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Chemistry

Assemblage et caractérisation des Micelles complexes polyélectrolytes

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

Nous fournissons des protocoles et des données représentatives pour la conception, l’assemblage et la caractérisation des micelles complexes polyélectrolytes, des nanoparticules à coquille centrale formées par des polyélectrolytes et des copolymères de blocs chargés hydrophiles.

Abstract

Les micelles complexes polyélectrolytes (PCM), nanoparticules à coquille centrale formées par auto-assemblage de polymères chargés en solution aqueuse, fournissent une plate-forme puissante pour explorer la physique des interactions polyélectrolytes et offrent également une solution prometteuse le problème pressant de la livraison des oligonucléotides thérapeutiques in vivo. Le développement de relations structure prédictives-propriété pour les PCM s’est avéré difficile, en partie en raison de la présence de pièges cinétiques forts pendant l’auto-assemblage des nanoparticules. Cet article traite des critères pour choisir des polymères pour la construction de PCM et fournit des protocoles basés sur l’annealing de sel qui permettent l’assemblage des nanoparticules reproductibles et à faible polydispersity. Nous discutons également de la caractérisation de PCM utilisant la diffusion de lumière, la diffusion de rayon X de petit angle, et la microscopie électronique.

Introduction

Lorsque les polyélectrolytes chargés en face sont mélangés dans une solution aqueuse, le gain d’entropie de la libération de leurs contreions provoque le démêlage de la solution dans une phase condensée riche en polymères et un supernatant appauvri en polymère1,2,3,4,5, un phénomène connu sous le nom de complexe polyélectrolyte. Si un bloc hydrophile neutre est conjugué à l’un ou les deux polyélectrolytes, la séparation de phase à l’échelle nanométrique se produit plutôt (figure 1A). Les nanoparticules auto-assemblées de noyau-coquille résultantes sont diversement appelées micelles complexes de polyélectrolyte (PCMs), micelles complexes de polyion, complexes d’ionomère de bloc, ou micelles coacervate-noyau par analogie à la micellation surfactant, même si tous les composants du système sont hydrophiles6,7. La capacité d’un PCM à encapsuler des molécules hydrophiles telles que les protéines et les acides nucléiques, ainsi que la tunabilité étendue offerte par l’architecture de porteur de copolymère de bloc les rend des candidats attrayants pour livrer des molécules thérapeutiques in vivo8,9,10,11,12,13.

La livraison d’acides nucléiques thérapeutiques aux cibles cellulaires est un défi particulièrement important, et pour lequel les PCM offrent plusieurs avantages. Les acides nucléiques thérapeutiques (ADN génétique, ARNm et oligonucléotides tels que siRNA) ont un immense potentiel d’amélioration de la santé humaine, mais doivent surmonter de nombreux obstacles biologiques et physiques pour réaliser ce potentiel14,15,16. Les acides nucléiques nus sont dégradés par le sérum et les nucléases cellulaires, sont rapidement éliminés de la circulation, et leur forte charge négative rend difficile pour eux de pénétrer les membranes cellulaires sans aide. Les approches actuelles pour surmonter ces obstacles comprennent des modifications chimiques coûteuses pour prévenir les dommages causés par les nucléases et/ou l’encapsulation dans diverses nanoparticules lipidiques assemblées par le biais d’interactions hydrophobes15,17,18. Bien que ces méthodes se soient avérées efficaces pour les injections locales et le ciblage du foie, l’utilisation systémique présente des limites importantes de toxicité, d’immunogénicité et de biodistribution limitée16. En revanche, les PCM utilisent la charge négative des acides nucléiques pour les condenser dans le noyau phase-séparé, alors que la couronne neutre fournit une barrière stérique contre la dégradation aussi bien qu’une plate-forme pour incorporer des ligands pour améliorer le ciblage ou l’internalisation11,19. Des études in vitro et animales ont montré que les PCM peuvent effectivement fournir diverses charges utiles d’acide nucléique20,21,22,23,24, mais les faiblesses dans notre capacité à prédire les propriétés PCM telles que la taille, la forme et la stabilité des propriétés des polymères constitutifs ont entravé leur adoption plus large.

Des travaux récents de notre groupe et d’autres dans le domaine ont commencé à résoudre ce problème en développant la structure-propriété, et dans certains cas structure-propriété-fonction des relations pour les PCM formés à partir d’acides nucléiques et divers polymères cationic-neutre7,25,26,27. Deux thèmes cohérents qui ont émergé de ces études sont l’importance de développer des protocoles bien contrôlés et répétables pour l’assemblage de PCM et l’avantage d’utiliser de multiples techniques pour caractériser les nanoparticules résultantes. Les polyélectrolytes, en particulier ceux qui ont une forte densité de charge comme les acides nucléiques, interagissent très fortement les uns avec les autres et semblent facilement se coincer de façon kinétique lors du mélange, ce qui entraîne des préparations PCM très sensibles aux petites variations de procédure et présentent une polydispersity élevée et une faible répétabilité d’un lot à l’autre. Il a également été démontré que les PCM adoptent un large éventail de formes et de tailles en fonction des configurations au niveau atomique de leurs composants, et il est très difficile de capturer cette diversité avec n’importe quelle technique de caractérisation individuelle, d’autant plus que certaines techniques courantes telles que la diffusion dynamique de la lumière (DLS) nécessitent des hypothèses sur la forme des particules pour leur interprétation.

Dans cet article, nous discutons la conception et la sélection de matériel pour des PCM, avec un accent sur des oligonucléotides et des copolymères cationic-neutres de diblock. Nous décrivons alors un protocole d’annealing de sel qui emploie des concentrations élevées de sel suivies de la dialyse lente pour éviter le piégeage cinétique pendant l’assemblage de PCM. Les polyélectrolytes sont mélangés dans des conditions de sel élevé où les attractions électrostatiques sont filtrées, puis la concentration de sel est lentement abaissée pour permettre aux polyélectrolytes de s’installer dans leurs configurations les plus favorables énergétiquement, analogues au processus de refroidissement lent de l’annealing thermique. En utilisant ce protocole, nous sommes régulièrement en mesure d’atteindre une polydispersity exceptionnellement faible et une grande répétabilité pour les PCM oligonucléotides7,26. Enfin, nous décrivons comment quatre techniques de mesure distinctes peuvent être utilisées pour caractériser les PCM sur une très large gamme d’échelles de longueur, de la morphologie externe à la structure interne : DLS, diffusion de lumière multi-angle (MALS), diffusion à rayons X à petit angle (SAXS) et microscopie électronique de transmission (TEM). Nous espérons que ces protocoles permettront à un plus grand nombre de chercheurs d’explorer efficacement les capacités de ces nanoparticules intéressantes.

