Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Сборка и характеристика полиэлектролитного комплекса Мицеллес

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894

Summary

Мы предоставляем протоколы и репрезентативные данные для проектирования, сборки и характеристики полиэлектролитных комплексных мицелл, наночастиц ядра, образованных полиэлектролитами и гидрофильных заряженными блоками copolymers.

Abstract

Полиэлектролитные сложные мицеллы (ПХМ), наночастицы ядра, образованные самосборкой заряженных полимеров в водином растворе, обеспечивают мощную платформу для изучения физики полиэлектролитных взаимодействий, а также предлагают перспективное решение насущная проблема доставки терапевтических олигонуклеотидов in vivo. Развитие отношений между прогностическими структурами и имуществом для ПХМ оказалось трудным, отчасти из-за наличия сильных кинетических ловушек во время самосборки наночастиц. В этой статье рассматриваются критерии выбора полимеров для строительства PCM и предусмотрены протоколы, основанные на соляном аннулировании, которые позволяют сборку повторяющихся, низкополидисперсности наночастиц. Мы также обсуждаем характеристику PCM с помощью рассеяния света, мелкоугольного рассеяния рентгеновских лучей и электронной микроскопии.

Introduction

Когда противоположно заряженные полиэлектролиты смешиваются в вковом растворе, энтропия выражается от высвобождения их контратов приводит к демиксу раствора в полимерно-богатую конденсированную фазу и полимерно-обедленный супернатант1,2,3,4,5, явление, известное как полиэлектролитная комплексация. Если нейтральный гидрофильный блок спрягится с одним или обоими полиэлектролитами, наноразмерное разделение фазпроисходит вместо этого(рисунок 1А). В результате самособранные наночастицы ядра по-разному называются полиэлектролитными сложными мицеллями (ПКМ), полиионными комплексными мицеллями, блочными иономерными комплексами или коацервате-ядерными мицеллесами по аналогии с суррогатной мицеллизмом, хотя все компоненты системы являются гидрофильные6,7. Способность PCM инкапсулировать гидрофильные молекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты, а также обширная настройка, предлагаемая архитектурой носителяблока,делает их привлекательными кандидатами для доставки терапевтических молекул in vivo8,9,10,11,12,13.

Доставка терапевтических нуклеиевых кислот к клеточным целям является особенно важной задачей, для которой ПХМ предлагают ряд преимуществ. Терапевтические нуклеиновые кислоты (генетическая ДНК, мРНК и олигонуклеотиды, такие как siRNA) имеют огромный потенциал для улучшения здоровья человека, но должны преодолеть многочисленные биологические и физические барьеры, чтобы понять, что потенциал14,15,16. Голые нуклеиевые кислоты деградируют сывороткой и клеточной нуклеазой, быстро вырываются из кровообращения, и их сильный отрицательный заряд затрудняет им проникновение в клеточные мембраны без посторонней помощи. Текущие подходы для преодоления этих барьеров включают дорогостоящие химические модификации для предотвращения повреждения от нуклеазы и / или инкапсуляции в различные липидные наночастицы, собранные с помощью гидрофобных взаимодействий15,17,18. Хотя эти методы доказали свою эффективность для местных инъекций и таргетинга печени, системное использование представляет собой значительные ограничения токсичности, иммуногенности и ограниченного биораспределения16. В отличие от этого, PCM использовать отрицательный заряд нуклеиевых кислот конденсировать их в фазе разделенных ядра, в то время как нейтральная корона обеспечивает стеринный барьер против деградации, а также платформу для включения лигандов для повышения ориентации или интернализации11,19. In vitro и исследования на животных показали, что ПХМ могут эффективно доставлять различные полезные нагрузки нуклеиновой кислоты20,21,22,23,24, но слабые стороны в нашей способности предсказывать свойства ПХМ, такие как размер, форма и стабильность от свойств составляющих полимеров, препятствуют их более широкому внедрению.

Недавняя работа нашей группы и других в этой области начал решать эту проблему путем разработки структуры собственности, а в некоторых случаях структура собственности-функции отношения для PCMs формируется из нуклеиновой кислоты и различных катионно-нейтральных полимеров7,25,26,27. Две последовательные темы, которые возникли из этих исследований являются важность разработки хорошо контролируемых, повторяемых протоколов для сборки PCM и в пользу использования нескольких методов для характеристики в результате наночастиц. Полиэлектролиты, особенно с высокой плотностью заряда, как нуклеиновые кислоты, взаимодействуют друг с другом очень сильно, и, кажется, легко стать kinetically захваченных при смешивании, в результате чего PCM препаратов, которые очень чувствительны к небольшим изменениям в процедуре и отображать высокую полидисперность и плохой повторяемости от партии к партии. Кроме того, было показано, что ПХМ принимают широкий спектр форм и размеров в зависимости от конфигураций их компонентов на атомном уровне, и запечатлеть это разнообразие с помощью любого индивидуального метода характеристики очень сложно, особенно с учетом того, что некоторые распространенные методы, такие как динамическое рассеяние света (DLS), требуют предположений о форме частиц для их интерпретации.

В этой статье мы обсуждаем проект материала и выбор для ПХМ, с акцентом на олигонуклеотиды и катионно-нейтральные кополимеры разблокирования. Затем мы описываем протокол аннулирования соли, который использует высокие концентрации соли с последующим медленным диализом, чтобы избежать кинетического захвата во время сборки PCM. Полиэлектролиты смешиваются в условиях высокой соли, где проверяются электростатические достопримечательности, затем концентрация соли медленно снижается, чтобы позволить полиэлектролитам осесть в их наиболее энергетически благоприятных конфигурациях, аналогичных медленному процессу охлаждения теплового аннулирования. Используя этот протокол, мы регулярно можем достичь исключительно низкой полидисперсности и высокой повторяемости для олигонуклеотида PCMs7,26. Наконец, мы описываем, как четыре отдельные методы измерения могут быть использованы для характеристики PCMs в очень широком диапазоне длины весов, от внешней морфологии до внутренней структуры: DLS, рассеяние света с несколькими углами (MALS), рассеяние рентгеновского излучения малого угла (SAXS) и электрон-микроскопии передачи (TEM). Мы надеемся, что эти протоколы позволят большему числу исследователей эффективно исследовать возможности этих интересных наночастиц.

