Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Assemblaggio e caratterizzazione di Micelle complesse di polielettroliti

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

Forniamo protocolli e dati rappresentativi per la progettazione, l'assemblaggio e la caratterizzazione di micelle complesse di polielettroliti, nanoparticelle core-shell formate da polielettroliti e copolimeri a blocchi caricati caricati idrofili.

Abstract

Le micelle complesse di polielettroti , nanoparticelle core-shell formate dall'auto-assemblaggio di polimeri caricati in una soluzione acquosa, forniscono una potente piattaforma per esplorare la fisica delle interazioni polielettrolitiche e offrono anche una soluzione promettente per il problema pressante di fornire oligonucleotidi terapeutici in vivo. Lo sviluppo di relazioni struttura-proprietà predittiva per i PCM si è rivelato difficile, in parte a causa della presenza di forti trappole cinetiche durante l'auto-assemblaggio delle nanoparticelle. Questo articolo illustra i criteri per la scelta dei polimeri per la costruzione PCM e fornisce protocolli basati sull'annealing del sale che consentono l'assemblaggio di nanoparticelle ripetibili e a bassa polidisità. Discutiamo anche della caratterizzazione pcM utilizzando la dispersione della luce, la dispersione a raggi X a piccolo angolo e la microscopia elettronica.

Introduction

Quando i polielettroliti caricati in modo opposto vengono mescolati in una soluzione acquosa, il guadagno entropia derivante dal rilascio delle loro contropartite provoca la demixazione della soluzione in una fase condensata ricca di polimeri e un supernatale impoverito di polimeri1,2,3,4, 5, un fenomeno noto come complessità polielettrolitale. Se un blocco idrofilo neutro viene coniugato a uno o a entrambi i polielettroliti, si verifica invece la separazione di fase su nanoscala (Figura 1A). Le nanoparticelle di nucleo-guscio autoassemblate risultanti sono variamente indicate come micelle complesse di polielettroliti (PCM), micelle complesse di poliione, complessi ionomerici a blocchi o micelle coacervate-core per analogia alla micellizzazione surrogata, anche se tutti i componenti del sistema sono idrofili6,7. La capacità di un PCM di incapsulare molecole idrofile come proteine e acidi nucleici, così come l'ampia sintonizzabilità offerta dall'architettura portante del copolimero a blocchi li rende interessanti candidati per la fornitura di molecole terapeutiche in vivo8,9,10,11,12,13.

Fornire acidi nucleici terapeutici a bersagli cellulari è una sfida particolarmente importante, per la quale i PCM offrono diversi vantaggi. Gli acidi nucleici terapeutici (DNA genetico, mRNA e oligonucleotidi come il siRNA) hanno un immenso potenziale per migliorare la salute umana, ma devono superare numerose barriere biologiche e fisiche per rendersi conto che il potenziale14,15,16. Gli acidi nucleici nudi nudi cisierizzano sono degradati da nucleasi cellulari e di siero, vengono rapidamente eliminati dalla circolazione e la loro forte carica negativa rende difficile per loro penetrare le membrane cellulari senza assistenza. Gli attuali approcci per il superamento di queste barriere includono costose modifiche chimiche per prevenire danni da nucleasi e/o incapsulamento in varie nanoparticelle di lipidi assemblate tramite interazioni idrofobiche15,17,18. Mentre questi metodi si sono dimostrati efficaci per iniezioni locali e targeting del fegato, uso sistemico presenta limitazioni significative di tossicità, immunogenicità, e biodistribuzione limitata16. Al contrario, i PCM utilizzano la carica negativa degli acidi nucleici per condensarli all'interno del nucleo separato da fase, mentre la corona neutra fornisce una barriera sterica contro la degradazione e una piattaforma per incorporare ligandi per migliorare il targeting o l'internalizzazione11,19. Studi in vitro e sugli animali hanno dimostrato che i PCM possono fornire efficacemente vari carichi utili di acido nucleico20,21,22,23,24, ma debolezze nella nostra capacità di prevedere le proprietà PCM come dimensioni, forma e stabilità dalle proprietà dei polimeri costituenti hanno ostacolato la loro più ampia adozione.

Il recente lavoro del nostro gruppo e di altri nel campo ha iniziato ad affrontare questo problema sviluppando la proprietà-struttura, e in alcuni casi le relazioni struttura-proprietà-funzione per PCM formate da acidi nucleici e vari polimeri cationici-neutri7,25,26,27. Due temi coerenti che sono emersi da questi studi sono l'importanza di sviluppare protocolli ben controllati e ripetibili per l'assemblaggio di PCM e il vantaggio di utilizzare più tecniche per caratterizzare le nanoparticelle risultanti. I polielettroliti, in particolare quelli ad alta densità di carica come gli acidi nucleici, interagiscono tra loro molto fortemente e sembrano facilmente rimanere cineticamente intrappolati durante la miscelazione, dando luogo a preparazioni PCM che sono altamente sensibili alle piccole variazioni nella procedura e mostrano un'elevata polidispersità e scarsa ripetibilità da lotto a lotto. I PCM hanno anche dimostrato di adottare una vasta gamma di forme e dimensioni a seconda delle configurazioni a livello atomico dei loro componenti, e catturare questa diversità con qualsiasi tecnica di caratterizzazione individuale è molto difficile, soprattutto perché alcune tecniche comuni come la dispersione dinamica della luce (DLS) richiedono ipotesi sulla forma delle particelle per la loro interpretazione.

In questo articolo, discutiamo di progettazione e selezione dei materiali per i PCM, con particolare attenzione agli oligonucleotidi e agli copolimeri di disblocco cationici-neutri. Descriviamo quindi un protocollo di annessione del sale che utilizza alte concentrazioni di sale seguite da dialisi lenta per evitare l'intrappolamento cinetico durante l'assemblaggio del PCM. I polielettroliti vengono mescolati in condizioni di sale elevato in cui vengono schermate le attrazioni elettrostatiche, quindi la concentrazione di sale viene lentamente abbassata per consentire ai polielettroliti di stabilirsi nelle loro configurazioni più favorevoli dal punto di vista energetico, analogamente al lento processo di raffreddamento dell'annealing termico. Utilizzando questo protocollo, siamo regolarmente in grado di ottenere polidispersità eccezionalmente bassa e alta ripetibilità per oligonucleotide PCMs7,26. Infine, descriviamo come quattro tecniche di misurazione separate possono essere utilizzate per caratterizzare i PCM su un'ampia gamma di scale di lunghezza, dalla morfologia esterna alla struttura interna: DLS, dispersione della luce multi-angolo (MALS), dispersione a raggi X a piccolo angolo (SAXS) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Speriamo che questi protocolli consentano a più ricercatori di esplorare efficacemente le capacità di queste interessanti nanoparticelle.