Sélection et préparation des polymères
Les propriétés PCM sont fortement influencées par les caractéristiques physiques et chimiques des polymères constitutifs, ce qui fait de la sélection des polymères une étape critique dans le processus de conception. Les copolymères de bloc les plus bien caractérisés pour les PCM d’acide nucléique sont des diblocs linéaires tels que poly(lysine)-poly (éthylène glycol) (pLys-PEG), mais les PCM peuvent être formés entre les polyélectrolytes et une variété de polymères hydrophiles à charge neutre, qui peuvent être générés d’une manière de débit élevé28. Le choix du groupe chargé affecte fortement la stabilité de l’appariement ionique et la forme des micelles26, et la taille pcM a été montré pour augmenter avec la longueur du bloc chargé5,7,26 (Figure 2), permettant ainsi aux propriétés PCM d’être réglés pour les exigences d’une application désirée. Pour les diblocs linéaires, nous avons constaté que le bloc chargé devrait avoir au moins 10 charges et être fortement chargé au pH désiré. Les blocs chargés plus longs peuvent favoriser la formation de PCM avec des oligonucléotides tels que siRNA, qui sont difficiles à complexer avec des blocs plus courts21. Nous avons observé avec succès la formation de PCM avec des longueurs de bloc jusqu’à 200, et la littérature décrit des polymères plus longs. Plus de flexibilité est disponible dans le choix des blocs neutres24, mais l’expérience a montré que les blocs neutres très courts conduisent à l’agrégation plutôt que la formation de nanoparticules, et que la longueur neutre minimale augmente avec la longueur du bloc chargé. Pour les pLys-PEG, un MW PEG d’au moins 3 000 à 5 000 est nécessaire pour les longueurs de pLys inférieures à 50 euros, et des longueurs plus longues sont nécessaires à mesure que le bloc chargé est augmenté davantage. L’augmentation de la longueur du bloc neutre entraîne une augmentation de la taille du PCM, en particulier l’épaisseur de la coquille, en raison de l’encombrement stérique des polymères neutres.

Ce manuscrit présente un protocole pour la préparation des PCM à partir de pLys-PEG lyophilisés de haute pureté et d’oligonucléotides de quantité connue, mais devrait être facilement adaptable à d’autres systèmes aussi bien. Nous l’avons testé avec succès avec plusieurs polypeptides chargés, y compris la polyarginine et l’acide polyglutamique, aussi bien que plusieurs polyélectrolytes synthétiques, tels que l’acide polyacrylique et le poly (vinylbenzyl trimethylammonium). Nous décrivons également la préparation de PCMs avec un rapport stoichiometric des charges de polyélectrolyte, mais ceci est facilement modifié. Nous trouvons qu’il est plus facile de travailler en unités de concentration de charge (c.c.), qui accueille aussi naturellement les polymères qui ne sont pas entièrement chargés. Si l’un ou l’autre polymère n’est pas bien caractérisé, il faut veiller à déterminer avec précision les longueurs/masses des polymères et à s’assurer que l’excès de sel n’est pas présent au-delà de celui nécessaire à la neutralisation des charges par dialyse, par exemple. La présence d’eau retenue doit également être prise en compte lors du calcul des concentrations. La concentration d’acide nucléique peut être commodément quantifiée par absorption à 260 nm, et la présence ou l’absence de phosphates terminaux devrait être prise en considération lors du calcul du c.c.

Lors de l’utilisation des oligonucléotides comme polyanions, l’état d’hybridation et la structure chimique aident à déterminer la propension à l’auto-assemblage et les caractéristiques duPCM5,7,26. L’optimisation de ceux-ci, dans les conditions pour l’efficacité biologique si l’utilisation des PCM pour l’administration, augmentera la probabilité de former les structures désirées. Les outils utiles pour analyser l’hybridation incluent les fonctions MATLAB pour les acides nucléiques, NUPACK29, et IDT OligoAnalyzer. Nous recommandons d’analyser une séquence de candidat pour comprendre la force de la liaison à 1) elle-même dans une formation d’épingle à cheveux ; 2) une autre copie de la même séquence (auto-dimer); et 3) à d’autres oligonucléotides présents dans le système. Les températures de fusion de l’ADN et de l’ARN pour une séquence spécifique peuvent également être calculées à l’aide de la méthode voisine la plus proche30,31. L’annexion thermique des acides nucléiques (étape 2.3) dénature toute structure secondaire résiduelle dans les nucléotides individuels et favorise le pliage de l’équilibre.

Caractérisation et analyse PCM
Un large éventail de techniques sont disponibles pour caractériser les nanoparticules, y compris la diffusion de la lumière statique et dynamique, la diffusion à petit angle d’électrons ou de neutrons, et la microscopie électronique. Dans cet article, nous fournissons des protocoles pour deux techniques de diffusion de lumière, la diffusion à petit angle de rayon X, et deux techniques de microscopie électronique.

DLS mesure l’autocorrélation des fluctuations temporelles dans l’intensité de diffusion à un angle du mouvement Brownien de l’échantillon. L’ajustement de ces données peut fournir un rayon hydrodynamique et une polydispersité pour les micelles sphériques (figure 3). La diffusion de la lumière à angle multiple (MALS) mesure l’intensité de diffusion statique à de nombreux angles. Cette dépendance angulaire décrit la forme de la nanoparticule, mais se limite à des échelles de longueur de plus de 50 nm pour la lumière visible, ce qui limite son efficacité pour les nanoparticules plus petites. Les deux techniques sont basées sur l’inadéquation de l’indice de réfraction et décrivent principalement les dimensions extérieures de la nanoparticule.

La diffusion des rayons X à petit angle (SAXS) utilise les rayons X comme sonde de diffusion, et leur longueur d’onde plus courte permet des mesures sur une plage de 0,1 à 100 nm. L’ajustement de l’intensité de diffusion observée par rapport à l’angle (traditionnellement exprimé comme transfert d’élan q) fournit des informations sur la morphologie PCM (c.-à-d., la taille et la forme) et aussi la structure interne. Si un étalonnage d’intensité absolue est disponible, et si l’intensité de diffusion peut être extrapolée à l’angle zéro, la masse pcM et le nombre d’agrégation peuvent également être estimés32, ce qui rend SAXS une méthode extrêmement polyvalente et précieuse. La diffusion de neutrons à petit angle (SANS) est sensible sur une gamme similaire d’échelles de longueur, mais n’est disponible que dans des installations spécialisées et ne sera pas explicitement discutée dans cet article33,34,35.