Отбор и приготовление полимеров
Свойства ПХМ сильно зависят от физических и химических характеристик составных полимеров, что делает выбор полимера важным шагом в процессе проектирования. Наиболее хорошо охарактеризованными блок-кополимерами для нуклеиновой кислоты ПХМ являются линейные диблоки, такие как поли (лизин)-поли (этиленгликоль) (pLys-PEG), но ПХМ могут образовываться между полиэлектролитами и различными гидрофильных нейтральными полимерами, которые могут быть созданы в высокой пропускной форме28. Выбор заряженной группы сильно влияет на стабильность ионного сопряжения и форму мицелле26,и размер PCM, как было показано, увеличивается с длиной заряженного блока5,7,26 (Рисунок 2), что позволяет свойствам PCM быть настроены на требования желаемого приложения. Для линейных диблоков, мы обнаружили, что заряженный блок должен иметь по крайней мере 10 зарядов и быть сильно заряжены на желаемый рН. Более длинные заряженные блоки могут способствовать образованию PCM с помощью олигонуклеотидов, таких как siRNA, которые трудно сложно усложнить с более короткими блоками21. Мы успешно наблюдали образование PCM с длиной блока до 200, и литература описывает более длинные полимеры. Больше гибкости доступно в выборе нейтральных блоков24, но опыт показал, что очень короткие нейтральные блоки приводят к агрегации, а не образование наночастиц, и что минимальная нейтральная длина увеличивается с заряженной длиной блока. Для pLys-PEG, PEG MW, по крайней мере 3000-5,000 требуется для pLys длины ниже 50, и больше длины требуется, как заряженный блок увеличивается дальше. Увеличение нейтральной длины блока приводит к увеличению размера PCM, особенно толщины оболочки, из-за стерисового скученности нейтральных полимеров.

Данная рукопись представляет протокол для подготовки ПХМ из лиофилизированных высокочистых pLys-PEG и олигонуклеотидов известного количества, но должна быть легко адаптируема к другим системам. Мы успешно протестировали его с несколькими заряженными полипептами, включая полиаргинина и полиглутаминовую кислоту, а также несколько синтетических полиэлектролитов, таких как полиакриловая кислота и поли (винилбензил триметилламмоний). Мы также описываем подготовку ПХМ со стоихиометрическим соотношением полиэлектролитных зарядов, но это легко модифицируется. Нам легче всего работать в зарядных концентрационных единицах (c.c.), которые также естественным образом вмещают полимеры, которые не полностью заряжены. Если ни один из полимеров не хорошо характеризуется, следует позаботиться о точном определении длины полимера/массы и обеспечения того, чтобы избыток соли не присутствовал сверх того, что необходимо для нейтрализации заряда диализом, например. При расчете концентраций следует также учитывать наличие какой-либо нераспределенной воды. Концентрация нуклеиновой кислоты может быть удобно количественно путем абсорбции на уровне 260 нм, а при расчете c.c следует учитывать наличие или отсутствие терминальных фосфатов.

При использовании олигонуклеотидов в качестве полианий, состояние гибридизации и химическая структура помогают определить склонность к самосборке и характеристики в результате PCM5,7,26. Оптимизация этих, в рамках требований к биологической эффективности при использовании ПХМ для доставки, увеличит вероятность формирования желаемых структур. Полезные инструменты для анализа гибридизации включают функции MATLAB для нуклеиновой кислоты, NUPACK29и IDT OligoAnalyzer. Мы рекомендуем проанализировать последовательность кандидатов, чтобы понять силу привязки к 1) в формировании шпильки; 2) еще одна копия той же последовательности (самодимер); и 3) к другим олигонуклеотидам, присутствующим в системе. Температура плавления ДНК и РНК для определенной последовательности также может быть рассчитана с помощью метода30,31. Тепловое аннулирование нуклеиевых кислот (шаг 2.3) денатурирует любую остаточную вторичную структуру в отдельных нуклеотидах и способствует равновесному сворачиванию.

Характеристика и анализ PCM
Широкий спектр методов доступны для характеристики наночастиц, в том числе статического и динамического рассеяния света, небольшого рассеяния углов электронов или нейтронов, а также электронной микроскопии. В этой статье мы предоставляем протоколы для двух методов рассеяния света, небольшого углового рентгеновского рассеяния и двух методов электронной микроскопии.

DLS измеряет автокорреляцию временных колебаний интенсивности рассеяния под одним углом от броуновского движения образца. Установка этих данных может обеспечить гидродинамический радиус и полидисперсность для сферических мицеллов(рисунок 3). Рассеяние света с несколькими углами (MALS) измеряет интенсивность статического рассеяния под разными углами. Эта угловая зависимость описывает форму наночастиц, но ограничена чешуей длины длиннее 50 нм для видимого света, что ограничивает ее эффективность для более мелких наночастиц. Оба метода основаны на несоответствии рефракционного индекса и в первую очередь описывают внешние размеры наночастиц.

Небольшой угол рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) использует рентгеновские лучи в качестве рассеяния зонда, и их более короткая длина волны позволяет измерения в диапазоне 0,1-100 нм. Установка наблюдаемой интенсивности рассеяния по сравнению с углом (обычно выраженная как перенос импульса q) предоставляет информацию о морфологии PCM (т.е. размере и форме), а также внутренней структуре. Если доступна абсолютная калибровка интенсивности, и если интенсивность рассеяния может быть экстраполирована до нуля, массу и агрегацию PCM также можно оценить32,что делает SAXS чрезвычайно универсальным и ценным методом. Небольшой угол рассеяния нейтронов (SANS) чувствителен в пределах аналогичного диапазона весов длины, но доступен только на специализированных объектах и не будет конкретно обсуждаться в этой статье33,34,35.

