Summary
我们提供协议和代表性数据，用于设计、组装和描述聚电解质复合云母、由聚电解质和亲水带无电荷块共聚物形成的核心壳纳米颗粒。
Abstract
聚电解质复合云母 （PCMs），由水溶液中带电聚合物自组装而成的核心壳纳米颗粒，为探索聚电解质相互作用的物理特性提供了强大的平台，也为在体内提供治疗性寡核苷酸的紧迫问题。事实证明，为PCM建立预测结构-属性关系很困难，部分原因是在纳米粒子自组装过程中存在强大的动力学陷阱。本文讨论了为PCM结构选择聚合物的标准，并提供了基于盐退火的协议，使可重复的低多分散性纳米粒子得以组装。我们还讨论了使用光散射、小角度X射线散射和电子显微镜的PCM表征。
Introduction
当相反的带电聚电解质混合在水溶液中时，其反离子释放产生的熵增益会导致溶液被解混合成聚合物富浓缩相和聚合物耗尽的上清液1、2、3、4、5，这种现象称为聚电解质复合物。如果中性亲水区块与一种或两种聚电解质结合，则改为纳米级相分离（图1A）。由此产生的自组装芯壳纳米粒子被各种称为聚电解质复合云母（PCMs）、多离子复合云母、块离子体复合体或coacervate-core云母，通过类比到表面活性剂模细胞化，即使系统的所有成分都是亲水性6，7。PCM能够封装亲水分子，如蛋白质和核酸，以及块共聚载体结构提供的广泛可调性，使它们成为在体内8、9、10、11、12、13中传递治疗性分子的诱人候选者。
向细胞靶提供治疗性核酸是一项特别重要的挑战，PCM 具有以下几个优势。治疗核酸（遗传DNA，mRNA，和寡核苷酸，如siRNA）具有巨大的潜力，以改善人类健康，但必须克服许多生物和物理障碍，以实现潜在的14，15，16。裸核酸被血清和细胞核酸降解，迅速从循环中清除，其强烈的负电荷使它们难以在没有帮助的情况下穿透细胞膜。目前克服这些障碍的方法包括昂贵的化学改性，以防止核酸酶和/或封装成各种脂质纳米粒子，通过疏水相互作用组装15，17，18。虽然这些方法已被证明对局部注射和肝脏靶向有效，但系统使用在毒性、免疫原性和有限的生物分布方面存在显著限制16。相比之下，PCM使用核酸的负电荷在相分离的核心内冷凝它们，而中性电晕提供了防止降解的硬质屏障，以及一个平台，用于结合配体增强靶向或内化11，19。体外和动物研究表明，PCM可以有效地提供各种核酸有效载荷20，21，22，23，24，但我们预测PCM特性的能力，如大小，形状和稳定性，从成分聚合物的性质，阻碍了他们更广泛的采用。
我们小组和该领域的其他人最近的工作已经开始解决这个问题，通过开发结构-特性，在某些情况下，由核酸和各种阳离子中性聚合物7、25、26、27形成的PCM的结构-属性-功能关系。这些研究产生的两个一致主题是，为PCM组装开发控制良好、可重复的协议的重要性，以及使用多种技术来描述产生的纳米粒子的好处。多晶石，尤其是高电荷密度（如核酸）的聚电解质，相互作用非常强，在混合后似乎很容易产生动能，导致PCM制剂对程序的微小变化高度敏感，并且表现出高多分散度和多分不重复性。PCM 还已被证明采用各种形状和大小，具体取决于其组件的原子级配置，并且使用任何单独的表征技术捕获这种多样性是非常困难的，特别是因为一些常见的技术（如动态光散射 （DLS））需要对粒子形状进行假设才能进行解释。
在本文中，我们将讨论 PCM 的材料设计和选择，重点是寡核苷酸和阳离子中性二块共聚物。然后，我们描述了一个盐退火协议，该协议使用高盐浓度，然后进行缓慢的透析，以避免PCM组装过程中的动力学陷阱。聚电解质在高盐条件下混合，在静电聚光处进行筛选，然后盐浓度缓慢降低，使聚电解质进入其最有利的配置，类似于热退火的缓慢冷却过程。使用该协议，我们定期能够实现极低的多分散度和高重复性寡核苷酸PCMs7，26。最后，我们描述了如何使用四种独立的测量技术来描述从外部形态到内部结构（从外部形态到内部结构）的非常广泛的长度尺度的PCM特征：DLS、多角度光散射（MALS）、小角度X射线散射（SAXS）和透射电子显微镜（TEM）。我们希望这些协议将使更多的研究人员能够有效地探索这些有趣的纳米粒子的能力。
聚合物选择和制备
