Summary
Este protocolo introduce un método de micropatrón libre de litografía que es simple y accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado. Este método utiliza plantillas de corte láser personalizadas para proteínas de matriz extracelular micropatrón en una forma de interés para la modulación de morfologías celulares. El procedimiento para el micropatrón se demuestra utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas.
Abstract
Las técnicas de micropatrón se han utilizado ampliamente en la biología celular para estudiar los efectos del control de la forma y el tamaño de las células en la determinación del destino celular a una sola resolución de celda. Las técnicas actuales de micropatrón de una sola célula de última generación implican litografía suave e impresión de microcontacto, que es una tecnología poderosa, pero requiere habilidades de ingeniería entrenadas y cierto soporte de instalaciones en microfabricación. Estas limitaciones requieren una técnica más accesible. Aquí, describimos un método simple y libre de litografía alternativo: patrón de células únicas basado en plantillas. Proporcionamos procedimientos paso a paso que incluyen diseño de plantillas, fabricación de hidrogel de poliacrilamida, incorporación de proteínas a base de plantillas y chapado y cultivo celular. Este método simple se puede utilizar para patrones de una matriz de hasta 2.000 celdas. Demostramos el patrón de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos únicos (hiPSC) con formas celulares distintas, de un cuadrado 1:1 a un rectángulo adulto similar a 7:1. Este patrón de una sola célula basado en plantillas es libre de litografía, técnicamente robusto, conveniente, barato y, lo que es más importante, accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado.
Introduction
La llegada de los hiPSC y el posterior desarrollo de protocolos para su diferenciación dirigida en diferentes tipos de células han hecho posible el estudio del desarrollo y la enfermedad a nivel molecular y específico del paciente, utilizando específicamente cardiomiocitos iPSC derivados del paciente (iPSC-CM) para modelar cardiomiopatías1,,2. Sin embargo, una limitación importante para estudiar el desarrollo y la fisiología utilizando el sistema iPSC y otros modelos in vitro es la ausencia de un microambiente estructurado. In situ, las celdas se someten a las restricciones de la matriz extracelular (ECM), así como de las celdas vecinas. La composición bioquímica particular y la rigidez de estos microambientes dictan la distribución espacial de las células, así como los factores disponibles para participar en la adhesión celular. Esto, a su vez, influye en las vías de señalización intracelular, la expresión génica y la determinación del destino celular. Por ejemplo, el iPSC-CM micropatrónizado en una forma de varilla similar a un adulto tiene una capacidad contráctile, flujo de calcio, organización mitocondrial, electrofisiología y formación de túbulostransversales 3. Por lo tanto, las propiedades del microambiente son integrales en la regulación de las funciones celulares.
Las técnicas anteriores de micropatrones se basaban en gran medida en la fotolitografía(Figura 1A). En esta técnica, una capa de polímero fotosensible, o fotorresistente, se hila sobre un sustrato plano de la solución para formar una película delgada de aproximadamente 1 m de espesor. A continuación, la luz ultravioleta (UV) se aplica sobre el fotorresistente a través de una máscara que contiene el patrón deseado. La exposición a la luz ultravioleta (UV) altera químicamente el fotorresistente modificando su solubilidad en su respectiva solución de desarrollo, transfiriendo el patrón deseado de la máscara al sustrato. Muchos métodos de micropatrones incorporan fotolitografía, ya que confiere nanómetro al control a nivel de micrómetro sobre el diseño de los patrones celulares. Sin embargo, el giro del fotorresistente es muy sensible a las impurezas, ya que las partículas de polvo más pequeñas interrumpirán la propagación de la solución en una película delgada. Por lo tanto, la fotolitografía debe llevarse a cabo en instalaciones no contaminadas, que son costosas de mantener y requieren conocimientos especializados especiales para su uso. Además, los productos químicos utilizados en la fotolitografía son a menudo tóxicos para las células y pueden desnaturalizar biomoléculas importantes. Por lo tanto, la fotolitografía plantea obstáculos significativos a la fabricación de micropatrones para aplicaciones biológicas convenientes.