В последние годы появились инструменты benchtop SAXS, но мы обнаружили, что синхротронные источники лучше подходят для характеристикPC, так как их более высокая интенсивность позволяет собирать данные гораздо быстрее для этих низкоконтрастных образцов. Мы предоставляем краткий протокол для получения данных PCM SAXS на Beamline 12-ID-B в Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, США) с точки зрения пользователя. Этот протокол должен быть применим к большинству синхротронных источников, но консультации с местным персоналом, прежде чем предлагать эксперимент настоятельно рекомендуется. Мы также предоставляем протокол сокращения данных и анализа с использованием Irena36, бесплатный набор макросов, написанных для Igor Pro. Irena включает в себя универсальный набор форм-факторов для моделирования данных SAXS и позволяет строить многокомпонентные модели, которые способны описывать сложный профиль рассеяния PCMs (см. Репрезентативные результаты, Рисунок 4). Ирена также имеет всеобъемлющую документацию и учебники доступны в Интернете. Прежде чем пытаться процедуры ниже, мы рекомендуем ознакомиться с ними, в частности, учебник "Моделирование данных SAXS с двумя основными популяциями рассеяния".

Радиационный ущерб является проблемой для рассеяния рентгеновских лучей, но некоторые меры могут быть использованы, чтобы свести его к минимуму. В частности, мы рекомендуем использовать установку ячейки потока с насосом шприца и образцом PCM, протекающим при получении данных, а не запечатанным капилляром. Это также значительно упрощает фоновое вычитание. Мы также предлагаем принять несколько экспозиций течет образца, а не один больше, с тем чтобы ограничить поток, что любой отдельный объем выборки видит и для сравнения данных воздействия для выявления любого ущерба.

В отличие от методов рассеяния, которые обычно требуют установки для интерпретации, передача электронной микроскопии (TEM) обеспечивает реальное визуальное изображение пространства наночастиц, проходя электронный луч через образец и проецирование изображения на экране сцинтилляции (Рисунок 5). В этой статье представлены протоколы для двух методов TEM. Cryo TEM замораживает образцы мицелле в тонкий слой стекловидного льда, сохраняя структурную конформацию с минимальными посторонними веществами, оптимальную для мицелле 10-100 нм в радиусе. Отрицательное пятно TEM использует соль тяжелых металлов (например, уран) для окружения образца после того, как она была высушена на поверхности сетки. Плотное пятно будет рассеивать больше электронов, чем образец, добавив контраст и производить отрицательное изображение образца. Cryo TEM рекомендуется для высококачественных изображений. Тем не менее, это более дорогостоящим, трудоемким, и не может обеспечить достаточный контраст. Когда это вызывает озабоченность, отрицательные окрашенные образцы должны быть использованы. Примеры каждого из них показаны на рисунке 5.

Каждый из этих методов сообщает о несколько различных аспектах наночастиц, с различными преимуществами и ограничениями. Светрассеяние легко доступны, и часто является самым быстрым подходом, но имеет существенные ограничения в размерах и форме резолюции. SAXS может предоставлять информацию в широком диапазоне весов длины при достаточно высокой пропускной состоянии, но требует специализированного оборудования для получения данных, а также моделирования для их интерпретации. TEM изображения просты в интерпретации, но могут быть ограничены в отличие и по своей сути низкой пропускной всей. Наш опыт показал, что использование нескольких методов для характеристик значительно увеличивает информацию, которую можно получить о свойствах PCM, и упрощает интерпретацию наборов данных, полученных от каждого из них в одиночку. Например, SAXS и TEM в основном исследуют плотное ядро PCM, в то время как свет рассеяния отчетов об общих размерах наночастиц. Таким образом, их объединение позволяет измерять как размер ядра, так и размер короны. Способность TEM приобретать реальные космические изображения может обеспечить наземные данные правды, позволяющие подбирать соответствующие форм-факторы для моделирования данных SAXS, которые в противном случае могли бы быть неоднозначными. В этой статье описаны протоколы для всех четырех методов, и в разделе Обсуждение приведен примерный процесс их использования для характеристики неизвестного образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка материалов

  1. Взвесьте лиофилизированный диблок полимер и добавьте воду почти до объема, необходимого для окончательного раствора запаса 10 мг/мл. Вихрь на максимальной скорости 2 мин.
  2. Sonicate в течение 5 мин. Очень длинные диблоки могут потребовать дополнительного sonication. Акционерное решение должно казаться полностью прозрачным и однородным.
  3. Отрегулируйте pH до 7.4 с помощью NaOH или HCl по мере необходимости. Добавьте воду в окончательный объем. решения pLys-PEG достаточно стабильны, но должны храниться в холодильнике для долгосрочного хранения, а рН необходимо проверить перед использованием. Лиофилизация предпочтительнее замораживания.
  4. Resuspend лиофилизированных олигонуклеотидов (ы) при желаемой концентрации запасов, как правило, 2-5 мМ молекулярной концентрации для длины 50 nt или ниже. Vortex тщательно, чтобы обеспечить полное роспуск.
  5. Рассчитайте концентрации моляров с использованием молекулярного веса или длины, как описано во Введении.
  6. Рассчитать концентрации молярового заряда (c.c.), где

Equation 1

Полиэлектролитный заряд — это количество заряженных мономеров, в то время как заряд нуклеиновой кислоты – это количество оснований минус 1, при условии отсутствия фосфорилирования. Имейте в виду, что двуцепочечная ДНК будет иметь в два раза больше зарядов на молекулу по сравнению с одноцепочечной ДНК.

  1. Создайте разбавленный запас на уровне 20 мМ c.c. для каждого полимера.

