Summary
We bieden protocollen en representatieve gegevens voor het ontwerpen, assembleren en karakteriseren van polyelektrolyt complexe micelles, core-shell nanodeeltjes gevormd door polyelektrolyten en hydrofielgeladen-niet-geladen blokcopolymeren.
Abstract
Polyelektrolyt complexe micelles (PCMs), core-shell nanodeeltjes gevormd door zelfassemblage van geladen polymeren in waterige oplossing, bieden een krachtig platform voor het verkennen van de fysica van polyelektrolyt interacties en bieden ook een veelbelovende oplossing het dringende probleem van het leveren van therapeutische oligonucleotiden in vivo. Het ontwikkelen van voorspellende structuur-eigenschap relaties voor PCMs is moeilijk gebleken, deels te wijten aan de aanwezigheid van sterke kinetische vallen tijdens nanodeeltjes zelfassemblage. Dit artikel bespreekt criteria voor het kiezen van polymeren voor PCM-constructie en biedt protocollen op basis van zoutannealing die het mogelijk maken om herhaalbare, laag-polydispersiaire nanodeeltjes samen te stellen. We bespreken ook PCM-karakterisering met behulp van lichtverstrooiing, kleine röntgenverstrooiing en elektronenmicroscopie.
Introduction
Wanneer omgekeerd geladen polyelektrolyten worden gemengd in waterige oplossing, entropie winst van het vrijkomen van hun tegenwerking veroorzaakt devermenging van de oplossing in een polymeer-rijke gecondenseerde fase en een polymeer-uitgeputsupernatant1,2,3,4,5, een fenomeen bekend als polyelektrolyt complexatie. Als een neutraal hydrofiel blok wordt geconjugeerd tot een of beide van de polyelektrolyten, nanoschaal fasescheiding vindt plaats plaats plaats (figuur 1A). De resulterende zelfgeassembleerde kern-shell nanodeeltjes worden verschillende woorden genoemd als polyelektrolyt complexe micelles (PCMs), polyion complex micelles, blok ionomer complexen, of coacervate-core micelles naar analogie van oppervlakteactieve micellization, hoewel alle componenten van het systeem hydrofiel6,7zijn. Het vermogen van een PCM om hydrofiele moleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren in te kapselen, evenals de uitgebreide tunability die wordt aangeboden door de architectuur van de blokcopolymeerdrager maakt hen aantrekkelijke kandidaten voor het leveren van therapeutische moleculen in vivo8,9,10,11,12,13.
Het leveren van therapeutische nucleïnezuren aan cellulaire doelen is een bijzonder belangrijke uitdaging, waarvoor PCMs verschillende voordelen bieden. Therapeutische nucleïnezuren (genetisch DNA, mRNA en oligonucleotiden zoals siRNA) hebben een enorm potentieel voor het verbeteren van de menselijke gezondheid, maar moeten tal van biologische en fysieke barrières overwinnen om te beseffen dat potentieel14,15,16. Kale nucleïnezuren worden afgebroken door serum en cellulaire nucleases, worden snel uit de bloedsomloop gewist en hun sterke negatieve lading maakt het moeilijk voor hen om celmembranen zonder hulp binnen te dringen. De huidige benaderingen voor het overwinnen van deze barrières omvatten kostbare chemische wijzigingen om schade door nucleases en/of inkapseling in verschillende lipide nanodeeltjes te voorkomen die via hydrofobe interacties worden geassembleerd15,17,18. Hoewel deze methoden effectief zijn gebleken voor lokale injecties en levertargeting, biedt systemisch gebruik aanzienlijke beperkingen van toxiciteit, immunogeniciteit en beperkte biodistributie16. PPC's gebruiken daarentegen de negatieve lading nucleïnezuren om ze te condenseren binnen de geleidelijk gescheiden kern, terwijl de neutrale corona een steric barrière tegen degradatie biedt, evenals een platform voor het opnemen van liganden om targeting of internalisatie te verbeteren11,19. In vitro en dierlijke studies hebben aangetoond dat PSO's effectief kunnen leveren verschillende nucleïnezuur payloads20,21,22,23,24, maar zwakke punten in ons vermogen om PCM eigenschappen zoals grootte, vorm en stabiliteit te voorspellen van de eigenschappen van de samenstellende polymeren hebben belemmerd hun bredere adoptie.
Recent werk van onze groep en anderen in het veld is begonnen met het aanpakken van dit probleem door het ontwikkelen van structuur-eigendom, en in sommige gevallen structuur-eigendom-functie relaties voor PPC's gevormd uit nucleïnezuren en diverse kationische-neutrale polymeren7,25,26,27. Twee consistente thema's die uit deze studies naar voren zijn gekomen, zijn het belang van het ontwikkelen van goed gecontroleerde, herhaalbare protocollen voor PCM-assemblage en het voordeel van het gebruik van meerdere technieken om de resulterende nanodeeltjes te karakteriseren. Polyelektrolyten, met name die met een hoge ladingsdichtheid zoals nucleïnezuren, interageren zeer sterk met elkaar en lijken gemakkelijk kinetisch gevangen te raken bij het mengen, wat resulteert in PCM-preparaten die zeer gevoelig zijn voor kleine variaties in de procedure en hoge polydispersie en slechte herhaalbaarheid van batch tot batch weergeven. Pcms is ook aangetoond dat een breed scala van vormen en maten vast te stellen, afhankelijk van de atomaire-niveau configuraties van hun componenten, en het vastleggen van deze diversiteit met een individuele karakterisering techniek is zeer moeilijk, vooral omdat sommige gemeenschappelijke technieken zoals dynamische lichtverstrooiing (DLS) vereisen veronderstellingen over deeltjesvorm voor hun interpretatie.
In dit artikel bespreken we materiaalontwerp en selectie voor PCM's, met een focus op oligonucleotiden en kationisch-neutrale diblock copolymeren. Vervolgens beschrijven we een zoutannealingprotocol dat hoge zoutconcentraties gebruikt, gevolgd door langzame dialyse om kinetische begtoepassing tijdens PCM-assemblage te voorkomen. De polyelektrolyten worden gemengd in hoge zoutomstandigheden waar elektrostatische attracties worden gescreend, dan wordt de zoutconcentratie langzaam verlaagd om de polyelektrolyten zich te laten vestigen in hun meest energetisch gunstige configuraties, analoog aan het langzame koelproces van thermische annealing. Met behulp van dit protocol zijn we regelmatig in staat om uitzonderlijk lage polydispersie en hoge herhaalbaarheid voor oligonucleotide PCMs7,26te bereiken. Tot slot beschrijven we hoe vier afzonderlijke meettechnieken kunnen worden gebruikt om PCM's te karakteriseren over een zeer breed scala aan lengteschalen, van externe morfologie tot interne structuur: DLS, multi-angle lichtverstrooiing (MALS), kleine hoek X-ray verstrooiing (SAXS) en transmissieelektronenmicroscopie (TEM). We hopen dat deze protocollen meer onderzoekers in staat zullen stellen om effectief de mogelijkheden van deze interessante nanodeeltjes te verkennen.