En 1994, Whitesides y sus colegas4 superaron algunos de los desafíos asociados con la fotolitografía al ser pioneros en una colección de técnicas llamadas litografía blanda. En la litografía blanda, se utiliza una superficie microestructurada hecha con polidimetilsiloxano (PDMS), un material transparente similar al caucho, para generar un patrón de proteínas ECM4. Las técnicas litográficas suaves comunes incluyen impresión de microcontacto sin patrones microfluídicos. En la impresión de microcontactos, actualmente el método litográfico suave más popular, un sello PDMS recubierto con proteínas ECM transfiere el material a una superficie en las áreas contactadas por el sello(Figura 1B). En el patrón microfluídico, las microestructuras se diseñan sobre una superficie PDMS de tal manera que cuando el sello se presiona a un sustrato, se crea una red de microcanales, a través de los cuales se pueden suministrar fluidos a las áreas deseadas (Figura 1C)5. La litografía suave ofrece varios beneficios sobre la fotolitografía. Una vez que una oblea maestra está microfabricada, los sellos PDMS se pueden replicar fácilmente sin más empleo de instalaciones de salas limpias. Además, la ausencia de disolventes orgánicos en el proceso de litografía blanda permite la utilización de materiales poliméricos como el poliestireno, normalmente utilizado en el cultivo celular. Por último, el micropatrón mediante métodos litográficos suaves no se limita a superficies planas. Por lo tanto, la litografía suave aumenta la accesibilidad y la funcionalidad de la fabricación de micropatrones sobre la fotolitografía6. Sin embargo, la litografía blanda tiene inconvenientes significativos. Por ejemplo, todavía se requiere un paso inicial de grabado, utilizando fotolitografía, para microfabricar el sello. Además, el micropatrón mediante un sello PDMS está sujeto a variaciones en la calidad de la transferencia de proteínas en el sustrato6. Evitar estas discrepancias requiere optimización y coherencia en la presión aplicada al sello PDMS durante la transferencia de proteínas, de lo contrario la deformación y distorsión de los tamaños de entidad de los moldes PDMS pueden ocurrir6. También existe una gran preocupación de utilizar repetidamente PDMS debido a la absorción de moléculas pequeñas7.
Para evitar el uso de fotolitografías blandas y sellos PDMS, describimos un método de micropatrón de células únicas basado en plantillas y libre de litografía que supera muchos de los obstáculos asociados con la fotolitografía y la litografía suave. En este método, un hidrogel de poliacrilamida se utiliza como sustrato para la incorporación de proteínas ECM a base de plantillas, lo que permite el chapado selectivo de hiPSC-CM únicos. Esta técnica es altamente compatible con materiales poliméricos utilizados en condiciones clásicas de cultivo celular. Además, con una limpieza y un mantenimiento adecuados, las plantillas son reutilizables y resistentes a la degradación y absorción de proteínas durante el proceso de microfabricación. Por último, el proceso de patrón es técnicamente robusto, económico, personalizable y accesible para aquellos que no tienen habilidades especializadas de bioingeniería. Esta técnica de micropatrón basada en plantillas ha sido ampliamente utilizada en nuestras publicaciones recientes modelando cardiomiopatías variadas8,,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricación de plantillas basadas en poliimida de patrón negativo
- Genere un patrón(figura 2A) en formato .dxf utilizando software de diseño asistido por ordenador (por ejemplo, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
- Genere un círculo (diámetro de 22 mm) para delinear el borde de la plantilla.
- Dibuje una forma llena de sólido o el patrón deseado.
- Incluya una letra quiral (por ejemplo, R) para marcar la parte frontal de las plantillas.
NOTA: Por ejemplo, se genera una matriz de cuadrados y rectángulos para patrones iPSC-CM en niveles de una sola celda y de par de celdas. Los archivos de diseño están disponibles (consulte Archivos suplementarios). El límite de resolución de la microfabricación es de 10 m.
- Envíe el diseño a una empresa de microfabricación para la película de poliimida cortada por láser y la fabricación de plantillas(Figura 2B,C).
2. Preparación de alícuotas sulfo-SANPAH
NOTA: El protocolo se modifica a partir de Fischer et al.11.
- Utilice una caja de almacenamiento de muestras de cartón resistente a la humedad (por ejemplo, 100 pozos, 10 x 10 espacios para tubos centrífugos, dimensiones: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Etiquetarlo como "nombre/fecha/sulfo-SANPAH 40 l/reconstituido con 1.200 ol de PBS".
- Etiquetar 50 tubos de microcentrífuga (polipropileno, 1,5 ml) con una 'S' en la tapa.
- Tomar 4 ml de sulfóxido de dimetil anhidro y extra seco (DMSO) y filtrar estérilmente la solución utilizando una unidad de filtro de membrana (tamaño de los poros a 0,22 m) en un tubo cónico estéril de 15 ml.
