ECM. Anche se la soluzione proteica Viscosa ECM è più probabile che rimanga sulla parte superiore dello stencil, può essere utilizzata anche una proteina meno viscosa. Un requisito è fare in modo che le superfici dello stencil e dell'idrogel PA siano abbastanza asciutte da formare un'interfaccia idrofobica relativamente stabile. In questa dimostrazione, è stata utilizzata la proteina della matrice della membrana sotterranea perché è viscosa e adatta per la coltura hiPSC-CMs. Tuttavia, altre proteine ECM possono probabilmente essere utilizzate (ad esempio, fibronectina, gelatina, collagene, laminina).
Oltre all'ottimizzazione della soluzione proteica ECM per ogni applicazione specifica, generare una corretta guarnizione tra lo stencil e la superficie idrogel è fondamentale per ottenere un modello preciso con la proteina ECM. Poiché un'eccessiva essiccazione può portare alla rottura dell'idrogel, è essenziale non asciugare lo stencil. Questi passaggi (cioè, mettendo lo stencil sull'idrogel e delicatamente scandagliandolo in seguito) richiedono un po 'di pratica. Stabilire una procedura di movimentazione ottimale per ogni condizione eviterà anche di avere la levetta idrogel agli stencil. Con questa ottimizzazione, le ustioni laser submicron causate da difetti nel taglio laser non influenzeranno sostanzialmente la tecnica per quanto riguarda i danni agli idrogel.
Un altro passo importante è quello di utilizzare la parte anteriore dello stencil quando si posiziona lo stencil sul substrato idrogel. Abbiamo scoperto che l'uso di ogni lato ha un effetto sul substrato, presumibilmente a causa del taglio laser (Figura 6). Una raccomandazione quando si modellano le celle in dimensioni o forma specifiche per la prima volta è generare uno stencil di ottimizzazione. Le caratteristiche di progettazione dello stencil non corrispondono necessariamente alle dimensioni finali delle celle con motivi. È consigliabile generare uno stencil di ottimizzazione contenente una sfumatura di dimensioni delle entità geografiche. Abbiamo preparato una tabella che elencai potenziali problemi e possibili soluzioni per la risoluzione dei problemi(Tabella 1).
Non è richiesto di utilizzare la stessa società di microfabbricazione menzionata in questo manoscritto. I tasti per una generazione precisa dello stencil sono il diametro del fascio del laser e lo spessore della pellicola stencil, nel nostro caso, la poliimide (50 m). Crediamo che un laboratorio laser dotato di un laser appropriato possa generare lo stencil con pochi passaggi, ottimizzando l'intensità del laser, l'allineamento e altre variabili. Anche se abbiamo lavorato solo con una società, ci sono molte aziende disponibili che eseguono il taglio laser di precisione.
Una limitazione a questo metodo è la risoluzione. Mentre la fotolitografia può ottenere una risoluzione su nanoscala, la risoluzione di patterning basata su stencil è limitata alla risoluzione del taglio laser degli stencil di poliimide, che fino ad oggi è di solito sulla scala di pochi micron (10 m). Tuttavia, dato che la dimensione media delle cellule è superiore a 10 m, la risoluzione è generalmente applicabile a qualsiasi modello a cella singola.
In sintesi, questo metodo fornisce piattaforme versatili per studiare le interazioni cella-ECM, esaminare la correlazione struttura-funzione delle cellule e molte altre applicazioni. Crediamo che questo protocollo andrà a beneficio di molti ricercatori biomedici e faciliterà gli studi sulle singole cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dello Stanford Child Health Research Institute (CHRI) e del National Institute of Health (1F32HL142205-01) a S.L, il NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), l'American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), lo Stanford Cardiovascular Institute, la Hoffmann and Schroepfer Foundation, e la Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W , premi del National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) e Il Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) a J.C.W, l'American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) a H.Y, e il fellowbergership Hengst a T.S. Ringraziamo il Dr. Andrew Olsen di Stanford Neuroscience Microscopy Service per il supporto dell'imaging confocale dell'hiPSC-CM micromodellato. Ringraziamo H.Y. per la prima progettazione di stencil, la fabbricazione, micropatterning a singola cellula di iPSC-CM sulla coverslip rivestita di idrogel in poliacrilamina e l'imaging confocale preliminare della struttura sarcomeda degli iPSC-CM a singola cellula.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
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