Polymeerselectie en -voorbereiding
PCM-eigenschappen worden sterk beïnvloed door de fysische en chemische kenmerken van de samenstellende polymeren, waardoor polymeerselectie een cruciale stap is in het ontwerpproces. De meest goed gekarakteriseerde blokcopolymeren voor nucleïnezuur PM's zijn lineaire diblokken zoals poly(lysine)-poly(ethyleenglycol) (pLys-PEG), maar PcM's kunnen worden gevormd tussen polyelektrolyten en een verscheidenheid aan hydrofiele neutrale polymeren, die op een hoge doorvoerwijze kunnen worden gegenereerd28. De keuze van de geladen groep heeft een sterke invloed op de stabiliteit van ionenkoppeling en vorm van micelles26, en de PCM-grootte is aangetoond te verhogen met de lengte van het in rekening gebrachte blok5,7,26 (figuur 2), waardoor PCM-eigenschappen kunnen worden afgestemd op de eisen van een gewenste toepassing. Voor lineaire diblocks hebben we vastgesteld dat het opgeladen blok ten minste 10 ladingen moet hebben en sterk moet worden opgeladen bij de gewenste pH. Langere geladen blokken kunnen de PCM-vorming bevorderen met oligonucleotiden zoals siRNA, die moeilijk te complex zijn met kortere blokken21. We hebben met succes waargenomen PCM vorming met blok lengtes tot 200, en de literatuur beschrijft langere polymeren. Meer flexibiliteit is beschikbaar in de keuze van neutrale blokken24,maar de ervaring heeft geleerd dat zeer korte neutrale blokken leiden tot aggregatie in plaats van nanodeeltjesvorming, en dat de minimale neutrale lengte toeneemt met geladen bloklengte. Voor pLys-PEG is een PEG MW van ten minste 3.000-5.000 vereist voor pLys-lengtes onder ~ 50, en langere lengtes zijn vereist omdat het opgeladen blok verder wordt verhoogd. Verhoogde neutrale bloklengte resulteert in een grotere PCM-grootte, met name shell dikte, als gevolg van steric verdringing van de neutrale polymeren.
Dit manuscript presenteert een protocol voor de voorbereiding van PcMs van lyophilized hoge zuiverheid pLys-PEG en oligonucleotiden van bekende hoeveelheid, maar moet gemakkelijk aanpasbaar zijn aan andere systemen ook. We hebben het met succes getest met verschillende geladen polypeptiden, waaronder polyarginine en polyglutaminezuur, evenals verschillende synthetische polyelektrolyten, zoals polyacrylzuur en poly(vinylbenzyl trimethylammonium). We beschrijven ook het voorbereiden van PCM's met een stoichiometrische verhouding van polyelektrolytladingen, maar dit is eenvoudig te wijzigen. Wij vinden het het gemakkelijkst om te werken in charge concentration units (c.c.), die ook natuurlijk geschikt is voor polymeren die niet volledig zijn opgeladen. Als een van beide polymeren niet goed wordt gekarakteriseerd, moet ervoor worden gezorgd dat de polymeerlengtes/massa's nauwkeurig worden bepaald en ervoor moet worden gezorgd dat overtollig zout niet aanwezig is dan bijvoorbeeld die nodig is voor ladingsneutralisatie door dialyse. Bij de berekening van de concentraties moet ook rekening worden gehouden met de aanwezigheid van vastgehouden water. De nucleïnezuurconcentratie kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door absorptie bij 260 nm, en bij de berekening van de c.c. moet rekening worden gehouden met de aanwezigheid of afwezigheid van eindfosfaten.
Bij het gebruik van oligonucleotiden als polyanionen helpen de hybridisatietoestand en de chemische structuur de neiging tot zelfassemblage en de kenmerken van het resulterende PCM5,7,26. Het optimaliseren van deze, binnen de eisen voor biologische werkzaamheid bij het gebruik van PCMs voor de levering, zal de kans op het vormen van de gewenste structuren verhogen. Handige tools voor het analyseren van hybridisatie zijn MATLAB-functies voor nuclezuren, NUPACK29en IDT OligoAnalyzer. We raden aan om een kandidaatsequentie te analyseren om de sterkte van binding tot 1) zelf te begrijpen in een haarspeldformatie; 2) een andere kopie van dezelfde sequentie (zelfdimmer); en 3) naar andere oligonucleotiden die in het systeem aanwezig zijn. DNA- en RNA-smelttemperaturen voor een specifieke sequentie kunnen ook worden berekend met behulp van de dichtstbijzijnde buurmethode30,31. Thermische annealing van nucleïnezuren (stap 2.3) denatureert elke resterende secundaire structuur in de individuele nucleotiden en bevordert evenwichtvouwen.
PCM-karakterisering en -analyse
Een breed scala aan technieken zijn beschikbaar voor het karakteriseren van nanodeeltjes, waaronder statische en dynamische lichtverstrooiing, kleine hoekverstrooiing van elektronen of neutronen, en elektronenmicroscopie. In dit artikel bieden we protocollen voor twee lichtverstrooiingstechnieken, kleine hoek-röntgenverstrooiing en twee elektronenmicroscopietechnieken.
DLS meet de autocorrelatie van temporele schommelingen in verstrooiingsintensiteit onder één hoek van brownse beweging van het monster. Het aanbrengen van deze gegevens kan hydrodynamische straal en polydispersie voor sferische micelles(figuur 3)bieden. Meervoudige hoek lichtverstrooiing (MALS) meet de statische verstrooiingintensiteit onder vele hoeken. Deze hoekige afhankelijkheid beschrijft de vorm van het nanodeeltje, maar is beperkt tot lengteschalen langer dan ~ 50 nm voor zichtbaar licht, wat de effectiviteit ervan voor kleinere nanodeeltjes beperkt. Beide technieken zijn gebaseerd op refractieve index mismatch en beschrijven vooral de buitenafmetingen van het nanodeeltje.
Kleine hoek X-ray verstrooiing (SAXS) maakt gebruik van röntgenstralen als de verstrooiing sonde, en hun kortere golflengte maakt metingen over een bereik van ~ 0,1-100 nm. Het passen van de waargenomen verstrooiingsintensiteit versus hoek (conventioneel uitgedrukt als momentum transfer q)geeft informatie over PCM morfologie (d.w.z. grootte en vorm) en ook interne structuur. Als er een absolute intensiteitskalibratie beschikbaar is en als de verstrooiingsintensiteit naar nulhoek kan worden geëxtrapoleerd, kunnen pcmmassa en aggregatienummer ook worden geschat op32,waardoor SAXS een uiterst veelzijdige en waardevolle methode is. Kleine hoek neutronenverstrooiing (SANS) is gevoelig over een vergelijkbaar bereik van lengteschalen, maar is alleen beschikbaar in gespecialiseerde faciliteiten en zal niet expliciet worden besproken in dit artikel33,34,35.