2. Нуклеиновая кислота полиэлектролит Мишель Подготовка

  1. В микроцентрифуговой трубке объемом 1,5 мл смешайте следующее до общего объема в 280 л:
    1. 200 л безнужной воды (ультрачистая вода для ПХМ, не содержащая нуклеиновые кислоты).
    2. 40 л 10-х фосфатно-буферизированного соления (PBS, 137 мМ хлорид натрия, 10 мМ фосфат, рН 7,4 при разбавлении до 1x) или другой подходящий буфер37.
    3. 40 л 20 мМ c.c. олигонуклеотид. Для двухцепочечных олигонуклеотидов добавьте 20 qL каждой нити при 20 мМ c.c.
  2. Инкубировать олигонуклеотидный раствор в течение 5 мин при 70 градусах Цельсия. Если расчетная температура плавления для олигонуклеотидов выше, температура должна быть соответственно увеличена. Обратите внимание, что РНК будет ухудшаться при повышенных температурах, так что этот шаг не должен быть больше, если этот или другие чувствительные компоненты присутствуют.
  3. Охладить в течение 15 мин. Добавить 40 qL 20 mM c.c. диблок, затем вихрь сразу на 20 с на максимальной скорости. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре (RT).
  4. Выполните соль anneal.
    1. Добавьте 80 л 5 М хлорида натрия для конечной концентрации 1 M NaCl и окончательного объема 400 Л. Вихрь для 10 с на максимальной скорости.
    2. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, затем загрузить в картриджи диализа. Обратите внимание, что перечисленные молекулярные отсечения веса определяются для шаровых белков и не будут точными для линейных полимеров. Мы находим, что картридж 2k MWCO позволяет избежать потери образца, а также обеспечивает постепенные изменения в ионной прочности.
    3. Приготовьте диализные ванны.
      1. Рассчитайте объем необходимой диализной ванны:
        Equation 2
      2. Смешайте 10x PBS (или другой желаемый буфер), 5 M NaCl, и ультрачистую воду для окончательного решения 1x PBS и 0.5M NaCl, а также два решения 1x PBS.
    4. Загрузите картриджи диализа.
      1. Картриджи этикетки с постоянным маркером. Замочите картриджи в буфере, по крайней мере 2 мин для гидрата мембран.
      2. Снимите крышку, скручивая против часовой стрелки. Загрузите образец с помощью гель загрузки пипетки отзыв. Удалите избыток воздуха, аккуратно сжимая мембраны. Замените крышку.
      3. Положите картриджи в 1x PBS, 0,5 М хлористого диализа натрия ванны. Картриджи должны плавать, с обеих мембран, подвергающихся ванне. Пены поплавки могут быть использованы в случае необходимости.
    5. Диализ
      1. Инкубировать в течение 24 ч помешивая медленно с магнитной панели перемешать.
      2. Переместите картриджи в новую ванну 1x PBS или другой желаемый рабочий буфер. Инкубировать в течение 24 ч, медленно помешивая с магнитным перемешать бар. Повторите этот шаг.
    6. Восстановить образец.
      1. Выньте картриджи из ванны. Снимите крышку и восстановите образец с помощью наконечника пипетки для загрузки геля. Обратите внимание, что восстановленный объем может быть выше, чем первоначальные 400 qL из-за отеков мембраны. Запись восстановленного объема, если небольшое разбавление является проблемой.
      2. Поместите образец в чистую микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. ПХМ, подготовленные таким образом, должны быть стабильными в течение нескольких месяцев при охлаждении при условии, что загрязнения нуклеазой удалось избежать.

3. Динамическое рассеяние света

  1. Для обеспечения безпылиния буферы должны быть тщательно отфильтрованы (фильтруемые в 3 x через шприц 0,22 мкм или вакуумный фильтр) и стеклянная посуда, тщательно очищенная между образцами. Важно также обеспечить, чтобы образец достиг теплового равновесия перед проведением измерения.
  2. Разбавить образец PCM до 0,2 мМ c.c. (10x при использовании протокола, описанного выше) с желаемым рабочим буфером и нагрузкой в подходящий кювет. Мы используем малообъемный кювет, который требует 200 евро л образца после разбавления.
  3. Установите положение детектора DLS до 90 градусов.
  4. Отрегулируйте мощность лазера и/или аттенуатор, чтобы, по возможности, количество отсчетов составляло 100 000-200 000 пунктов в секунду (cpS). Количество ставок, как низко как 10 kcps могут быть использованы, но время измерения, возможно, потребуется расширить, чтобы получить хорошую статистику (шаг 4.1). Более высокие показатели подсчета следует избегать, так как несколько рассеяния смутит измерение.
  5. Получение данных за 1 мин. Коэффициент подсчета должен быть неизменным в течение всего времени приобретения; если нет, то это означает, что какой-либо компонент образца или инструмента еще не уравновесился.
  6. Изучите данные автокорреляции. Долгосрочный базовый участок должен быть очень плоским, а кривая автокорреляции должна быть гладкой, с минимальным рассеянием, как показано на рисунке 3А. Базовый дрейф указывает на отсутствие равновесия, и шум в данных может быть улучшен путем получения большего объема данных.
  7. Функция автоматической корреляции.
    1. Используйте REPES38,39 для выполнения упорядоченных обратных преобразований Laplace, чтобы обеспечить распределение времени релаксации и коэффициент диффузии, D. Этот метод затем вычисляет гидродинамический радиус, Rh, используя уравнение Стокса-Эйнштейна:
      Equation 3
      На рисунке 1B показана представленность Rh, а на рисунке 3B показан результат REPES.
    2. Кроме того, используйте другие методы, в том числе CONTIN40,41 (альтернативный алгоритм регуляризации), или неотрицательные установки наименьших квадратов (NNLS). Последовательными результатами нескольких методов установки является подпись высококачественных данных. Обратите внимание, что кумулятивный анализ (стандарт по многим инструментам) дает нефизические значения для мультимодальных размеров/распределений длины.

4. Рассеяние света с многоугольным углом

ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность рассеяния света против угла может быть измерена на различных инструментах. Мы добились хороших результатов, используя как инструменты на основе гониометра, так и инструменты с несколькими детекторами, работая в пакетном режиме.

  1. Отрегулируйте концентрацию и интенсивность освещения PCM, чтобы обеспечить достаточный сигнал/шум по сравнению с образцом только буфера под любым углом без насыщения детектором. Последние могут быть проверены путем подготовки образцов при различных факторах разбавления и проверки линейности интенсивности против концентрации (при условии минимального взаимодействия между ПХМ).
  2. Запишите скорость рассеяния света от 15 до 135 градусов за 1 минуту на угол. Если образец и инструмент должным образом уравновешиваются, скорость рассеяния будет постоянной в течение времени измерения.
  3. Участок нормализованной скорости рассеяния, ягрех (я), по сравнению с д, где я скорость рассеяния. q является вектором рассеяния (передача фотона импульса), как это определено

Equation 4

где - рефракционный индекс растворителя, угол измерения и длина волны источника света. На рисунке 4 показан сюжет интенсивности рассеяния MALS.