- Preparar un baño de nitrógeno líquido y cubrir con la tapa para minimizar la evaporación del nitrógeno líquido.
- Disolver 50 mg de sulfo-SANPAH en 2 ml del DMSO filtrado.
- Vortex bien para disolver completamente el sulfo-SANPAH en el DMSO.
- Distribuya alícuotas de 40 ml de la solución sulfo-SANPAH en tubos estériles de 1,5 ml.
- Transfiera los tubos a la caja.
- Congele los tubos en nitrógeno líquido durante 5 min.
- Conservar las alícuotas a -80oC.
NOTA: Las alícuotas se pueden utilizar durante un máximo de 6 meses sin una eficiencia disminuida. La concentración de sulfo-SANPAH de stock es de 25 mg/ml o 50,77 mM.
3. Esterilización de herramientas
- Autoclave dos fórceps, 24 tapas de vidrio (22 x 22 mm, No. 1 o No. 1.5), una cuchilla de afeitar y tres toallitas absorbentes sin pelusas.
NOTA: Para hacer 12 construcciones de hidrogel, se necesitan 24 tapas de vidrio. Debe haber dos tapas por construcción. Es aconsejable preparar algunos cubreobjetos de repuesto. - Coloque dos piezas de película de parafina (4 x 4 pulgadas) en una caja de plástico resistente al etanol (por ejemplo, una caja de punta de pipeta de 1.000 ml) y esterilizarlas en etanol fresco 70% durante al menos 15 minutos.
4. Preparación de la solución precursora de hidrogel de poliacrilamida
NOTA: El protocolo se modifica de Lee et al.12.
- Disolver 125 mg de metacrilato aminoetilo (AEM) en 36,25 ml de agua desionizada en un tubo centrífugo de polipropileno de 50 ml por vórtice.
- Para preparar 50 ml de solución precursora de poliacrilamida de 10 kPa (8–0,15–15 mM), mezclar 10 ml de solución de acrilamida al 40%, 3,75 ml de solución de centrífuga de bis-acrilamida al 2% y 36,25 ml de la solución AEM preparada en el paso 4.1 en un nuevo tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
NOTA: La concentración final de la solución precursora es del 8% de acrilamida, del 0,15% de bis-acrilamida y de 15 mM de AEM, que se midió para tener una rigidez de 10 kPa mediante microscopía de fuerza atómica. De acuerdo con las aplicaciones tisulares de interés, la rigidez del hidrogel se puede alterar cambiando la relación de la acrilamida del 40% a la solución de bis-acrilamida al 2%. Por ejemplo, la solución de acrilamida-0,08% bis-acrilamida del 8% produce hidrogeles de 3 kPa; 8% acrilamida–0.48% solución bis-acrilamida produce 38 kPa hidrogeles; 8% acrilamida–0.48% solución bis-acrilamida produce 60 kPa hidrogeles. Es aconsejable confirmar la rigidez de los hidrogeles hechos de las soluciones precursoras con relaciones alteradas.
5. Preparación de la solución fotoiniciador
- Para 1 ml de solución fotoiniciador al 5%, disolver primero 50 mg de 2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenoa en 700 l de etanol 100% en un tubo de centrífuga de polipropileno de 1,5 ml con tapa.
NOTA: 2-Hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenoa no es soluble en agua. Asegúrese de disolver completamente el polvo en etanol por vórtice. - Después de disolver completamente el 2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenoa en etanol por vórtice, añadir 300 l de solución salina con fosfato (PBS) para un volumen final de 1 ml.
NOTA: La concentración final de 2-hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenoa solución es 5%. La solución fotoiniciadora de 5% frustrada es buena durante 4 semanas a 4 oC.
6. Preparación de la solución de proteína de matriz de membrana del sótano
NOTA: La matriz de membrana de sótano(Tabla de materiales)es un material sensible a la temperatura. Asegúrese de trabajar en hielo con puntas y tubos de pipeta refrigerados, así como soluciones heladas. Un nuevo stock de matriz de membrana del sótano debe descongelarse lentamente sobre hielo a 4 oC durante la noche.
- Preparar 200 l de solución de proteína de matriz de membrana de sótano por construcción de hidrogel. Para 12 construcciones, se necesitan 2,4 ml de solución de proteína de matriz de membrana de sótano. Preparar una solución adicional al 10% (p. ej., 2,6 ml).
- Para cada nuevo lote/lote de solución de proteína de matriz de membrana de sótano, optimice la relación de dilución. Por primera vez, pruebe las relaciones de dilución de 1:10, 1:20, 1:40 para encontrar la relación de dilución que produce las mejores cualidades para el patrón celular.