Selezione e preparazione del polimero
Le proprietà PCM sono fortemente influenzate dalle caratteristiche fisiche e chimiche dei polimeri costituenti, rendendo la selezione dei polimeri una fase critica nel processo di progettazione. I copolimeri a blocchi più caratterizzati per i PCM acidi nucleici sono blocchi lineari come poly(lysine)-poly(ethylene glycol) (pLys-PEG), ma i PCM possono essere formati tra polielettroti e una varietà di polimeri idrofili a carica neutra, che possono essere generati in modo ad alta velocità28. La scelta del gruppo carico influisce fortemente sulla stabilità dell'abbinamento ionista e sulla forma delle micelle26,e la dimensione del PCM è stata dimostrata aumentare con la lunghezza del blocco caricato5,7,26 (Figura 2), consentendo così di tessere le proprietà PCM per i requisiti di un'applicazione desiderata. Per gli sblocchi lineari, abbiamo scoperto che il blocco caricato dovrebbe avere almeno 10 cariche ed essere fortemente caricato al pH desiderato. Blocchi caricati più lunghi possono promuovere la formazione di PCM con oligonucleotidi come il siRNA, che sono difficili da complesso con blocchi più brevi21. Abbiamo osservato con successo la formazione di PCM con lunghezze di blocco fino a 200, e la letteratura descrive polimeri più lunghi. Più flessibilità è disponibile nella scelta dei blocchi neutri24, ma l'esperienza ha dimostrato che blocchi neutri molto brevi portano all'aggregazione piuttosto che alla formazione di nanoparticelle, e che la lunghezza minima neutra aumenta con la lunghezza del blocco caricato. Per pLys-PEG, è necessario un PEG MW di almeno 3.000-5.000 per lunghezze di pLys inferiori a 50 dollari e sono necessarie lunghezze più lunghe man mano che il blocco caricato aumenta ulteriormente. L'aumento della lunghezza del blocco neutro comporta un aumento delle dimensioni del PCM, in particolare lo spessore del guscio, a causa dell'affollamento sterico dei polimeri neutri.

Questo manoscritto presenta un protocollo per la preparazione di PCM da pLys-PEG e oligonucleotidi di quantità nota lyophilizzata, ma dovrebbe essere facilmente adattabile anche ad altri sistemi. L'abbiamo testato con successo con diversi polipeptidi caricati, tra cui la poliargina e l'acido poliglutamico, così come diversi polielettroliti sintetici, come l'acido poliacrilico e il polietilene(vinylbenzyl trimethylammonium). Descriviamo anche la preparazione di PCM con un rapporto stoichiometrico di cariche di poligliti, ma questo è facilmente modificabile. Troviamo più facile lavorare in unità di concentrazione di carica (c.c.), che ospita anche naturalmente polimeri che non sono completamente caricati. Se uno dei polimeri non è ben caratterizzato, occorre prestare attenzione a determinare con precisione le lunghezze/masse di polimeri e garantire che il sale in eccesso non sia presente oltre quello necessario per la neutralizzazione della carica mediante dialisi, ad esempio. La presenza di acqua trattenuta deve essere contabilizzato anche quando vengono calcolate le concentrazioni. La concentrazione di acido nucleico può essere convenientemente quantificata mediante assorbimento a 260 nm e la presenza o l'assenza di fosfati terminali deve essere considerata nel calcolo del c.c.

Quando si utilizzano oligonucleotidi come polianioni, lo stato di ibridazione e la struttura chimica aiutano a determinare la propensione per l'auto-assemblaggio e le caratteristiche del PCM risultante5,7,26. L'ottimizzazione di questi, entro i requisiti di efficacia biologica se si utilizzano PCM per la consegna, aumenterà la probabilità di formare le strutture desiderate. Strumenti utili per l'analisi dell'ibridazione includono le funzioni MATLAB per gli acidi nucleici, NUPACK29e IDT OligoAnalyzer. Si consiglia di analizzare una sequenza candidata per comprendere la forza di legame a 1) se stesso in una formazione forcina; 2) un'altra copia della stessa sequenza (auto-dimero); e 3) ad altri oligonucleotidi presenti nel sistema. Le temperature di fusione del DNA e dell'RNA per una sequenza specifica possono anche essere calcolate utilizzando il metodo più vicino30,31. L'annessione termico degli acidi nucleici (passaggio 2.3) denatura qualsiasi struttura secondaria residua nei singoli nucleotidi e favorisce il ripiegamento dell'equilibrio.

Caratterizzazione e analisi PCM
È disponibile un'ampia gamma di tecniche per caratterizzare le nanoparticelle, tra cui la dispersione statica e dinamica della luce, la dispersione di piccoli angoli di elettroni o neutroni e la microscopia elettronica. In questo articolo, forniamo protocolli per due tecniche di diffusione della luce, la dispersione a raggi X a piccolo angolo e due tecniche di microscopia elettronica.

DLS misura l'autocorrelazione delle fluttuazioni temporali nell'intensità di dispersione ad un angolo dal moto browniano del campione. L'installazione di questi dati può fornire raggio idrodinamico e polidispersione per le micelle sferiche (Figura 3). La dispersione della luce a più angoli (MALS) misura l'intensità di dispersione statica a molti angoli. Questa dipendenza angolare descrive la forma della nanoparticella, ma è limitata a scale di lunghezza più lunghe di 50 nm per la luce visibile, che ne limita l'efficacia per le nanoparticelle più piccole. Entrambe le tecniche si basano sulla mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione e descrivono principalmente le dimensioni esterne della nanoparticella.

La dispersione a raggi X ad angolo ridotto (SAXS) utilizza i raggi X come sonda di dispersione e la loro lunghezza d'onda più corta consente misurazioni su un intervallo di 0,1–100 nm. L'adattamento dell'intensità di dispersione osservata rispetto all'angolo (convenzionalmente espresso come trasferimento di momentum q) fornisce informazioni sulla morfologia PCM (ad esempio, dimensioni e forma) e anche sulla struttura interna. Se è disponibile una calibrazione di intensità assoluta, e se l'intensità di dispersione può essere estrapolata ad angolo zero, la massa PCM e il numero di aggregazione possono anche essere stimati32, rendendo SAXS un metodo estremamente versatile e prezioso. La SANS (Small angle neutron scattering) è sensibile su una gamma simile di scale di lunghezza, ma è disponibile solo presso strutture specializzate e non sarà discussa esplicitamente in questo articolo33,34,35.