5. Небольшое рассеяние рентгеновского снимка

  1. Приобретение данных
    1. Подготовка pcM образцы, как описано выше на 2 мМ зарядконцентрации для олигонуклеотидов PCMs для достаточно рассеяния выше фона. Для ПХМ, не хватает тяжелых атомов (например, фосфора в нуклеиновых кислотах), может потребоваться более высокая концентрация. Плотность рассеяния может быть оценена с помощью калькуляторов, таких как SASSIE42.
    2. Для минимизации радиационного ущерба путем очистки свободных радикалов, добавить глицерол из концентрированного (например, 50%) стоковое решение так, чтобы раствор micelle содержит 1% (v/v) глицерол. Обратите внимание, что аккуратный глицерол очень вязкий и трудно точно измерить. Разбавление водой или буфером настоятельно рекомендуется.
    3. Подготовьте большой объем рабочего буфера с 1% глицерола для использования в качестве фонового монитора.
    4. Подготовьте лучный специфический аппарат клеток потока и калибровочный детектор. Протокол использует кварцевый капилляр диаметром 3 мм, подключенный к управляемому компьютером шприц-насосу небольшого диаметра и полиэтиленовой трубе минимальной длины. С этой настройкой необходим минимальный объем в размере 140 евро на один образец.
    5. Определить параметры экспозиции образца. Оптимальное воздействие будет варьироваться в зависимости от интенсивности луча, чувствительности детектора и концентрации, силы рассеяния и подверженности повреждения образца, но цель состоит в том, чтобы подвергнуть образец минимальному потоку, необходимому для получения достаточной интенсивности рассеяния над диапазоном q интереса.
    6. Для олигонуклеотида/pLys-PEG PCM, 30x 0,2 с экспозиций на 1 Гц частоты повторения производят хорошее качество данных с небольшим заметным ущербом. Для новых образцов может быть полезна следующая процедура:
      1. Подготовка образцов ПХМ в различных концентрациях (например, 10–10 000 мкм c.c.).
      2. Начиная с промежуточной концентрации, альтернативные PCM и буфер только образцы с различными время экспозиции. Ниже приведены данные о процедуре сбора и сокращения данных. Образец сигнала должен иметь хорошую статистику (небольшая статистическая погрешность, или плавная вариация по д). Если статистические данные являются плохими, время воздействия может быть увеличено.
      3. Образец сигнала также должен быть четко различим от фона над диапазоном интереса q. Вычислите и потяните (сигнал-фон)/фоновое соотношение против q для определения соотношения сигнала/фона. Если соотношение сигнала/фона является низким, концентрация выборки должна быть увеличена.
      4. Убедитесь, что интенсивность рассеяния (нормализованная до концентрации) не зависит от концентрации выборки, приобретая данные в более высоких и низких концентрациях, при необходимости масштабируя время воздействия. Взаимодействия между частицами (наиболее вероятная причина концентрационной зависимости) будут наиболее выражены в низком диапазоне q.
    7. Приобретение данных для образцов ПХМ и фона (т.е. буфера с глицеролом).
      1. Триггер шприц насос для перемещения образца через капилляр. Допустимо либо двунаправленное, либо одноразовое движение, однако следует позаботиться о том, чтобы изолировать каждый образец (например, путем вставки воздушного пузыря между образцами). Образцы могут быть восстановлены и могут быть использованы повторно, если не обнаружено повреждений радиации.
      2. Как только поток начался, запустите рентгеновское облучение и программу сбора данных, описанную выше. Следует позаботиться о том, чтобы воздействие луча заканчивалось до того, как поток жидкости будет происходить.
    8. После каждого образца, выполнять azimuthal усреднения и сюжет 1D профилей (т.е. интенсивность по сравнению с q) для каждого воздействия вместе. Они должны быть идентичны в рамках статистической погрешности. Изменение сигнала с течением времени может указывать на радиационное повреждение.
      1. Изолированные аномальные профили могут указывать на наличие микропузырей. Если пузырьки наблюдаются часто, снижение скорости потока может помочь.
    9. Среднее количество профилей рассеяния 1D.
    10. Приобретать данные для образцов только буфера часто (один раз в каждые 4-5 PCM образцов) и сравнить их с течением времени. Увеличение сигнала из образцов, только буферных, указывает на то, что капилляр может быть загрязнен поврежденным радиацией образцом.
      1. Когда загрязнение заметили, мыть капилляр с отбеливателем, и рассмотреть вопрос о сокращении времени воздействия, если это возможно.
  2. Сокращение и анализ данных с использованием Ирены
    1. Импортная мицелль и фоновые наборы данных ASCII(данные sAS/Data импорта и экспорта/импорта ASCII SAS).
    2. Вычесть рассеяние фона из данных выборки. Как правило, самые высокие значения q (например, q q sgt; 0.5) показывают бессвязное рассеяние от растворителя, доминирующего над сигналом. Масштабирование фоновых данных в соответствии с выборочными данными в этом диапазоне q удаляет любые изменения из-за изменения интенсивности луча и концентрации выборки.