De afgelopen jaren hebben gezien de komst van benchtop SAXS instrumenten, maar we vinden dat synchrotron bronnen zijn beter geschikt voor PCM karakterisering, omdat hun hogere intensiteit maakt het mogelijk om gegevens te worden verzameld veel sneller voor deze low-contrast monsters. We bieden een kort protocol voor het verkrijgen van PCM SAXS-gegevens bij Beamline 12-ID-B in het Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) vanuit een gebruikersperspectief. Dit protocol moet van toepassing zijn op de meeste synchrotronbronnen, maar overleg met lokale medewerkers alvorens een experiment voor te stellen wordt ten zeerste aanbevolen. We bieden ook een data reduction en analyse protocol met behulp van Irena36, een gratis set van macro's geschreven voor Igor Pro. Irena bevat een veelzijdige set vormfactoren voor het modelleren van SAXS-gegevens en maakt de bouw mogelijk van multicomponentmodellen die in staat zijn het complexe verstrooiingsprofiel van PCM's te beschrijven (zie representatieve resultaten, figuur 4). Irena heeft ook uitgebreide documentatie en tutorials online beschikbaar. Voordat u de onderstaande procedures probeert, raden we u aan deze te vertrouwd maken, met name de zelfstudie "Modellering van SAXS-gegevens met twee belangrijke verstrooiingspopulaties".
Stralingsschade is een zorg voor röntgenverstrooiing, maar er kunnen verschillende maatregelen worden genomen om het te minimaliseren. In het bijzonder raden we aan om een flowcell setup te gebruiken met een spuitpomp en PCM-monster dat stroomt tijdens het verkrijgen van gegevens, in plaats van een verzegelde capillaire. Dit vereenvoudigt ook de aftrekking van de achtergrond sterk. We raden ook aan om meerdere blootstellingen van het stromende monster te nemen in plaats van één langer om de flux te beperken die een enkel volume van de steekproef ziet en om vergelijking van de blootstellingsgegevens mogelijk te maken om eventuele schade te identificeren.
In tegenstelling tot de verstrooiingstechnieken, die over het algemeen montage nodig hebben om te interpreteren, biedt transmissieelektronenmicroscopie (TEM) een echt ruimtevisueel beeld van de nanodeeltjes door een elektronenstraal door het monster te laten lopen en een beeld te projecteren op een scintillatiescherm(figuur 5). We presenteren protocollen voor twee TEM-technieken in dit artikel. Cryo TEM bevriest micelle monsters in een dunne laag glasijs, met behoud van structurele bevleesdheid met minimale vreemde stoffen, optimaal voor micelles ≤~10-100 nm in straal. Negatieve vlek TEM gebruikt een zwaar metaalzout (bijvoorbeeld uranium) om het monster te omringen nadat het op het oppervlak van een raster is gedroogd. De dichte vlek zal meer elektronen verspreiden dan het monster, het toevoegen van contrast en het produceren van een negatief beeld van het monster. Cryo TEM wordt aanbevolen voor afbeeldingen van hoge kwaliteit. Het is echter duurder, tijdrovender en biedt mogelijk niet voldoende contrast. Wanneer dit een probleem is, moeten negatieve gekleurde monsters worden gebruikt. Voorbeelden van elk zijn weergegeven in figuur 5.
Elk van deze technieken rapporteert over iets verschillende aspecten van de nanodeeltjes, met verschillende sterke punten en beperkingen. Lichtverstrooiing is direct beschikbaar, en is vaak de snelste aanpak, maar heeft aanzienlijke beperkingen in grootte en vormresolutie. SAXS kan informatie verstrekken over een groot aantal lengteschalen bij een redelijk hoge doorvoer, maar vereist gespecialiseerde apparatuur om de gegevens te verkrijgen, evenals modellering om het te interpreteren. TEM-afbeeldingen zijn eenvoudig te interpreteren, maar kunnen in contrast worden beperkt en zijn inherent lage doorvoer. Onze ervaring heeft aangetoond dat het gebruik van meerdere technieken voor karakterisering de informatie die kan worden verkregen over PCM-eigenschappen sterk verhoogt en de interpretatie van gegevenssets die alleen van elk afzonderlijk zijn verkregen, vereenvoudigt. Saxs en TEM onderzoeken bijvoorbeeld voornamelijk de dichte kern van een PCM, terwijl lichtverstrooiingsrapporten over de totale afmetingen van het nanodeeltje. Zo, het combineren van hen maakt het mogelijk meting van zowel de kern en corona grootte. Tem's vermogen om echte ruimtebeelden te verkrijgen, kan grondwaarheidsgegevens opleveren om de selectie van geschikte vormfactoren voor het modelleren van SAXS-gegevens mogelijk te maken die anders dubbelzinnig zouden kunnen zijn. Dit artikel beschrijft protocollen voor alle vier de technieken, en een voorbeeldproces voor het gebruik ervan om een onbekend monster te karakteriseren wordt gegeven in de sectie Discussie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van materialen
- Weeg lyophilized diblock polymeer af en voeg water toe tot bijna het volume dat nodig is voor een voorraadoplossing van 10 mg/mL eindconcentratie. Vortex op maximale snelheid voor 2 min.
- Sonicate voor 5 min. Zeer lange diblocks kan extra sonicatie vereisen. De voorraadoplossing moet volledig transparant en homogeen lijken.
- Pas de pH indien nodig aan op 7,4 met NaOH of HCl. Voeg water toe aan het uiteindelijke volume. pLys-PEG-oplossingen zijn vrij stabiel, maar moeten worden gekoeld voor opslag op langere termijn en de pH moet voor gebruik worden gecontroleerd. Lyophilisatie heeft de voorkeur boven bevriezing.
- Resuspend lyophilized oligonucleotide(s) bij gewenste voorraadconcentratie, meestal 2-5 mM moleculaire concentratie voor lengtes van 50 nt of lager. Vortex grondig om volledige ontbinding te garanderen.
- Bereken molaire concentraties met behulp van moleculair gewicht of lengte zoals beschreven in de inleiding.
- Berekening molar charge concentrations (c.c.), waar
De polyelektrolyt lading is het aantal geladen monomeren, terwijl de nucleïnezuur lading is het aantal basen minus 1, uitgaande van geen fosforylatie. Houd in gedachten dat dubbelstrengs DNA twee keer zoveel ladingen per molecuul zal hebben in vergelijking met enkelstrengs DNA.
- Maak verdunde bouillon op 20 mM c.c. voor elk polymeer.
2. Nucleïnezuur polyelektrolyt Micelle Preparaat
- Meng in een microcentrifugebuis van 1,5 m L het volgende tot een totaal volume van 280 μL:
- 200 μL nuclease-vrij water (ultrazuiver water voor PCM's die geen nucleïnezuren bevatten).
- 40 μL van 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 137 mM natriumchloride, 10 mM fosfaat, pH 7,4 bij verdund tot 1x) of andere geschikte buffer37.
- 40 μL van 20 mM c.c. oligonucleotide. Voeg voor dubbelstrengs oligonucleotiden 20 μL van elke streng toe bij 20 mM c.c.
- Incubeer de oligonucleotideoplossing gedurende 5 min bij 70 °C. Als de berekende smelttemperatuur voor de oligonucleotiden hoger is, moet de temperatuur dienovereenkomstig worden verhoogd. Houd er rekening mee dat RNA zal degraderen bij verhoogde temperaturen, dus deze stap mag niet langer zijn als deze of andere gevoelige componenten aanwezig zijn.
- Koel gedurende 15 min. Voeg 40 μL van 20 mM c.c. diblock toe en draai onmiddellijk vortex voor 20 s bij maximale snelheid. Incubeer 5 min bij kamertemperatuur (RT).