NOTA: Si la solución de proteína de matriz de membrana del sótano es demasiado viscosa, formará un gel en la parte superior de la plantilla, y es más probable que se despegue al retirar la plantilla. Si la solución proteica es demasiado fluida, penetrará a través de los orificios de patrón de las plantillas, lo que resultará en patrones de mala calidad. - Diluir la solución de matriz de matriz de membrana del sótano en hielo con medios de mezcla de proteínas de águila modificada/nutrientes F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco en hielo o 1x PBS a la relación de dilución optimizada arriba. Por ejemplo, diluir 120 l de la solución en stock en 2,4 ml de medios DMEM/F12 (1:20) y mantener en hielo para su uso posterior.
7. Fabricación de hidrogel
- Coloque una lámpara de banco UV (365 nm, 4 mW/cm2) en una campana de seguridad biológica.
- Coloque las películas de parafina esterilizadas del paso 3.2 y séquelas completamente en condiciones estériles. Si las películas de parafina no están completamente secas, utilice un sistema de aspiración al vacío para eliminar cualquier líquido residual. Coloque seis cubiertas autoclavedas de cada película de parafina usando los fórceps autoclavedos.
- Preparar la solución precursora de poliacrilamida reticulable UV diluyendo la solución fotoiniciadora al 5% (paso 5.2) con solución precursora de poliacrilamida (paso 4.2) en un tubo centrífugo de polipropileno de 50 ml. Para 5 ml de solución precursora de poliacrilamida retilable por UV, añada 50 ml de solución fotoiniciador al 5% a 5 ml de solución precursora de poliacrilamida.
- Filtre la solución precursora del paso 7.3 utilizando una unidad de filtro de 50 ml con un tamaño de poro de 0,22 m para la esterilización.
NOTA: Prepare siempre una solución precursora fresca. - Dispensar 200 l de solución precursora de poliacrilamida del paso 7.4 en cada resbalón de cubierta de vidrio de 22 x 22 mm en la placa Petri filmada con parafina y cubrir cuidadosamente con otro cubredes de vidrio de 22 x 22 mm en la parte superior para emparedar la solución en el medio(Figura 3A).
NOTA: La película de parafina se utiliza para evitar derrames y para limitar la solución precursora entre los cubreobjetos. - Coloque la placa Petri que contiene el revestimiento de cubierta del paso 7.5 debajo de la lámpara de banco UV y fotopolimerizar los hidrogeles de poliacrilamida durante 5 min(Figura 3B).
NOTA: Si la superficie no es blanca, la absorbancia UV de la superficie reduce la eficiencia de fotocrosslinking. La cobertura del libro blanco en la superficie no blanca es importante para minimizar la pérdida de intensidad UV. Para protegerse de la radiación UV, cubra la lámpara con papel de aluminio y use gafas de protección UV. - Separe cuidadosamente una cubierta que se deslice de la otra usando una cuchilla de afeitar mediante la acción de apalancamiento(Figura 3C).
NOTA: El hidrogel generalmente se pegará a la cubierta superior. Preste especial atención al separar el cubreobjetos del hidrogel blando, ya que es probable que se rompa. - Llene un depósito de polipropileno desechable con PBS. Transfiera los compuestos de hidrogel-coverslip en un depósito que contiene PBS para enjuagar los hidrogeles en PBS durante 5 min. Después de enrestar, coloque la construcción de hidrogel de nuevo en la película de parafina en el plato Petri.
8. Conjugación de proteínas
- Prepare un cubo de hielo y preenfríe PBS.
NOTA: Para seis hidrogeles, se necesitan 1.200 ml de PBS frío. - Saque la alícuota sulfo-SANPAH (1 vial a 6 geles).
NOTA: Si es necesario, la cantidad de sulfo-SANPAH utilizada se puede reducir después de la optimización. - Agregue 1.200 ml de PBS frío en un vial de alícuota sulfo-SANPAH y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Dispensar 200 l de sulfo-SANPAH en la película de parafina en la placa Petri y cubrir con el compuesto de hidrogel-coverslip con hidrogel en contacto sulfo-SANPAH(Figura 3D).
NOTA: Sulfo-SANPAH es muy susceptible al agua debido a la hidrólisis. Recién descongelar se a partir de -80 oC justo antes de su uso. No reutilice ni vuelva a congelar las sobras. - Exponga el hidrogel a la lámpara UV a 365 nm, 4 mW/cm2 durante 5 min para activar sulfo-SANPAH.