Ces dernières années ont vu l’avènement des instruments SAXS sur le banc, mais nous constatons que les sources de synchrotron sont mieux adaptées à la caractérisation pcM, car leur intensité plus élevée permet de recueillir des données beaucoup plus rapidement pour ces échantillons à faible contraste. Nous fournissons un bref protocole pour l’acquisition des données PCM SAXS à Beamline 12-ID-B à l’Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) du point de vue de l’utilisateur. Ce protocole devrait s’appliquer à la plupart des sources de synchrotron, mais il est fortement recommandé de consulter le personnel local avant de proposer une expérience. Nous fournissons également un protocole de réduction et d’analyse des données à l’aide d’Irena36, un ensemble gratuit de macros écrite pour Igor Pro. Irena comprend un ensemble polyvalent de facteurs de forme pour la modélisation des données SAXS et permet la construction de modèles multicomposants capables de décrire le profil de diffusion complexe des PCM (voir Résultats représentatifs, Figure 4). Irena dispose également d’une documentation complète et de tutoriels disponibles en ligne. Avant de tenter les procédures ci-dessous, nous recommandons la familiarisation avec ceux-ci, en particulier le tutoriel "Modélisation des données SAXS avec deux populations principales de diffuseur".

Les dommages causés par les radiations sont préoccupants pour la diffusion des rayons X, mais plusieurs mesures peuvent être utilisées pour la minimiser. En particulier, nous recommandons d’utiliser une configuration de cellule d’écoulement avec une pompe à seringues et un échantillon de PCM qui coule pendant l’acquisition de données, plutôt qu’un capillaire scellé. Cela simplifie également considérablement la soustraction de fond. Nous suggérons également de prendre plusieurs expositions de l’échantillon qui coule plutôt qu’une plus longue afin de limiter le flux que tout volume d’échantillon voit et de permettre la comparaison des données d’exposition pour identifier tout dommage.

Contrairement aux techniques de diffusion, qui nécessitent généralement un ajustement pour interpréter, la microscopie électronique de transmission (TEM) fournit une image visuelle réelle de l’espace des nanoparticules en passant un faisceau d’électrons à travers l’échantillon et en projetant une image sur un écran de scintillation (Figure 5). Nous présentons des protocoles pour deux techniques de TEM dans cet article. Cryo TEM congele des échantillons de micelle dans une fine couche de glace vitrée, préservant la conformation structurelle avec un minimum de substances étrangères, optimale pour les micelles de 10 à 100 nm dans un rayon. Tache négative TEM utilise un sel de métal lourd (p. ex. uranium) pour entourer l’échantillon après qu’il a été séché à la surface d’une grille. La tache dense dispersera plus d’électrons que l’échantillon, ajoutant du contraste et produisant une image négative de l’échantillon. Cryo TEM est recommandé pour les images de haute qualité. Cependant, il est plus coûteux, long, et peut ne pas fournir un contraste suffisant. Lorsqu’il s’agit d’une préoccupation, des échantillons tachés négatifs doivent être utilisés. Des exemples de chacun sont présentés à la figure 5.

Chacune de ces techniques rend compte d’aspects légèrement différents des nanoparticules, avec des forces et des limitations différentes. La diffusion de la lumière est facilement disponible, et est souvent l’approche la plus rapide, mais a des limites substantielles dans la taille et la résolution de la forme. SAXS peut fournir des informations sur une large gamme d’échelles de longueur à un débit raisonnablement élevé, mais nécessite de l’équipement spécialisé pour acquérir les données, ainsi que la modélisation pour les interpréter. Les images TEM sont simples à interpréter, mais peuvent être limitées en contraste et sont intrinsèquement faibles débit. Notre expérience a montré que l’utilisation de multiples techniques de caractérisation augmente considérablement l’information qui peut être obtenue sur les propriétés PCM et simplifie l’interprétation des ensembles de données obtenus de chacun seul. Par exemple, SAXS et TEM examinent principalement le noyau dense d’un PCM, tandis que la diffusion de la lumière rend compte des dimensions globales de la nanoparticule. Ainsi, les combiner permet de mesurer à la fois la taille du noyau et de la couronne. La capacité de TEM d’acquérir des images spatiales réelles peut fournir des données de vérité au sol pour permettre la sélection de facteurs de forme appropriés pour la modélisation des données SAXS qui pourraient autrement être ambigus. Cet article décrit les protocoles pour les quatre techniques, et un processus d’exemple pour les utiliser pour caractériser un échantillon inconnu est donné dans la section Discussion.

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Protocol

1. Préparation des matériaux

  1. Peser le polymère diblock lyophilisé et ajouter de l’eau jusqu’à près du volume requis pour une solution de stock de 10 mg/mL de concentration finale. Vortex à vitesse maximale pendant 2 min.
  2. Sonicate pendant 5 min. Les diblocks très longs peuvent nécessiter une sonication supplémentaire. La solution de stock doit apparaître complètement transparente et homogène.
  3. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant NaOH ou HCl au besoin. Ajouter de l’eau au volume final. les solutions pLys-PEG sont assez stables mais doivent être réfrigérées pour un stockage à plus long terme et le pH doit être vérifié avant utilisation. La lyophilisation est préférable à la congélation.
  4. Resuspendre l’oligonucléotide lyophilisé (s) à la concentration de stock désirée, généralement 2-5 mM concentration moléculaire pour des longueurs de 50 nt ou ci-dessous. Vortex à fond pour assurer une dissolution complète.
  5. Calculer les concentrations molaires en utilisant le poids moléculaire ou la longueur tel que décrit dans l’introduction.
  6. Calculer les concentrations de charge molaire (c.c.), où

Equation 1

La charge de polyélectrolyte est le nombre de monomères chargés, tandis que la charge d’acide nucléique est le nombre de bases moins 1, en supposant qu’il n’y ait pas de phosphorylation. Gardez à l’esprit que l’ADN à double brin aura deux fois plus de charges par molécule par rapport à l’ADN à brin unique.