- Voer de zoutanneal uit.
- Voeg 80 μL natriumchloride van 5 M toe voor een eindconcentratie van 1 M NaCl en het eindvolume van 400 μL. Vortex voor 10 s op maximale snelheid.
- Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur en laad vervolgens in dialysepatronen. Merk op dat de genoemde moleculaire gewichtsverlagingen worden bepaald voor bolvormige eiwitten en niet nauwkeurig zal zijn voor lineaire polymeren. We vinden dat een 2k MWCO cartridge monsterverlies vermijdt en ook voorziet in geleidelijke veranderingen in ionische sterkte.
- Bereid dialysebaden voor.
- Bereken het benodigde dialysebad:
- Meng 10x PBS (of andere gewenste buffer), 5 M NaCl en ultrazuiver water voor een definitieve oplossing van 1x PBS en 0.5M NaCl, evenals twee oplossingen van 1x PBS.
- Bereken het benodigde dialysebad:
- Dialysecartridges laden.
- Labelcartridges met permanente markering. Week cartridges in buffer gedurende ten minste 2 min om membranen te hydrateren.
- Verwijder de dop door tegen de klok in te draaien. Laad monster met behulp van gel laden pipet tip. Verwijder overtollige lucht door membranen zachtjes te knijpen. De dop vervangen.
- Doe cartridges in het 1x PBS, 0,5 M natriumchloride dialysebad. Cartridges moeten drijven, waarbij beide membranen aan het bad worden blootgesteld. Schuimdrijvers kunnen indien nodig worden gebruikt.
- Dialyse
- Incubeer gedurende 24 uur langzaam roeren met een magnetische roerstaaf.
- Verplaats de cartridges naar een nieuw bad van 1x PBS of een andere gewenste werkbuffer. Incubeer gedurende 24 uur en roer langzaam met een magnetische roerstaaf. Herhaal deze stap.
- Herstel het monster.
- Haal de patronen uit het bad. Verwijder de dop en herstel monster met behulp van een gel laden pipet tip. Houd er rekening mee dat het teruggewonnen volume hoger kan zijn dan de eerste 400 μL als gevolg van zwelling van het membraan. Record herstelde volume als lichte verdunning is een punt van zorg.
- Plaats het monster in een schone microcentrifugebuis van 1,5 mL. Pcm's die op deze wijze worden voorbereid, moeten gedurende enkele maanden stabiel zijn wanneer deze gekoeld worden gekoeld, op voorwaarde dat nuclease-verontreiniging is vermeden.
3. Dynamische lichtverstrooiing
- Om stofvrije omstandigheden te garanderen, moeten buffers zorgvuldig worden gefilterd (gefilterd 3x door een spuit of vacuümfilter van 0,22 μm) en glaswerk grondig gereinigd tussen monsters. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat het monster thermisch evenwicht heeft bereikt voordat het de meting uitvoert.
- Verdun het PCM-monster tot 0,2 mM c.c. (10x bij gebruik van het hierboven beschreven protocol) met de gewenste werkbuffer en laad in een geschikte cuvette. We gebruiken een kleine cuvette, waarvoor ~ 200 μL monster nodig is na verdunning.
- Stel de DLS-detectorpositie in op 90°.
- Pas de laserkracht en/of attenuator aan, zodat het telpercentage 100.000-200.000 tellingen per seconde (cps) is, indien mogelijk. Telpercentages zo laag als 10 kcps kunnen worden gebruikt, maar meettijden kunnen nodig zijn om goede statistieken te verkrijgen (stap 4.1). Hogere telpercentages moeten worden vermeden, omdat meerdere verstrooiingen de meting zullen verwarren.
- Gegevens verzamelen voor 1 min. Het aantal moet constant zijn gedurende de gehele acquisitietijd; zo niet, dan geeft dit aan dat een deel van het monster of instrument nog niet is geëquilibreerd.
- De autocorrelatiegegevens onderzoeken. De lange tijd basislijn moet zeer vlak zijn en de autocorrelatiecurve moet glad zijn, met minimale spreiding, zoals aangegeven in figuur 3A. Baseline drift geeft een gebrek aan evenwicht, en ruis in de gegevens kan worden verbeterd door het verwerven van meer gegevens.
- De functie Automatischecorrelatie aanpassen.
- Gebruik REPES38,39 om geregulariseerde omgekeerde Laplace transformatie uit te voeren om een verdeling van de ontspanningstijden en een diffusiecoëfficiënt te leveren, D. Deze methode berekent vervolgens hydrodynamische straal, Rh, met behulp van de Stokes-Einstein vergelijking:
Figuur 1B toont een weergave van Rh en figuur 3B toont het resultaat van REPES. - U ook andere methoden gebruiken, waaronder CONTIN40,41 (een alternatief regularisatiealgoritme) of niet-negatieve minimumvierkantenfitting (NNLS). Consistente resultaten van meerdere montagemethoden zijn een handtekening van gegevens van hoge kwaliteit. Merk op dat cumulant analyse (standaard op veel instrumenten) geeft niet-fysieke waarden voor multimodale grootte / lengte distributies.
- Gebruik REPES38,39 om geregulariseerde omgekeerde Laplace transformatie uit te voeren om een verdeling van de ontspanningstijden en een diffusiecoëfficiënt te leveren, D. Deze methode berekent vervolgens hydrodynamische straal, Rh, met behulp van de Stokes-Einstein vergelijking:
4. Lichtverstrooiing met meerdere hoeken
OPMERKING: Lichtverstrooiingsintensiteit versus hoek kan worden gemeten op verschillende instrumenten. We hebben goede resultaten behaald met behulp van zowel goniometer-gebaseerde instrumenten en multiple-detector instrumenten, draaien in batch-modus.
- Pas de PCM-concentratie en verlichtingsintensiteit aan om voldoende signaal/ruis te bieden versus een buffermonster onder alle hoeken zonder een detector te verzadigen. Dit laatste kan worden getest door monsters op verschillende verdunningsfactoren voor te bereiden en te controleren op de lineariteit van intensiteit versus concentratie (uitgaande van minimale interactie tussen de PCB's).
- Noteer de lichtverstrooiingssnelheid van 15° tot 135° gedurende 1 min per hoek. Als het monster en het instrument goed zijn geëquilibreerd, zal de verstrooiingssnelheid constant zijn gedurende de meettijd.
- Plot de genormaliseerde verstrooiing skoers, ikzonde (γ), vs q, waar ik de verstrooiing tarief. q is de verstrooiingsvector (foton momentum transfer) zoals gedefinieerd door
waar η = de oplosmiddelrefractieindex, γ = de meethoek, en λ = de golflengte van de lichtbron. Figuur 4 toont een plot van MALS verstrooiing intensiteit.
5. Kleine hoek X-ray verstrooiing
- Data-acquisitie
- Bereid PCM-monsters zoals hierboven beschreven bij 2 mM ladingconcentratie voor oligonucleotide PCMs voor voldoende verstrooiing boven de achtergrond. Voor PPM's die zware atomen ontbreken (bijvoorbeeld fosfor in nucleïnezuren), kunnen hogere concentraties nodig zijn. Verstrooiingslengtedichtheden kunnen worden geschat met behulp van rekenmachines zoals SASSIE42.