      1. Участок образца и фон вместе по шкале журнала. Проверить плоскую интенсивность на высоком q (SAS / Данные Манипуляции / Данные Манипуляция I). Вычислите соотношения выборки/фона(Data1/Data 2),участок по линейно-логовой шкале и проверьте асимптот высокогоуровня q.
      2. Вычислите среднее соотношение (образец/фон) по этому диапазону q (используйте пользовательский макрос или копию/вставить в электронную таблицу из браузера данных).
      3. Используя макрос манипулирования данными, масштабируйте фон (например, измените данные 2)с помощью коэффициента, выработавого выше, и построите соотношение фонового вычитаемого сигнала к фону по сравнению с q («Data1-Data2»/Data2),проверяя, что он теперь асимптоты к нулю при высоком q. Запишите это соотношение; она должна быть от 1,0 до 1,0 для каждого образца.
      4. Участок фонового вычитаемого сигнала(Data1-Data2) против q и сохранить данные с новым именем. Не перезаписывайте исходные данные.
      5. Если данные с высокимуровнем q отсутствуют, используйте коэффициент масштабирования 1 для фонового вычитания, но имейте в виду, что неточности могут быть введены в диапазонах q, где соотношение сигнала/фона невелико.
    3. Откройте макрос моделирования , (SAS/ Моделирование), затем загрузить и построить фоновые вычитанные данные(данные cntrls/ Добавить данные). Не масштабируйте в этом макросе.
    4. Во-первых, найти примерную модель для внешней поверхности PCM (мицелразмер/форма):
      1. В данных cntrls, выберите от низкого до умеренного диапазона q (например, 0,003"-1 "lt; q lt; 0,1 "-1). Если колебания видны, включите их.
      2. Выберите форм-фактор, подходящий для данных. Склон на низком q свидетельствует о форме наночастиц, которые также могут быть проверены через TEM и / или MALS. Используйте сфероид Шульц-Зимм(q0), цилиндр(q-1), или гибкий цилиндр(q-2) модели. Irena предоставляет инструменты для установки законов власти (SAS / Поддержка Инструменты для участков и таблиц).
      3. В модели cntrls, выберите первый рассеяния населения (1P) и убедитесь, что это единственный в использовании (Выберите использование? флажок).
      4. Выберите размер dist. для модели и выберите желаемый тип распределения и форм-фактор. Установите начальные параметры поиска, введя значения в поля шкалы, средний размери ширину и нажмите «Вычислить модель», чтобы нарисовать полученный форм-фактор.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Гибкий цилиндр форм-фактор может быть добавлен в качестве фактора формы пользователя и загружен из https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. Параметры 1 и 2 соответствуют длине цилиндра и длине Кун соответственно.
      5. После того, как разумные параметры были найдены, нажмите Fit Model для выполнения нелинейных наименьших квадратов, пригодных для данных. Модель распределения размера дает средний радиус и ширину.
        Для расчета полигазиперсности (PDI) использования
        Equation 5
        Как и в случае с любой нелинейной процедурой установки, может потребоваться корректировка диапазона данных(q region) и начальных параметров для получения стабильной, физически разумной подгонки.
      6. После того, как разумный припадок получен, сохранить его(Хранить в ноутбуке/магазин в Folder).
    5. Затем смоделируем рассеяние отдельных полимеров в ядре PCM. Это может быть захвачено моделью закона о власти (например, q-2 для идеальных цепей, q-5/3 для опухших цепей и т.д.). Ирена реализует это через модель Beaucage43:
      Equation 6
      где P является законом власти и G и B являются префакторами.
      1. Отрегулируйте элементы управления данными, чтобы охватить весь диапазон q и перекроить модель(Вычислить модель). Как правило, избыточное рассеяние наблюдается в диапазоне от умеренного до высокого кв (например, q qgt;0,1 "-1").
      2. Используйте элементы управления данными, чтобы выбрать диапазон q, в котором наблюдается избыточное рассеяние (10x модель форм-фактора).
      3. Добавить второй рассеяния населения (2P) и убедитесь, что это единственный в использовании (deselect Использование? для 1P).
      4. Выберите единый уровень для модели. B и P являются соответствующими параметрами. Используйте инструменты поддержки построения или Fit P/ B между макросом csrs, чтобы получить первоначальное предположение по этим параметрам, и отрегулировать факторы Guinier G и Rg, чтобы убедиться, что модель не предсказывает чрезмерное рассеяние при низком д.
      5. Что касается форм-фактора, выполните нелинейную посадку и запишите параметры и модель.
    6. Далее, Если присутствует пик дифракции, как на рисунке 4,добавьте третью модель для пика дифракции в диапазоне q интереса данном случае q q 0.22-1).
    7. После того, как приблизительные значения подходят получены для отдельных рассеяния популяций, включите все три вместе (выбрать Использование? для каждого) и оптимизировать комбинированные подходят.
    8. Убедитесь, что каждое значение остается физически обоснованным. Результатом этой процедуры должна стать композитная модель, описывающая данные SAXS на большой диапазон размеров, как показано на рисунке 4. Сохраните пригонку с помощью кнопки Store in Folder для хранения в igor.