  1. Créer un bouillon dilué à 20 mM c.c. pour chaque polymère.

2. Préparation micelle à l’acide nucléique

  1. Dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml, mélanger ce qui suit pour un volume total de 280 l :
    1. 200 l d’eau sans nucléane (eau ultrapure pour les PCM ne contenant pas d’acides nucléiques).
    2. 40 l de saline tamponnée de phosphate 10x (PBS, 137 mM de chlorure de sodium, 10 mM de phosphate, pH 7,4 lorsqu’elle est diluée à 1x) ou autre tampon approprié37.
    3. 40 l de 20 mM c.c. oligonucléotide. Pour les oligonucléotides à double brin, ajouter 20 l de chaque brin à 20 mm c.c.
  2. Incuber la solution oligonucléotide pendant 5 min à 70 oC. Si la température de fusion calculée pour les oligonucléotides est plus élevée, la température doit être augmentée en conséquence. Notez que l’ARN se dégrade ragrade à des températures élevées, de sorte que cette étape ne devrait pas être plus longue si ceci ou d’autres composants sensibles sont présents.
  3. Laisser refroidir pendant 15 min. Ajouter 40 'L de 20 m.c. diblock, puis vortex immédiatement pendant 20 s à vitesse maximale. Incuber 5 min à température ambiante (RT).
  4. Effectuer l’anneale de sel.
    1. Ajouter 80 oL de chlorure de sodium de 5 M pour une concentration finale de 1 M NaCl et un volume final de 400 l. Vortex pour 10 s à vitesse maximale.
    2. Incuber 10 min à température ambiante, puis charger dans des cartouches de dialyse. Notez que les seuils de poids moléculaires énumérés sont déterminés pour les protéines globulaires et ne seront pas précis pour les polymères linéaires. Nous constatons qu’une cartouche MWCO de 2k évite la perte d’échantillon et prévoit également des changements progressifs de la force ionique.
    3. Préparer les bains de dialyse.
      1. Calculer le volume de bain de dialyse nécessaire :
        Equation 2
      2. Mélanger 10x PBS (ou autre tampon désiré), 5 M NaCl, et de l’eau ultrapure pour une solution finale de 1x PBS et 0,5 M NaCl, ainsi que deux solutions de 1x PBS.
    4. Chargez les cartouches de dialyse.
      1. Étiqueter les cartouches avec marqueur permanent. Tremper les cartouches dans un tampon pendant au moins 2 minutes pour hydrater les membranes.
      2. Retirez le bouchon en tordant dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Charger l’échantillon à l’aide de la pointe de pipette de chargement de gel. Enlever l’excès d’air en serrant doucement les membranes. Remplacer le bouchon.
      3. Mettre les cartouches dans le bain de dialyse au chlorure de sodium de 0,5 M. 1x PBS. Les cartouches doivent flotter, les deux membranes ayant été exposées au bain. Des flotteurs en mousse peuvent être utilisés si nécessaire.
    5. Dialyse
      1. Incuber pendant 24 h en remuant lentement avec une barre magnétique.
      2. Déplacez les cartouches vers un nouveau bain de 1x PBS ou d’un autre tampon de travail souhaité. Incuber pendant 24 h, en remuant lentement avec une barre magnétique. Répétez cette étape.
    6. Récupérez l’échantillon.
      1. Retirez les cartouches du bain. Retirez le bouchon et récupérez l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel. Notez que le volume récupéré peut être plus élevé que les 400 L initiaux en raison de l’enflure de la membrane. Enregistrer le volume récupéré en cas de légère dilution.
      2. Placer l’échantillon dans un tube microcentrifuge propre de 1,5 ml. Les PCM préparés de cette façon devraient être stables pendant plusieurs mois lorsqu’ils sont réfrigérés, à condition d’éviter la contamination par les nucléasmes.

3. Diffusion dynamique de la lumière

  1. Pour garantir des conditions exemptes de poussière, les tampons doivent être soigneusement filtrés (filtrés 3x à travers une seringue ou un filtre à vide de 0,22 m) et la verrerie soigneusement nettoyée entre les échantillons. Il est également important de s’assurer que l’échantillon a atteint l’équilibre thermique avant de procéder à la mesure.
  2. Diluer l’échantillon de PCM à 0,2 mM c.c. (10x si vous utilisez le protocole décrit ci-dessus) avec le tampon de travail désiré et charger dans une cuvette appropriée. Nous utilisons une cuvette à petit volume, qui nécessite 200 l’échantillon après dilution.
  3. Définir la position du détecteur DLS à 90 degrés.
  4. Ajustez la puissance laser et/ou l’atténuateur de sorte que le taux de comptage soit de 100 000 à 200 000 comptes par seconde (cps), si possible. Des taux de comptage aussi bas que 10 kcps peuvent être utilisés, mais les temps de mesure peuvent devoir être prolongés pour obtenir de bonnes statistiques (étape 4.1). Des taux de comptage plus élevés devraient être évités, car la diffusion multiple confondra la mesure.
  5. Acquérir des données pour 1 min. Le taux de comptage doit être constant pendant toute la durée de l’acquisition; si ce n’est pas le cas, cela indique qu’une composante de l’échantillon ou de l’instrument n’a pas encore été aquilnée.
  6. Examiner les données d’autocorrélation. La ligne de base de longue durée doit être très plate, et la courbe d’autocorrélation doit être lisse, avec une diffusion minimale, comme le montre la figure 3A. La dérive de base indique un manque d’équilibre, et le bruit dans les données peut être amélioré en acquérant plus de données.
  7. Ajuster la fonction d’autocorrélation.
    1. Utilisez REPES38,39 pour effectuer la transformation laplace inverse régularisée pour offrir une distribution des temps de relaxation et un coefficient de diffusion, D. Cette méthode calcule ensuite le rayon hydrodynamique, Rh, en utilisant l’équation Stokes-Einstein:
      Equation 3
      La figure 1B montre une représentation de Rh et la figure 3B montre le résultat de REPES.
    2. Vous pouvez également utiliser d’autres méthodes, dont CONTIN40,41 (un algorithme de régularisation alternatif) ou le raccord de carrés les moins négatifs (NNLS). Les résultats cohérents de plusieurs méthodes d’ajustement sont une signature de données de haute qualité. Notez que l’analyse cumulant (standard sur de nombreux instruments) donne des valeurs non physiques pour les distributions multimodales de taille/longueur.

4. Diffusion de lumière multi-angle

REMARQUE : L’intensité de diffusion de la lumière par rapport à l’angle peut être mesurée sur une variété d’instruments. Nous avons obtenu de bons résultats à l’aide d’instruments à base de goniomètres et d’instruments à détecteurs multiples, exécutés en mode lot.

  1. Ajustez la concentration et l’intensité d’éclairage du PCM pour fournir un signal/bruit suffisant par rapport à un échantillon tampon uniquement sous tous les angles sans saturer aucun détecteur. Ce dernier peut être testé en préparant des échantillons à divers facteurs de dilution et en vérifiant la linéarité de l’intensité par rapport à la concentration (en supposant une interaction minimale entre les PCM).
  2. Enregistrez le taux de diffusion de la lumière de 15 à 135 degrés pour 1 min par angle. Si l’échantillon et l’instrument sont correctement équilibrés, le taux de diffusion sera constant pendant le temps de mesure.
  3. Tracer le taux de diffusion normalisé, jepéchez ( ( ) vs q, où je suis le taux de diffusion. q est le vecteur de diffusion (transfert d’élan photon) tel que défini par

Equation 4

où l’indice de réfraction des solvants, l’angle de mesure et la longueur d’onde de la source lumineuse. La figure 4 montre une parcelle d’intensité de diffusion DE MALS.