PCM 特性受到成分聚合物的物理和化学特性的强烈影响，使聚合物选择成为设计过程中的关键步骤。核酸PCM中分子结构最良好的块共聚物是线性二块，如聚（盐）-聚（乙二醇）（pLys-PEG），但五氯苯酚可以在聚电解质和各种亲水中性电荷聚合物之间形成，这些聚合物可以以高通量方式产生28。带电组的选择对电团的稳定性和云母26的形状有强烈的影响，而PCM尺寸已证明会随着带电块5、7、26的长度而增加（图2），从而使PCM特性能够适应所需应用的要求。对于线性 diblock，我们发现带电块应至少充电 10 次，并在所需的 pH 下进行强充电。较长的带电块可能促进PCM的形成与寡核苷酸，如siRNA，这是很难复杂与较短的块21。我们已经成功地观察到了块长度达200的PCM形成，文献描述了更长的聚合物。在选择中性块24时，具有更大的灵活性，但经验表明，极短的中性块会导致聚合而不是纳米粒子的形成，最小中性长度随带电块长度的增加而增加。对于 pLys-PEG，PLYs 长度低于 +50 时至少需要 3，000 到 5，000 的 PEG MW，并且随着带电块的进一步增加，需要更长的长度。由于中性聚合物的块状拥挤，中性块长度的增加导致 PCM 尺寸增加，尤其是壳体厚度。
本手稿提供了一个协议，用于从冻干高纯度PLys-PEG和已知数量的寡核苷酸制备PCM，但也应易于适应其他系统。我们已经成功地用几种带电多肽，包括聚精氨酸和聚谷氨酸，以及几种合成聚电解质，如聚丙烯酸和聚苯乙烯（乙烯基三甲基胺）。我们还描述了制备具有聚电解质电荷的化学计量比的PCM，但这很容易修改。我们发现在电荷浓度单位（c.c.）中工作是最容易的，该单位也自然地容纳了未充满电的聚合物。如果任一聚合物的特性不良好，应注意准确确定聚合物长度/质量，并确保超过透析电荷中和所需的过量盐。在计算浓度时，也应说明任何保留水的存在。核酸浓度可以通过260nm的吸光度方便地量化，在计算c.c时应考虑终端磷酸盐的存在或不存在。
当使用寡核苷酸作为聚苯乙烯时，杂交状态和化学结构有助于确定自组装的倾向和产生的PCM5、7、26的特性。如果使用 PCM 进行交付，在生物功效要求范围内优化这些结构将增加形成所需结构的可能性。分析杂交的有用工具包括用于核酸的MATLAB函数、NUPACK29和IDT OligoAnalyzer。我们建议分析候选序列，以了解在发夹形成中绑定到 1 本身的强度;2） 同一序列的另一个副本（自二分法）;和3）到系统中存在的其他寡核苷酸。DNA和RNA的熔融温度也可用于使用最近邻法30，31计算。核酸的热退火（步骤2.3）使单个核苷酸中的任何残余二级结构变性，并促进平衡折叠。
PCM 特征和分析
纳米粒子的特征技术范围广泛，包括静态和动态光散射、电子或中子的小角度散射和电子显微镜。在本文中，我们提供了两种光散射技术、小角度X射线散射和两个电子显微镜技术的协议。
DLS测量散射强度中的时间波动与样品布朗运动在一个角度的自相关。拟合此数据可为球形云母提供流体动力学半径和多分散度（图3）。多角度光散射 （MALS） 以多个角度测量静态散射强度。这种角度依赖性描述纳米粒子的形状，但可见光的长度范围大于 ±50 nm，这限制了其对较小纳米粒子的有效性。这两种技术都基于折射率不匹配，主要描述纳米粒子的外部尺寸。
小角度 X 射线散射 （SAXS） 使用 X 射线作为散射探头，其较短的波长允许在 ±0.1~100 nm 范围内进行测量。拟合观察到的散射强度与角度（通常表示为动量传递q）可提供有关 PCM 形态（即大小和形状）以及内部结构的信息。如果提供绝对强度校准，并且散射强度可以外推为零角，PCM 质量和聚合数也可以估计为32，使 SAXS 成为一种用途极其广泛且有价值的方法。小角中子散射（SANS）在类似的长度尺度范围内是敏感的，但仅在专门设施中可用，并且不会在本条第33、34、35条中明确讨论。