NOTA: Después de la exposición, el sulfo-SANPAH cambiará de naranja a marrón(Figura 3E). Si el hidrogel se vuelve marrón, indica la activación exitosa del grupo de azidas de fenilo de sulfo-SANPAH y la incorporación de sulfo-SANPAH en el hidrogel. Proceda directamente con los pasos 8.6-8.9 dentro de un máximo de 10 min, porque la actividad de sulfo-SANPAH disminuirá. - Reponer un depósito de polipropileno desechable con PBS fresco. Después de la activación del sulfo-SANPAH, transfiera los hidrogeles activados y enjuague rápidamente los hidrogeles en un depósito de PBS para eliminar el sulfo-SANPAH no unido.
NOTA: Un lavado largo puede resultar en una baja eficiencia de conjugación proteica. - Después de un enjuague rápido, coloque los cubredes unidos a hidrogel en la película de parafina en los platos de Petri y coloque cuidadosamente los hidrogeles con toallitas estériles sin pelusas.
NOTA: El PBS restante en la parte superior del hidrogel dará lugar a la fuga de la solución de proteína de matriz de membrana del sótano a través de la plantilla, y el secado demasiado extenso conducirá a la ruptura del hidrogel al retirar la plantilla debido a una adherencia demasiado alta a la plantilla. - Coloque la plantilla enlafadas y colóquela con toallitas autoclave sin pelusas para asegurar un sellado hermético entre la plantilla y el hidrogel(Figura 3F).
- Dispensar cuidadosamente 200 l de la solución de proteína de matriz de membrana de sótano diluido preparada a partir del paso 6.3(Figura 3G)en la parte superior. Dejar pasar la noche en la incubadora (37oC).
NOTA: Cuando el contacto entre la plantilla y el hidrogel es estrecho y la concentración de la solución de proteína de matriz de membrana del sótano es óptima, la solución de proteína de matriz de membrana del sótano se secuestrará y permanecerá encima de la plantilla(Figura 3H). El tiempo de incubación se puede reducir tras la optimización. Teóricamente, se puede reducir a 30 min-2 h. - Al día siguiente, transfiera los hidrogeles a una placa de 6 pocillos y sumérgelos completamente en PBS.
NOTA: Se recomienda despegar la plantilla con inmersión PBS sobre la cubierta para evitar el desgarro y pegado del hidrogel a la plantilla. - Retire cuidadosamente la plantilla con pinzas autoclavedas sin romper el hidrogel. Resuspenda bien con DMEM, devuelva los hidrogeles estampados a la incubadora y déjelos durante la noche para comprobar cualquier contaminación.
- Si el medio permanece limpio, los hidrogeles están listos para ser utilizados para el revestimiento celular. Optimice la densidad de chapado celular y el tiempo de incubación para permitir la adhesión de las células para las aplicaciones respectivas.
NOTA: Para patrones de una sola célula de hiPSC-CM, semilla e incubar durante la noche. Se recomiendan los siguientes números de celda para la sembración: 30,000, 60,000, y 90,000 celdas/pozo. La sembración de demasiadas células conduce a más de una celda por patrón. Se recomienda un colador celular para tensar las células no individuales antes de la sembración celular. - Al día siguiente, observe el apego celular y la propagación, y cambie los medios para deshacerse de las células separadas.
9. Limpieza de las plantillas usadas
- Para eliminar las proteínas de matriz residual en las plantillas usadas, sumerja las plantillas en solución enzimática(Tabla de materiales)durante 10 min a 37 oC.
NOTA: La enzima debe seleccionarse en función de las proteínas de matriz utilizadas. Para una solución de proteína de matriz rica en colágeno, utilice la colagenasa. También se recomienda una ultrasonicación de 10-15 minutos en solución enzimática. - Aspirar la solución y reponer con 10% de lejía. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
- Enjuague 3x con PBS.