5. Diffusion de rayons X à petit angle

  1. Acquisition de données
    1. Préparer des échantillons de PCM comme décrit ci-dessus à la concentration de charge de 2 mM pour les PCM oligonucléotides pour la diffusion suffisante au-dessus du fond. Pour les MCP dépourvus d’atomes lourds (p. ex., phosphore dans les acides nucléiques), des concentrations plus élevées peuvent être nécessaires. Les densités de longueur de dispersion peuvent être estimées à l’aide de calculatrices telles que SASSIE42.
    2. Afin de minimiser les dommages causés par les radiations en récupérant les radicaux libres, ajouter le glycérol d’un concentré (p. ex., 50 %) solution de stock de sorte que la solution micelle contient 1% (v/v) de glycérol. Notez que le glycérol propre est très visqueux et difficile à mesurer avec précision. Il est fortement recommandé de se diluer avec de l’eau ou un tampon.
    3. Préparer un grand volume de tampon de travail avec 1% de glycérol pour une utilisation comme moniteur de fond.
    4. Préparer l’appareil de cellule d’écoulement spécifique à la ligne de faisceau et calibrer le détecteur. Le protocole utilise un capillaire de quartz de 3 mm de diamètre relié à une pompe à seringues commandée par ordinateur avec un petit diamètre, et un tube en polyéthylène de longueur minimale. Un volume minimum de 140 l l par échantillon est nécessaire avec cette configuration.
    5. Déterminer les paramètres d’exposition de l’échantillon. L’exposition optimale varie en fonction de l’intensité du faisceau, de la sensibilité du détecteur et de la concentration, de la force de dispersion et de la susceptibilité des dommages de l’échantillon, mais le but est d’exposer l’échantillon au flux minimal requis pour obtenir une intensité de diffusion suffisante sur la plage d’intérêt q.
    6. Pour les PCM oligonucléotide/pLys-PEG, les expositions de 30x 0,2 à un taux de répétition de 1 Hz produisent une bonne qualité de données avec peu de dommages perceptibles. Pour les nouveaux échantillons, la procédure suivante peut être utile :
      1. Préparer des échantillons de PCM sur une gamme de concentrations (p. ex., 10 à 10 000 m c.c.).
      2. À partir d’une concentration intermédiaire, alternez les échantillons de PCM et de tampon seulement avec des temps d’exposition variables. Voir ci-dessous pour la procédure d’acquisition et de réduction des données. Le signal d’échantillon devrait avoir de bonnes statistiques (petite erreur statistique, ou variation lisse à travers q). Si les statistiques sont médiocres, le temps d’exposition peut être augmenté.
      3. Le signal d’échantillon doit également être clairement distinguable de l’arrière-plan au-dessus de la gamme d’intérêt de q. Calculez et tracez le ratio (signal-arrière)/background par rapport à q pour déterminer le rapport signal/arrière-plan. Si le rapport signal/arrière-plan est faible, la concentration de l’échantillon doit être augmentée.
      4. Vérifier que l’intensité de diffusion (normalisée à la concentration) est indépendante de la concentration de l’échantillon en acquérant des données à des concentrations plus élevées et plus faibles, en évoluant le temps d’exposition si nécessaire. Les interactions entre les particules (la cause la plus probable de dépendance à la concentration) seront les plus prononcées dans la fourchette de q faible.
    7. Acquérir des données pour les échantillons de PCM et le fond (c.-à-d., tampon avec le glycérol).
      1. Déclencher la pompe à seringues pour déplacer l’échantillon à travers le capillaire. Le mouvement bidirectionnel ou une fois à travers est acceptable, mais il faut prendre soin d’isoler chaque échantillon (p. ex., en insérant une bulle d’air entre les échantillons). Les échantillons peuvent être récupérés et réutilisés si aucun dommage aux radiations n’est constaté.
      2. Une fois le flux commencé, déclencher le programme d’exposition aux rayons X et d’acquisition de données décrit ci-dessus. Il faut prendre soin de l’exposition au faisceau avant que le flux de fluide ne le fasse.
    8. Après chaque échantillon, effectuez une moyenne azimuthal et tracez les profils 1D (c.-à-d. intensité vs q) pour chaque exposition ensemble. Ils doivent être identiques dans l’erreur statistique. Changer le signal au fil du temps peut indiquer des dommages causés par les radiations.
      1. Des profils anormal isolés peuvent indiquer la présence de microbulles. Si des bulles sont observées fréquemment, la diminution du débit peut aider.
    9. Moyenne des profils de diffusion 1D.
    10. Acquérez fréquemment des données pour les échantillons de mémoire tampon seulement (une fois par tranche de 4 à 5 échantillons de PCM) et comparez-les au fil du temps. L’augmentation du signal provenant d’échantillons tampons seulement indique que le capillaire peut être contaminé par un échantillon endommagé par les radiations.
      1. Lorsque la contamination est remarquée, lavez le capillaire avec de l’eau de Javel et envisagez de réduire le temps d’exposition si possible.
  2. Réduction et analyse des données à l’aide d’Irena
    1. Microelle d’importation et ensembles de données ASCIId’arrière-plan (données SAS/Data import and export/Import ASCII SAS).
    2. Soustrayez la diffusion de fond à partir des données de l’échantillon. Typiquement, les valeurs q les plus élevées (par exemple q 'gt; 0.5) montrent la diffusion incohérente du solvant dominant le signal. La mise à l’échelle des données d’arrière-plan pour correspondre aux données de l’échantillon sur cette plage q élimine toute variation due à la variation de l’intensité du faisceau et à la concentration de l’échantillon.