- Om stralingsschade te minimaliseren door vrije radicalen op te ruimen, voeg glycerol toe van een geconcentreerde (bijv. 50%) voorraadoplossing zodat de micelle-oplossing 1% (v/v) glycerol bevat. Merk op dat nette glycerol is zeer stroperig en moeilijk nauwkeurig te meten. Verdunnen met water of buffer is een aanrader.
- Bereid een groot volume van het werken buffer met 1% glycerol voor gebruik als achtergrond monitor.
- Bereid het beamline specifieke stroomcelapparaat voor en kalibreer de detector. Het protocol maakt gebruik van een kwartscapillair met een diameter van 3 mm die is aangesloten op een computergestuurde spuitpomp met een kleine diameter en een minimale lengte polyethyleenbuizen. Met deze installatie is een minimumvolume van ~140 μL per monster nodig.
- Bepaal de parameters voor de blootstelling van monsters. De optimale belichting zal variëren op basis van de intensiteit van de bundel, de gevoeligheid van de detector en de concentratie, de verstrooiingssterkte en de gevoeligheid van het monster, maar het doel is om het monster bloot te stellen aan de minimale flux die nodig is om voldoende verstrooiingsintensiteit te verkrijgen over het q-bereik van belang.
- Voor oligonucleotide/pLys-PEG PCMs produceren 30x 0,2 s belichtingen bij een herhalingssnelheid van 1 Hz een goede datakwaliteit met weinig merkbare schade. Voor nieuwe monsters kan de volgende procedure nuttig zijn:
- Bereid PCM-monsters voor over een reeks concentraties (bijvoorbeeld 10-10.000 μM c.c.).
- Beginnend bij een tussenliggende concentratie, alternatieve PCM en buffer-only monsters met verschillende belichtingstijden. Zie hieronder voor data acquisitie en reductie procedure. Voorbeeldsignaal moet goede statistieken hebben (kleine statistische fout, of vloeiende variatie in q). Als de statistieken slecht zijn, kan de blootstellingstijd worden verhoogd.
- Voorbeeldsignaal moet ook duidelijk te onderscheiden zijn van de achtergrond boven het q-interessebereik. Bereken en plot de (signaal-achtergrond)/achtergrondverhouding versus q om de signaal/achtergrondverhouding te bepalen. Als de signaal/achtergrondverhouding laag is, moet de monsterconcentratie worden verhoogd.
- Controleer of de verstrooiingsintensiteit (genormaliseerd naar concentratie) onafhankelijk is van de concentratie van de steekproef door gegevens te verkrijgen bij hogere en lagere concentraties, waarbij de blootstellingstijd indien nodig wordt verkleind. Interdeeltjesinteracties (de meest waarschijnlijke oorzaak van concentratieafhankelijkheid) zullen het meest uitgesproken zijn in het lage q-bereik.
- Gegevens verzamelen voor PCM-samples en achtergrond (d.w.z. buffer met glycerol).
- Activeer de spuitpomp om het monster door de capillaire te verplaatsen. Ofwel bidirectioneel of eenmalige beweging is aanvaardbaar, maar er moet voor worden gezorgd dat elk monster wordt geïsoleerd (bijvoorbeeld door een luchtbel tussen monsters in te voegen). Monsters kunnen worden teruggewonnen en kunnen worden hergebruikt als er geen stralingsschade wordt gezien.
- Zodra de stroom is begonnen, activeert u het hierboven beschreven programma voor röntgenblootstelling en gegevensverwerving. Er moet voor worden gezorgd dat de blootstelling aan de straal eindigt voordat de vloeistofstroom dat doet.
- Voer na elk monster azimutale middeling uit en plot de 1D-profielen (d.w.z. intensiteit versus q)voor elke belichting samen. Ze moeten identiek zijn in statistische fouten. Het veranderen van signaal na verloop van tijd kan wijzen op stralingsschade.
- Geïsoleerde afwijkende profielen kunnen wijzen op de aanwezigheid van microbellen. Als bellen vaak worden waargenomen, kan het verlagen van de stroomsnelheid helpen.
- Gemiddeld de 1D-verstrooiingsprofielen.
- Verkrijg gegevens voor buffer-only monsters vaak (een keer per 4-5 PCM monsters) en vergelijk deze in de tijd. Een verhoogd signaal van buffermonsters geeft aan dat de capillaire kan worden verontreinigd met door straling beschadigd monster.
- Wanneer besmetting wordt opgemerkt, was de capillaire met bleekmiddel, en overweeg het verminderen van de blootstelling stijd indien mogelijk.
- Gegevensreductie en -analyse met Irena
- Micelle- en achtergrondgegevenssets importeren(SAS/Data import & export/Import ASCII SAS-gegevens).
- Achtergrondverstrooiing aftrekken van voorbeeldgegevens. Doorgaans vertonen de hoogste q-waarden (bijvoorbeeld q > 0,5) onsamenhangende verstrooiing van het oplosmiddel dat het signaal domineert. Als u de achtergrondgegevens schaalt die overeenkomen met de voorbeeldgegevens over dit q-bereik, worden elke variatie als gevolg van de variatie van de bundelintensiteit en de monsterconcentratie verwijderd.
- Plot het voorbeeld en de achtergrond samen op een logboekschaal. Controleer de vlakke intensiteit bij hoge q (SAS/Data Manipulation/Data Manipulation I). Bereken de sample/background ratio(Data1/Data 2),plot op een lineaire-logschaal en controleer de high-q asymptote.
- Bereken de gemiddelde (voorbeeld/achtergrond) verhouding over dit q-bereik (gebruik een aangepaste macro of kopieer/plak in een spreadsheet vanuit de gegevensbrowser).
- Schaal met behulp van de macro Gegevensmanipulatie de achtergrond (bijvoorbeeld Gegevens wijzigen 2)met behulp van de hierboven berekende verhouding en plot de verhouding van het achtergrondafgetrokken signaal naar de achtergrond versus q ([Data1-Data2]/Data2), om te controleren of deze nu asymptotes tot nul bij hoog q. Neem deze verhouding op; het moet <1–2% verwijderd zijn van 1,0 voor elk monster.
- Plot het signaal met achtergrondafgetrokken(Data1-Data2)versus q en sla de gegevens op met een nieuwe naam. Overschrijf de oorspronkelijke gegevens niet.
- Als er geen hogeq-gegevens beschikbaar zijn, gebruikt u een schaalfactor van 1 voor aftrekking van de achtergrond, maar houd u ervan bewust dat er onnauwkeurigheden kunnen worden ingevoerd in q-bereiken waar de signaal/achtergrondverhouding klein is.
- Open de macro Modelleren (SAS/Modellering)en laad en plot de gegevens met achtergrondafgetrokken(Gegevenscntrls/Gegevens toevoegen). Schaal niet in deze macro.
- Zoek eerst een bij benadering model voor het buitenoppervlak van de PCM (micelle grootte/vorm):
- Selecteer in Data cntrlseen laag tot matig q-bereik (bijvoorbeeld ~0,003Å-1 < q < ~0,1Å-1). Als oscillaties zichtbaar zijn, neem ze dan op.