- Conservar en 70% de etanol a 4oC hasta su uso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Se ha demostrado la fabricación de plantillas que contienen una matriz de cuadrados o rectángulos (Figura 4A). Siguiendo este protocolo, obtuvimos islas proteicas de matriz de patrones(Figura 4B y Figura 5A)y células (Figura 4C). La concentración de la solución de proteína de matriz subóptima dio lugar a patrones subóptimos(Figura 5B). Es fundamental utilizar la parte frontal de la plantilla. Si se utiliza la parte posterior de la plantilla, el tamaño de las islas de proteína de matriz aumenta debido a la dirección del corte por láser(Figura 6A,B). Si bien la anchura de los patrones rectangulares no cambió significativamente(Figura 6C),la altura aumentó significativamente cuando se utiliza la parte posterior de la plantilla, lo que conduce a una reducción de la relación de aspecto prevista(Figura 6D,E). Aplicamos patrones basados en plantillas a sustratos de elastómero de silicio(Figura 7). Los cardiomiocitos patrones en sustratos de elastómero de silicio fueron visualizados por la inmunocitoquímica de la troponina cardiaca T a bajo aumento(Figura 7A)y la proteína sarcomrica-actinina a alto aumento(Figura 7B). El patrón basado en la plantilla también se podría aplicar al patrón de dos cardiomiocitos lado a lado en hidrogeles con diferentes rigidezes. Como demostración, mostramos el patrón de cardiomiocitos en rigidez fisiológicamente relevante(Figura 8A)y rigidez patológicamente relevante(Figura 8B).
Figura 1: Esquema de tres estrategias de micropatrones estándar de oro. (A) Fotolitografía. (B) Impresión de microcontacto. (C) Patrones microfluídicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo de diseño de plantillas. (A) El diseño asistido por ordenador de la plantilla. (B) Una fotografía representativa de una plantilla de poliimida cortada por láser. (C) Una imagen microscópica representativa de una plantilla. El área amarilla representa la plantilla de poliimida, mientras que el área azul claro representa una serie de agujeros cortados por láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Fotografías de los pasos de fabricación de hidrogel. (A) Fabricación de hidrogel de poliacrilamida mediante la intercalación de la solución precursora entre dos tapas. (B) foto-reticulación UV de hidrogeles de poliacrilamida bajo la lámpara de banco UV. La lámpara UV está cubierta con papel de aluminio para la protección del usuario. (C) El hidrogel foto-reticulado se recupera desprendiendo un cubreobjetos en un lado. (D) La construcción del hidrogel está en contacto con la solución sulfo-SANPAH para modificar el hidrogel para la incorporación de proteínas ECM. Antes de la activación UV, el sulfo-SANPAH es naranja. (E) Después de la activación UV, sulfo-SANPAH se vuelve marrón, lo que indica que está activado e incorporado sobre la superficie del hidrogel. ( F) Después de colocar el hidrogel con toallitas estériles libres de pelusas para eliminar el exceso de agua, la plantilla se coloca en el hidrogel. (G) La solución de proteína de matriz de membrana sótano se pipetea sobre las construcciones de plantilla-hidrogel. (H) Si el contacto entre la plantilla y el hidrogel es apretado con éxito, la solución de proteína de matriz de membrana del sótano permanecerá en la parte superior y no se filtra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Micropatrón de proteínas de matriz de membrana de sótano y cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC-CM) con diferentes formas rectangulares. (A) Imágenes microscópicas de plantillas que contienen rectángulos cortados por láser con diferentes relaciones de aspecto (1:1, 4:1, 11:1). (B) Imágenes representativas de islas de proteínas de matriz inmunomancha en sustratos de hidrogel. (C) Imágenes representativas de hiPSC-CP teñidos de núcleos (cian) y troponina cardiaca T (magenta). Barra de escala de 20 m para los paneles B y C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La concentración de proteínas ECM desempeña un papel esencial en la generación de patrones adecuados. (A) Imagen representativa de una concentración óptima con distribución muy homogénea de proteínas de matriz de membrana de sótano en los patrones individuales. (B) Patrones de proteína sóctosimos debido a la baja concentración, que causó fugas de proteína de matriz fuera de los patrones y bajas cantidades de proteínas de matriz dentro de los patrones determinados por la tinción de aglutinina de glúteos de trigo. Barra de escala de 20 m para los paneles A y B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Efecto secundario de la plantilla. (A) Patrones de proteína de matriz de membrana sótano cuando se utilizó la parte frontal de la plantilla. (B) Patrones de proteína de matriz de membrana sótano cuando se utilizó la parte posterior de la plantilla. Cuantificación de (C) anchura, (D) altura, (E) relación de aspecto de las islas de proteína de matriz de membrana rectangular de sótano. El gráfico es la media trazada : SEM. Las estadísticas se calculan mediante la prueba T del estudiante no emparejado. n.s. no es significativo. • p < 0.0001. Barra de escala a 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Patrón a base de plantillas sobre sustrato de elastómero de silicio. (A) Una imagen representativa de cardiomiocitos con patrón de una sola célula en sustratos de elastómero de silicio manchados por el marcador cardíaco, troponina cardiaca T (cTnT), con bajo aumento. Barra de escala a 300 m.