      1. Tracez l’échantillon et l’arrière-plan ensemble sur une échelle de journal de bord. Vérifier l’intensité plate à q élevé (SAS/Data Manipulation/Data Manipulation I). Calculez le rapport échantillon/fond (Data1/Data 2), tracez sur une échelle de journal linéaire, et vérifiez l’asymptote à hautq.
      2. Calculez le rapport moyen (échantillon/arrière)sur cette plage q (utiliser une macro personnalisée ou copier/coller dans une feuille de calcul à partir du navigateur de données).
      3. À l’aide de la macro Manipulation des données, évoluez l’arrière-plan (p. ex., Modifier les données 2) en utilisant le rapport ci-dessus et tracer le rapport de signal sous-traitance de fond par rapport à q ([Data1-Data2]/Data2), en vérifiant qu’il asymptote maintenant à zéro à qélevé . Enregistrez ce ratio; il devrait être de 1 à 2 % par rapport à 1,0 pour chaque échantillon.
      4. Tracez le signal sous-traitance d’arrière-plan (Data1-Data2) vs q et enregistrez les données avec un nouveau nom. Ne pas remplacer les données d’origine.
      5. Si des données à hautq ne sont pas disponibles, utilisez un facteur de mise à l’échelle de 1 pour la soustraction de fond, mais sachez que des inexactitudes peuvent être introduites dans les plages q où le rapport signal/arrière est faible.
    3. Ouvrez la macro modélisation , (SAS/Modeling), puis chargez et tracez les données sous-traitancées en arrière-plan (données cntrls/Add data). Ne pas l’échelle dans cette macro.
    4. Tout d’abord, trouver un modèle approximatif pour la surface externe du PCM (taille/forme de micelle) :
      1. Dans Data cntrls, sélectionnez la plage de q faible à modérée (par exemple, 0,003- 1 lt; q 'lt; '0.1 '-1). Si les oscillations sont visibles, incluez-les.
      2. Choisissez un facteur de formulaire approprié aux données. La pente à faible q est indicative de la forme des nanoparticules, qui peut également être vérifiée par TEM et/ou MALS. Utilisez Schulz-Zimm sphéroïde (q0), cylindre (q-1), ou cylindre flexible (q-2) modèles. Irena fournit des outils pour l’ajustement des lois sur le pouvoir (SAS / Outilsde soutien pour les parcelles et les tables ).
      3. Dans Le modèle cntrls, sélectionnez la première population dispersée (1P) et assurez-vous qu’elle est la seule en usage (Sélectionnez la case à cocher Use?).
      4. Sélectionnez Dist taille pour le modèle et choisissez le type de distribution souhaité et le facteur de forme. Définiz les paramètres initiaux de la recherche en entrant des valeurs dans l’échelle, la taille moyenne,les champs de largeur et cliquez sur Calculer le modèle pour dessiner le facteur de forme résultant.
        REMARQUE : Le facteur de formulaire Flexible Cylinder peut être ajouté en tant que facteur de formulaire utilisateur et téléchargé à partir de https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. Les paramètres 1 et 2 correspondent respectivement à la longueur du cylindre et à la longueur de Kuhn.
      5. Une fois que des paramètres raisonnables ont été trouvés, cliquez sur Fit Model pour effectuer un modèle de moindre souad non linéaire adapté aux données. Le modèle de distribution taille donne un rayon et une largeur moyennes.
        Pour calculer l’utilisation de la polydispersité (PDI)
        Equation 5
        Comme pour toute procédure d’ajustement non linéaire, il peut être nécessaire d’ajuster la plage de données (régionq) et les paramètres de départ afin d’obtenir un ajustement stable et physiquement raisonnable.
      6. Une fois qu’un ajustement raisonnable est obtenu, enregistrez-le(Store in Notebook/Store in Folder).
    5. Ensuite, modélisez la diffusion des polymères individuels dans le noyau PCM. Cela peut être capturé par un modèle de droit du pouvoir (par exemple, q-2 pour les chaînes idéales, q-5/3 pour les chaînes gonflées, etc.). Irena met cela en œuvre à travers un modèle Beaucage43:
      Equation 6
      où P est la loi du pouvoir et G et B sont des préfacteurs.
      1. Ajuster les contrôles de données pour couvrir toute la plage q et replot le modèle (Calculer le modèle). En règle générale, la diffusion excessive sera observée dans la plage de q modérée à élevée (par exemple, q 'gt; '0.1'-1).
      2. Utilisez les contrôles de données pour sélectionner la plage q où la diffusion excessive (le modèle de facteur de forme) est observée.
      3. Ajouter une deuxième population dispersée (2P) et assurez-vous qu’il est le seul en usage (désélectionner l’utilisation? pour 1P).
      4. Sélectionnez niveau unifié pour le modèle. B et P sont les paramètres pertinents. Utilisez les outils de support de traçage ou le Fit P/B entre les csrs macro pour obtenir une première estimation de ces paramètres, et ajuster les facteurs Guinier G et Rg pour s’assurer que le modèle ne prévoit pas une diffusion excessive à faible q.
      5. En ce qui concerne le facteur de forme, effectuer un ajustement non linéaire et enregistrer les paramètres et le modèle.
    6. Ensuite, si un pic de diffraction est présent, comme dans la figure 4, ajouter un troisième modèle pour un pic de diffraction dans la gamme q d’intérêt (q - 0,22- -1 dans ce cas).
    7. Une fois que des valeurs d’ajustement approximatives sont obtenues pour les populations de diffusion individuelles, activez les trois ensemble (sélectionnez Utiliser? pour chacun) et optimisez l’ajustement combiné.
    8. Vérifiez que chaque valeur reste physiquement raisonnable. Le résultat de cette procédure devrait être un modèle composite qui décrit les données SAXS bien au-dessus d’une large gamme d’échelles de taille, comme illustré dans la figure 4. Enregistrez l’ajustement à l’aide du bouton Store in Folder pour stocker au sein d’Igor.