- Kies een formulierfactor die geschikt is voor de gegevens. De helling bij lage q is indicatief voor de vorm van nanodeeltjes, die ook kan worden geverifieerd via TEM en/of MALS. Gebruik Schulz-Zimm sferoïde(q0),cilinder (q-1), of flexibele cilinder(q-2) modellen. Irena biedt tools voor het monteren van energiewetten(SAS/Support Tools voor percelen en tabellen).
- Selecteer in Modelcntrlsde eerste verstrooiingspopulatie(1P)en controleer of dit de enige is die in gebruik is (Schakel het selectievakje Gebruiken selecteren).
- Selecteer Grootte dist. voor Model en kies het gewenste distributietype en formulierfactor. Stel de eerste parameters voor de zoekopdracht in door waarden in te voeren in de velden Schaal, Gemiddelde grootteen Breedte en klik op Model berekenen om de resulterende formulierfactor te tekenen.
OPMERKING: De flexibele cylinder form factor kan worden toegevoegd als een User Form Factor en gedownload van https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. Parameters 1 en 2 komen overeen met respectievelijk de lengte van de cilinder en de Kuhn-lengte. - Zodra redelijke parameters zijn gevonden, klikt u op Fit Model om een niet-lineaire minst-vierkanten die aan de gegevens passen uit te voeren. Het groottedistributiemodel geeft een gemiddelde straal en breedte.
Polydispersity (PDI) gebruik berekenen
Zoals bij elke niet-lineaire montageprocedure kan het nodig zijn om het gegevensbereik(q-regio) en de beginparameters aan te passen om een stabiele, fysiek redelijke pasvorm te verkrijgen. - Zodra een redelijke pasvorm is verkregen, op te slaan(Store in Notebook/Store in Folder).
- Modelleer vervolgens de verstrooiing van de afzonderlijke polymeren binnen de PCM-kern. Dit kan worden vastgelegd door een power law model (bijvoorbeeldq-2 voor ideale ketens, q-5/3 voor gezwollen kettingen, enz.). Irena implementeert dit door middel van een Beaucage model43:
waar P is de macht wet en G en B zijn prefactors.- Pas de gegevensbesturingselementen aan om het gehele q-bereik te bestrijken en het model opnieuw uit testippelen (Model berekenen). Meestal wordt oververstrooiing waargenomen in het matige tot hoge q-bereik (bijvoorbeeld q > ~0.1Å-1).
- Gebruik de gegevensbesturingselementen om het q-bereik te selecteren waar overtollige verstrooiing (>10x het form factormodel) wordt waargenomen.
- Voeg een tweede verstrooiingspopulatie(2P)toe en zorg ervoor dat het de enige is die in gebruik is (schakel Gebruik uit voor 1P).
- Selecteer Uniform niveau voor het model. B en P zijn de relevante parameters. Gebruik de plottende ondersteuningstools of de Fit P/B tussen csrs macro om een eerste schatting voor deze parameters te verkrijgen en pas de Guinier-factoren G en Rg aan om ervoor te zorgen dat het model geen overmatige verstrooiing bij lage qvoorspelt.
- Wat betreft de vormfactor, voer een niet-lineaire pasvorm uit en noteer de parameters en het model.
- Vervolgens voegt u, als een diffractiepiek aanwezig is, zoals in figuur 4,een derde model toe voor een diffractiepiek in het q-interessebereik (q = ~ 0,22 Å-1 in dit geval).
- Zodra de geschatte pasvormwaarden voor de afzonderlijke verstrooiingspopulaties zijn verkregen, schakelt u alle drie samen in (selecteer Gebruiken voor elk) en optimaliseert u de gecombineerde pasvorm.
- Controleer of elke waarde fysiek redelijk blijft. Het resultaat van deze procedure moet een samengesteld model zijn dat de SAXS-gegevens ruim over een groot aantal schaalgroottes beschrijft, zoals geïllustreerd in figuur 4. Sla de pasvorm op met de knop Opslaan in map om op te slaan in Igor.
6. Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM)
- Cryo TEM
- Selecteer het raster. We raden holey carbon support film op een standaard TEM grid of lacey carbon als alternatief. In beide gevallen zorgen de gaten tussen de koolstof voor een beeldgebied van zuiver glasijs en monster en geen film.
- Plaats het rooster carbon kant omhoog in een gloed ontladen apparaat op een schone glazen schuif. Het verpakken van de dia in laboratoriumfilm kan helpen met de netbehandeling. Raak het midden van het raster niet aan met een pincet en knijp altijd in de buurt van de rand van het raster.
- Stel het raster voor 30 s. bloot.
- Bereid een vitrification robot voor monsterafzetting.
- Ingesteld op 100% vochtigheid en RT en voeg blotting papier. Bereid vloeibare ethaan en vloeibare stikstof baden aan de basis van de robot. Zie online tutorials en video's voor extra hulp bij de voorbereiding en het gebruik van vitrification-robot.
- Verdun monster 5x.
- Met behulp van de negatieve actie pincet voorzien van de vitrification robot, pick-up een raster, dan bevestig de pincet aan de robot en verplaats de pincet in de kamer.
- Terwijl in de robot, voeg 4 μL van het monster aan de koolstofkant van het rooster met behulp van een pipet door het gat in de zijkant van de machine.
- Incubeer voor 4 min.
- Met behulp van de robot, dep 3-5 s met filterpapier.
- De vitrification robot dompelt het rooster in vloeibaar ethaan.
- Verwijder de pincet en verplaats het rooster naar vloeibare stikstof en in een opslagcontainer, die ook onder vloeibare stikstof moet staan. Dit proces bevestigt het monster in een dunne laag glasijs. Minimaliseer de tijd die het raster tijdens deze stap doorbrengt uit de vloeibare ethaan of vloeibare stikstof.
- Koel de cryomonsterhouder af met vloeibare stikstof. Houd een Dewar en reservoir vol.
- Wanneer u klaar bent om te beeld, laadt u het raster op de houder van het cryomonster. Houd het monster onder vloeibare stikstof of kort in de extreem koude stikstofstoom net boven het vloeibare oppervlak.
- Beeld het raster op 120 kV tussen 75kx en 150kx in dun en dik ijs, omdat verschillende grootte micelles misschien de voorkeur geven aan een bepaalde ijsdikte.
- Beperk de blootstelling aan stralen om smeltend ijs te voorkomen en het monster te beschadigen. Richt niet direct waar de planning van de afbeelding; focus in de buurt. Alleen bloot het gebied van belang tijdens het vastleggen van een beeld.
- Zorg ervoor dat u vloeibare ethaandruppels van het monster onderscheidt bij het bekijken van afbeeldingen (zie figuur 5).
- Conventionele TEM met negatieve vlekken
- Bereid de vlek voor.
- Kook ~10 mL ultrazuiver water. Weeg 0,1 g uranyl formate (UFo) af in een conische buis van 15 mL.
- Voeg 5 mL van het warme water toe aan het UFo-poeder voor een 2% oplossing. Sluit stevig en wikkel in aluminiumfolie om licht te blokkeren. Een 1% uranyl acetaat vlek wordt ook vaak gebruikt.