近年来，台式 SAXS 仪器的出现，但我们发现同步加速器源更适合 PCM 表征，因为它们的较高强度使得这些低对比度样品的数据收集速度更快。我们提供一个简短的协议，从用户的角度在高级光子源（美国阿贡国家实验室）的Beamline 12-ID-B获取PCM SAXS数据。该协议应适用于大多数同步辐射源，但强烈建议在提出实验之前咨询当地工作人员。我们还提供了一个数据缩减和分析协议，使用Irena36，一套为Igor Pro编写的免费宏。Irena 包括一组用于对 SAXS 数据建模的通用外形规格，并允许构建能够描述 PCM 复杂散射剖面的多组件模型（参见代表性结果，图 4）。Irena 还提供全面的文档和教程在线。在尝试以下过程之前，我们建议熟悉这些过程，特别是教程"具有两个主要散射群体的 SAXS 数据的建模"。
辐射损伤是X射线散射的一个关注点，但可以采用多种措施将其最小化。特别是，我们建议使用带注射器泵和 PCM 样品在数据采集过程中流动的流细胞设置，而不是密封毛细管。这也大大简化了背景减法。我们还建议对流动样品进行多次接触，而不是进行较长的接触，以限制任何单个样本的通量，并允许对比接触数据，以识别任何损坏。
与一般需要进行精密解释的散射技术不同，透射电子显微镜（TEM）通过电子束穿过样品并将图像投射在闪烁屏幕上，从而提供了纳米粒子的真实空间视觉图像（图5）。在本文中，我们将介绍两种 TEM 技术的协议。Cryo TEM 将云母样品冻结成薄薄的葡萄冰层，用最少的异物保持结构构象，最适合云母的半径±10-100 nm。负污渍 TEM 在样品在网格表面干燥后，使用重金属盐（如铀）来环绕样品。致密的污渍会比样品散射更多的电子，从而增加对比度并产生样品的负图像。对于高质量图像，建议使用 Cryo TEM。但是，它的成本更高、耗时，并且可能无法提供足够的对比度。当这是一个问题时，应使用负染色样品。每个示例如图5所示。
每种技术都报道了纳米粒子的略有不同的方面，具有不同的强度和局限性。光散射是现成的，并且通常是最快的方法，但在大小和形状分辨率方面有很大的限制。SAXS 可以在相当高的吞吐量下在较大范围内提供信息，但需要专门的设备来获取数据，以及建模来解释数据。TEM 图像易于解释，但对比度可能有限，而且吞吐量较低。我们的经验表明，使用多种技术进行表征，可大大增加可获得的有关 PCM 属性的信息，并简化了仅从每个数据集中获取的数据集的解释。例如，SAXS 和 TEM 主要检查 PCM 的致密核，而光散射报告纳米粒子的整体尺寸。因此，结合它们可以测量核心和电晕大小。TEM 获取真实空间图像的能力可以提供地面真实数据，以便选择适当的外形规格来建模可能不明确的 SAXS 数据。本文介绍了所有四种技术的协议，并在"讨论"部分中给出了使用它们来描述未知示例的示例过程。
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Protocol
1. 材料准备
- 称重冻干二块聚合物，并添加水到接近10mg/mL最终浓度的库存溶液所需的体积。最大速度为 2 分钟。
- 声波5分钟。非常长的二块可能需要额外的声波。库存解决方案应完全透明且均匀。
- 根据需要使用 NaOH 或 HCl 将 pH 调整到 7.4。将水添加到最终体积中。pLys-PEG溶液相当稳定，但应冷藏以进行长期储存，使用前必须检查pH值。冻血比冷冻更可取。
- 在所需的库存浓度下重新悬浮冻干寡核苷酸，通常为长度为 50 nt 或以下的 2~5 mM 分子浓度。涡旋彻底，以确保完全溶解。
- 使用分子量或长度计算摩尔浓度，如导言中所述。
- 计算摩尔电荷浓度（c.c.），其中
聚电解质电荷是带电单体的数量，而核酸电荷是基数减去1，假设没有磷酸化。请记住，双链DNA与单链DNA相比，每个分子的电荷是单链DNA的两倍。
- 为每个聚合物在 20 mM c.c. 下创建稀释的库存。
2. 核酸聚电解质米切尔制剂
- 在 1.5 mL 微离心管中，将以下体积混合到 280 μL 的总体积：
- 200 μL 无核酸酶水（不含核酸的 PCM 的超纯水）。
- 40 μL 的 10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS， 137 mM 氯化钠， 10 mM 磷酸盐， pH 7.4 当稀释到 1x） 或其他合适的缓冲液37.
- 40 μL 的 20 mM c.c. 寡核苷酸。对于双链寡核苷酸，在 20 mM c.c.