6. Microscopie électronique de transmission (TEM)

  1. Cryo TEM
    1. Sélectionnez la grille. Nous recommandons le film de soutien de carbone troué sur une grille standard de TEM ou de carbone de dentelle comme alternative. Dans les deux cas, les trous entre le carbone fourniront une zone d’imagerie de glace et d’échantillon vitreux pur s’il n’y aura pas de film.
    2. Placez le côté carbone de la grille vers le haut dans un appareil de déchargement de lueur sur une glissière de verre propre. Envelopper la diapositive dans un film de laboratoire peut aider à la manipulation de la grille. Évitez de toucher le centre de la grille avec une pince à épiler et pincez toujours près du bord de la grille.
    3. Exposer la grille pour 30 s.
    4. Préparer un robot de vitrification pour le dépôt de l’échantillon.
      1. Définir à 100% d’humidité et RT et ajouter du papier buvard. Préparer l’éthane liquide et les bains d’azote liquide à la base du robot. Consultez des tutoriels et des vidéos en ligne pour obtenir de l’aide supplémentaire pour la préparation et l’utilisation des robots de vitrification.
    5. Diluer l’échantillon 5x.
    6. À l’aide de la pince à épiler à action négative fournie par le robot de vitrification, prenez une grille, puis attachez les pinces au robot et déplacez les pinces dans la chambre.
    7. Dans le robot, ajouter 4 l’échantillon au côté carbone de la grille à l’aide d’une pipette à travers le trou sur le côté de la machine.
    8. Incuber pendant 4 min.
    9. À l’aide du robot, tachez les 3 à 5 s avec du papier filtre.
    10. Le robot vitrification plongera la grille dans l’éthane liquide.
    11. Retirez les pinces et déplacez la grille vers l’azote liquide et dans un contenant de stockage, qui devrait également être sous l’azote liquide. Ce processus fixe l’échantillon en une fine couche de glace vitrée. Minimisez le temps que la grille passe hors de l’éthane liquide ou de l’azote liquide pendant cette étape.
    12. Refroidir le porte-échantillons cryo à l’aide d’azote liquide. Gardez un dewar et un réservoir plein.
    13. Lorsque vous êtes prêt à l’image, chargez la grille sur le support de l’échantillon cryo. Gardez l’échantillon sous l’azote liquide ou brièvement dans la vapeur d’azote extrêmement froide juste au-dessus de la surface liquide.
    14. Imagedez la grille à 120 kV entre 75kx et 150kx dans la glace mince et épaisse, parce que les micelles de taille différente peuvent préférer une certaine épaisseur de glace.
      1. Limitez l’exposition au faisceau pour éviter de faire fondre la glace et d’endommager l’échantillon. Ne vous concentrez pas directement lorsque vous planifiez une image; se concentrer à proximité. N’exposez que la zone d’intérêt lors de la capture d’une image.
      2. Assurez-vous de différencier les gouttes d’éthane liquide de l’échantillon lorsque vous visionnez des images (voir la figure 5).
  2. TEM conventionnel utilisant la coloration négative
    1. Préparer la tache.
      1. Faire bouillir 10 ml d’eau ultrapure. Peser 0,1 g de formatur uranyl (UFo) dans un tube conique de 15 ml.
      2. Ajouter 5 ml d’eau chaude à la poudre UFo pour une solution de 2%. Fermer fermement et envelopper dans du papier d’aluminium pour bloquer la lumière. Une tache d’acétate uranyl de 1% est également couramment utilisée.
      3. Vortex ou secouer vigoureusement pendant 5 min. Attacher le tube au vortexur aidera. Filtrer à travers un filtre à seringues de 0,2 m dans un tube conique propre.
      4. Laisser refroidir 10 min à RT. Ajouter 25 'L de 5M NaOH et vortex immédiatement pendant 2 min.
        1. Alternativement, congelez 200 aliquots L de 2% UFo. Une fois prêt à l’emploi, décongeler un aliquot, ajouter 1 l de 5 M NaOH, et vortex pendant 2 min.
      5. Gardez la tache enveloppée dans du papier d’aluminium ou à l’écart de la lumière.
    2. Diluer l’échantillon 10x en 1x PBS (ou tampon désiré).
    3. Sélectionnez la grille. Nous recommandons le film de soutien au carbone sur les grilles de cuivre. Le côté plus foncé et plus brillant de la grille est le côté recouvert de carbone où l’échantillon sera déposé et taché.
    4. Placez le côté carbone de la grille vers le haut dans un appareil de déchargement de lueur sur une glissière de verre propre. Voir l’étape 6.1.2.
    5. Exposer la grille pour 30 s.
    6. Ramassez la grille avec le côté carbone toujours tourné vers le haut et maintenez avec des pinces d’action négative par le bord de la grille pour empêcher déchirer la zone d’imagerie dans le centre. Poser les pinces avec la grille toujours tenue côté carbone vers le haut.
    7. Appliquer une gouttelette d’échantillon de 4 lll l’en haut (côté carbone) de la grille à l’arme.
    8. Incuber 4 min.
    9. Avec 1 min à gauche, pipette un 10 L et une goutte de 20 L de solution UFo sur un morceau de film de laboratoire propre.
    10. Utilisez du papier filtre pour évacuer l’échantillon du bord de la grille (contact perpendiculaire) afin d’éviter tout contact avec la surface d’imagerie.
    11. À l’aide de la pince à épiler (qui tient toujours la grille), placez immédiatement le côté échantillon de la grille sur la gouttelette UFo de 10 L, puis évacuez immédiatement le liquide (étape de lavage). Il est important de ne pas laisser sécher la grille, alors ne vous arrêtez pas entre les étapes.
    12. De la même manière, appliquez la gouttelette UFo de 20 L sur la grille. Maintenez la grille sur l’UFo pendant 40 s. Mèche le liquide et laissez la grille sécher.
    13. Image de la grille sèche à 120 kV entre 20.000x et 100.000x.
    14. Assurez-vous d’éliminer correctement tous les matériaux contaminés par l’UFo en utilisant le service de sécurité de l’institution pour les déchets radioactifs.
    15. Si nécessaire, l’amélioration de la luminosité/contraste et un filtre médian peuvent être appliqués aux images TEM dans ImageJ pour réduire le bruit de fond. Le post-traitement doit être effectué uniformément, uniquement pour les images qui ne sont pas utilisées pour des mesures quantitatives telles que l’intensité, et doivent toujours être signalées.

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Representative Results

Afin d’illustrer les méthodes de caractérisation décrites ci-dessus, nous montrons des résultats typiques pour les PCM assemblés à partir d’oligonucléotides et de copolymères de bloc de différentes longueurs et chimies (Figure 1). La figure 2 fournit un exemple de la façon dont la taille du noyau PCM (déterminée à partir de SAXS et TEM, Figure 4 et Figure 5) variait en fonction de la longueur du bloc chargé. La figure 3 montre les données DLS et les résultats d’ajustement pour les PCM sphériques formés à partir de copolymères de blocs relativement longs et de courts oligonucléotides à brin unique. La figure 4 illustre comment les spectres d’intensité SAXS complexes pourraient être adaptés avec précision en combinant des modèles pour les multiples corrélations spatiales qui étaient présentes (surface externe, diffusion intra-cœur, commande inter-héliix), et comment MALS pourrait être utilisé pour étendre les mesures de diffusion à des échelles de longueur plus longues. Enfin, la figure 5 montre des données représentatives de microscopie électronique pour les MCP de morphologie variable.