- Vortex of schud krachtig gedurende 5 min. Het vastmaken van de buis aan de vortexer zal helpen. Filter door een spuitfilter van 0,2 μm in een schone conische buis.
- Laat 10 min afkoelen aan RT. Voeg 25 μL 5M NaOH en vortex onmiddellijk gedurende 2 min toe.
- Ukunt ook 200 μL aliquots van 2% UFo bevriezen. Wanneer u klaar bent voor gebruik, ontdooit u een aliquot, voeg 1 μL van 5 M NaOH toe en vortex gedurende 2 min.
- Houd vlek gewikkeld in folie of uit de buurt van licht.
- Verdun monster 10x in 1x PBS (of gewenste buffer).
- Selecteer raster. Wij raden carbon support film op koperen roosters. De donkere, glanzender kant van het rooster is de met koolstof bedekte kant waar het monster wordt afgezet en bevlekt.
- Plaats het rooster carbon kant omhoog in een gloed ontladen apparaat op een schone glazen schuif. Zie stap 6.1.2.
- Stel het raster voor 30 s. bloot.
- Pak het raster met de koolstofkant nog steeds naar boven en houd met negatieve actie pincet door de rand van het raster om te voorkomen dat scheuren de beeldvorming gebied in het centrum. Zet de pincet met het rooster nog steeds gehouden koolstof kant omhoog.
- Breng met een pipet een druppel monster van 4 μL aan op de bovenkant (koolstofzijde) van het rooster.
- Incubeer 4 min.
- Met ~ 1 min links, pipeteen 10 μL en een 20 μL drop van UFo oplossing op een stuk van schone laboratoriumfilm.
- Gebruik filterpapier om het monster van de rand van het raster te afvoeren (loodrecht contact) om contact met het beeldoppervlak te voorkomen.
- Met behulp van de pincet (nog steeds met het rooster), onmiddellijk plaats de monster kant van het rooster naar beneden op de 10 μL UFo droplet, dan onmiddellijk wick off de vloeistof (wasstap). Het is belangrijk om het net niet te laten drogen, dus stop niet tussen de stappen door.
- Breng op een vergelijkbare manier de 20 μL UFo druppel op het rooster. Houd het rooster op de UFo voor 40 s. Wick de vloeistof af en laat het rooster drogen.
- Beeld het droge raster bij 120 kV tussen 20.000x en 100.000x.
- Zorg ervoor dat u alle met UFo verontreinigde materialen op de juiste wijze afdeed met behulp van de veiligheidsdienst van de instelling voor radioactief afval.
- Indien nodig kunnen helderheids-/contrastverbetering en een mediaan filter worden toegepast op TEM-afbeeldingen in ImageJ om achtergrondgeluid te verminderen. Nabewerking moet uniform worden gedaan, alleen voor beelden die niet worden gebruikt voor kwantitatieve metingen, zoals intensiteit, en moet altijd worden gerapporteerd.
- Bereid de vlek voor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de hierboven beschreven karakteriseringsmethoden te illustreren, tonen we typische resultaten voor PCB's die zijn samengesteld uit oligonucleotiden en blokcopolymeren van verschillende lengtes en chemie (figuur 1). Figuur 2 geeft een voorbeeld van hoe de PCM-kerngrootte (zoals bepaald op basis van SAXS en TEM, figuur 4 en figuur 5)varieerde met de opgeladen bloklengte. Figuur 3 toont DLS-gegevens en montageresultaten voor sferische PCB's gevormd uit relatief lange blokcopolymeren en korte enkelstrengs oligonucleotiden. Figuur 4 illustreert hoe complexe SAXS-intensiteitsspectra nauwkeurig kunnen worden aangepast door modellen te combineren voor de meervoudige ruimtelijke correlaties die aanwezig waren (externe oppervlakte, intra-core verstrooiing, interhelix-volgorde), en hoe MALS kan worden gebruikt om verstrooiingsmetingen uit te breiden tot langere lengteschalen. Ten slotte toont figuur 5 representatieve elektronenmicroscopiegegevens voor PCM's van verschillende morfologie.
Figuur 1: Assemblage en karakterisering van nucleïnezuur-PCB's. (A) Anionische polymeren, zoals oligonucleotiden, vormden fasegescheiden complexen met kationische gebieden van diblock copolymeren. De aanwezigheid van een hydrofiel neutraal blok (grijs) resulteerde in de vorming van stabiele PCM nanodeeltjes. (B) PCMs waren core-shell nanodeeltjes met meerdere parameters te karakteriseren. De totale grootte (hydrodynamische straal, Rh)kan worden bepaald met behulp van DLS, de kernstraal (Rc)kan worden gevonden met behulp van SAXS en TEM, corona grootte kan worden berekend als Rh-Rc, en morfologie kan worden bepaald over meerdere lengte schalen door het combineren van SAXS, MALS, en TEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Micelle grootte afhankelijkheid. De kerngrootte van Micelle werd voornamelijk bepaald door de lengte van het geladen blok van het blokcopolymeer, en grotendeels onafhankelijk van de lengte van het homopolymeer7,26. Dit zorgt voor controle van pcm grootte door de keuze van blok polymeer. De hier getoonde gegevens zijn voor pLys-PEG met 88 nt/bp DNA en zijn eerder gemeld26. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Dynamische lichtverstrooiing. (A) Autocorrelatiefunctie (willekeurige eenheden) voor 10 nt enkelstrengs DNA + pLys(100)-PEG(10k) PCM. (B) Hydrodynamische straalverdeling (histogram) van REPES fit. De autocorrelatiefunctie is met één tijdschaal tot een vlakke waarde vervallen, wat resulteert in een piek van één grootte in de VERDELING van de REPES-grootte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve SAXS- en MALS-gegevens en geschikt voor een cilindrische micelle. SAXS-gegevens (grijze cirkels) worden weergegeven voor PCM's die zijn samengesteld uit pLys(50)-PEG(5k) en 88 bp dubbelstrengs DNA. Bij lage q (< 10-2 Å-1)toonde de intensiteit een ongeveer q-2 afhankelijkheid van momentum transfer, wat een flexibele cilindervorm impliceert (worm-achtige micelle). MALS-gegevens (open zwarte cirkels) tonen dezelfde afhankelijkheid, wat aangeeft dat de micellen ten minste enkele micrometers lang waren (bevestigd door TEM-beeldvorming, figuur 5C,D). Sferoïdale micelles zou een vlakke afhankelijkheid (q0) van intensiteit op q in dit bereik. De gekleurde lijnen illustreren de multicomponentmontageprocedure voor PCM SAXS-gegevens beschreven in sectie 5. Verstrooiing bij lage q (grote afstand schalen) werd gedomineerd door het externe oppervlak van de PCM, en paste goed door een flexibele cilinder model (rood). Bij hogere q-waarden (kleinere lengteschaal) werd verstrooiing gedomineerd door de afzonderlijke polymeren in de PCM-kern, die hier passen bij een energiewet (groen) met lage q-cutoff. We hebben ook parallelle verpakking van dubbelstrengs DNA-helices waargenomen binnen de PCM-kern, wat resulteerde in een quasi-Bragg diffractiepiek (blauw). De zwarte stippellijn toont aan dat het combineren van deze modellen nauwkeurig beschreven de SAXS-gegevens, en de toevoeging van licht verstrooiing gegevens (open cirkels) uitgebreid de grootte bereik over bijna vier ordes van grootte. Montage resultaten gaf een PCM bevolking met gemiddelde straal = 11,0 nm en PDI = 0,03, macht wet op hoge q = 1,81 en de diffractie piek vertegenwoordigt inter-helix afstand van 2,71 nm. SAXS-gegevens zijn eerder gemeld26 en zijn openbaar beschikbaar44. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: TEM-afbeeldingen van nucleïnezuur-PCM's. (A–B) Cryo TEM van 22 nt enkelstrengs DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, met voornamelijk bolvormige morfologie. Blauwe pijlen geven vloeibare ethaandruppels aan, niet te verwarren met de PCMs (getextureerde sferoïdale objecten). (A) is iets ondergericht, het toevoegen van een licht contrast met behoud van resolutie. (B) is aanzienlijk ondergericht, het toevoegen van meer contrast, maar het opofferen van duidelijkheid. Op beide afbeeldingen werden helderheids- en contrastaanpassingen en een mediaan filter van twee pixels toegepast. (C-D) Negatief gekleurde TEM van 88 bp dubbelstrengs DNA + pLys(50)-PEG(5k) PCM's, lange flexibele cilinders. In beide gevallen waren kernstralen van TEM consistent met de waarden die werden verkregen uit het aanpassen van SAXS-gegevens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals hierboven vermeld, zijn de hier gepresenteerde protocollen geschreven met een focus op oligonucleotiden als de polyanioncomponent en pLys-PEG als kationisch-neutraal blokcopolymeer, maar we hebben ze getest met een verscheidenheid aan polymeren, zoals poly(acrylzuur), polyglutamaat en PEG-poly (vinylbenzyl trimethylammonium), en geloven dat ze over het algemeen toepasbaar zullen zijn voor de meeste polyelektrolyserparen. Een parameter die kan moeten worden geoptimaliseerd is de zoutconcentratie die wordt gebruikt voor annealing, omdat het hoog genoeg moet zijn dat PCM's zich niet vormen aan het begin van de anneal. Dit kan experimenteel door DLS, of in vergelijking met observatie van fasescheiding met polyelectrolytes alleen (geen neutraal blok) worden gecontroleerd. Thermische annealing kan worden gebruikt als zout annealing ongewenst is, hoewel de resulterende polydispersities groter zijn7. De concentraties die worden gebruikt voor karakterisering kunnen ook moeten worden geoptimaliseerd, omdat grotere nanodeeltjes meer licht verspreiden dan kleine, en nucleïnezuren efficiënter zijn in het verspreiden van röntgenstralen dan veel andere polymeren als gevolg van de aanwezigheid van elektronendichte fosforatomen in de ruggengraat. Het kan ook nodig zijn om de pH van de buffer beter te controleren als een van beide polyelektrolyt een pKa heeft die dicht bij de werktoestand staat.
In dit artikel presenteren we protocollen voor twee lichtverstrooiingstechnieken (d.w.z. multi-angle/statisch lichtverstrooiing en dynamische lichtverstrooiing), evenals kleine hoek X-ray verstrooiing, en zowel cryo als conventionele negatieve vlektransmissie elektronenmicroscopie, met representatieve gegevens voor elk. Niet alle technieken zijn nodig voor alle scenario's, en andere zijn ook beschikbaar, waardoor de vraag wordt gesteld wanneer. Uitgebreide review literatuur bestaat over dit onderwerp45,46, maar we suggereren het volgende bij het karakteriseren van een nieuwe PCM of soortgelijke nanodeeltje. Begin met het controleren op aggregatie, zowel door visuele inspectie op troebelheid als door optische microscopie. Als er geen aggregatie wordt waargenomen, is de volgende stap om te bepalen of er nanodeeltjes bestaan. DLS is een snelle manier om dit te bepalen, omdat PCMs strooilicht krachtig, en zwakke of niet-bestaande lichtverstrooiing is een sterke indicator van slechte nanodeeltjesvorming. Hoewel DLS de aanwezigheid van nanodeeltjes kan bevestigen, is het moeilijk om hun grootte en vorm te bepalen zonder verwijzing naar andere gegevens, omdat de meeste analysemethoden afhankelijk zijn van de Stokes-Einstein relatie, die sferische deeltjes aanneemt. MALS kan sferische vormen bevestigen (vlakke genormaliseerde intensiteit versus hoek), maar kan niet in staat zijn om de vorm van niet-asferische deeltjes te bepalen, tenzij de grootteverdeling zowel smal is als in het juiste bereik voor resolutie valt. Als gevolg hiervan raden we aan OM TEM, SAXS of beide uit te voeren op een PCM-monster om de eigenschappen ervan volledig te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Phil Griffin en Tera Lavoie van de Soft Matter Characterization Facility en Advanced Electron Microscopy Facility, respectievelijk, aan de Universiteit van Chicago. We danken xiaobing Zuo en Soenke Seifert van de Advanced Photon Source bij Argonne National Laboratory en NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) voor ondersteuning. Wij danken Jeff Ting en Michael Lueckheide voor hun bijdragen aan dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 mm circle filter paper | Whatman | 1001-070 | Filter paper for wicking during grid prep |
| Carbon Film TEM grid | Electron Microscopy Sciences | CF200-Cu | TEM grid |
| DAWN | Wyatt Technology | DAWN | MALS instrument |
| DNA oligonucleotide | Integrated DNA Nanotechnologies Inc | Custom oligonucleotide | |
| Lacey Carbon TEM grid | Electron Microscopy Sciences | LC200-Cu | TEM grid |
| Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 | Alamanda Polymers Inc | mPEG5K-b-PLKC50 | Example block copolymer |
| Milli-Q | Millipore Sigma | Ultrapure water | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | For measuring nucleic acid concentration | |
| negative-action tweezers | Dumont | N7 | Tweezers for grid preparation |
| Parafilm "M" | Bemis Company Inc | PM996 | Laboratory film |
| Quantifoil Holey Carbon TEM grid | Electron Microscopy Sciences | Q210CR1.3 | TEM grid |
| Research Goniometer and Laser Light Scattering System | Brookhaven Instruments | BI-200SM | DLS/MALS instrument |
| Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL | Thermo Scientific Pierce Protein Biology | 87723 | Dialysis cartridge |
| small volume cuvette | Brookhaven Instruments | BI-SVC | Cuvette for DLS/MALS |
| Solarus 950 Advanced Plasma System | Gatan | Solarus 950 | Plasma system for TEM grids |
| Talos TEM | FEI | Talos | TEM used for cryo samples |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | Spirit | TEM used for dry samples |
| Uranyl Formate | SPI-Chem | 16984-59-1 | For negative staining samples for TEM |
| Vitrobot | FEI | Vitrobot | Vitrification robot for cryo grid preparation |
References
- Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
- van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
- Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
- Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
- Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
- Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
- Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
- De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
- Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
- Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
- Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
- Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
- Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
- Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
- Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
- Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
- Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
- Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
- Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
- Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
- Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
- Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
- Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
- Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
- Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
- Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
- Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
- Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
- Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
- Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
- Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
- Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
- Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
- Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
- Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
- Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
- Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
- Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
- Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
- Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
- Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).