(B) Un cardiomicito representativo patrón de una sola célula manchado por la proteína sarcomerica-actinina con alto aumento. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Micropatrón de hiPSC-CM en hidrogeles de poliacrilamida con diferentes rigidezes. (A) 10 kPa, (B) 60 kPa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Paso | Problema observado | Posible razón | Solución |
| 1.1 | El tamaño del patrón es mayor de lo esperado | La plantilla está volteada | Incluya una letra/forma quiral en el diseño de la plantilla para indicar la parte delantera y trasera de las plantillas |
| 8.1 | Fracturas de hidrogel al pelar plantillas | Hydrogel se adhiere a las plantillas | Limpieza de plantillas |
| No seque demasiado el hidrogel antes de poner plantillas | |||
| 8.13 | El apego celular es subóptimo | Sulfo-SANPAH degradado | Utilice el nuevo sulfo-SANPAH |
| Incorporación ineficiente de proteínas | Preparar una nueva solución proteica de ECM | ||
| Solución proteica ECM antigua | |||
| 8.13 | El patrón celular es subóptimo | La solución de proteína de matriz de membrana de sótano se derrama sobre | Realizar inmunostaining utilizando anticuerpos IgG anti ratón conjugados con fluoróforo o aglutina de germen de trigo para examinar la distribución de la solución de proteína de matriz de membrana de sótano en hidrogel |
| 8.13 | Más de una celda en una ranura | No en suspensión de una sola celda | Utilice un colador de células de 40 a 70 m para tener suspensión de una sola célula |
| Densidad de sembrado no óptima | Optimizar la densidad de semillas de 30 k a 90 k por ml |
Tabla 1: Directrices de solución de problemas. Se discuten problemas frecuentes, posibles razones y posibles soluciones.
Archivos suplementarios. Haga clic aquí para descargar archivos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Describimos un método de micropatrón basado en plantillas libre de litografía que permite un patrón eficaz de las células adherentes. En este protocolo, demostramos el patrón de hiPSC-CM en diferentes relaciones longitud-anchura mediante el micropatrón de islas de proteína de matriz de membrana de sótano en hidrogeles de poliacrilamida con rigidez tisular fisiológica o patológicamente relevante o sustratos de elastómero a base de silicio. Este método es relativamente simple y altamente accesible para cualquier investigador, incluyendo aquellos que tienen poco contenido en fotolitografía y técnicas de microfabricación. El método descrito elude los desafíos significativos asociados con la generación de sellos mediante litografía suave y la transferencia de proteínas de moldes de sellos a sustratos de interés involucrados en la técnica de impresión de microcontactos. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo a 1) crear plantillas diseñadas a medida con un área y forma de interés de una manera rentable; 2) fabricar un sustrato de hidrogel con la rigidez de interés; y 3) conjugar eficientemente las proteínas ECM en el sustrato de hidrogel.
Los métodos tradicionales de litografía suave se han utilizado para el patrón de diversas formas de proteínas ECM, incluyendo triángulos y estrellas en sustratos de diferentes materiales como materiales a base de silicio y cubiertas de vidriolips13,14. En este estudio, sólo demostramos patrones rectangulares dada la forma fisiológica y patológicamente relevante de los cardiomiocitos. Creemos que el patrón basado en plantillas de otras formas complejas puede funcionar siempre y cuando la característica más pequeña de la forma no vaya más allá de la resolución (10 m). Con respecto a los materiales de sustrato, demostramos que el patrón basado en plantillas se puede aplicar en hidrogel(Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 y Figura 8) o sustrato de elastómero a base de silicio(Figura 7). El método presentado no funciona en sustratos con una mínima adherencia a materiales de poliimida como plásticos de cultivo de tejido y tapas de vidrio porque no se logra el sellado hermético entre la plantilla a base de poliimida y estos sustratos. Para permitir un sellado hermético, se requiere una modificación adicional de la superficie. Por último, mostramos que el método se puede utilizar para producir de forma fiable patrones de par celular en hidrogeles con diferentes rigidezes (es decir, 10 kPa, 60 kPa)(Figura 8).