Figure 1
Figure 1 : Assemblage et caractérisation des PCM à l’acide nucléique. (A) Les polymères anioniques, tels que les oligonucléotides, ont formé des complexes séparés par phase avec des régions cationiques de copolymères diblock. La présence d’un bloc neutre hydrophile (gris) a entraîné la formation de nanoparticules STABLES de PCM. (B) Les PCM étaient des nanoparticules à coquille centrale avec de multiples paramètres à caractériser. La taille globale (rayon hydrodynamique, Rh) pourrait être déterminée à l’aide de DLS, le rayon de base (Rc) pourrait être trouvé en utilisant SAXS et TEM, la taille de la couronne pourrait être calculée comme Rh-Rc, et la morphologie pourrait être déterminée sur plusieurs échelles de longueur en combinant SAXS, MALS, et TEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Dépendance à la taille de la Micelle. La taille du noyau de Micelle a été principalement déterminée par la longueur du bloc chargé du copolymère de bloc, et en grande partie indépendante de la longueur de l’homopolymère7,26. Cela permet de contrôler la taille du PCM par choix de polymère de bloc. Les données présentées ici sont pour pLys-PEG avec 88 nt/bp D’ADN et ont déjà été signalés26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Diffusion dynamique de la lumière. (A) Fonction d’autocorrélation (unités arbitraires) pour 10 nt d’ADN à brin unique et 100 pLys(100)-PEG(10k) PCM. (B) Distribution de rayon hydrodynamique (histogramme) de REPES fit. La fonction d’autocorrélation s’est désintégrée à une valeur plate avec une seule échelle de temps, résultant en un pic de taille unique dans la distribution de taille REPES. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Données sAXS et MALS représentatives et adaptées à une micelle cylindrique. Les données SAXS (cercles gris) sont affichées pour les PCM assemblés à partir de pLys(50)-PEG(5k) et 88 bp d’ADN à double brin. À un faible q (10-2 - -1),l’intensité a montré une dépendance approximativement q-2 sur le transfert d’élan, ce qui implique une forme de cylindre flexible (micelle ver-like). Les données DU MALS (cercles noirs ouverts) montrent la même dépendance, ce qui indique que les micelles mesuraient au moins plusieurs micromètres de longueur (corroborépar par l’imagerie TEM, Figure 5C,D). Les micelles sphéroïdes montreraient une dépendance plate (q0) d’intensité sur q dans cette gamme. Les lignes colorées illustrent la procédure d’ajustement multicomposante pour les données PCM SAXS décrites à la section 5. La diffusion à faible q (grandes échelles de distance) a été dominée par la surface externe du PCM, et s’adapte bien par un modèle de cylindre flexible (rouge). À des valeurs q plus élevées (échelle de longueur plus petite), la dispersion a été dominée par les polymères individuels à l’intérieur du noyau PCM, s’adapter ici par une loi de puissance (vert) avec une faible coupure q. Nous avons également observé l’emballage parallèle des hélices d’ADN à double brin dans le noyau de PCM, ayant pour résultat un pic de diffraction de quasi-Bragg (bleu). La ligne pointillée noire montre que la combinaison de ces modèles décrit avec précision les données SAXS, et l’ajout de données de diffusion de lumière (cercles ouverts) a étendu la plage de taille sur près de quatre ordres de grandeur. Les résultats d’ajustement ont donné une population de PCM avec le rayon moyen de 11,0 nm et PDI 0,03, la loi de puissance à q élevé 1,81 et le pic de diffraction représente l’espacement inter-helix de 2,71 nm. Les données SAXS ont déjà été signalées26 et sont accessibles au public44. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Images TEM de PCM d’acide nucléique. (A-B) Cryo TEM de 22 nt de l’ADN à brin unique - pLys(50)-PEG(5k) PCMs, montrant une morphologie principalement sphérique. Les flèches bleues indiquent des gouttelettes d’éthane liquides, à ne pas confondre avec les PCM (objets sphéroïdaux texturés). (A) est légèrement sous-concentré, ajoutant un léger contraste tout en préservant la résolution. (B) est largement sous-concentré, ajoutant plus de contraste, mais sacrifiant la clarté. Des ajustements de luminosité et de contraste et un filtre médian de deux pixels ont été appliqués aux deux images. (C-D) TEM taché négatif de 88 bp d’ADN à double brin - pLys(50)-PEG(5k) PCMs, qui sont de longs cylindres flexibles. Dans les deux cas, les radii de base de TEM étaient compatibles avec les valeurs obtenues à partir de l’ajustement des données SAXS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Comme mentionné ci-dessus, les protocoles présentés ici sont écrits avec un accent sur les oligonucléotides comme le composant de polyanion et pLys-PEG comme copolymère de bloc cationic-neutre, mais nous les avons testés avec une variété de polymères, tels que poly (acide acrylique), polyglutamate, et PEG-poly (vinylbenzyl trimethylammonium), et croyons qu’ils seront généralement applicables pour la plupart des couples polyélectrolyte. Un paramètre qui peut avoir besoin d’être optimisé est la concentration de sel utilisé pour l’annealing, car il devrait être assez élevé que les PCM ne se forment pas au début de l’anneale. Cela peut être vérifié expérimentalement par DLS, ou par comparaison à l’observation de la séparation de phase avec les polyélectrolytes seuls (pas de bloc neutre). L’annealing thermique peut être employé si l’annealing de sel est indésirable, bien que les polydispersities résultantes soient plus grandes7. Les concentrations utilisées pour la caractérisation peuvent également devoir être optimisées, parce que les nanoparticules plus grandes dispersent plus de lumière que les petites, et les acides nucléiques sont plus efficaces à disperser des rayons X que beaucoup d’autres polymères en raison de la présence des atomes de phosphore électron-dense dans l’épine dorsale. Il peut également être nécessaire de contrôler plus étroitement le pH du tampon si l’un ou l’autre polyélectrolyte a un pKa proche de l’état de travail.

Dans cet article, nous présentons des protocoles pour deux techniques de diffusion de la lumière (c.-à-d., multi-angle/diffusion de lumière statique et diffusion dynamique de lumière), aussi bien que la diffusion de rayon X de petit angle, et la microscopie électronique de transmission négative de cryo et de tache conventionnelle, avec des données représentatives pour chacun. Toutes les techniques ne sont pas nécessaires pour tous les scénarios, et d’autres sont disponibles ainsi, soulevant la question de savoir qui devrait être utilisé quand. La littérature d’examen abondante existe sur ce sujet45,46, mais nous suggérons ce qui suit lors de la caractérisation d’un nouveau PCM ou nanoparticule similaire. Commencez par vérifier l’agrégation, à la fois par inspection visuelle pour la turbidité et par microscopie optique. Si aucune agrégation n’est observée, l’étape suivante consiste à déterminer s’il existe des nanoparticules. DLS est un moyen rapide de déterminer cela parce que les PCM dispersent la lumière vigoureusement, et la diffusion faible ou inexistante de lumière est un indicateur fort de la formation pauvre de nanoparticules. Bien que le DLS puisse confirmer la présence de nanoparticules, il est difficile de déterminer leur taille et leur forme sans référence à d’autres données, car la plupart des méthodes d’analyse reposent sur la relation Stokes-Einstein, qui suppose des particules sphériques. MALS peut confirmer des formes sphériques (intensité normalisée plate par rapport à l’angle), mais peut ne pas être en mesure de déterminer la forme des particules non sphériques à moins que la distribution de la taille est à la fois étroite et se trouve à tomber dans la bonne plage pour la résolution. Par conséquent, nous vous recommandons d’effectuer TEM, SAXS, ou les deux sur n’importe quel échantillon de PCM afin de caractériser pleinement ses propriétés.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions Phil Griffin et Tera Lavoie de l’installation de caractérisation de la matière molle et de l’installation avancée de microscopie électronique, respectivement, à l’Université de Chicago. Nous remercions également Xiaobing Zuo et Soenke Seifert de l’Advanced Photon Source du Laboratoire national d’Argonne et du NIST Center for HiHiMaD pour leur soutien. Nous remercions Jeff Ting et Michael Lueckheide pour leur contribution à ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

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References

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Chimie Numéro 157 livraison d’acide nucléique complexe de polyélectrolytes micelle nanoparticules séparation de phase oligonucléotides
Assemblage et caractérisation des Micelles complexes polyélectrolytes
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Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

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