6. Электронная микроскопия передачи (TEM)

  1. Крио TEM
    1. Выберите сетку. Мы рекомендуем дырявую углеродную пленку поддержки на стандартной сетке TEM или кружева углерода в качестве альтернативы. В любом случае, отверстия между углеродом обеспечит область изображения чистого стекловидного льда и образца и никакой пленки.
    2. Поместите сетку углерода сторону вверх в свечение разгрузки аппарата на чистой стеклянной горке. Упаковка слайда в лабораторную пленку может помочь при обработке сетки. Избегайте прикосновения к центру сетки с помощью пинцета и всегда щепотку вблизи края сетки.
    3. Выставь сетку на 30 с.
    4. Подготовьте робота-витрификации для осаждения образцов.
      1. Установите на 100% влажность и RT и добавить промотирование бумаги. Приготовьте жидкие этановые и жидкие азотные ванны у основания робота. Смотрите онлайн-уроки и видео для дополнительной помощи в подготовке и использовании робота витрификации.
    5. Разбавить образец 5x.
    6. Используя отрицательное действие пинцета, предоставленного роботом-витрификацией, подберите сетку, затем прикрепите пинцет к роботу и переместите пинцет в камеру.
    7. В то время как в роботе, добавить 4 зл и л образца на углеродную сторону сетки с помощью пипетки через отверстие в стороне машины.
    8. Инкубировать в течение 4 мин.
    9. Используя робота, пятно 3-5 с фильтровальной бумагой.
    10. Робот-витрификация погрузит сетку в жидкий этан.
    11. Удалите пинцет и переместите сетку в жидкий азот и в контейнер для хранения, который также должен находиться под жидким азотом. Этот процесс фиксирует образец в тонкий слой стекловидного льда. Свести к минимуму время, потратив на этот шаг в сетке жидкий этан или жидкий азот.
    12. Охладите держатель крио образеца с помощью жидкого азота. Держите Dewar и резервуар полный.
    13. Когда готовы к изображению, загрузите сетку на держатель крио образец. Держите образец под жидким азотом или кратко в очень холодном пара азота чуть выше жидкой поверхности.
    14. Изображение сетки на 120 кВ между 75kx и 150kx в тонком и толстом льду, потому что различных размеров micelles может предпочесть определенную толщину льда.
      1. Ограничьте воздействие луча, чтобы избежать таяния льда и повреждения образца. Не фокусируйтесь непосредственно там, где планируется изображение; сосредоточиться поблизости. Только подвергать области, представляющие интерес при захвате изображения.
      2. При просмотре изображений необходимо дифференцировать жидкие капли этана (см. рисунок 5).
  2. Обычные TEM с использованием отрицательного окрашивания
    1. Приготовьте пятно.
      1. Отварить 10 мл ультрачистой воды. Взвесьте 0,1 г уранила formate (UFo) в коническую трубку 15 мл.
      2. Добавьте 5 мл горячей воды в порошок UFo для 2% раствора. Закрыть плотно и завернуть в алюминиевую фольгу, чтобы заблокировать свет. 1% uranyl ацетат пятно также широко используется.
      3. Вихрь или встряхнуть энергично в течение 5 мин. Закрепление трубки к вихрю поможет. Фильтр через фильтр шприца 0,2 мкм в чистую коническую трубку.
      4. Дайте остыть 10 мин rt. Добавить 25 зл 5M NaOH и вихрь сразу в течение 2 мин.
        1. Кроме того, заморозить 200 qL aliquots 2% НЛО. Когда готовы к использованию, оттаять aliquot, добавить 1 зл и 5 M NaOH, и вихрь в течение 2 мин.
      5. Держите пятно, завернутое в фольгу или вдали от света.
    2. Разбавить образец 10x в 1x PBS (или желаемый буфер).
    3. Выберите сетку. Мы рекомендуем пленку поддержки углерода на медных сетях. Темнее, блестящие стороны сетки является углеродное покрытие стороны, где образец будет сдан на хранение и окрашенных.
    4. Поместите сетку углерода сторону вверх в свечение разгрузки аппарата на чистой стеклянной горке. Смотрите шаг 6.1.2.
    5. Выставь сетку на 30 с.
    6. Возьмите сетку с углеродной стороны по-прежнему лицом вверх и удерживайте с отрицательным действием пинцета по краю сетки, чтобы предотвратить разрыв области изображения в центре. Установите пинцет с сеткой по-прежнему провел углерода вверх.
    7. Нанесите капельку 4 л образца на верхнюю (углеродную сторону) сетки с помощью пипетки.
    8. Инкубировать 4 мин.
    9. С 1 мин слева, пипетка 10 л и 20 л капли раствора НЛО на кусок чистой лабораторной пленки.
    10. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы сотворить образец с края сетки (перпендикулярный контакт), чтобы избежать контакта с поверхностью изображения.
    11. Используя пинцет (по-прежнему удерживая сетку), немедленно поместите образец стороны сетки вниз на 10 л капли УФО, а затем сразу же фитиль от жидкости (мыть шаг). Важно не дать сетке высохнуть, поэтому не останавливайтесь между шагами.
    12. Аналогичным образом, применить 20 л капли УФО в сетку. Держите сетку на UFo в течение 40 с. Wick жидкости и дайте сетке высохнуть.
    13. Изображение сухой сетки на 120 кВ между 20,000x и 100,000x.
    14. Будьте уверены, чтобы должным образом утилизировать все UFo загрязненных материалов с помощью службы безопасности учреждения для радиоактивных отходов.
    15. При необходимости для уменьшения фонового шума к изображениям TEM в ImageJ можно наносить повышение яркости/контрастности и средний фильтр. После обработки должно быть сделано равномерно, только для изображений, которые не используются для количественных измерений, таких как интенсивность, и всегда должны быть сообщены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того, чтобы проиллюстрировать методы характеристик, описанные выше, мы показываем типичные результаты для ПХМ, собранных из олигонуклеотидов и блок copolymers различной длины и химии (Рисунок 1). Рисунок 2 служит примером того, как размер ядра PCM (как определено из SAXS и TEM, Рисунок 4 и Рисунок 5)изменяется с заряженной длиной блока. На рисунке 3 показаны данные DLS и соответствующие результаты для сферических ПХМ, образованных из относительно длинных блочных кополимеров и коротких одноцепочечных олигонуклеотидов. На рисунке 4 показано, как сложные спектры интенсивности SAXS могут быть точно пригодны, сочетая модели для нескольких присутствующих пространственных корреляций (внешняя поверхность, внутриядерное рассеяние, межсежная сепсака), и как MALS может быть использован для расширения измерений рассеяния до более длинных весов длины. Наконец, на рисунке 5 показаны репрезентативные данные электронной микроскопии для ПХМ различной морфологии.