En el protocolo, el paso más crítico es la optimización de la concentración de proteínas ECM (sección 6 del protocolo). El objetivo de este paso es encontrar la concentración óptima de proteína ECM que es lo suficientemente viscosa como para inhibir la solución proteica para filtrarse a través de los agujeros de la plantilla, pero no demasiado concentrado, para evitar la gelación(Figura 5). Este método basado en plantillas no restringe el tipo de proteína ECM. Aunque es más probable que la solución de proteína ECM viscosa permanezca en la parte superior de la plantilla, también se puede utilizar una proteína menos viscosa. Un requisito es asegurarse de que las superficies de la plantilla y el hidrogel PA son lo suficientemente secos como para formar una interfaz hidrofóbica relativamente estable. En esta demostración, se utilizó la proteína de matriz de membrana del sótano porque es viscosa y adecuada para el cultivo de hiPSC-CMs. Sin embargo, es probable que se puedan utilizar otras proteínas ECM (p. ej., fibronectina, gelatina, colágeno, laminina).
Además de la optimización de la solución proteica ECM para cada aplicación dada, la generación de un sello adecuado entre la plantilla y la superficie del hidrogel es crucial para obtener un patrón preciso con la proteína ECM. Debido a que el secado excesivo puede conducir a la ruptuación del hidrogel, es esencial no secar en exceso la plantilla. Estos pasos (es decir, colocar la plantilla en el hidrogel, así como pealing suavemente después) requieren un poco de práctica. Establecer un procedimiento de manipulación óptimo para cada condición dada también evitará tener el hidrogel pegado a las plantillas. Con esta optimización, las quemaduras láser a escala submigrante causadas por defectos en el corte por láser no afectarán sustancialmente a la técnica en lo que respecta al daño del hidrogel.
Otro paso importante es utilizar la parte frontal de la plantilla al colocar la plantilla en el sustrato de hidrogel. Encontramos que el uso de cada lado tiene un efecto sobre el sustrato, presumiblemente debido al corte por láser(Figura 6). Una recomendación al modelar celdas en un tamaño o forma específicos por primera vez es generar una galería de símbolos de optimización. Las características de diseño de plantillas no coinciden necesariamente con los tamaños de celda con patrón final. Se recomienda generar una galería de símbolos de optimización que contenga un degradado de tamaños de entidad. Hemos preparado una tabla que enumera los posibles problemas y posibles soluciones para ayudar con la solución de problemas (Tabla 1).
No está obligado a utilizar la misma empresa de microfabricación mencionada en este manuscrito. Las claves para la generación precisa de la plantilla son el diámetro del haz del láser y el espesor de la película de la plantilla, en nuestro caso, la poliimida (50 m). Creemos que un laboratorio láser equipado con un láser adecuado podría generar la plantilla con unos pocos pasos, optimizando la intensidad del láser, la alineación y otras variables. Aunque sólo hemos trabajado con una empresa, hay muchas empresas disponibles que realizan cortes láser de precisión.
Una limitación a este método es la resolución. Mientras que la fotolitografía puede lograr una resolución a nanoescala, la resolución de patrón basada en la plantilla se limita a la resolución del corte por láser de las plantillas de poliimida, que hasta la fecha suele estar en la escala de unas pocas micras (10 m). Sin embargo, dado que el tamaño medio de la celda es de más de 10 m, la resolución es generalmente aplicable a cualquier patrón de celda única.
En resumen, este método proporciona plataformas versátiles para estudiar las interacciones célula-ECM, examinar la correlación estructura-función de la célula y muchas otras aplicaciones. Creemos que este protocolo beneficiará a muchos investigadores biomédicos y facilitará los estudios de una sola célula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas postdoctorales del Stanford Child Health Research Institute (CHRI) y el Instituto Nacional de Salud (1F32HL142205-01) a S.L, el NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), el American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), el Stanford Cardiovascular Institute, la Hoffmann and Schroepfer Foundation, y la División de Medicina Cardiovascular de Stanford, el Departamento de Medicina a S.M.W , premios del Instituto Nacional de Salud (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) y el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco (TRDRP 27IR-0012) a J.C.W, el Premio de Becas Postdoctorales de la Asociación Americana del Corazón (AHA) (18POST34030106) a H.Y, y la beca Hengstberger a T.S. Agradecemos al Dr. Andrew Olsen, del Servicio de Microscopía de Neurociencia de Stanford, el apoyo a las imágenes confocales del hiPSC-CM micropatrónizado. Agradecemos a H.Y. por el primer diseño de plantilla, fabricación, micropatrón de célula única de iPSC-CM en el cubreobjetos recubiertos de hidrogel de poliacrilamida, y la imagen confocal preliminar de la estructura sarcomere de iPSC-CM micropatrónizados de una sola célula.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