- 在70°C下孵育寡核苷酸溶液5分钟。如果寡核苷酸的计算熔融温度较高，温度应相应升高。请注意，RNA在高温下会降解，因此如果存在此或其他敏感成分，此步骤不应更长。
- 冷却15分钟，加入40 μL的20 mM c.c.diblock，然后以最大速度立即涡旋20秒。在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
- 执行盐退火。
- 加入80 μL的5M氯化钠，最终浓度为1M NaCl，最终体积为400μL。最大速度为 10 s 的涡流。
- 在室温下孵育10分钟，然后装入透析盒。请注意，列出的分子量截止点是确定球状蛋白的，对于线性聚合物来说则不准确。我们发现，2k MWCO 墨盒可避免样品损耗，并可使离子强度逐渐发生变化。
- 准备透析浴。
- 计算所需的透析浴量：
- 将 10x PBS（或其他所需缓冲液）、5 M NaCl 和超纯水混合，用于 1x PBS 和 0.5M NaCl 的最终解决方案，以及两个 1x PBS 解决方案。
- 计算所需的透析浴量：
- 加载透析盒。
- 用永久标记标记墨盒。将墨盒浸泡在缓冲液中至少 2 分钟，以滋润膜。
- 逆时针旋转，取下盖子。使用凝胶加载移液器尖端加载样品。通过轻轻挤压膜去除多余的空气。更换盖。
- 将墨盒放入 1x PBS，0.5 M 氯化钠透析浴。墨盒应浮动，两个膜都暴露在浴缸中。如果需要，可以使用泡沫浮子。
- 透析
- 用磁搅拌棒缓慢搅拌24小时。
- 将墨盒移到 1x PBS 或其他所需工作缓冲液的新槽中。孵育24小时，用磁力搅拌棒缓慢搅拌。重复此步骤。
- 恢复示例。
- 从浴缸中取出墨盒。使用凝胶加载移液器尖端取下盖子并回收样品。请注意，由于膜肿胀，恢复的体积可能高于初始的 400 μL。记录恢复的体积，如果轻微的稀释是一个问题。
- 将样品放入干净的1.5 mL微离心管中。以这种方式制备的PCM在冷藏时应稳定数月，但须避免核酸化污染。
3. 动态光散射
- 为确保无尘条件，应仔细过滤缓冲液（通过 0.22 μm 注射器或真空过滤器过滤 3x）和样品之间彻底清洁玻璃器皿。在进行测量之前，确保样品达到热平衡也很重要。
- 将 PCM 样品稀释至 0.2 mM c.c.c.（如果使用上述协议，则为 10 倍），并加载到合适的比色皿中。我们使用小体积的比色皿，稀释后需要±200 μL的样品。
- 将 DLS 探测器位置设置为 90°。
- 调整激光功率和/或衰减器，以便计数速率为每秒 100，000-200，000 计数 （cps），如果可能。可以使用低至 10 kcps 的计数速率，但可能需要延长测量时间才能获得良好的统计信息（步骤 4.1）。应避免较高的计数速率，因为多重散射会混淆测量。
- 获取数据 1 分钟。计数速率在整个采集时间中应保持不变;否则，这表明样品或仪器的某些成分尚未平衡。
- 检查自相关数据。长期基线应非常平坦，自相关曲线应平滑，散射最小，如图3A所示。基线漂移表示缺乏平衡，通过获取更多数据可以改善数据中的噪声。
- 拟合自相关函数。
- 使用 REPES38，39执行正则逆拉普兰变换，以提供松弛时间和扩散系数 D 的分布。然后，此方法使用斯托克斯-爱因斯坦方程计算流体动力学半径Rh：
图 1B显示了 Rh的表示形式，图 3B显示了 REPES 的结果。 - 或者，使用其他方法，包括 CONTIN40、41（替代正则化算法）或非负最小二乘拟合 （NNLS）。来自多个拟合方法的一致结果是高质量数据的签名。请注意，cumulant 分析（许多仪器的标准）为多模式尺寸/长度分布提供了非物理值。
- 使用 REPES38，39执行正则逆拉普兰变换，以提供松弛时间和扩散系数 D 的分布。然后，此方法使用斯托克斯-爱因斯坦方程计算流体动力学半径Rh：
4. 多角度光散射
注：光散射强度与角度可以在各种仪器上测量。采用基于测位计的仪器和多检测器仪器，在批量模式下运行，取得了良好的效果。
- 调整 PCM 浓度和照明强度，以在所有角度提供足够的信号/噪声，而仅缓冲样品，而不会使任何探测器饱和。后者可以通过在各种稀释因子下制备样品并检查强度与浓度的线性度（假设 PCM 之间的相互作用最小）进行测试。
- 记录光散射率从 15° 到 135°，每个角度 1 分钟。如果样品和仪器正确平衡，散射速率将在测量时间内保持不变。
- 绘制规范化散射速率，iin（*），与q，其中I是散射速率。q是散射矢量（光子动量传输），由
其中 [ ] 溶剂折射率， = 测量角度， 和 + = 光源的波长。图 4显示了 MALS 散射强度图。
5. 小角度X射线散射
- 数据采集
- 以2 mM电荷浓度为寡核苷酸PCM制备PCM样品，以便充分散射背景以上。对于缺乏重原子的五氯苯酚（例如核酸中的磷），可能需要更高的浓度。散射长度密度可以用计算器（如SASSIE42）来估计。
- 为了通过清除自由基来尽量减少辐射损害，从浓缩的甘油中加入甘油（例如，50%）库存溶液，使米特尔溶液包含1%（v/v）甘油。请注意，整洁的甘油是高度粘性，难以准确测量。强烈建议用水或缓冲液稀释。
- 准备大量工作缓冲液，其中含有 1% 的甘油，用作背景监视器。
- 准备光束线专用流单元装置并校准探测器。该协议使用一个直径为 3 mm 的石英毛细管连接到计算机控制的注射器泵，其直径较小，聚乙烯管长度最小。此设置需要每个样品的最小体积 ±140 μL。
- 确定样品曝光参数。最佳曝光会因光束强度、探测器灵敏度以及样品的浓度、散射强度和损伤易感性而异，但目标是将样品暴露在所需的最小通量下，以获得足够远射强度（在q感兴趣的范围内）。
- 对于寡核苷酸/pLys-PEG PCM，以 1 Hz 重复率进行 30x 0.2 s 的曝光可产生良好的数据质量，几乎没有可察觉的损害。对于新示例，以下过程可能会有所帮助：
- 在浓度范围内制备 PCM 样品（例如，10~10，000 μM c.c.）。
- 从中间浓度开始，交替PCM和仅缓冲样品，接触时间不同。有关数据采集和减少过程，请参阅下文。样本信号应具有良好的统计（小统计误差，或平滑变化跨越q）。如果统计数据不佳，暴露时间可能会增加。
- 样本信号也应在感兴趣的q范围内与背景明确区分。计算和绘制（信号+背景）/背景比与q，以确定信号/背景比。如果信号/背景比较低，应提高样品浓度。
- 通过获取浓度较高和较低浓度的数据，验证散射强度（归为浓度）是否独立于样品浓度，并根据需要缩放暴露时间。粒子间相互作用（最可能导致浓度依赖的原因）在低q范围内最为明显。
- 获取 PCM 样品和背景的数据（即使用甘油缓冲液）。
- 触发注射器泵，将样品移过毛细管。双向或一次运动是可以接受的，但应小心分离每个样品（例如，通过在样品之间插入气泡）。样品可以回收，如果没有发现辐射损伤，可以重复使用。
- 一旦流启动，触发上述 X 射线曝光和数据采集程序。应注意光束暴露在流体流动结束之前结束。
- 在每个样本之后，执行阿齐木塔尔平均，并绘制每个曝光的 1D 轮廓（即强度与q）。在统计误差内，它们应该相同。随时间变化的信号可能表示辐射损坏。
- 孤立的异常型材可能表示存在微气泡。如果经常观察到气泡，降低流速可能会有所帮助。
- 平均 1D 散射剖面。
- 频繁获取仅缓冲样本的数据（每 4⁄5 个 PCM 样本一次），并随着时间的推移进行比较。仅缓冲液样品发出的信号增加表明毛细管可能受到辐射损坏的样品的污染。
- 当发现污染时，用漂白剂清洗毛细管，并尽可能减少暴露时间。
- 使用 Irena 减少数据和分析
- 导入云母和后台 ASCII 数据集 （SAS/数据导入和导出/导入 ASCII SAS 数据）。
- 从样本数据中减去背景散射。通常，最高q值（例如q > 0.5）显示来自主导信号的溶剂的不相干散射。在此q范围内缩放背景数据以匹配样本数据可消除由于光束强度变化和样品浓度而导致的任何变化。
- 在日志比例上一起绘制示例和背景。验证高q （SAS/数据操作/数据操作 I） 的平坦强度 。计算采样/背景比（Data1/Data 2）， 在线性对数尺度上绘图， 并验证高q amptote.
- 计算此q范围内的平均（示例/背景）比率（使用自定义宏或将数据浏览器复制/粘贴到电子表格中）。
- 使用"数据操作"宏，使用上面计算的比率缩放背景（例如修改数据 2），并将背景减去信号与背景信号与背景（[Data1-Data2]/Data2）的比率绘制，验证它现在在高q时将无症状地归零。记录此比率;每个样本的 1.0 应为 <1-2%。
- 绘制背景减去信号 （Data1-Data2） 与q，用新名称保存数据。不要覆盖原始数据。
- 如果高q数据不可用，请使用缩放因子 1 进行背景减法，但请注意，在信号/背景比较小的q范围内可能会引入不准确的值。
- 打开建模宏（SAS/建模），然后加载和绘制背景减去的数据（数据cntrls/Add数据）。不要在此宏中缩放。
- 首先，查找 PCM 外部表面的近似模型（云母尺寸/形状）：
- 在数据 cntrl中，选择低到中度q范围（例如，±0.003+-1
-1）。 如果振荡是可见的，请包括它们。
- 选择适合数据的外形规格。低q的斜率表示纳米粒子形状，也可通过TEM和/或MALS进行验证。使用舒尔茨-齐姆球形 （q0）， 气缸 （q-1） 或柔性气缸 （q-2） 模型.Irena 提供用于拟合电源法的工具 （用于绘图和表格的 SAS/支持工具）。
- 在"模型 cntrls"中，选择第一个散射总体（1P），并确保它是唯一正在使用（选择"使用？ "复选框）。
- 为"模型"选择"大小"，然后选择所需的分布类型和外形规格。通过在"比例"、"平均大小"和"宽度"字段中输入值来设置搜索的初始参数，然后单击"计算模型"以绘制生成的外形规格。
注：灵活的气缸外形可以添加为用户外形规格，并从https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena下载。参数 1 和 2 分别对应于气缸的长度和库恩长度。 - 找到合理的参数后，单击"拟合模型"以执行与数据拟合的非线性最小二乘。大小分布模型提供平均半径和宽度。
计算多分散度 （PDI） 使用
与任何非线性拟合过程一样，可能需要调整数据范围（q区域）和起始参数，以获得稳定、物理上合理的拟合。 - 一旦获得合理的拟合，保存它 （存储在笔记本/存储在文件夹中）。
- 在数据 cntrl中，选择低到中度q范围（例如，±0.003+-1
- 接下来，对 PCM 核心内单个聚合物的散射进行建模。这可以通过电源法模型捕获（例如，用于理想链的q-2、用于膨胀链的q-5/3等）。Irena 通过 Beaucage 模型43实现此 ：
其中 P 是权力定律，G 和 B 是先决条件。- 调整数据控件以覆盖整个q范围并重新绘制模型 （计算模型）。通常，在中到高q范围内（例如，q > ±0.1 +-1） 中观察到过度散射。
- 使用数据控件选择观察到过度散射（>10x 外形模型）的q范围。
- 添加第二个散射总体（2P），并确保它是唯一在使用 （取消选择使用？ 1P）。
- 选择模型的统一级别。B 和 P 是相关参数。使用绘图支持工具或csrs 宏之间的拟合 P/B来获取这些参数的初始猜测，并调整 Guinier 因子 G 和 Rg以确保模型不会预测在低q处过度散射。
- 对于外形尺寸，执行非线性拟合并记录参数和模型。
- 其次，如果存在衍射峰值（如图 4所示），则在q感兴趣的范围内为衍射峰添加第三个模型（在这种情况下，q = ±0.22 =-1）。
- 一旦为单个散射种群获得近似拟合值，将所有三个组合打开（为每个点选择"使用？"），并优化组合拟合。
- 检查每个值在物理上保持合理。此过程的结果应该是一个复合模型，该模型在较大的大小尺度上很好地描述了 SAXS 数据，如图4所示。使用"文件夹中的存储"按钮保存适合，以存储在 Igor 中。
6. 透射电子显微镜 （TEM）
- 克里奥·特姆
- 选择网格。我们建议在标准 TEM 网格上采用孔状碳支撑膜或蕾丝碳作为替代方案。在这两种情况下，碳之间的孔将提供纯冰和样品的成像区域，没有薄膜。
- 将网格碳侧向上放在一个发光装置中，放在干净的玻璃幻灯片上。在实验室薄膜中包裹幻灯片有助于网格处理。避免用钳子触摸网格中心，并始终在网格边缘附近捏合。
- 公开网格 30 s。
- 准备一个用于样品沉积的硝化机器人。
- 设置为 100% 湿度和 RT 并添加印迹纸。在机器人底座上准备液体伊森和液氮浴。有关天化机器人准备和使用的其他帮助，请参阅在线教程和视频。
- 稀释样品5倍。
- 使用与压化机器人一起提供的负动作钳子，拾起一个网格，然后将钳子连接到机器人，然后将钳子移到腔室中。
- 在机器人中，使用移液器通过机器侧面的孔将 4 μL 样品添加到电网的碳侧。
- 孵育4分钟。
- 使用机器人，用滤纸吸3~5s。
- 硝化机器人会将网格注入液体的电义。
- 取出钳子，将电网移至液氮和储存容器中，容器也应在液氮下。此过程将样品固定成薄薄的一层冰。在此步骤中，尽量减少电网从液体伊森或液氮中花费的时间。
- 使用液氮冷却低温样品架。保持德瓦尔和水库满。
- 准备好成像时，将网格加载到低温样品架上。将样品保存在液氮下或短暂地保存在液体表面正上方的极冷氮蒸汽中。
- 在薄而厚的冰中，在 75kx 和 150kx 之间以 120 kV 的电网图像，因为不同大小的云母可能更喜欢一定的冰厚度。
- 限制光束暴露，以避免融化冰和损坏样品。不要直接聚焦到规划的想象中;焦点附近。仅在捕获图像时公开感兴趣的区域。
- 查看图像时，务必从样品中区分液体伊森液液滴（参见图 5）。
- 使用负染色的传统 TEM
- 准备污渍。
- 沸腾±10 mL的超纯水。将 0.1 g 乌兰醇 （UFo） 称重到 15 mL 锥形管中。
- 将 5 mL 的热水添加到 UFo 粉末中，获得 2% 的溶液。紧闭并包裹在铝箔中，以阻止光线。1% 的醋酸酯染色也常用。
- 涡旋或剧烈摇动5分钟，将管子紧固到涡旋器将有帮助。通过 0.2 μm 注射器过滤器过滤到干净的锥形管中。
- 让冷却 10 分钟到 RT.加入 25 μL 的 5M NaOH 和涡流 2 分钟。
- 或者，冻结 200 μL 等分 2% UFo。准备使用时，解冻等分，加入1 μL的5M NaOH，涡旋2分钟。
- 保持污渍包裹在铝箔或远离光线。
- 在 1x PBS（或所需的缓冲液）中稀释样品 10 倍。
- 选择网格。我们建议在铜网上使用碳支持膜。网格较暗、较亮的一侧是碳涂层的一侧，样品将在那里沉积和染色。
- 将网格碳侧向上放在一个发光装置中，放在干净的玻璃幻灯片上。请参阅步骤 6.1.2。
- 公开网格 30 s。
- 拾起碳侧仍然朝上，并在网格边缘用负作用钳保持，以防止撕裂中心的成像区域。放下网格仍然保持碳的钳子。
- 使用移液器将 4 μL 样品滴涂抹到网格的顶部（碳侧）。
- 孵育4分钟
- 在还剩 ±1 分钟时，将移液器移移 10 μL 和 20 μL UFo 溶液滴到一块干净的实验室薄膜上。
- 使用滤纸从网格边缘（垂直接触）对样品进行芯，以避免与成像表面发生任何接触。
- 使用钳子（仍然握住网格），立即将网格的样品侧放在 10 μL UFo 液滴上，然后立即从液体上芯下来（洗涤步骤）。重要的是不要让电网干燥，所以不要停在台阶之间。
- 以类似方式，将 20 μL UFo 滴到网格中。将 UFo 上的网格保持 40 s.将液体关闭，让电网干燥。
- 以 120 kV 的干电网在 20，000x 和 100，000x 之间成像。
- 请务必使用该机构的放射性废物安全服务，妥善处理所有受 UFo 污染的材料。
- 必要时，可在 ImageJ 中的 TEM 图像上应用亮度/对比度增强和中值滤波器，以减少背景噪声。后处理应统一完成，只对未用于定量测量（如强度）的图像进行，并且应始终报告。
- 准备污渍。
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Representative Results
为了说明上述特性方法，我们展示了从寡核苷酸和块共聚物中组装的各种长度和化学成分的PCM的典型结果（图1）。图 2 提供了 PCM 核心尺寸（根据 SAXS 和 TEM 确定，图 4和图 5）如何随带电块长度变化的示例。 图3显示了由相对长块共聚物和短单链寡核苷酸形成的球形PCM的DLS数据和拟合结果。图 4说明了如何通过组合存在多个空间相关性（外部表面、核心内散射、螺旋间排序）的模型来精确拟合复杂的 SAXS 强度光谱，以及如何使用 MALS 将散射测量扩展到较长的长度刻度。最后，图5显示了不同形态的PCM的代表性电子显微镜数据。
图1：核酸PCM的组装和表征。（A） 阴离子聚合物，如寡核苷酸，与二聚糖共聚物的阳离子区形成相分离复合物。亲水中性块（灰色）的存在导致形成稳定的PCM纳米粒子。（B） PCM 是核心壳纳米粒子，具有多个参数表征。使用DLS可以确定整体大小（流体动力学半径，Rh），核心半径（Rc）可以使用SAXS和TEM，电晕大小可以计算为Rh-Rc，形态可以通过结合SAXS、MALS和TEM在多个长度尺度上确定。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：米切勒大小依赖。Micelle核心尺寸主要取决于块共聚物的带电块的长度，并且基本上与同聚物7、26的长度无关。这允许通过选择块聚合物来控制 PCM 尺寸。此处显示的数据是带有 88 nt/bp DNA 的 pLys-PEG，之前已报告26。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：动态光散射。（A） 自相关函数（任意单位）用于 10 nt 单链 DNA + pLys（100）-PEG（10k） PCM。（B） 从 REPES 拟合的流体动力学半径分布（直方图）。自相关函数衰减为具有单个时间刻度的平坦值，从而在 REPES 大小分布中产生单个大小峰值。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：代表性 SAXS 和 MALS 数据，适合圆柱形云母。SAXS 数据（灰色圆圈）显示从 pLys（50）-PEG（5k） 和 88 bp 双链 DNA 组装的 PCM。在低q （< 10-2 +-1）时，强度显示大约q-2依赖于动量传递，这意味着一个灵活的圆柱形（蠕虫状的云母）。 MALS数据（打开的黑色圆圈）显示了相同的依赖性，表明云母的长度至少有几微米（由TEM成像证实，图5C，D）。在这个范围内，球形云母会显示对q的扁平依赖性（q0）。彩色线条说明了第 5 节中描述的 PCM SAXS 数据的多组件拟合过程。低q（大距离刻度）的散射由 PCM 的外部表面主导，并且由灵活的气缸模型（红色）很好地拟合。在较高的q值（较小的长度尺度）下，散射由 PCM 核心内的单个聚合物主导，此处由低q截止的功率定律（绿色）适合。我们还观察到PCM核心内双链DNA螺旋的平行包装，导致准布拉格衍射峰（蓝色）。黑色虚线显示，结合这些模型准确地描述了 SAXS 数据，而光散射数据（开放圆）的添加将大小范围扩展到了近四个数量级。拟合结果给出平均半径为 11.0 nm 和 PDI = 0.03 的 PCM 总体，高q时的功率定律 = 1.81，衍射峰值表示 2.71 nm 的螺旋间间距。SAXS 数据之前已报告26，并公开提供44。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：核酸PCM的TEM图像。（A+B）22 nt 单链DNA的Cryo TEM = pLys（50）-PEG（5k）PCM，主要显示球形形态。蓝色箭头表示液体伊森液液滴，不要与 PCM（纹理球形对象）混淆。（A） 稍微不太集中，在保持分辨率的同时增加了轻微的对比度.（B） 明显不够集中，增加了对比度，但牺牲了清晰度.对两种图像应用了亮度和对比度调整以及两像素中值滤镜。（C-D）负染色 TEM 88 bp 双链 DNA + pLys（50）-PEG（5k） PCM，这是长柔性气缸。在这两种情况下，来自 TEM 的核心半径都与从拟合 SAXS 数据中获得的值一致。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
如上所述，本文提出的协议以寡核苷酸作为聚烷基成分和pLys-PEG作为阳离子中性块共聚物，但我们用各种聚合物，如聚（丙烯酸）、聚谷氨酸和PEG-Poly（乙烯基苯基三甲基铵）进行了测试，并相信它们通常适用于大多数聚电解质对。可能需要优化的一个参数是用于退火的盐浓度，因为它应该足够高，以至于 PCM 在退火开始时不会形成。这可以通过DLS进行实验检查，或者与仅用聚电解质（无中性块）观察相分离进行比较。如果盐退火不可取，可以使用热退火，尽管由此产生的多分散性较大7。用于表征的浓度可能也需要优化，因为较大的纳米粒子比小粒子散射更多的光，并且核酸在散射X射线方面比许多其他聚合物更有效，因为骨干中存在电子致密磷原子。如果任一聚电解质的 pKa 接近工作状态，则可能需要更密切地控制缓冲液的 pH。
在本文中，我们提出了两种光散射技术（即多角度/静态光散射和动态光散射）和小角X射线散射，以及低温和常规负染色传输电子显微镜的协议，每种技术都有代表性的数据。并非所有技术都是所有方案所必需的，其他技术也可用，这就提出了何时应采用的技术问题。关于这个主题的文献文献很多，但我们建议在描述新的PCM或类似的纳米粒子时遵循以下要求。首先检查聚合，通过目视检查浊度和光学显微镜。如果未观察到聚合，则下一步是确定是否存在任何纳米粒子。DLS 是确定这一点的快速方法，因为 PCM 大力散射光，弱光或不存在的光散射是纳米粒子形成不良的有力指标。虽然DLS可以确认纳米粒子的存在，但很难确定其大小和形状而不参考其他数据，因为大多数分析方法依赖于斯托克斯-爱因斯坦关系，后者假定球形粒子。MALS 可以确认球形形状（平面标准化强度与角度），但可能无法确定非球面粒子的形状，除非尺寸分布较窄且恰好落在正确的分辨率范围内。因此，我们建议在任何 PCM 样品上执行 TEM、SAXS 或两者，以便完全描述其特性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们分别感谢芝加哥大学软物质特征处理设施和高级电子显微镜设施的菲尔·格里芬和泰拉·拉沃伊。我们还感谢阿贡国家实验室和NIST分层材料设计中心（CHiMaD）高级光子源的左小兵和森克·塞弗特的支持。我们感谢杰夫·丁和迈克尔·吕克海德对这项工作的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 mm circle filter paper | Whatman | 1001-070 | Filter paper for wicking during grid prep |
| Carbon Film TEM grid | Electron Microscopy Sciences | CF200-Cu | TEM grid |
| DAWN | Wyatt Technology | DAWN | MALS instrument |
| DNA oligonucleotide | Integrated DNA Nanotechnologies Inc | Custom oligonucleotide | |
| Lacey Carbon TEM grid | Electron Microscopy Sciences | LC200-Cu | TEM grid |
| Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 | Alamanda Polymers Inc | mPEG5K-b-PLKC50 | Example block copolymer |
| Milli-Q | Millipore Sigma | Ultrapure water | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | For measuring nucleic acid concentration | |
| negative-action tweezers | Dumont | N7 | Tweezers for grid preparation |
| Parafilm "M" | Bemis Company Inc | PM996 | Laboratory film |
| Quantifoil Holey Carbon TEM grid | Electron Microscopy Sciences | Q210CR1.3 | TEM grid |
| Research Goniometer and Laser Light Scattering System | Brookhaven Instruments | BI-200SM | DLS/MALS instrument |
| Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL | Thermo Scientific Pierce Protein Biology | 87723 | Dialysis cartridge |
| small volume cuvette | Brookhaven Instruments | BI-SVC | Cuvette for DLS/MALS |
| Solarus 950 Advanced Plasma System | Gatan | Solarus 950 | Plasma system for TEM grids |
| Talos TEM | FEI | Talos | TEM used for cryo samples |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | Spirit | TEM used for dry samples |
| Uranyl Formate | SPI-Chem | 16984-59-1 | For negative staining samples for TEM |
| Vitrobot | FEI | Vitrobot | Vitrification robot for cryo grid preparation |
References
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