Figure 1
Рисунок 1: Сборка и характеристика ПХМ нуклеиновой кислоты. (A) Анионические полимеры, такие как олигонуклеотиды, образуют фазовые отдельные комплексы с катионными областями диблокированных кополимеров. Наличие гидрофильных нейтральных блоков (серый) привело к образованию стабильных наночастиц ПЦМ. (B) ПХМ были наночастицы основной оболочки с несколькими параметрами для характеристики. Общий размер (гидродинамический радиус, Rh) можно определить с помощью DLS, радиус ядра (Rc) может быть найден с помощью SAXS и TEM, размер короны может быть рассчитан как Rh-Rc, и морфология может быть определена в нескольких масштабах длины путем объединения SAXS, MALS и TEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Зависимость размера Мишеля. Размер ядра Micelle в первую очередь определялся длиной заряженного блока блока кополимера и в значительной степени не зависит от длины гомополимера7,26. Это позволяет контролировать размер PCM путем выбора блока полимера. Данные, приведенные здесь для pLys-PEG с 88 nt/bp ДНК и ранее сообщалось26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Динамическое рассеяние света. (A) Функция автокорреляции (произвольные единицы) для 10 nt одноцепочечной ДНК и pLys (100)-PEG (10k) PCM. (B) Распределение гидродинамического радиуса (гистограмма) от REPES подходит. Функция автокорреляции разлагалась до плоского значения с одной временной шкалой, что привело к пику одного размера в распределении размера REPES. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Представитель SAXS и MALS данных и подходит для цилиндрической мицелле. Данные SAXS (серые круги) отображаются для ПХМ, собранных из pLys (50)-PEG (5k) и 88 bp двухцепочечной ДНК. При низком q (Злт; 10-2 -1), интенсивность показала примерно q-2 зависимость от передачи импульса, подразумевая гибкую форму цилиндра (червь-как micelle). Данные MALS (открытые черные круги) показывают ту же зависимость, указывая, что мицеллы были по крайней мере несколько микрометров в длину (подтверждено TEM изображений, Рисунок 5C,D). Сфероидальные мицеллы показали бы плоскую зависимость (q0) интенсивности на q в этом диапазоне. Цветные линии иллюстрируют многокомпонентную процедуру установки для данных PCM SAXS, описанных в разделе 5. Рассеяние на низком q (большие весы расстояния) было преобладано внешней поверхностью PCM, и приспосабливает наилучшим образом гибкой моделью цилиндра (красный цвет). При более высоких значениях q (меньшая длина шкалы), рассеяние доминировали отдельные полимеры внутри ядра PCM, подходят здесь закон власти (зеленый) с низким q отсечения. Мы также наблюдали параллельную упаковку двухцепочечных сипов ДНК в ядре PCM, в результате чего квази-Брэгг дифракционный пик (синий). Черная пунктирная линия показывает, что объединение этих моделей точно описывало данные SAXS, а добавление данных рассеяния света (открытых кругов) расширило диапазон размеров почти на четыре порядка величины. Установка результатов дала популяции PCM со средним радиусом 11,0 нм и PDI 0,03, власть закон на высоком q 1,81 и дифракции пик представляет межспировочную интервал 2,71 нм. Данные SAXS ранее были зарегистрированы26 и являются общедоступными44. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: TEM изображения нуклеиновой кислоты ПХМ. (A-B) Cryo TEM 22 nt одноцепочечной ДНК и pLys (50)-PEG (5k) PCMs, показывающие преимущественно сферическую морфологию. Синие стрелки указывают на жидкие капельки этана, не следует путать с ПХМ (текстурированные сфероидальные объекты). (A) немного недостаточно ориентирована, добавляя небольшой контраст при сохранении разрешения. (B) существенно недоориентирован, добавляя больше контраста, но жертвуя ясностью. К обоим изображениям были применены коррективы яркости и контрастности и двухпиксельный средний фильтр. (C-D) Отрицательные окрашенные TEM 88 bp двухцепочечной ДНК и pLys (50)-PEG (5k) PCMs, которые являются длинными гибкими цилиндрами. В обоих случаях радиусы ядра tEM соответствовали значениям, полученным на основе соответствующих данных SAXS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как уже упоминалось выше, протоколы, представленные здесь написаны с акцентом на олигонуклеотидоиды, как компонент полианиона и pLys-PEG как катионно-нейтральный блок кополимера, но мы протестировали их с различными полимерами, такими как полиэтилевые (акриловая кислота), полиглутамат, и PEG-поли (винилбензил тримет-триметхамимоний), и считаем, что они будут в целом применимы для наиболее применимых. Одним из параметров, которые могут потребоваться для оптимизации является концентрация соли, используемая для аннулирования, потому что она должна быть достаточно высокой, чтобы ПХМ не образуются в начале anneal. Это может быть проверено экспериментально DLS, или по сравнению с наблюдением фазового разделения с полиэлектролитами в одиночку (без нейтрального блока). Тепловое аннулирование может быть использовано, если соль annealing является нежелательным, хотя в результате полидисперсности больше7. Концентрации, используемые для характеристики, также могут нуждаться в оптимизации, поскольку более крупные наночастицы рассеивают больше света, чем мелкие, а нуклеиновые кислоты более эффективны при рассеянии рентгеновских лучей, чем многие другие полимеры из-за присутствия в позвоночнике атомов фосфора, насыщенных электроном. Это также может быть необходимо более тесно контролировать рН буфера, если либо полиэлектролит имеет pKa близко к рабочему состоянию.

В этой статье мы представляем протоколы для двух методов рассеяния света (т.е. многоуглового/статического рассеяния света и динамического рассеяния света), а также небольшого рассеяния рентгеновского излучения, а также крио- и обычных отрицательных эффектных электронных микроскопов, с репрезентативными данными для каждого. Не все методы необходимы для всех сценариев, и другие доступны, а также, поднимая вопрос о том, какие должны быть использованы, когда. Обширная литература обзора существует на эту тему45,46, но мы предлагаем следующее при характеристике нового PCM или аналогичных наночастиц. Начните с проверки на агрегацию, как путем визуального осмотра на мутность, так и с помощью оптической микроскопии. Если агрегации не наблюдается, следующим шагом является определение наличия наночастиц. DLS это быстрый способ определить это, потому что ПХМ рассеивать свет энергично, и слабые или несуществующие рассеяния света является сильным показателем плохого образования наночастиц. Хотя DLS может подтвердить наличие наночастиц, трудно определить их размер и форму без ссылки на другие данные, так как большинство методов анализа полагаются на отношение Стокса-Эйнштейна, которое предполагает сферические частицы. MALS может подтвердить сферические формы (плоская нормализованная интенсивность против угла), но не может быть в состоянии определить форму несферических частиц, если распределение размера является узким и случается упасть в правильном диапазоне для разрешения. В результате, мы рекомендуем выполнять TEM, SAXS, или как на любой выборке PCM, чтобы полностью охарактеризовать его свойства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Фила Гриффина и Теру Лавуа из Фонда характеристик мягкой материи и Продвинутого фонда электронной микроскопии, соответственно, в Чикагском университете. Мы также благодарим Сяобин Цзо и Соэнке Сейферт из Advanced Photon Source в Аргоннской национальной лаборатории и NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) за поддержку. Мы благодарим Джеффа Тинга и Майкла Луэкхайде за их вклад в эту работу.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Tags

Химия выпуск 157 доставка нуклеиновой кислоты полиэлектролитный комплекс мицелль наночастицы фазовое разделение олигонуклеотиды
Сборка и характеристика полиэлектролитного комплекса Мицеллес
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marras, A. E., Vieregg, J. R.,More

Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter