Chemistry

הרכבה ואפיון של מטלות מורכבות פוליאלקטרוליט

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894

Alexander E. Marras¹, Jeffrey R. Vieregg¹, Matthew V. Tirrell¹

¹Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

אנו מספקים פרוטוקולים ונתונים מייצגים עבור עיצוב, הרכבה, ואפיון מיקרו מורכבות מורכבים, חלקיקים ליבה פגז שנוצרו על ידי פוליאלקטרוליטים וטעונה הידרופילי מחויב לחסום הסופולימרים.

Abstract

מיקרואלקטרוליטים מורכבים (PCMs), ליבה פגז חלקיקים נוצר על ידי הרכבה עצמית של פולימרים טעונים בתמיסה מימית, לספק פלטפורמה רבת עוצמה לחקור את הפיסיקה של אינטראקציות פוליאלקטרוליט וגם להציע פתרון מבטיח הבעיה הדחופה של העברת הטיפול הרפואי בvivo. פיתוח מבנה חזוי-קשרי גומלין עבור PCMs הוכיחה קשה, בין השאר בשל נוכחותם של מלכודות קינטי חזקים במהלך ננו-חלקיק self-הרכבה. מאמר זה דן בקריטריונים לבחירת פולימרים עבור בניית PCM ומספק פרוטוקולים המבוססים על ריפוי מלחים המאפשרים הרכבה של חלקיקים מתאפשרים לשחזור, בעלי מבנה מצומצם. אנו דנים גם באפיון PCM באמצעות פיזור אור, פיזור של קרני רנטגן קטנים ומיקרוסקופ אלקטרוני.

Introduction

כאשר הפוליאלקטרוליטים טעונים בהחלט מעורבים בתמיסה מימית, הזכות באנטרופיה משחרור היונים הנגדיות שלהם גורמת לביטול הפתרון לשלב צפוף של פולימר ומרוקן-על-פי הפולימר¹^,²^,³^,⁴^,⁵, תופעה הידועה בשם polyelectrolytes complexation. אם בלוק הידרופילי נייטרלי מופיע לאחד או לשני הפוליאלקטרוליטים, הפרדת הפאזה הננו מתרחשת במקום (איור 1א). חלקיקי הליבה-פגז שנוצר כתוצאה מכך מכונים באופן שונה מיקרואלקטרוליט מורכבים (pcms), polyion מורכבים מיקרולים, לחסום את מכלולי מתחמי, או מרכיבי הליבה של מיקרו-ליבה על ידי אנלוגיה כדי למנוע, למרות כל הרכיבים של המערכת הם ידרופילי⁶^,⁷. היכולת של PCM לכמס מולקולות הידרופיליות כגון חלבונים וחומצות גרעין, כמו גם את היכולות הנרחבות המוצעות על ידי ארכיטקטורת המנשא של בלוק סופולימר הופכת אותם למועמדים אטרקטיביים לאספקת מולקולות טיפוליות ב vivo⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³.

אספקת חומצות גרעין טיפולית למטרות סלולריות הוא אתגר חשוב במיוחד, ואחד אשר PCMs להציע מספר יתרונות. חומצות גרעין תרפויטי (דנ א גנטי, mrna, ו פורוזימטר כגון sirna) יש פוטנציאל עצום לשיפור בריאות האדם, אבל חייב להתגבר על חסימות ביולוגיות ופיזיות רבות כדי להבין כי פוטנציאל¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. חומצות גרעין חשופים מושפל על ידי הנסיוב והנוקלאוסים הסלולריים, נמחקים במהירות מהמחזור, ואת המטען השלילי חזק שלהם מקשה עליהם לחדור קרום התא ללא סיוע. גישות נוכחיות להתגברות על המחסומים הללו כוללות שינויים כימיים יקרים כדי למנוע נזק של נוקלאוסים ו/או כימוס לתוך חלקיקי שומנים שונים שנאספו באמצעות אינטראקציות הידרופובי¹⁵^,¹⁷^,¹⁸. בעוד שיטות אלה הוכיחו יעילות עבור זריקות מקומיות ומיקוד הכבד, שימוש מערכתי מציג מגבלות משמעותיות של רעילות, חיסוני, ומוגבל biodistribution¹⁶. לעומת זאת, pcms להשתמש במטען שלילי של חומצות גרעין כדי לדחוס אותם בתוך הליבה מופרדים פאזה, בעוד הקורונה נייטרלי מספק מכשול אפקט סטרי נגד השפלה, כמו גם פלטפורמה לשילוב ליגנדס כדי לשפר את המיקוד או הפנמה¹¹^,¹⁹. בתחומי החוץ מבחנה ובעלי חיים הוכיחו כי pcms יכול ביעילות לספק מטענים חומצות גרעין שונים²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴, אבל חולשות ביכולתנו לחזות מאפייני PCM כגון גודל, צורה, ויציבות מן המאפיינים של פולימרים המכוננת הפריע האימוץ הרחב שלהם.

העבודה האחרונה על ידי הקבוצה שלנו ואחרים בתחום החלה לטפל בבעיה זו על ידי פיתוח מבנה-נכס, ובמקרים מסוימים מבנה קשרים בפונקציה של pcms נוצר מחומצות גרעין ופולימרים מסוגים שונים הנייטרלי⁷^,²⁵^,²⁶^,²⁷. שני נושאים עקביים שצצו ממחקרים אלה הם החשיבות של פיתוח היטב מבוקרת, פרוטוקולים לשחזור עבור הרכבה PCM והיתרון של שימוש בטכניקות מרובות כדי לאפיין את חלקיקי התוצאה. פוליאלקטרוליטים, במיוחד אלה עם צפיפות גבוהה כמו חומצות גרעין, אינטראקציה אחד עם השני מאוד חזק, ולהיראות בקלות להיות קיסטי לכוד על ערבוב, וכתוצאה מכך ההכנות PCM כי הם רגישים מאוד וריאציות קטנות בהליך ולהציג ברמה גבוהה polyelectrolytes היכולת לעבור העניים מאצווה כדי אצווה. PCMs הוכחו גם לאמץ מגוון רחב של צורות וגדלים בהתאם תצורות ברמה האטומית של הרכיבים שלהם, ולכידת זה גיוון עם כל טכניקה האפיון הפרט קשה מאוד, במיוחד מאז כמה טכניקות נפוצות כגון פיזור אור דינמי (DLS) דורשים הנחות על צורת חלקיקים עבור הפרשנות שלהם.

במאמר זה, אנו דנים בעיצוב ובבחירה של חומרים עבור PCMs, עם דגש על מחלת האוליונודיליות והסופולימרים מבוססי-בלוק ניטרליים. לאחר מכן נתאר נוהל ריפוי מלחים שעושה שימוש בריכוזים גבוהים של מלח ואחריו באמצעות דיאליזה איטית כדי למנוע השמנה קינטית במהלך הרכבת PCM. הפוליאלקטרוליטים מעורבבים בתנאי מלח גבוהים, שבהם מוקרנים אטרקציות אלקטרוסטטית, אז ריכוז המלח מופחת באיטיות כדי לאפשר לפוליאלקטרוליטים להתיישב בתצורות החיוביות האנרגטית ביותר שלהם, האנלוגית לתהליך הצינון האיטי של ריפוי תרמי. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מסוגלים בדרך כלל להשיג באופן קבוע מאוד מזידיניות נמוכות והחזרה גבוהה עבור מחלת הסוכר pcms⁷^,²⁶. לבסוף, אנו מתארים כיצד ארבע טכניקות מדידה נפרדות ניתן להשתמש כדי לאפיין PCMs על פני מגוון רחב מאוד של קשקשים אורך, מורפולוגיה חיצונית למבנה פנימי: DLS, רב זווית פיזור אור (דוליטל), זווית קטנה קרני רנטגן (סאקס), ו מיקרוסקופ אלקטרון הילוכים (TEM). אנו מקווים כי פרוטוקולים אלה יאפשרו יותר חוקרים לחקור ביעילות את היכולות של חלקיקים מעניינים אלה.

מבחר פולימר והכנה
מאפייני PCM מושפעים מאוד מהמאפיינים הפיזיים והכימיים של הפולימרים המכוננת, מה שהופך את בחירת הפולימר לצעד קריטי בתהליך העיצוב. הסופולימרים בלוק מאופיין ביותר עבור חומצות גרעין PCMs הם diblocks ליניארי כגון פולי (ליזין)-פולי (אתילן גליקול) (pLys-יתד), אבל PCMs ניתן ליצור בין פוליאלקטרוליטים ומגוון של פולימרים הידרופילי טעון נייטרלי, אשר ניתן לייצר באופן תפוקה גבוהה²⁸. הבחירה של הקבוצה טעונה בחוזקה משפיע על היציבות של שיוך יונים וצורה של מיקרולים²⁶, ו-PCM גודל הוכח להגדיל עם אורך של בלוק טעונה⁵^,⁷^,²⁶ (איור 2), ובכך לאפשר מאפייני PCM להיות מכוון לדרישות של יישום רצוי. עבור diblocks ליניארי, גילינו כי הבלוק טעונה צריך לפחות 10 חיובים להיות טעונה מאוד ב-pH הרצוי. בלוקים טעונים עוד עשוי לקדם את מבנה ה-PCM עם פורוזימטר כגון sirna, אשר קשה מורכבים עם בלוקים קצרים יותר²¹. הבחנו בהצלחה בהיווצרות PCM עם אורכים לחסום עד 200, והספרות מתארת פולימרים ארוכים יותר. גמישות רבה יותר זמין בבחירה של בלוקים ניטרליים²⁴, אבל הניסיון הראה כי בלוקים ניטרליים קצר מאוד להוביל לצבור ולא ננו-חלקיק היווצרות, וכי אורך מינימלי נייטרלי גדל עם אורך בלוק טעונה. עבור pLys-יתד, מגוואט יתד של לפחות 3000 – 5000 נדרש עבור pLys אורכים מתחת ~ 50, ובאורכים ארוכים נדרשים כמו לחסום טעונה מוגברת יותר. הגדלת אורך בלוק נייטרלי תוצאות בגודל PCM מוגבר, במיוחד עובי פגז, עקב הצפיפות אפקט סטרי של פולימרים ניטרליים.

כתב יד זה מציג פרוטוקול להכנת pcms מן הטוהר הגבוהה העליון plys-יתד ו-פורוזימטר של כמות ידועה, אבל צריך להיות שניתן להתאמה בקלות למערכות אחרות, כמו גם. בדקנו אותו בהצלחה עם polypeptides טעונים מספר, כולל polyarginine ו polyglutamic חומצה, כמו גם מספר רב של פוליאלקטרוליטים סינתטיים, כגון חומצה פוליאקרילית ו פולי (וינילוקסיל trimethymonium). כמו כן, אנו מתארים הכנת PCMs עם יחס stoichiometric של חיובים פוליאלקטרומטרים, אבל זה שונה בקלות. אנו מוצאים את זה הכי קל לעבוד ביחידות ריכוז (סיסי), אשר גם מתאים באופן טבעי פולימרים שאינם טעונים במלואה. אם או פולימר לא מאופיין היטב, יש לנקוט כדי לקבוע במדויק את אורכי/גושים פולימריים ולהבטיח כי מלח עודף אינו נוכח מעבר לזה הדרוש עבור ניטרול החיוב על ידי דיאליזה, למשל. יש להתייחס לנוכחות של מים שנשמרו גם כאשר ריכוזים מחושבים. ריכוז חומצות גרעין ניתן לכמת בנוחות על ידי ספיגת ב260 nm, ואת הנוכחות או העדר פוספטים מסוף צריך להיחשב בעת חישוב הסיסי

כאשר משתמשים ב-olig, מבנה כימי של מדינת הכלאה וכימית, מסייעים לקבוע את הנטייה להרכבה עצמית ולמאפייני ה-PCM המתקבל⁵^,⁷^,²⁶. מיטוב אלה, בתוך הדרישות של יעילות ביולוגית אם באמצעות PCMs למסירה, יגדיל את הסבירות להרכיב את המבנים הרצויים. כלים שימושיים לניתוח היברידיזציה כוללים פונקציות MATLAB עבור חומצות גרעין, NUPACK²⁹, ו IDT OligoAnalyzer. אנו ממליצים לנתח רצף של מועמד כדי להבין את כוחה של הכריכה ל -1) עצמו בצורה של סיכת ראש; 2) עותק נוסף של אותו רצף (self-dimer); ו-3) לעוד מחלת האוגורונודים המצויים במערכת. DNA ו-RNA טמפרטורות התכה עבור רצף מסוים יכול גם להיות מחושב באמצעות שיטת השכנה הקרובה³⁰^,³¹. ריפוי תרמי של חומצות גרעין (שלב 2.3) מודד מבנה משני שיורית בנוקלאוטידים הבודדים ומקדם קיפול שיווי משקל.

אפיון וניתוח PCM
מגוון רחב של טכניקות זמינות לאפיון חלקיקי חלקיקים, כולל פיזור אור סטטי ודינאמי, פיזור זווית קטן של אלקטרונים או נויטרונים, ומיקרוסקופ אלקטרוני. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים עבור שתי טכניקות פיזור אור, זווית קטנה פיזור קרני רנטגן, ושתי טכניקות המיקרוסקופיה אלקטרונים.

DLS מודד את הקורלציה האוטומטית של תנודות הזמן בעוצמת פיזור בזווית אחת מתנועה בראונית של המדגם. התאמת נתונים אלה יכול לספק רדיוס הידרודינמי ופולידיסטיטיות עבור מיקרולים כדוריים (איור 3). פיזור אור זווית מרובה (דוליטל) מודד את עוצמת פיזור סטטי בזוויות רבות. התלות הזוויתית הזאת מתארת את צורת הננו-חלקיק אך מוגבלת לאורך הזמן הארוך יותר מ-~ 50 ננומטר לאור גלוי, המגביל את יעילותו לחלקיקים קטנים יותר. שתי הטכניקות מבוססות על חוסר התאמה במדד השבירה ומתארות בעיקר את הממדים החיצוניים של הננו-חלקיק.

זווית קטנה X-ray פיזור (סאקאס) משתמש קרני רנטגן כמו בדיקה פיזור, ואת אורך הגל הקצר שלהם מאפשר מדידות מעל טווח של ~ 0.1 – 100 ננומטר. מתאים את עוצמת פיזור נצפתה לעומת זווית (ביטוי מקובל כמו מומנטום העברה q) מספק מידע על מורפולוגיה PCM (כלומר, גודל וצורה) וגם מבנה פנימי. אם כיול אינטנסיביות מוחלט זמין, ואם עוצמת הפיזור ניתן להטות לזווית אפס, המסה PCM ואת מספר הצבירה יכול להיות גם מוערך³², מה שהופך את הסאקס לשיטה מגוונת ורבת ערך במיוחד. זווית קטנה של נייטרון (SANS) הוא רגיש על פני מגוון דומה של קשקשים אורך אך זמין רק במתקנים מיוחדים ולא יידונו במפורש במאמר זה³³^,³⁴^,³⁵.

השנים האחרונות ראו את הופעתו של כלים מהשורה העליונה של הספסל, אבל אנחנו מוצאים כי מקורות סינכרוטרון מתאימים יותר עבור האפיון PCM, כמו אינטנסיביות גבוהה יותר שלהם מאפשר נתונים לאסוף הרבה יותר מהר עבור אלה דגימות חדות נמוכה. אנו מספקים פרוטוקול קצר לרכישת נתוני ה-PCM ב-Beamline 12-ID-B במקור פוטון מתקדם (ארגוננה המעבדה הלאומית, ארה ב) מנקודת מבט של משתמש. פרוטוקול זה צריך להיות ישים על רוב המקורות הסינכרוטרון, אבל התייעצות עם צוות מקומי לפני הצעת ניסוי מומלץ מאוד. אנו מספקים גם הפחתת נתונים פרוטוקול ניתוח באמצעות אירנה³⁶, סט חינם של פקודות מאקרו שנכתבו עבור איגור Pro. אירנה כוללת סט רב-תכליתי של מרכיבי טופס למידול נתוני ה-סאקס ומאפשר בנייה של מודלים רב-רכיבים המסוגלים לתאר את פרופיל הפיזור המורכב של PCMs (ראה תוצאות מייצגות, איור 4). אירנה יש גם תיעוד מקיף הדרכות זמין באינטרנט. לפני שמנסים את ההליכים הבאים, אנו ממליצים לכרות עם אלה, במיוחד את ערכת הלימוד "דוגמנות של נתוני ה-סאקאס עם שתי אוכלוסיות מרכזיות".

פגיעה בקרינה היא דאגה לפיזור קרני רנטגן, אך מספר מדדים יכולים להיות מועסקים כדי למזער אותו. במיוחד, אנו ממליצים להשתמש בכיוונון תא זרימה עם משאבת מזרק ו-PCM מדגם זורם במהלך רכישת נתונים, ולא נימי. זה גם מפשט במידה ניכרת את החיסור הרקע. אנו מציעים גם לקיחת חשיפות מרובות של המדגם זורם במקום אחד עוד אחד כדי להגביל את שטף כי כל נפח יחיד של המדגם רואה וכדי לאפשר השוואה של נתוני החשיפה כדי לזהות כל נזק.

בניגוד לטכניקות פיזור, אשר בדרך כלל דורשים התאמה לפענוח, העברת אלקטרון מיקרוסקופ (TEM) מספק מרחב אמיתי תמונה חזותית של חלקיקי חלקיקים על ידי העברת קרן אלקטרון דרך המדגם ומקרין תמונה על המסך (איור 5). אנו מציגים פרוטוקולים עבור שתי טכניקות TEM במאמר זה. מיקרו לאחר ההקפאה לתוך שכבה דקה של קרח אינדקטור, שמירה על קונפורמציה מבנית עם חומרים זרים מינימליים, אופטימלי עבור מיקרולים ≤ ~ 10-100 nm ברדיוס. כתם שלילי TEM משתמשת מלח מתכת כבדה (למשל, אורניום) כדי להקיף את המדגם לאחר שהתייבש על פני השטח של רשת. הכתם הצפוף יפזר יותר אלקטרונים מאשר המדגם, הוספת ניגודיות והפקת תמונה שלילית של המדגם. ההקפאה מומלצת לתמונות באיכות גבוהה. עם זאת, הוא יקר יותר, זמן רב, ואינו יכול לספק ניגודיות מספקת. כאשר מדובר בדאגה, יש להשתמש בדגימות שליליות. דוגמאות לכל אחת מהן מוצגות באיור 5.

כל אחת מטכניקות אלה מדווחת על היבטים שונים מעט של חלקיקים, עם חוזק ומגבלות שונות. פיזור אור זמין, והוא לעתים קרובות הגישה המהירה ביותר, אבל יש מגבלות משמעותיות ברזולוציה גודל וצורה. ה-סאקאס יכול לספק מידע על מגוון רחב של קשקשים באורך בתפוקה גבוהה באופן סביר, אך דורש ציוד מיוחד כדי לרכוש את הנתונים, כמו גם מידול כדי לפרש אותו. תמונות TEM הם פשוט לפרש אבל יכול להיות מוגבל בניגוד והם תפוקה נמוכה מטבעו. הניסיון שלנו הראה כי שימוש בטכניקות מרובות לאפיון מגדיל מאוד את המידע שניתן להשיג על מאפייני PCM ומפשט את הפרשנות של ערכות נתונים שהתקבלו מכל אחד בלבד. לדוגמה, ה-סאקאס ו-TEM בעיקר בודקים ליבה צפופה של PCM, בעוד שפיזור האור מדווח על הממדים הכלליים של הננו-חלקיק. לכן, שילוב שלהם מאפשר מדידה של שני הליבה וגודל קורונה. היכולת של TEM לרכוש תמונות מרחב אמיתי יכולה לספק נתוני אמת קרקעיים כדי לאפשר בחירה של גורמי טופס מתאימים למידול נתוני ה-סאקס שעלולים להיות ברורים יותר. מאמר זה מתאר פרוטוקולים עבור כל ארבע הטכניקות, ותהליך לדוגמה לשימוש בהם כדי לאפיין מדגם לא ידוע מוענק במקטע הדיון .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חומרים

לשקול החוצה מפולימר diblock ולהוסיף מים עד כמעט נפח הנדרש עבור פתרון מניות של 10 מ"ג/mL ריכוז סופי. מערבולת במהירות מקסימלית עבור 2 דקות.
Sonicate עבור 5 דקות. מאוד הרבה diblocks עשויים לדרוש sonication נוספים. פתרון המניה אמור להופיע שקוף ואחיד לחלוטין.
התאם את ה-pH ל 7.4 באמצעות NaOH או HCl לפי הצורך. הוסיפו מים לכרך הסופי. pLys-יתד פתרונות הם יציבים למדי אבל צריך להיות בקירור עבור אחסון ארוך טווח ו-pH יש לבדוק לפני השימוש. . עדיף שלאופליזציה תהיה קפואה
השעיית מחדש של מחלת השמש (s) בריכוז המניות הרצוי, בדרך כלל 2 – 5 מ"מ ריכוז מולקולרי לאורכים של 50 nt או למטה. מערבולת ביסודיות כדי להבטיח פירוק מלא.
חישוב ריכוזי מולרי באמצעות משקל מולקולרי או אורך כפי שמתואר במבוא.
חישוב ריכוזי מטען מולרי (סיסי), היכן

Equation 1

המטען ולא הוא מספר monomers טעונה, בעוד המטען חומצות גרעין הוא מספר בסיסים פחות 1, בהנחה לא זירחון. זכור כי ה-DNA כפול תקועים יהיה כפול חיובים רבים לכל מולקולה לעומת DNA אחד תקוע.

ליצור מלאי מדולל ב 20 מ"מ סיסי עבור כל פולימר.

2. חומצת גרעין מיקרואלקטרוליט הכנה

ב שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, לערבב את הבאים לנפח הכולל של 280 μL:
1. 200 μL של nuclease-מים ללא תשלום (מים באולטרטהור עבור PCMs לא מכיל חומצות גרעין).
2. 40 μL של מתמיסת מלח באגירה 10x פוספט (PBS, 137 mM נתרן כלוריד, 10 מ"מ פוספט, pH 7.4 כאשר מדולל ל-1x) או מאגר מתאים אחרים³⁷.
3. 40 μL של 20 מ"מ מיקרומטר. מוסיפים 20 μL של כל שערה ב -20 ממ ס
המשך 5 דקות ב 70 ° c. אם טמפרטורת ההיתוך המחושבת הינה גבוהה יותר, יש להגדיל את הטמפרטורה בהתאם. שים לב כי RNA יהיה לבזות בטמפרטורות גבוהות, ולכן שלב זה לא צריך להיות ארוך יותר אם זה או רכיבים רגישים אחרים נמצאים.
מגניב עבור 15 דקות. להוסיף 40 μL של 20 מ"מ בלוק סיסי diblock, ואז מערבולת מיד עבור 20 s במהירות מקסימלית. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
. בצעו את המלח
1. הוסף 80 μL של 5 M נתרן כלוריד לריכוז הסופי של 1 M והנפח הסופי של 400 μL. . מערבולת של 10 במהירות מקסימלית
2. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לטעון לתוך מחסניות דיאליזה. שימו לב שהגושים המולקולריים המפורטים בעלי משקל מולקולרי נקבעים עבור חלבונים בעלי כדורי הרים ולא יהיו מדויקים עבור פולימרים ליניאריים. אנו מוצאים כי מחסנית 2k MWCO נמנעת הפסד לדוגמה גם מספק שינויים הדרגתיים חוזק יוניים.
3. הכינו אמבטיות דיאליזה.
  1. לחשב את הנפח של אמבטיית דיאליזה הדרושים:
  2. מערבבים 10x PBS (או מאגר רצוי אחר), 5 M הנאל, ו באולטרסאונד מים עבור הפתרון הסופי של ה-PBS 1x ו 0.5 M הנאל, כמו גם שני פתרונות של 1x PBS.
4. טען מחסניות דיאליזה.
  1. מחסניות תוויות עם סמן קבוע. להשרות מחסניות במאגר עבור לפחות 2 דקות לממברנות מימה.
  2. הסר כובע על-ידי פיתול נגד כיוון השעון. לטעון דגימה באמצעות ג'ל טעינת הצינורות. מסירים את האוויר העודף על ידי סחיטה עדינה של הקרומים. החלפת אות.
  3. שימו מחסניות ב-1x PBS, 0.5 M נתרן כלוריד אמבטיה דיאליזה. מחסניות צריך לצוף, עם שתי ממברנות חשופים לאמבטיה. קצף מרחף ניתן להשתמש במידת הצורך.
5. דיאליזה
  1. מודטה עבור 24 שעות ערבוב לאט עם בר מגנטי המהומה.
  2. הזז את מכלי הדיו לאמבט חדש של מאגר העבודה הרצוי של 1x PBS או אחר. המשך 24 שעות, ערבוב לאט עם בר מגנטי המהומה. חזור על שלב זה.
6. . שחזר את הדגימה
  1. הסר את מכלי הדיו מהאמבטיה. הסרת כובע ולשחזר דגימת באמצעות ג'ל טעינת מפית הצינורות. שים לב כי אמצעי האחסון התאושש עשוי להיות גבוה יותר 400 μL הראשונית בשל נפיחות קרום. הקלט אמצעי אחסון ששוחזרו אם דילול קל הוא דאגה.
  2. מניחים את המדגם לתוך נקי 1.5 mL השפופרת מיקרוצנטריפוגה. Pcms הכין בדרך זו צריך להיות יציב במשך כמה חודשים כאשר בקירור, בתנאי כי זיהום נוקלאז כבר נמנע.

3. פיזור אור דינמי

כדי להבטיח תנאים ללא אבק, מאגרי צריך להיות מסוננים בקפידה (מסוננים 3x דרך מזרק יקרומטר 0.22 או מסנן ואקום) וכלי זכוכית ניקוי יסודי בין דגימות. חשוב גם לוודא שהמדגם הגיע לשיווי משקל תרמי לפני ביצוע המדידה.
לדלל את המדגם PCM כדי 0.2 mM סיסי (10x אם באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל) עם מאגר העבודה הרצוי לטעון לתוך קובט מתאים. אנו משתמשים קובט כרך קטן, אשר דורש ~ 200 μL של דגימה לאחר דילול.
קבע מיקום גלאי DLS ל 90 °.
כוונן את כוח הלייזר ו/או מחליש כך שקצב הספירה הוא 100,000 – 200000 ספירות לשניה (שווה), במידת האפשר. שיעורי ספירה נמוך כמו 10 kcps ניתן להשתמש, אבל זמני המדידה עשוי להיות צורך להאריך כדי לקבל סטטיסטיקות טובות (שלב 4.1). שיעורי ספירה גבוהה יותר יש להימנע, כמו פיזור מרובים יהיה לבלבל את המדידה.
לרכוש נתונים עבור 1 דקות. שיעור הספירה צריך להיות קבוע במשך כל זמן הרכישה; אם לא, הדבר מעיד על כך שרכיב כלשהו של המדגם או הכלי עדיין לא שולל.
בדוק את נתוני המתאם האוטומטי. הבסיס הארוך צריך להיות מאוד שטוח, ואת עקומת המתאם האוטומטי צריך להיות חלק, עם פיזור מינימלי, כפי שמוצג באיור 3א. סחיפה בסיסית מצביעה על חוסר שיווי משקל, וניתן לשפר את הרעש בנתונים על-ידי רכישת נתונים נוספים.
התאמת פונקציית התאמה אוטומטית.
1. להשתמש repes³⁸^,³⁹ לבצע המרה לפלס תפלגות ההופכי כדי לספק הפצה של זמני הרפיה ומקדם דיפוזיה, D. שיטה זו מחשבת לאחר מכן רדיוס הידרודינמי, R_h, באמצעות משוואת סטוקס-איינשטיין:
  
  איור 1ב מציג ייצוג של R_h ואיור 3ב הצגת התוצאה של repes.
2. לחלופין, השתמש בשיטות אחרות, כולל CONTIN⁴⁰^,⁴¹ (אלגוריתם הסדרה חלופי), או שאינם שליליים התאמה ריבועים לפחות (nnls). תוצאות עקביות משיטות התאמה מרובות היא חתימה של נתונים באיכות גבוהה. שים לב לכך שניתוח cumulant (סטנדרטי במכשירים רבים) מספק ערכים לא פיזיים עבור הפצות גודל/אורך של מודאליים.

4. רב זווית פיזור אור

הערה: ניתן למדוד את עוצמת פיזור האור לעומת זווית במגוון כלים. הצלחנו להשיג תוצאות טובות באמצעות שני מכשירים מבוססי goniometer ומכשירים מרובי גלאי, לרוץ במצב אצווה.

כוונן את הריכוז ועוצמת התאורה של PCM כדי לספק מספיק אותות/רעש לעומת מדגם מאגר בלבד בכל הזוויות מבלי לספק מזהה כלשהו. ניתן לבחון את האחרון על-ידי הכנת דגימות בגורמי דילול שונים ובדיקת יניאריות של עוצמה לעומת ריכוז (בהנחה של התערבות מינימלית בין PCMs).
הקלט את שיעור פיזור האור בין 15 ° עד 135 ° עבור 1 דקות לכל זווית. אם המדגם והכלי מחוברים כראוי, שיעור הפיזור יהיה קבוע לאורך זמן המדידה.
התווה את קצב הפיזור המנורמל, אניהחטא (θ), לעומת q, שבו אני הוא קצב הפיזור. ש הוא וקטור הפיזור (העברת תנע פוטון) כפי שהוגדר על ידי

Equation 4

כאשר η = מדד השבירה הממס, θ = זווית המדידה, ו λ = אורך הגל של מקור האור. איור 4 מראה מזימה של עוצמת פיזור דוליטל.

5. בזווית נמוכה פיזור קרני רנטגן

רכישת נתונים
1. הכנת דגימות PCM כמתואר לעיל בריכוז 2 מ"מ עבור oligmopm PCMs הגאות עבור פיזור בשפע מעל הרקע. עבור PCMs חסר אטומים כבדים (g., זרחן בחומצות גרעין), ריכוזים גבוהים יותר עשוי להידרש. צפיפויות אורך פיזור ניתן להעריך באמצעות מחשבונים כגון SASSIE⁴².
2. על מנת למזער את הנזק לקרינה על ידי ניקוי רדיקלים חופשיים, להוסיף גליצרול מ מרוכז (למשל, 50%) פתרון מניות כך הפתרון מיצלה מכיל 1% (v/v) גליצרול. שימו לב כי גליצרול מסודר הוא מאוד צמיגי וקשה למדידה במדויק. דילול עם מים או מאגר מומלץ מאוד.
3. הכן נפח גדול של מאגר עבודה עם 1% גליצרול לשימוש כצג הרקע.
4. הכן את המכשיר הספציפי לתאי זרימה וכיול גלאי. הפרוטוקול משתמש בנימי קוורץ בקוטר 3 מ"מ המחוברים למשאבת מזרק במחשב מבוקר עם קוטר קטן, וצינורות פוליאתילן באורך מינימלי. כמות מינימלית של ~ 140 μL לכל מדגם נדרשת עם הגדרה זו.
5. קביעת פרמטרי חשיפה למדגם. החשיפה האופטימלית תשתנה בהתאם לעוצמת הקורה, הרגישות של הגלאי והריכוז, כוח הפיזור והרגישות הרבה של המדגם, אך המטרה היא לחשוף את המדגם לשטף המינימלי הנדרש להשגת עוצמת פיזור מספיקה מעל טווח הריבית q .
6. עבור מחלת השמש/pLys-יתד PCMs, 30x 0.2 s חשיפות בקצב החזרות 1 הרץ לייצר איכות נתונים טובה עם נזק מורגש מעט. עבור דוגמאות חדשות, ההליך הבא עשוי להיות שימושי:
  1. הכנת דגימות PCM על פני מגוון של ריכוזים (למשל, 10-10000 μM סיסי).
  2. החל מריכוז ביניים, PCM חלופי ודגימות מאגר בלבד עם זמני חשיפה משתנים. ראה להלן לקבלת הליך רכישת נתונים והפחתה. לאות לדוגמה צריך להיות סטטיסטיקה טובה (שגיאה סטטיסטית קטנה או וריאציה חלקה לאורך q). אם הסטטיסטיקה נמוכה, ניתן להגדיל את זמן החשיפה.
  3. האות לדוגמה צריך גם להבחין בבהירות מהרקע על טווח הריבית של q . חשב והתווה את (אות-רקע)/יחס רקע לעומת q כדי לקבוע יחס אות/רקע. אם יחס האות/רקע נמוך, יש להגדיל את הריכוז המדגם.
  4. ודא שעוצמת הפיזור (מנורמלת לריכוז) אינה תלויה בריכוז המדגם על-ידי רכישת נתונים בריכוזים גבוהים ונמוכים יותר, שינוי גודל זמן חשיפה במידת הצורך. אינטראקציות אינטרחלקיקים (הגורם הסביר ביותר לתלות בריכוז) תהיה מודגשת ביותר בטווח ה- q הנמוך.
7. רכישת נתונים עבור דוגמאות PCM ורקע (כלומר, מאגר עם גליצרול).
  1. להפעיל את משאבת המזרק כדי להזיז את הדגימה דרך הנימים. תנועה דו-כיוונית או מקבילה מקובלת, אך יש לקחת את הטיפול כדי לבודד כל מדגם (למשל, על ידי הוספת בועת אוויר בין דגימות). דגימות עשוי להיות התאושש ניתן לשימוש חוזר אם אין נזק הקרינה נתפסת.
  2. לאחר הזרימה החלה, להפעיל את החשיפה רנטגן ותוכנית רכישת נתונים שתוארו לעיל. הטיפול צריך להילקח כי חשיפה הקרן מסתיים לפני זרימת הנוזל עושה.
8. לאחר כל דוגמה, לבצע azimuthal בממוצע ולהתוות את פרופילי 1D (כלומר, עוצמה לעומת q) עבור כל חשיפה יחד. הם צריכים להיות זהים בתוך שגיאה סטטיסטית. שינוי אות לאורך זמן. יכול להצביע על נזק לקרינה
  1. פרופילים בודדים חריגות עשוי להצביע על נוכחות של מיקרובועות. אם הבועות נצפו לעתים קרובות, הפחתת קצב הזרימה עשויה לעזור.
9. ממוצע פרופילי הפיזור התלת-ממדיים.
10. רכוש נתונים עבור דוגמאות של מאגר בלבד לעתים קרובות (פעם אחת בכל אחד מ-4-5 דוגמאות PCM) והשווה אותן לאורך זמן. מוגבר האות מדגימות מאגר בלבד מציין כי הקפילר עשוי להיות מזוהם עם דגימת קרינה נזק.
  1. כאשר מבחינים בזיהום, רוחצים את הנימים באקונומיקה, ומחשיבים את זמן החשיפה במידת האפשר.
הפחתת נתונים וניתוח באמצעות אירנה
1. ייבוא מערכות נתונים של ASCII והרקע (שיוכי אבטחה/ייבוא נתונים & ייצוא/ייבוא של נתוניםמסוג sas).
2. הפחת פיזור רקע מנתונים לדוגמה. בדרך כלל, ערכי ה- q הגבוהים ביותר (לדוגמה q > 0.5) מציגים פיזור בצורה לא מבולבלת מהממס ששולט באות. שינוי קנה המידה של נתוני הרקע כך שיתאים לנתונים לדוגמה בטווח q זה יסיר את כל הווריאציה עקב וריאציה של עוצמת הקרן והריכוז לדוגמה.
  1. התווה את הדוגמה והרקע יחד בקנה מידה של יומן רישום. אמת עוצמה שטוחה ברמה גבוהה של q (מניפולציה SAS/שינוי נתונים/טיפול בנתונים I). חשב את יחס המדגם/הרקע (Data1/Data 2), התווה את קנה המידה של יומן הרישום הליניארי, ואמת את הרזולוציה הגבוהה.
  2. חשב את יחס הממוצע (לדוגמה/רקע) בטווח q זה (השתמש במאקרו מותאם אישית או בהעתקה/הדבקה בגיליון אלקטרוני מתוך דפדפן הנתונים).
  3. שימוש במאקרו טיפול בנתונים , שינוי גודל הרקע (לדוגמה, שינוי נתונים 2) תוך שימוש ביחס שחושב לעיל ומתווה את היחס בין אות הרקע לבין הרקע לבין התאים שחושבו לעומת ( [Data1-Data2]/data2), ומוודא שכעת אסימפטוטים לאפס ברמה גבוהה. הקלט יחס זה; זה צריך להיות < 1 – 2% הרחק מ 1.0 עבור כל מדגם.
  4. התווה את אות הרקע המופחת (Data1-Data2) לעומת q ושמור את הנתונים בשם חדש. אל תחליף את הנתונים המקוריים.
  5. אם הנתונים באיכות high-q אינם זמינים, השתמש בפקטור שינוי קנה מידה של 1 עבור חיסור רקע, אך שים לב שלא ניתן להציג אי-דיוקים בטווחי q שבהם יחס האות/רקע קטן.
3. פתח את מאקרו המידול , (SAS/מידול), לאחר מכן טען והתווה את הנתונים הנמצאים ברקע (Cntrls נתונים/הוסף נתונים). אל תשנה את קנה המידה במאקרו זה.
4. ראשית, מצא מודל מקורב עבור המשטח החיצוני של ה-PCM (גודל/צורה של micelle):
  1. ב- cntrls נתונים, בחר נמוך עד מתון טווח q (למשל, ~ 0.003 å^-1 < q < ~ 0.1 å^-1). אם התנודות גלויות, כלול אותן.
  2. בחר מארז טופס המתאים לנתונים. המדרון ב- q נמוך מעיד על צורה ננו-חלקיק, אשר ניתן גם לאמת באמצעות TEM ו/או דוליטל. השתמש שולץ-זים ספרואיד(q⁰), גליל(q^-1), או מודלים של גליל גמיש (q^-2). אירנה מספקת כלים להתאמת חוקי כוח (SAS/תמיכה כלים לחלקות ושולחנות).
  3. בדגם cntrls, בחר את אוכלוסיית הפיזור הראשונה (1p) וודא שהוא היחיד בשימוש (בחר את תיבת הסימון ? ).
  4. בחר באפשרות dist של גודל עבור מודל ובחר את סוג ההתפלגות ומארז הטופסהרצויים. הגדר פרמטרים ראשוניים עבור החיפוש על-ידי הזנת ערכים בשדות קנה מידה, גודל ממוצע ורוחב ולחץ על חשב מודל כדי לצייר את פקטור הטופס המתקבל.
    הערה: ניתן להוסיף את מארז הטופס ' גליל גמיש ' כפקטור טופס של משתמש ולהורידו מ- https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. פרמטרים 1 ו-2 תואמים את אורך הצילינדר ואת אורך Kuhn, בהתאמה.
  5. לאחר שנמצאו פרמטרים סבירים, לחץ על התאם דגם כדי לבצע התאמה של ריבועים לפחות לא ליניאריים לנתונים. מודל הפצת הגודל מעניק רדיוס ורוחב.
    כדי לחשב את השימוש בפולידיפיטיות (PDI)
    
    כמו בכל הליך הולם לינארית, ייתכן שיהיה צורך לכוונן את טווח הנתונים (q region) ולהתחיל בפרמטרים כדי לקבל התאמה יציבה, פיזית סבירה.
  6. לאחר השגת התאמה סבירה, שמור אותו (חנות במחברת/חנות בתיקייה).
5. לאחר מכן, מודל הפיזור של הפולימרים הבודדים בליבת ה-PCM. זה יכול להיות נתפס על ידי מודל חוק הכוח (למשל, q^-2 עבור רשתות אידיאלי, q^-5/3 עבור שרשראות נפוחות, וכו '). אירנה מיישמת את זה דרך דגם ביוקייג⁴³:
  
  כאשר P הוא חוק הכוח G ו-B הם גורמים מוקדמים.
  1. כוונן את פקדי הנתונים כדי לכסות את טווח ה- q כולו ולבצע החלקה של הדגם (חשב מודל). בדרך כלל, פיזור עודף יהיה נצפתה בינוני עד גבוה טווח q (g, q > ~ 0.1 å^-1).
  2. השתמש בפקדי הנתונים כדי לבחור בטווח q שבו מציין פיזור עודף (> 10x מודל מארז הטופס).
  3. הוסף אוכלוסיית פיזור שניה (2P) וודא שהיא היחידה שנמצאת בשימוש (בטלו את הסימון בשימוש? עבור 1p).
  4. בחר רמה אחידה עבור המודל. B ו-P הם הפרמטרים הרלוונטיים. השתמש בכלי התמיכה בהתווייה או ב-P/B בין מאקרו לנציגי שמור כדי לקבל ניחוש התחלתי עבור פרמטרים אלה, ולהתאים את הגורמים Guinier G ו-R_g כדי להבטיח כי המודל אינו מנבא פיזור מוגזם ב- qנמוך.
  5. באשר לפקטור הטופס, בצע התאמה לא לינארית והקלט את הפרמטרים והמודלים.
6. לאחר מכן, אם מופיע שיא עקיפה, כמו באיור 4, הוסף מודל שלישי לשיא עקיפה בטווח הריבית של q (q = ~ 0.22 Å^-1 במקרה זה).
7. לאחר השגת ערכי ההתאמה המשוערת לאוכלוסיות הפיזור הבודדות, הפעל את שלושתם יחד (בחר שימוש? עבור כל אחד) ומטב את ההתאמה המשולבת.
8. בדוק כי כל ערך נשאר סביר פיזית. התוצאה של הליך זה צריכה להיות מודל מורכב המתאר את נתוני ה-ה-סאקס היטב על-פני מגוון רחב של סולמות, כפי שמודגם באיור 4. שמור את ההתאמה באמצעות לחצן חנות בתיקייה לאחסן בתוך איגור.

6. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM)

הקפאה בהקפאה
1. בחר את הרשת. אנו ממליצים על הסרט לתמוך הפחמן holey על רשת TEM סטנדרטית או פחמן לייסי כחלופה. בכל מקרה, החורים בין הפחמן יספקו שטח הדמיה של קרח טהור ומדגם ללא סרט.
2. מניחים את הפחמן ברשת בצד למעלה בתוך מכשיר הברק מחליק על שקופית זכוכית נקייה. גלישת שקופית בסרט מעבדה יכול לעזור עם טיפול ברשת. הימנע לגעת במרכז הרשת עם מלקחיים ולצבוט תמיד ליד קצה הרשת.
3. . לחשוף את הרשת במשך 30 שנות שלושים
4. הכינו רובוט ויטריפיקציה. לקבלת עדות לדוגמא
  1. מוגדר ל 100% לחות ו-RT ולהוסיף נייר מוכתם. הכינו אתאן נוזלי ואמבטיות חנקן נוזלי בבסיס הרובוט. ראה הדרכות וסרטוני וידאו באינטרנט לקבלת עזרה נוספת עם הכנה ויטריפיקציה רובוט ושימוש.
5. . לדלל את הדגם 5x
6. באמצעות מלקחיים פעולה שלילית המסופקים עם הרובוט ויטריפיקציה, להרים רשת, ואז לצרף את הפינצטה לרובוט ולהעביר את הפינצטה לתוך החדר.
7. בעוד ברובוט, להוסיף 4 μL של המדגם לצד הפחמן של הרשת באמצעות פיפטה דרך החור בצד של המכונה.
8. מודקון עבור 4 דקות.
9. באמצעות הרובוט, למחוק 3-5 s עם נייר סינון.
10. הרובוט ויטריפיקציה את הרשת לתוך אתיאן נוזלי.
11. הסירו את הפינצטה והזיזו את הרשת לחנקן נוזלי ולתוך מיכל אחסון, שאמור להיות גם תחת חנקן נוזלי. תהליך זה מתקן את המדגם לשכבה דקה של קרח ויטרני. מזער את הזמן שהרשת מוציאה מאתאן הנוזלי או מהחנקן הנוזלי במהלך שלב זה.
12. לצנן את מחזיק דגימת ההקפאה באמצעות חנקן נוזלי. . שמור על מלחמה ומאגר מלא
13. כאשר מוכנים לתמונה, לטעון את הרשת על מחזיק דגימת ההקפאה. שמור את המדגם תחת חנקן נוזלי או לזמן קצר באדים החנקן הקר ביותר ממש מעל פני השטח הנוזלי.
14. תמונה הרשת ב 120 kV בין 75 kx ו 150kx בקרח דק ועבה, משום מיקרולים בגודל שונים עשוי להעדיף עובי קרח מסוים.
  1. להגביל את החשיפה קרן כדי למנוע קרח נמס לפגוע במדגם. אל תתמקד ישירות במקום התכנון לתמונה; התמקד בקרבת מקום. חשוף את אזור הריבית בזמן לכידת תמונה.
  2. הקפידו להבדיל את הטיפות של אתאן נוזלי ממדגם בעת הצגת תמונות (ראה איור 5).
שימוש קונבנציונאלי בצביעת שלילי
1. . הכן את הכתם
  1. מרתיחים ~ 10 מ ל של מים באולטרטהורים. שקול 0.1 g uranyl formate (עב מים) לתוך שפופרת של 15 מ ל חרוט.
  2. הוסף 5 מ ל של מים חמים אבקת UFo עבור 2% פתרון. סגור היטב ועטוף ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור. 1% uranyl הכתם אצטט גם בשימוש נפוץ.
  3. מערבולת או לנער במרץ עבור 5 דקות. הידוק הצינורית לתוך הוורטקאר יסייע. סנן דרך מסנן מזרק 0.2 יקרומטר לתוך צינור חרוט נקי.
  4. בואו להתקרר 10 דקות כדי RT. הוסף 25 μL של 5 מ NaOH ו מערבולת מיד עבור 2 דקות.
    1. לחילופין, הקפאת 200 μL של 2% עב מים. כאשר מוכן לשימוש, הפשרת aliquot, להוסיף 1 μL של 5 M NaOH, ומערבולת עבור 2 דקות.
  5. לשמור על כתם עטוף בנייר כסף או הרחק מן האור.
2. דלל לדוגמה 10x ב-1x PBS (או המאגר הרצוי).
3. בחר רשת. אנו ממליצים על הסרט תמיכה בפחמן על רשתות נחושת. הצד כהה, מבריק יותר של הרשת הוא הצד מצופה פחמן שבו המדגם יהיה הופקד ומוכתם.
4. מניחים את הפחמן ברשת בצד למעלה בתוך מכשיר הברק מחליק על שקופית זכוכית נקייה. ראה שלב 6.1.2.
5. . לחשוף את הרשת במשך 30 שנות שלושים
6. להרים את הרשת עם הצד הפחמן עדיין פונה למעלה ולהחזיק עם מלקחיים פעולה שלילית על ידי קצה הרשת כדי למנוע קריעה אזור ההדמיה במרכז. להגדיר את הפינצטה עם הרשת עדיין מוחזק בצד הפחמן למעלה.
7. החל מדגם 4 μL של דגימה לחלק העליון (צד הפחמן) של הרשת באמצעות פיפטה.
8. דגירה 4 דקות
9. עם ~ 1 דקות לשמאל, פיפטה 10 μL ו -20 μL שחרור של תמיסת UFo על פיסת סרט מעבדה נקי.
10. השתמש בנייר סינון כדי לפתיל המדגם משולי הרשת (איש קשר בניצב) כדי להימנע ממגע עם משטח ההדמיה.
11. באמצעות מלקחיים (עדיין מחזיק את הרשת), מיד למקם את הצד לדוגמה של הרשת למטה על 10 μL UFo, ולאחר מכן מיד הפתיל את הנוזל (לשטוף את הצעד). חשוב לא לתת לרשת להתייבש, ולכן לא לעצור בין שלבים.
12. באופן דומה, להחיל את ה-10 μL UFo לרשת. להחזיק את הרשת על UFo עבור 40 s. הפתיל הנוזל ולתת את הרשת יבש.
13. תמונה הרשת יבש ב 120 kV בין 20, 000x ו-100, 000x.
14. הקפד להיפטר כראוי של כל החומרים מזוהמים UFo באמצעות שירות הבטיחות של המוסד עבור פסולת רדיואקטיבית.
15. בשעת הצורך, ניתן להחיל שיפור בהירות/ניגודיות ומסנן חציון על תמונות TEM ב-ImageJ כדי להפחית את רעשי הרקע. העיבוד הפוסט צריך להיעשות אחיד, רק עבור תמונות שאינן מנוצל עבור מדידות כמותית כגון עוצמה, ויש לדווח תמיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת להמחיש את שיטות האפיון המתוארות לעיל, אנו מראים תוצאות טיפוסיות עבור pcms התאספו מ פורוזימטר ולחסום סופולימרים באורכים שונים וchemistries (איור 1). איור 2 מספק דוגמה לגודל הליבה PCM (כפי שנקבע מ-סאקאס ו-TEM, איור 4 ואיור 5) מגוון עם אורך בלוק טעון. איור 3 מציג נתונים DLS ותוצאות התאמה עבור pcms כדורית נוצר מן בלוק ארוך יחסית מסופולימרים וללא מחסור ביחיד. איור 4 מדגים כיצד ספקטרום מורכב של ה-סאקאס יכול להיות מתאים במדויק על-ידי שילוב מודלים עבור היחסים מרחבי המרחבי המרובים שהיו נוכחים (משטח חיצוני, פיזור פנים-ליבה, בין הסליל), וכיצד דוליטל יכול לשמש להרחבת מדידות פיזור לאורך זמן ארוך יותר. בסופו של דבר, איור 5 מציג נתונים מיקרוסקופיה אלקטרונים עבור pcms של מורפולוגיה שונים.

איור 1: הרכבה ואיפיון של חומצות גרעין PCMs. (א) פולימרים אניאניים, כגון אויגונואודים, הקימו מתחמי מופרדים בפאזה עם אזורים מפרידים של דילוקים סופולימרים. הנוכחות של בלוק נייטרלי הידרופילי (אפור) הביא היווצרות של חלקיקי PCM יציבה. (ב) pcms היו חלקיקים ליבה פגז עם פרמטרים מרובים כדי לאפיין. הגודל הכולל (רדיוס הידרודינמי, R_h) יכול להיקבע באמצעות DLS, רדיוס הליבה (r_c) ניתן למצוא באמצעות הסקאס ו TEM, גודל קורונה יכול להיות מחושב כמו r_h-r_c, ואת מורפולוגיה יכול להיקבע על מאזניים אורך מרובים על ידי שילוב של הסאקאס, דוליטל, ו TEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: התלות של מיקאל בגודל. גודל הליבה של micelle נקבע בעיקר על ידי אורכו של הבלוק הטעון של קופולימר בלוק, ובעיקר בלתי תלוי באורך של homopolymer⁷^,²⁶. זה מאפשר שליטה על גודל PCM על ידי בחירת פולימר לחסום. הנתונים המוצגים כאן הם עבור pLys-יתד עם 88 nt/bp-DNA ו כבר דיווחו בעבר²⁶. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: פיזור אור דינמי. (A) התאמה אוטומטית של פונקציה (יחידותשרירותיות) עבור 10 nt יחיד-תקועים DNA + plys (100)-יתד (10k) PCM. (ב) הפצת רדיוס הידרודינמי (היסטוגרמה) מ-repes התאמה. פונקציית המתאם האוטומטי התפורר לערך שטוח עם קנה מידה יחיד, והתוצאה היא שיא בגודל בודד בהתפלגות הגודל REPES. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הנציג של ה-סאקאס ו-דוליטל ומתאים לmicelle גלילי. הנתונים של סאקס (עיגולים אפורים) מוצגים עבור PCMs התאספו מ pLys (50)-יתד (5k) ו 88 bp כפולה תקועים DNA. ב- q נמוך (< 10^-2 Å^-1), העוצמה הראתה התלות של q^-2 בקירוב על העברת תנע, רומזת על צורת צילינדר גמיש (micelle של תולעת). דוליטל נתונים (לפתוח עיגולים שחורים) להראות את התלות זהה, המציין כי המילים היו לפחות כמה מיקרומטר באורך (מאימת TEM הדמיה, איור 5C,D). מיקרו-מלים מראים תלות שטוחה (q⁰) של אינטנסיביות ב- q בטווח זה. הקווים הצבעוניים מדגימים את הליך המדידה רב-הרכיבים עבור נתוני PCM סאקאס המתוארים בסעיף 5. פיזור ב- q נמוך (סולמות למרחקים גדולים) נשלט על-ידי המשטח החיצוני של ה-PCM, ומתאים היטב לדגם צילינדר גמיש (אדום). בערכי q גבוה יותר (גודל קטן יותר), הפיזור נשלט על ידי פולימרים בודדים בתוך הליבה PCM, להתאים כאן על ידי חוק כוח (ירוק) עם הפסקת q נמוך. כמו כן צפינו באריזה מקבילה של הדיקות דנ א כפולות בתוך ליבת ה-PCM, והתוצאה היא שיא עקיפה של מעין בראג (כחול). הקו המקווקו השחור מראה ששילוב מודלים אלה תיאר במדויק את נתוני ה-ה-, והוספת פיזור נתונים (עיגולים פתוחים) הרחיב את טווח הגודל מעל כמעט ארבע הזמנות של גודל. תוצאות התאמה העניקו לאוכלוסיית PCM עם רדיוס ממוצע = 11.0 ננומטר ו-PDI = 0.03, חוק הכוח ברמה הגבוהה q = 1.81 והשיא העקיפה מייצג ריווח בין היליליקס של 2.71 nm. נתוני ה-סאקאס דווחו בעבר על²⁶ והם זמינים לציבור⁴⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונות TEM של חומצת גרעין PCMs. (א–ב) הקפאה של 22 nt יחיד-תקועים DNA + pLys (50)-יתד (5k) PCMs, מראה בעיקר כדורית מורפולוגיה. חיצים כחולים מציינים טיפות אתאן נוזלי, לא להתבלבל עם pcms (אובייקטים מרקם מובנה). (א) הוא מעט ממוקד, הוספת ניגודיות קלה תוך שמירה על הרזולוציה. (ב) מרוכז באופן משמעותי, ומוסיף ניגודיות יותר, אך מקריב את הבהירות. התאמות בהירות וניגודיות ומסנן חציון של שני פיקסלים הוחלו על שתי התמונות. (C-D) שלילי ויטראז ' של 88 bp כפול תקועים DNA + pLys (50)-יתד (5k) PCMs, שהם צילינדרים גמיש. בשני המקרים, הליבה רדיוi מ-TEM היו עקביים עם הערכים שהושגו מתוך נתוני ה-, המתאימים של ה-סאקאס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כפי שהוזכר לעיל, הפרוטוקולים המוצגים כאן נכתבים עם דגש על פורוזימטר כמו מרכיב polyanion ו plys-יתד כמו בלוק נייטרלי מחוסמת, אבל בדקנו אותם עם מגוון רחב של פולימרים, כגון פולי (חומצה אקרילית), polyגלוטמט, ו יתד-פולי (vinylבנזיל trimethממוניום), ולהאמין שהם יהיו ישימים בדרך כלל עבור רוב הצמדים הפוליפונים. פרמטר אחד שעשוי להיות ממוטב הוא ריכוז המלח המשמש לריפוי, מכיוון שהוא צריך להיות גבוה מספיק כדי PCMs לא ליצור בתחילת האנאל. ניתן לבדוק זאת באמצעות DLS, או בהשוואה להתבוננות בהפרדת הפאזה עם הפוליאלקטרוליטים בלבד (ללא בלוק נייטרלי). ניתן להשתמש בריפוי תרמי במידה וריפוי המלח אינו רצוי, למרות שהפולידיזים הנובעים מהם גדולים יותר⁷. הריכוזים המשמשים לאפיון יכול גם צריך להיות ממוטב, כי חלקיקים גדולים יותר פיזור אור יותר קטנים, וחומצות גרעין יעילים יותר בפיזור קרני רנטגן מאשר פולימרים רבים אחרים בשל נוכחותם של אטומי זרחן צפוף בעמוד השדרה. ייתכן גם שיהיה צורך לשלוט באופן הדוק יותר ברמת ה-pH של המאגר אם לפוליאלקטרוליט יש pKa קרוב למצב העבודה.

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים עבור שתי טכניקות פיזור אור (כלומר, רב זווית/פיזור אור סטטי ופיזור אור דינמי), כמו גם הזווית הקטנה פיזור קרני רנטגן, ושניהם הקפאה שלילי קונבנציונאלי הילוכים הכתם אלקטרון מיקרוסקופ, עם נתונים מייצגים עבור כל. לא כל הטכניקות נחוצות עבור כל התרחישים, ואחרים זמינים גם כן, העלאת השאלה שבה יש להעסיק כאשר. ספרות סקירה מספיק קיימת בנושא זה⁴⁵^,⁴⁶, אבל אנו מציעים את הפעולות הבאות בעת אפיון PCM חדש או ננו-חלקיק דומה. התחל בבדיקת הצבירה, הן באמצעות בדיקה חזותית לעכירות ומיקרוסקופ אופטי. אם לא נצפתה צבירה, השלב הבא הוא לקבוע אם קיימים חלקיקים כלשהם. DLS היא דרך מהירה כדי לקבוע את זה, כי PCMs פיזור אור במרץ, ואת פיזור אור חלש או לא קיים הוא אינדיקציה חזקה של היווצרות ננו-חלקיק עניים. בעוד DLS יכול לאשר את הנוכחות של חלקיקים, קשה לקבוע את גודלם ואת צורתם ללא התייחסות לנתונים אחרים, כמו רוב שיטות ניתוח להסתמך על הקשר סטוקס-איינשטיין, אשר מניח חלקיקים כדוריים. דוליטל יכול לאשר צורות כדוריות (עוצמה מנורמלת לעומת זווית) אך ייתכן שלא תהיה אפשרות לקבוע את הצורה של חלקיקים שאינם כדוריים, אלא אם כן התפלגות הגודל היא צרה וקורה ליפול בטווח הנכון לרזולוציה. כתוצאה מכך, אנו ממליצים לבצע TEM, סאקאס, או שניהם על כל דגימת PCM כדי לאפיין במלואו את תכונותיו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים פיל גריפין ו Tera Lavoie של מתקן האפיון של החומר הרך ומתקן המיקרוסקופיה אלקטרון מתקדם, בהתאמה, באוניברסיטת שיקגו. כמו כן, אנו מודים לאוקובאינג זואו ולסואנקה סייפרט של מקור הפוטון המתקדם במרכז המעבדה הלאומית של ארגוננה ומרכז נשים לעיצוב חומרים הירארכיים (CHiMaD) לקבלת תמיכה. אנו מודים לג טינג ולמייקל. לואקלי על תרומתם לעבודה זו

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 mm circle filter paper	Whatman	1001-070	Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid	Electron Microscopy Sciences	CF200-Cu	TEM grid
DAWN	Wyatt Technology	DAWN	MALS instrument
DNA oligonucleotide	Integrated DNA Nanotechnologies Inc		Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid	Electron Microscopy Sciences	LC200-Cu	TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50	Alamanda Polymers Inc	mPEG5K-b-PLKC50	Example block copolymer
Milli-Q	Millipore Sigma		Ultrapure water
NanoDrop	Thermo Scientific		For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers	Dumont	N7	Tweezers for grid preparation
Parafilm "M"	Bemis Company Inc	PM996	Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid	Electron Microscopy Sciences	Q210CR1.3	TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System	Brookhaven Instruments	BI-200SM	DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL	Thermo Scientific Pierce Protein Biology	87723	Dialysis cartridge
small volume cuvette	Brookhaven Instruments	BI-SVC	Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System	Gatan	Solarus 950	Plasma system for TEM grids
Talos TEM	FEI	Talos	TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM	FEI	Spirit	TEM used for dry samples
Uranyl Formate	SPI-Chem	16984-59-1	For negative staining samples for TEM
Vitrobot	FEI	Vitrobot	Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Chemistry

הרכבה ואפיון של מטלות מורכבות פוליאלקטרוליט

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.