Negli ultimi anni abbiamo visto l'avvento degli strumenti SAXS da banco, ma scopriamo che le sorgenti di sincrotrone sono più adatte per la caratterizzazione PCM, poiché la loro maggiore intensità consente di raccogliere i dati molto più velocemente per questi campioni a basso contrasto. Forniamo un breve protocollo per l'acquisizione di dati PCM SAXS presso Beamline 12-ID-B presso l'Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) dal punto di vista dell'utente. Questo protocollo dovrebbe essere applicabile alla maggior parte delle fonti di sincrotrone, ma è altamente consigliabile consultare il personale locale prima di proporre un esperimento. Forniamo anche un protocollo di riduzione e analisi dei dati utilizzando Irena36, un insieme gratuito di macro scritte per Igor Pro. Irena include un insieme versatile di fattori di forma per la modellazione dei dati SAXS e consente la costruzione di modelli multicomponente in grado di descrivere il profilo di dispersione complesso dei PCM (vedere Risultati rappresentativi, Figura 4). Irena ha anche una documentazione completa e tutorial disponibili online. Prima di tentare le procedure riportate di seguito, si consiglia di familiarizzare con questi, in particolare il tutorial "Modellazione dei dati SAXS con due principali popolazioni di scatterer".

Il danno da radiazioni è una preoccupazione per la dispersione dei raggi X, ma possono essere impiegate diverse misure per ridurlo al minimo. In particolare, si consiglia di utilizzare una configurazione di celle di flusso con una pompa di siringa e un campione PCM che scorre durante l'acquisizione dei dati, piuttosto che un capillare sigillato. Questo semplifica notevolmente anche la sottrazione in background. Suggeriamo inoltre di assumere esposizioni multiple del campione che scorre piuttosto che una più lunga per limitare il flusso che ogni singolo volume di campione vede e per consentire il confronto dei dati di esposizione per identificare eventuali danni.

A differenza delle tecniche di dispersione, che generalmente richiedono il montaggio per interpretare, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) fornisce un'immagine visiva dello spazio reale delle nanoparticelle passando un fascio di elettroni attraverso il campione e proiettando un'immagine su uno schermo di scintillazione (Figura 5). In questo articolo presentiamo protocolli per due tecniche TEM. Cryo TEM congela i campioni di micelle in un sottile strato di ghiaccio vitreo, preservando la conformazione strutturale con sostanze estranee minime, ottimale per le micelle a 10-100 nm nel raggio. Il TEM con macchie negative utilizza un sale metallico pesante (ad esempio, l'uranio) per circondare il campione dopo che è stato essiccato sulla superficie di una griglia. La macchia densa disperderà più elettroni del campione, aggiungendo contrasto e producendo un'immagine negativa del campione. Cryo TEM è consigliato per immagini di alta qualità. Tuttavia, è più costoso, richiede tempo e potrebbe non fornire un contrasto sufficiente. Quando questo è un problema, campioni macchiati negativi dovrebbero essere utilizzati. Esempi di ciascuno sono mostrati figura 5.

Ognuna di queste tecniche riporta aspetti leggermente diversi delle nanoparticelle, con diversi punti di forza e limitazioni. La dispersione della luce è prontamente disponibile ed è spesso l'approccio più veloce, ma presenta notevoli limitazioni in termini di dimensioni e risoluzione della forma. SAXS può fornire informazioni su un'ampia gamma di scale di lunghezza a velocità effettiva ragionevolmente elevata, ma richiede apparecchiature specializzate per acquisire i dati, nonché la modellazione per interpretarli. Le immagini TEM sono semplici da interpretare, ma possono essere limitate al contrario e sono intrinsecamente basse. La nostra esperienza ha dimostrato che l'utilizzo di più tecniche per la caratterizzazione aumenta notevolmente le informazioni che possono essere ottenute sulle proprietà PCM e semplifica l'interpretazione dei set di dati ottenuti da ciascuno solo di essi. Ad esempio, SAXS e TEM esaminano principalmente il nucleo denso di un PCM, mentre la dispersione della luce riferisce sulle dimensioni complessive della nanoparticella. Così, combinandoli permette la misurazione della dimensione del nucleo e della corona. La capacità di TEM di acquisire immagini di spazi reali può fornire dati sulla verità del terreno per consentire la selezione di fattori di forma appropriati per la modellazione di dati SAXS che potrebbero altrimenti essere ambigui. In questo articolo vengono descritti i protocolli per tutte e quattro le tecniche e nella sezione Discussione viene fornito un processo di esempio per il loro utilizzo per caratterizzarne un esempio sconosciuto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparazione dei materiali

  1. Pesare il polimero del diblock lofilfato e aggiungere acqua fino a quasi il volume necessario per una soluzione di riserva di 10 mg/mL di concentrazione finale. Vortice alla massima velocità per 2 min.
  2. Sonicato per 5 min. Gli sblocchi molto lunghi possono richiedere una sonicazione aggiuntiva. La soluzione stock dovrebbe apparire completamente trasparente e omogenea.
  3. Regolare pH a 7.4 utilizzando NaOH o HCl in base alle esigenze. Aggiungere acqua al volume finale. Le soluzioni pLys-PEG sono abbastanza stabili, ma devono essere refrigerate per lo stoccaggio a lungo termine e il pH deve essere controllato prima dell'uso. La lofilazione è preferibile al congelamento.
  4. Risospendi resimo l'oligonucleotide lyophilizzata alla concentrazione di scorte desiderata, in genere da 2 a 5 mM di concentrazione molecolare per lunghezze di 50 nt o inferiori. Vortice accuratamente per garantire la completa dissoluzione.
  5. Calcolare le concentrazioni molare utilizzando il peso molecolare o la lunghezza come descritto nell'Introduzione.
  6. Calcolare le concentrazioni di carica molare (c.c.), dove

Equation 1

La carica polielettrolita è il numero di monomeri caricati, mentre la carica dell'acido nucleico è il numero di basi meno 1, supponendo che non ci sia fosforilazione. Tenete a mente che il DNA a doppio filamento avrà il doppio delle cariche per molecola rispetto al DNA a filamento singolo.

  1. Creare materiale diluito a 20 mM c.c. per ogni polimero.

2. Acido nucleico Polielettrolitco Micelle Preparazione

  1. In un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, mescolare quanto segue a un volume totale di 280:
    1. 200 l di acqua priva di nuclea (acqua ultrapura per PCM che non contiene acidi nucleici).
    2. 40 - L di 10x di salina con buffer fosfato (PBS, 137 mM di cloruro di sodio, 10 mM fosfato, pH 7.4 quando diluito a 1x) o altro buffer adatto37.
    3. 40-L di 20 mM c.c. oligonucleotide. Per oligonucleotidi a doppio filamento, aggiungere 20 l di ogni filamento a 20 mM c.c.
  2. Incubare la soluzione oligonucleotide per 5 min a 70 gradi centigradi. Se la temperatura di fusione calcolata per gli oligonucleotidi è più alta, la temperatura dovrebbe essere aumentata di conseguenza. Si noti che l'RNA si degrada a temperature elevate, quindi questo passaggio non dovrebbe essere più lungo se questo o altri componenti sensibili sono presenti.
  3. Raffreddare per 15 min. Aggiungere 40 .L di 20 mM c.c. diblock, quindi vortice immediatamente per 20 s alla massima velocità. Incubare 5 min a temperatura ambiente (RT).
  4. Eseguire l'anneal di sale.
    1. Aggiungere 80 -L di cloruro di sodio da 5 M per una concentrazione finale di 1 M NaCl e un volume finale di 400 gradi centigradi. Vortice per 10 s alla massima velocità.
    2. Incubare per 10 min a temperatura ambiente, quindi caricare in cartucce di dialisi. Si noti che i tagli di peso molecolare elencati sono determinati per le proteine globulari e non saranno accurati per i polimeri lineari. Troviamo che una cartuccia MWCO da 2k eviti la perdita del campione e preveda anche cambiamenti graduali nella resistenza ionica.
    3. Preparare bagni di dialisi.
      1. Calcolare il volume del bagno di dialisi necessario:
        Equation 2
      2. Mescolare 10x PBS (o altro buffer desiderato), 5 M NaCl e acqua ultrapura per una soluzione finale di 1x PBS e 0,5M NaCl, oltre a due soluzioni di 1x PBS.
    4. Caricare le cartucce di dialisi.
      1. Cartucce etichettate con pennarelli permanenti. Immergere le cartucce nel tampone per almeno 2 min per idratare le membrane.
      2. Rimuovere il tappo ruotando in senso antiorario. Caricare il campione utilizzando la punta pipetta di carico gel. Rimuovere l'aria in eccesso spremendo delicatamente le membrane. Sostituire il tappo.
      3. Mettere le cartucce nel bagno di dialisi cloruro di sodio da 0,5 M. Le cartucce devono galleggiare, con entrambe le membrane esposte al bagno. I galleggianti in schiuma possono essere utilizzati se necessario.
    5. Dialisi
      1. Incubare per 24 h mescolando lentamente con una barra di agitazione magnetica.
      2. Spostare le cartucce in un nuovo bagno di 1x PBS o altro buffer di lavoro desiderato. Incubare per 24 h, mescolando lentamente con una barra di stirazione magnetica. Ripetere questo passaggio.
    6. Recuperare il campione.
      1. Rimuovere le cartucce dal bagno. Rimuovere il tappo e recuperare il campione utilizzando una punta di pipetta di caricamento gel. Si noti che il volume recuperato può essere superiore a i 400 l iniziali a causa del gonfiore della membrana. Registrare il volume recuperato se una leggera diluizione è una preoccupazione.
      2. Collocare il campione in un tubo di microcentrifuga pulito da 1,5 mL. I PCM preparati in questo modo dovrebbero essere stabili per diversi mesi quando refrigerati, a condizione che sia stata evitata la contaminazione da nucleasi.

3. Dispersione dinamica della luce

  1. Per garantire condizioni antipolvere, i tamponi devono essere accuratamente filtrati (filtrati 3x attraverso una siringa da 0,22 m o un filtro a vuoto) e la vetreria accuratamente pulita tra i campioni. È inoltre importante assicurarsi che il campione abbia raggiunto l'equilibrio termico prima di effettuare la misurazione.
  2. Diluire il campione PCM a 0,2 mM c.c. (10 volte se si utilizza il protocollo descritto in precedenza) con il buffer di lavoro desiderato e caricarlo in una cuvette adatta. Usiamo una cuvette di piccolo volume, che richiede 200 dollari di campione dopo la diluizione.
  3. Impostare la posizione del rilevatore DLS su 90.
  4. Regolare la potenza laser e/o l'attenuatore in modo che il tasso di conteggio sia 100.000–200.000 conteggi al secondo (cps), se possibile. È possibile utilizzare tassi di conteggio a partire da 10 kcp, ma potrebbe essere necessario estendere i tempi di misurazione per ottenere statistiche utili (passaggio 4.1). Dovrebbero essere evitati tassi di conteggio più elevati, poiché la misurazione sarà confusa da più dispersione.
  5. Acquisire dati per 1 min. Il tasso di conteggio deve essere costante per l'intero tempo di acquisizione; in caso contrario, ciò indica che qualche componente del campione o strumento non ha ancora equilibrato.
  6. Esaminare i dati di correzione automatica. La linea di base di lunga data deve essere molto piatta e la curva di autocorrelazione deve essere uniforme, con una dispersione minima, come illustrato nella Figura 3A. La deriva di base indica la mancanza di equilibrio e il rumore nei dati può essere migliorato acquisendo più dati.
  7. Funzione di autocorrelazione di adattamento.
    1. Utilizzare REPES38,39 per eseguire regolarizzata la trasformazione inversa Laplace per fornire una distribuzione dei tempi di rilassamento e un coefficiente di diffusione, D. Questo metodo calcola quindi il raggio idrodinamico, Rh, utilizzando l'equazione di Stokes-Einstein:
      Equation 3
      La figura 1B mostra una rappresentazione di Rh e Figura 3B mostra il risultato di REPES.
    2. In alternativa, utilizzare altri metodi, tra cui CONTIN40,41 (un algoritmo di regolarizzazione alternativo) o raccordo di minimi quadrati non negativi (NNLS). Risultati coerenti derivanti da più metodi di adattamento è una firma di dati di alta qualità. Si noti che l'analisi cumulante (standard su molti strumenti) fornisce valori non fisici per distribuzioni multimodale di dimensioni/lunghezza.

4. Dispersione della luce multi-angolo

NOTA: l'intensità di dispersione della luce rispetto all'angolo può essere misurata su una varietà di strumenti. Abbiamo ottenuto buoni risultati utilizzando sia strumenti basati su goniometro che strumenti a rilevatore multiplo, eseguiti in modalità batch.

  1. Regolare la concentrazione e l'intensità dell'illuminazione del PCM per fornire un segnale/rumore sufficiente rispetto a un campione solo buffer a tutte le angolazioni senza saturare alcun rilevatore. Quest'ultimo può essere testato preparando campioni a vari fattori di diluizione e controllando la linearità di intensità rispetto alla concentrazione (assumendo un'interazione minima tra i PCM).
  2. Registrare la velocità di dispersione della luce da 15 a 135 s per 1 min per angolo. Se il campione e lo strumento sono opportunamente equilibrati, il tasso di dispersione sarà costante nel tempo di misurazione.
  3. Tracciare il tasso di dispersione normalizzato, Isin (oq), vs. q, dove I è il tasso di dispersione. q è il vettore di dispersione (trasferimento di moto foto) come definito da

Equation 4

dove è l'indice di rifrazione del solvente, l'angolo di misurazione e la lunghezza d'onda della sorgente luminosa. La figura 4 mostra un grafico dell'intensità di dispersione MALS.

5. Dispersione a raggi X ad angolo piccolo

  1. Acquisizione dei dati
    1. Preparare i campioni di PCM come descritto sopra a 2 mM di concentrazione di carica per i PCM oligonucleotidi per un'ampia dispersione sopra lo sfondo. Per i PCM privi di atomi pesanti (ad esempio, fosforo negli acidi nucleici), possono essere necessarie concentrazioni più elevate. Le densità di lunghezza di dispersione possono essere stimate utilizzando calcolatrici come SASSIE42.
    2. Al fine di ridurre al minimo i danni da radiazioni mediante loscavenging dei radicali liberi, aggiungere il glicerolo da un concentrato (ad es. 50%) soluzione stock in modo che la soluzione micelle contenga 1% (v/v) glicerolo. Si noti che il glicerolo pulito è altamente viscoso e difficile da misurare con precisione. Si raccomanda vivamente di diluire con acqua o tampone.
    3. Preparare un grande volume di buffer di lavoro con 1% glicerolo per l'uso come monitor in background.
    4. Preparare l'apparato di celle di flusso specifico della trave e calibrare il rilevatore. Il protocollo utilizza un capillare al quarzo di 3 mm di diametro collegato a una pompa di siringa controllata dal computer con un piccolo diametro e tubi in polietilene di lunghezza minima. Con questa configurazione è necessario un volume minimo di 140 USD di L per campione.
    5. Determinare i parametri di esposizione del campione. L'esposizione ottimale varia in base all'intensità del fascio, alla sensibilità del rivelatore e alla concentrazione, alla forza di dispersione e alla suscettibilità ai danni del campione, ma l'obiettivo è quello di esporre il campione al flusso minimo necessario per ottenere sufficiente intensità di dispersione nell'intervallo di interesse q.
    6. Per i PCM oligonucleotide/pLys-PEG, le esposizioni di 30x 0,2 s a un tasso di ripetizione di 1 Hz producono una buona qualità dei dati con pochi danni percepibili. Per i nuovi campioni, la procedura seguente può essere utile:
      1. Preparare campioni di PCM su una gamma di concentrazioni (ad esempio, 10-10.000 m.c.).
      2. Partendo da una concentrazione intermedia, campioni alternativi di PCM e solo buffer con tempi di esposizione variabili. Vedere di seguito per la procedura di acquisizione e riduzione dei dati. Il segnale di esempio dovrebbe avere buone statistiche (piccolo errore statistico o variazione graduale tra q). Se le statistiche sono scarse, il tempo di esposizione può essere aumentato.
      3. Il segnale del campione dovrebbe anche essere chiaramente distinguibile dallo sfondo sulla gamma q di interesse. Calcolare e tracciare il rapporto (segnale-sfondo)/rapporto di sfondo rispetto a q per determinare il rapporto segnale/sfondo. Se il rapporto segnale/sfondo è basso, la concentrazione del campione deve essere aumentata.
      4. Verificare che l'intensità di dispersione (normalizzata alla concentrazione) sia indipendente dalla concentrazione del campione acquisendo dati a concentrazioni più alte e inferiori, scalando il tempo di esposizione se necessario. Le interazioni tra particelle (la causa più probabile della dipendenza dalla concentrazione) saranno più pronunciate nell'intervallo q basso.
    7. Acquisire dati per campioni PCM e sfondo (ad esempio, buffer con glicerolo).
      1. Innescare la pompa della siringa per spostare il campione attraverso il capillare. Il movimento bidirezionale o una tantudare è accettabile, ma occorre prestare attenzione a isolare ogni campione (ad esempio, inserendo una bolla d'aria tra i campioni). I campioni possono essere recuperati e possono essere riutilizzati se non si riscontrano danni da radiazioni.
      2. Una volta avviato il flusso, attivare il programma di esposizione ai raggi X e di acquisizione dei dati descritto in precedenza. Occorre prestare attenzione al fatto che l'esposizione del fascio termini prima del flusso di liquido.
    8. Dopo ogni campione, eseguire la media azimuthal e tracciare insieme i profili 1D (ad esempio, intensità e q). Devono essere identici all'interno di errori statistici. Cambiare il segnale nel tempo può indicare danni da radiazioni.
      1. I profili anomali isolati possono indicare la presenza di microbolle. Se le bolle vengono osservate frequentemente, può essere utile ridurre la portata.
    9. Media dei profili di dispersione 1D.
    10. Acquisire frequentemente i dati per i campioni solo buffer (una volta ogni 4-5 campioni PCM) e confrontarli nel tempo. L'aumento del segnale proveniente da campioni tampone indica che il capillare può essere contaminato da campioni danneggiati dalle radiazioni.
      1. Quando si nota la contaminazione, lavare il capillare con candeggina e considerare di ridurre il tempo di esposizione, se possibile.
  2. Riduzione e analisi dei dati con Irena
    1. Importare micelle e set di dati ASCII in background (SAS/Data import & export/Import ASCII SAS data).
    2. Sottrarre la dispersione dello sfondo dai dati campione. Tipicamente, i valori q più alti (ad esempio q > 0.5) mostrano una dispersione incoerente dal solvente che domina il segnale. La scalabilità dei dati di sfondo in modo che corrispondano ai dati di esempio in questa gamma q rimuove qualsiasi variazione dovuta alla variazione dell'intensità del fascio e alla concentrazione del campione.
      1. Tracciare il campione e lo sfondo insieme su una scala log-log. Verificare l'intensità piatta ad alta q (SAS/Manipolazione dati/Manipolazione dati I). Calcolare il rapporto campione/sfondo (Dati1/Dati 2), stampare su una scala di log lineare e verificare l'asintomo high-q.
      2. Calcola il rapporto medio (campione/sfondo) su questo intervallo q (usa una macro personalizzata o copia/incolla in un foglio di calcolo dal browser dati).
      3. Utilizzando la macro Manipolazione dati, ridimensionare lo sfondo (ad esempio, Modifica dati 2) utilizzando il rapporto calcolato in precedenza e tracciare il rapporto tra segnale sottratto in background e q ([Data1-Data2]/Data2), verificando che ora aspunti a zero a zero ad alta q. Registrare questo rapporto; dovrebbe essere <1–2% di distanza da 1.0 per ogni campione.
      4. Tracciare il segnale sottratto in background ( Data1-Data2) e salvare i dati con un nuovo nome. Non sovrascrivere i dati originali.
      5. Se i datihigh-q non sono disponibili, utilizzare un fattore di scala pari a 1 per la sottrazione in background, ma tenere presente che le imprecisioni possono essere introdotte negli intervalli q in cui il rapporto segnale/sfondo è ridotto.
    3. Aprire la macro Modellazione (SAS/Modelling), quindi caricare e tracciare i dati sottratti in background (Dati cntrls/Aggiungi dati). Non ridimensionare questa macro.
    4. In primo luogo, trovare un modello approssimativo per la superficie esterna del PCM (dimensioni/forma di micelle):
      1. In Dati cntrls, selezionare l'intervallo q dal basso al moderato (ad esempio, 0,003 USD-1 < q < -0,1USD -1). Se le oscillazioni sono visibili, includerle.
      2. Scegliere un fattore di forma appropriato per i dati. La pendenza a bassa q è indicativa della forma delle nanoparticelle, che può essere verificata anche tramite TEM e/o MALS. Utilizzare i modelli Schulz-'idm spheroid (q0),cilindro (q-1) o cilindro flessibile (q-2). Irena fornisce strumenti per l'adattamento delle leggi di alimentazione (SAS/Support Tools for plots and tables).
      3. In Cntrls modelloselezionare la prima popolazione di dispersione (1P) e assicurarsi che sia l'unica in uso (selezionare la casella di controllo Usa? ).
      4. Selezionare Dimensione dist. per Modello e scegliere il tipo di distribuzione e il fattoredi forma desiderati. Impostare i parametri iniziali per la ricerca immettendo i valori nei campi Scala, Dimensione mediae Larghezza e fare clic su Calcola modello per disegnare il fattore di forma risultante.
        NOTA: il fattore di forma Cilindro flessibile può essere aggiunto come fattore di forma utente e scaricato da https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. I parametri 1 e 2 corrispondono rispettivamente alla lunghezza del cilindro e alla lunghezza di Kuhn.
      5. Una volta trovati i parametri ragionevoli, fare clic su Adatta modello per eseguire un adattamento dei minimi quadrati non lineari ai dati. Il modello di distribuzione Dimensioni fornisce raggio e larghezza medi.
        Per calcolare l'utilizzo della polidispersità (PDI)
        Equation 5
        Come per qualsiasi procedura di adattamento non lineare, potrebbe essere necessario regolare l'intervallo di dati(regione q) e i parametri di partenza per ottenere una misura stabile e fisicamente ragionevole.
      6. Una volta ottenuta una misura ragionevole, salvarla (Memorizza nel notebook/Archivia nella cartella).
    5. Successivamente, modellare la dispersione dei singoli polimeri all'interno del nucleo PCM. Questo può essere catturato da un modello di legge di potenza (ad esempio, q-2 per catene ideali, q-5/3 per catene gonfie, ecc.). Irena implementa questo attraverso un modello Beaucage43:
      Equation 6
      dove P è la legge di potere e G e B sono prefattori.
      1. Regolare i controlli dati per coprire l'intera gamma q e ritracciare il modello (Calcola modello). In genere, la dispersione in eccesso verrà osservata nell'intervallo q da moderato a alto (ad es. q >0,1 USD -1).
      2. Utilizzare i controlli dati per selezionare l'intervallo q in cui viene osservata la dispersione in eccesso (>10x il modello del fattore di forma).
      3. Aggiungere una seconda popolazione di dispersione (2P) e assicurarsi che sia l'unica in uso (deselezionare Usa? per 1P).
      4. Selezionare Livello unificato per il modello. B e P sono i parametri rilevanti. Utilizzare gli strumenti di supporto di stampa o la macro Adatta P/B tra csrs per ottenere un'ipotesi iniziale per questi parametri e regolare i fattori Guinier G e Rg per garantire che il modello non preveda una dispersione eccessiva a q.
      5. Per quanto riguarda il fattore di forma, eseguire un adattamento non lineare e registrare i parametri e il modello.
    6. Successivamente, se è presente un picco di diffrazione, come nella Figura 4, aggiungere un terzo modello per un picco di diffrazione nell'intervallo di interesse q (q : 0,22USD -1 in questo caso).
    7. Una volta ottenuti valori di adattamento approssimativi per le singole popolazioni di dispersione, attivare tutti e tre insieme (selezionare Usa per ciascuno) e ottimizzare l'adattamento combinato.
    8. Verificare che ogni valore rimanga fisicamente ragionevole. Il risultato di questa procedura deve essere un modello composito che descrive i dati SAXS su un'ampia gamma di scale di dimensioni, come illustrato nella Figura 4. Salva la misura usando il pulsante Memorizza nella cartella per memorizzare all'interno di Igor.

6. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

  1. Cryo TEM
    1. Selezionare la griglia. Consigliamo la pellicola a supporto al carbonio Holey su una griglia TEM standard o sul carbonio lacey come alternativa. In entrambi i casi, i fori tra il carbonio forniranno un'area di imaging di ghiaccio puro e vitreo e campione e nessuna pellicola.
    2. Posizionare il lato in carbonio della griglia in un apparecchio di scarico bagliore su uno scivolo di vetro pulito. Avvolgere la diapositiva in pellicola di laboratorio può aiutare con la gestione della griglia. Evitare di toccare il centro della griglia con una pinzetta e pizzicare sempre vicino al bordo della griglia.
    3. Esporre la griglia per 30 s.
    4. Preparare un robot di vetrificazione per la deposizione del campione.
      1. Impostare su 100% umidità e RT e aggiungere carta gonfia. Preparare i bagni liquidi di etano e di azoto liquido alla base del robot. Consulta tutorial e video online per ulteriore assistenza con la preparazione e l'uso dei robot di vitrificazione.
    5. Campione diluito 5x.
    6. Utilizzando le pinzette ad azione negativa fornite con il robot di vitrificazione, raccogliere una griglia, quindi attaccare le pinzette al robot e spostare le pinzette nella camera.
    7. Durante il robot, aggiungere 4 l' l del campione al lato in carbonio della griglia utilizzando una pipetta attraverso il foro nel lato della macchina.
    8. Incubare per 4 min.
    9. Utilizzando il robot, macchia 3-5 s con carta da filtro.
    10. Il robot di vetrificazione immergerà la griglia in etano liquido.
    11. Rimuovere le pinzette e spostare la griglia in azoto liquido e in un contenitore di stoccaggio, che dovrebbe anche essere sotto azoto liquido. Questo processo fissa il campione in un sottile strato di ghiaccio vitreo. Ridurre al minimo il tempo che la griglia trascorre dall'etano liquido o dall'azoto liquido durante questa fase.
    12. Raffreddare il supporto del campione crio con azoto liquido. Tenere un Dewar e serbatoio pieno.
    13. Quando si è pronti per l'immagine, caricare la griglia sul supporto del campione crio. Conservare il campione sotto azoto liquido o brevemente nel vapore di azoto estremamente freddo appena sopra la superficie liquida.
    14. Immagine della griglia a 120 kV tra 75kx e 150kx in ghiaccio sottile e spesso, perché micelle di dimensioni diverse possono preferire un certo spessore del ghiaccio.
      1. Limitare l'esposizione del fascio per evitare lo scioglimento del ghiaccio e danneggiare il campione. Non mettere a fuoco direttamente dove la pianificazione dell'immagine; messa a fuoco nelle vicinanze. Esporre l'area di interesse solo durante l'acquisizione di un'immagine.
      2. Assicurarsi di differenziare le gocce di etano liquido dall'esempio durante la visualizzazione delle immagini (vedere la figura 5).
  2. TEM convenzionale con colorazione negativa
    1. Preparate la macchia.
      1. Far bollire 10 mL di acqua ultrapura. Pesare il formato uranilo (UFo) da 0,1 g in un tubo conico da 15 mL.
      2. Aggiungere 5 mL di acqua calda alla polvere UFo per una soluzione del 2%. Chiudere saldamente e avvolgere in un foglio di alluminio per bloccare la luce. Una macchia di acetato di acetato di uranyl 1% è anche comunemente usato.
      3. Vortice o agitare vigorosamente per 5 min. Filtrare attraverso un filtro di siringa da 0,2 m in un tubo conico pulito.
      4. Lasciar raffreddare 10 min a RT. Aggiungere 25 -L di 5M NaOH e vortice immediatamente per 2 min.
        1. In alternativa, congelare 200 l'aliquota del 2% di UFO. Quando è pronto per l'uso, scongelare un, aggiungere 1 -L l di 5 M NaOH, e vortice per 2 min.
      5. Mantenere le macchie avvolte nella pellicola o lontano dalla luce.
    2. Diluire il campione 10x in 1x PBS (o buffer desiderato).
    3. Selezionare la griglia. Si consiglia una pellicola di supporto al carbonio sulle griglie in rame. Il lato più scuro e lucido della griglia è il lato rivestito in carbonio in cui il campione verrà depositato e macchiato.
    4. Posizionare il lato in carbonio della griglia in un apparecchio di scarico bagliore su uno scivolo di vetro pulito. Vedere il passaggio 6.1.2.
    5. Esporre la griglia per 30 s.
    6. Raccogliere la griglia con il lato carbonio ancora rivolto verso l'alto e tenere con effetto negativo pinzette per il bordo della griglia per evitare di strappare l'area di imaging al centro. Impostare giù le pinzette con la griglia ancora tenuto lato in carbonio.
    7. Applicare una goccia di 4 -L di campione sulla parte superiore (lato carbonio) della griglia con una pipetta.
    8. Incubare 4 min.
    9. A 1 min di euro, pipette una 10 l e una 20 -L goccia di soluzione UFo su un pezzo di pellicola da laboratorio pulita.
    10. Utilizzare la carta filtrante per invogliare il campione dal bordo della griglia (contatto perpendicolare) per evitare qualsiasi contatto con la superficie di imaging.
    11. Utilizzando le pinzette (tenendo ancora la griglia), posizionare immediatamente il lato del campione della griglia verso il basso sulla goccia UFo 10 L, quindi ingrandersi immediatamente il liquido (passo di lavaggio). È importante non lasciare asciugare la griglia, quindi non fermarti tra i passaggi.
    12. Allo stesso modo, applicare la goccia UFo da 20 litri alla griglia. Tenere la griglia sull'UFo per 40 s. Wick il liquido off e lasciare asciugare la griglia.
    13. Immagine della griglia a secco a 120 kV tra 20.000x e 100.000x.
    14. Assicurarsi di smaltire correttamente tutti i materiali contaminati da UFo utilizzando il servizio di sicurezza dell'istituto per le scorie radioattive.
    15. Se necessario, è possibile applicare un miglioramento della luminosità/contrasto e un filtro mediano alle immagini TEM in ImageJ per ridurre il rumore di fondo. La post-elaborazione deve essere eseguita in modo uniforme, solo per le immagini che non vengono utilizzate per misurazioni quantitative come l'intensità e devono essere sempre segnalate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per illustrare i metodi di caratterizzazione descritti in precedenza, mostriamo risultati tipici per i PCM assemblati da oligonucleotidi e copolimeri a blocchi di varie lunghezze e sostanze chimiche (Figura 1). Figura 2 fornisce un esempio di come le dimensioni del nucleo PCM (come determinato da SAXS e TEM, Figura 4 e Figura 5) variava con lunghezza del blocco caricato. La figura 3 mostra i dati DLS e i risultati di adattamento per i PCM sferici formati da copolimeri a blocchi relativamente lunghi e oligonucleotidi a singolo filamento corti. La figura 4 illustra la complessità degli spettri di intensità SAXS combinando in modo accurato i modelli per le correlazioni spaziali multiple presenti (superficie esterna, dispersione intra-core, ordinamento intereeliano) e come MALS potrebbe essere utilizzato per estendere le misurazioni di dispersione a scale di lunghezza più lunghe. Infine, la Figura 5 mostra dati rappresentativi di microscopia elettronica per PCM di morfologia variabile.

Figure 1
Figura 1: Assemblaggio e caratterizzazione dei PCM acidi nucleici. (A) Polimeri anionici, come gli oligonucleotidi, formavano complessi separati di fase con regioni cationiche di copolimeri di disblocco. La presenza di un blocco neutro idrofilo (grigio) ha portato alla formazione di nanoparticelle PCM stabili. (B) I PCM erano nanoparticelle core-shell con più parametri da caratterizzare. La dimensione complessiva (raggio idrodinamico, Rh) può essere determinata utilizzando DLS, il raggio del nucleo (Rc)è stato trovato utilizzando SAXS e TEM, la dimensione della corona potrebbe essere calcolata come Rh-Rce la morfologia potrebbe essere determinata su scale a lunghezza multipla combinando SAXS, MALS e TEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dipendenza dalle dimensioni delle miecelle. La dimensione del nucleo di micelle è stata determinata principalmente dalla lunghezza del blocco caricato del copolimero del blocco, e in gran parte indipendente dalla lunghezza dell'omopolimero7,26. Ciò consente il controllo delle dimensioni PCM mediante la scelta del polimero a blocchi. I dati qui mostrati sono per pLys-PEG con 88 DNA nt/bp e sono stati precedentemente segnalati26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Dispersione dinamica della luce. (A) Funzione di autocorrelazione (unità arbitrarie) per 10 nt DNA a filamento singolo - pLys(100)-PEG(10k) PCM. (B) Distribuzione del raggio idrodinamico (istogramma) da REPES fit. La funzione di autocorrelazione è decaduta in un valore piatto con una singola scala temporale, determinando un picco di dimensione singola nella distribuzione delle dimensioni REPES. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rappresentativi dei dati SAXS e MALS e adatti a una micelle cilindrica. I dati SAXS (cerchi grigi) vengono visualizzati per i PCM assemblati da pLys(50)-PEG(5k) e 88 bp di DNA a doppio filamento. A bassa q (< 10-2 -1), l'intensità ha mostrato una dipendenza di circa q-2 dal trasferimento di momento, implicando una forma flessibile del cilindro (micelle simili a verme). I dati MALS (cerchi neri aperti) mostrano la stessa dipendenza, indicando che le micelle avevano una lunghezza di almeno diversi micrometri (confermate dall'imaging TEM, Figura 5C,D). Le micelle spheroidale mostrerebbero una dipendenza piatta (q0) di intensità su q in questo intervallo. Le linee colorate illustrano la procedura di adattamento multicomponente per i dati PCM SAXS descritta nella sezione 5. La dispersione a q basso (scale di grandi dimensioni) è stata dominata dalla superficie esterna del PCM e si adatta bene a un modello di cilindro flessibile (rosso). A valori q più alti (scala di lunghezza più piccola), la dispersione è stata dominata dai singoli polimeri all'interno del nucleo PCM, adattati qui da una legge di potenza (verde) con basso qoff. Abbiamo anche osservato l'imballaggio parallelo di eliche di DNA a doppio filamento all'interno del nucleo PCM, con conseguente picco di diffrazione quasi-Bragg (blu). La linea tratteggiata nera mostra che combinando questi modelli descriveva accuratamente i dati SAXS e l'aggiunta di dati di dispersione della luce (cerchi aperti) ha esteso l'intervallo di dimensioni su quasi quattro ordini di grandezza. I risultati dell'adattamento hanno dato a una popolazione PCM con raggio medio 11,0 nm e PDI , la legge sull'alimentazione ad alta q - 1,81 e il picco di diffrazione rappresenta la spaziatura intereelica di 2,71 nm. I dati SAXS sono stati precedentemente riportati26 e sono disponibili al pubblico44. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: immagini TEM di PCM acidi nucleici. (A–B) Cryo TEM di 22 nt single-stranded DNA - pLys(50)-PEG(5k) PCM, che mostra la morfologia prevalentemente sferica. Le frecce blu indicano goccioline di etano liquido, da non confondere con i PCM (oggetti sferoidali strutturati). (A) è leggermente sotto-focalizzata, aggiungendo un leggero contrasto pur preservando la risoluzione. (B) è sostanzialmente sotto-focalizzato, aggiungendo più contrasto, ma sacrificando la chiarezza. Le regolazioni di luminosità e contrasto e un filtro mediano a due pixel sono stati applicati a entrambe le immagini. (C-D) TEM colorato negativo di 88 bp di DNA a doppio filamento : pLys(50)-PEG(5k) PCM, che sono lunghi cilindri flessibili. In entrambi i casi, i raggi di base di TEM erano coerenti con i valori ottenuti dall'adattamento dei dati SAXS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Come accennato in precedenza, i protocolli qui presentati sono scritti con un focus sugli oligonucleotidi come componente di polianione e pLys-PEG come copolisimero di blocchi cationici-neutri-neutri, ma li abbiamo testati con una varietà di polimeri, come polimero (acido acrilico), poliglutamate e PEG-poly (vinybenzl'altro trimethylammonium), e crediamo che saranno generalmente applicabili per la maggior parte delle coppie polielettroli. Un parametro che potrebbe essere necessario ottimizzare è la concentrazione di sale utilizzata per l'annessione, perché dovrebbe essere sufficientemente elevata da non formare i PCM all'inizio dell'anale. Questo può essere controllato sperimentalmente da DLS, o rispetto all'osservazione della separazione di fase con i polielettroliti da solo (nessun blocco neutro). L'annessione termica può essere utilizzata se l'annessione del sale è indesiderabile, anche se le polidispersità risultanti sono più grandidi 7. Le concentrazioni utilizzate per la caratterizzazione potrebbero anche essere ottimizzate, perché le nanoparticelle più grandi disperdono più luce di quelle piccole, e gli acidi nucleici sono più efficienti nei raggi X di dispersione rispetto a molti altri polimeri a causa della presenza di atomi di fosforo densaditi di elettroni nella spina dorsale. Potrebbe anche essere necessario controllare più da vicino il pH del buffer se uno dei polielettroliti ha un pKa vicino alla condizione di lavoro.

In questo articolo presentiamo protocolli per due tecniche di dispersione della luce (ad esempio, dispersione di luce multi-angolo/statica e dispersione dinamica della luce), nonché dispersione a raggi X a piccolo angolo, e la microscopia elettronica a trasmissione di macchie negative crio-convenzionali crio-convenzionali, con dati rappresentativi per ciascuna. Non tutte le tecniche sono necessarie per tutti gli scenari, e altre sono disponibili, sollevando la questione di quale dovrebbe essere impiegato quando. Esiste un'ampia letteratura di revisione su questo argomento45,46, ma suggeriamo quanto segue quando si caratterizza un nuovo PCM o nanoparticella simile. Iniziare controllando l'aggregazione, sia mediante ispezione visiva per torbidità che mediante microscopia ottica. Se non si osserva alcuna aggregazione, il passo successivo è quello di determinare se esistono nanoparticelle. DLS è un modo rapido per determinare questo perché i PCM disperdono la luce vigorosamente, e la diffusione della luce debole o inesistente è un forte indicatore di scarsa formazione di nanoparticelle. Mentre DLS può confermare la presenza di nanoparticelle, è difficile determinare la loro dimensione e forma senza riferimento ad altri dati, poiché la maggior parte dei metodi di analisi si basano sulla relazione Stokes-Einstein, che presuppone particelle sferiche. MALS può confermare le forme sferiche (intensità normalizzata piatta rispetto all'angolo) ma potrebbe non essere in grado di determinare la forma delle particelle non sferiche a meno che la distribuzione delle dimensioni non sia stretta e rilevi l'intervallo corretto per la risoluzione. Di conseguenza, si consiglia di eseguire TEM, SAXS o entrambi su qualsiasi campione PCM al fine di caratterizzarne completamente le proprietà.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Phil Griffin e Tera Lavoie del Soft Matter Characterization Facility e Advanced Electron Microscopy Facility, rispettivamente, presso l'Università di Chicago. Ringraziamo anche xiao bing Eo e Soenke Seifert dell'Advanced Photon Source presso l'Argonne National Laboratory e il NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) per il supporto. Ringraziamo Jeff Ting e Michael Lueckheide per il loro contributo a questo lavoro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System - a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin - a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Materials Data Facility. , 10.18126/M2QW8R (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Tags

Chimica Numero 157 consegna di acido nucleico complesso polielettrolittico micelle nanoparticelle separazione di fase oligonucleotidi
Assemblaggio e caratterizzazione di Micelle complesse di polielettroliti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marras, A. E., Vieregg, J. R.,… More

Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter