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Chemistry

폴리전해질 복합 미셀의 조립 및 특성화

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

당사는 폴리전해질 복합 미셀, 폴리전해질 및 친수성 전하 충전되지 않은 블록 공중합체에 의해 형성된 코어 쉘 나노입자를 설계, 조립 및 특성화하기 위한 프로토콜 및 대표 데이터를 제공합니다.

Abstract

다연화 질화 복합 미셀 (PCMs), 수성 용액에서 충전 된 폴리머의 자체 조립에 의해 형성 된 코어 쉘 나노 입자는 다연화 물질 상호 작용의 물리학을 탐구하기위한 강력한 플랫폼을 제공하고 또한 유망한 솔루션을 제공합니다. 생체 내에서 치료 올리고뉴클레오티드를 전달하는 시급한 문제. PCM에 대한 예측 구조-특성 관계를 개발하는 것은 나노 입자 자체 조립 중에 강력한 운동 트랩이 존재하기 때문에 부분적으로 어렵다는 것이 입증되었습니다. 이 문서에서는 PCM 시공을 위한 폴리머 선택 기준에 대해 설명하고 반복 가능한 저다분산성 나노입자의 조립을 가능하게 하는 염조를 기반으로 하는 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 빛 산란, 작은 각도 X 선 산란 및 전자 현미경 검사법을 사용하여 PCM 특성화에 대해 설명합니다.

Introduction

반대로 충전 된 폴리 전해질이 수성 용액에 혼합되면, 그들의 카운터션의 방출로 인한 엔트로피 이득은 용액을 중합체가 풍부한 응축상으로 분해하고 중합체 고갈 된상층1,2,3,4,5,폴리 전해질 복합화로 알려진 현상을 일으킨다. 중성 친수성 블록이 폴리전해질 중 하나 또는 둘 다에 공액화되는 경우, 나노스케일 상 분리가 대신 발생한다(도1A). 생성된 자체 조립 된 코어 쉘 나노 입자는 다양하게 시스템의 모든 구성 요소가 친수성6,7임에도불구하고, 계면 활성제 미셀화에 비유하여 폴리 전해질 복합 미셀 (PCM), 폴리이온 복합 미셀, 블록 이오노머 복합체 또는 응축코어 미셀로 지칭된다. 단백질 및 핵산과 같은 친수성 분자를 캡슐화하는 PCM의 능력뿐만 아니라 블록 공중합체 담체 아키텍처에 의해 제공되는 광범위한 튜닝성은 생체 내 치료분자를생체 내에서 전달하기위한 매력적인 후보를 만든다8,9,10, 11,12, 13.

세포 표적에 치료 핵산을 전달하는 것은 특히 중요한 도전이며, PCM은 몇 가지 이점을 제공합니다. 치료핵산(유전DNA, mRNA 및 siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드)은 인간의 건강을 개선하기 위한 엄청난 잠재력을 가지고 있지만, 그 잠재력을 실현하기 위해서는 수많은 생물학적 및 물리적 장벽을 극복해야 한다14,15,16. 베어 핵산은 혈청과 세포 뉴클레아제에 의해 분해되고, 순환에서 빠르게 제거되며, 강한 음전하가 도움없이 세포막을 관통하는 것을 어렵게 만듭니다. 이러한 장벽을 극복하기위한 현재의 접근법은 소수성 상호 작용을 통해 조립 된 다양한 지질 나노 입자로의 뉴클레아제 및 / 또는 캡슐화로의 손상을 방지하기 위해 비용이 많이 드는 화학 적 변형을 포함15,17,18. 이러한 방법은 국소 주사 및 간 표적화에 효과가 입증되었지만, 전신 사용은 독성, 면역원성 및 제한된 생체 분포16의상당한 한계를 제시한다. 대조적으로, PCM은 핵산의 음전하를 사용하여 위상 분리 코어 내에서 응축하는 반면, 중성 코로나는 타게팅 또는 내재화를 향상시키기 위해 리간드를 통합하는 플랫폼뿐만 아니라 분해에 대한 고정 장벽을 제공합니다11,19. 생체 외 및 동물 연구에 따르면 PCM은 다양한 핵산 페이로드20,21,22,23,24를효과적으로 전달할 수 있지만 구성 폴리머의 특성에서 크기, 모양 및 안정성과 같은 PCM 특성을 예측하는 능력의 약점은 더 넓은 채택을 방해했습니다.

우리 그룹 및 현장에서 다른 사람들에 의한 최근 연구는 구조-성질을 개발함으로써 이 문제를 해결하기 시작했으며, 경우에 따라 핵산 및 다양한 양이온 중성 중합체7,25,26,27로형성된 PCM에 대한 구조-특성-기능 관계를 개발하고 있다. 이러한 연구에서 나온 두 가지 일관된 주제는 PCM 어셈블리를 위한 잘 제어되고 반복 가능한 프로토콜을 개발하는 것의 중요성과 결과 나노 입자를 특성화하기 위해 여러 기술을 사용하는 이점입니다. 폴리전해질, 특히 핵산과 같은 전하 밀도가 높은 사람들은 서로 매우 강하게 상호 작용하며, 혼합 시 쉽게 문제가 되는 것처럼 보이며, PCM 제제는 절차의 작은 변화에 매우 민감하며 배치마다 높은 다분산성과 불쌍한 반복성을 표시합니다. PCM은 또한 구성 요소의 원자 수준 구성에 따라 다양한 모양과 크기를 채택하는 것으로 나타났으며, 특히 동적 광 산란(DLS)과 같은 일부 일반적인 기술은 해석을 위해 입자 모양에 대한 가정이 필요하기 때문에 개별 특성화 기술로 이러한 다양성을 캡처하는 것은 매우 어렵습니다.

이 기사에서는 올리고뉴클레오티드 및 양이온 중성 디블록 공중합체에 중점을 둔 PCM의 재료 설계 및 선택에 대해 논의합니다. 그런 다음 PCM 조립 중에 운동 트래핑을 피하기 위해 느린 투석을 위해 높은 염 농도를 사용하는 소금 어닐링 프로토콜을 설명합니다. 폴리전해질은 정전기 적 매력이 스크리처되는 높은 염분 조건에서 혼합된 다음 염 농도가 서서히 낮아져 폴리전해질이 가장 정력적으로 유리한 구성에 정착할 수 있도록 하며, 이는 열 어닐링의 느린 냉각 과정과 유사합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 정기적으로 올리고 뉴클레오티드 PCM7,26에대한 매우 낮은 다분산성과 높은 반복성을 달성 할 수 있습니다. 마지막으로, 외부 형태에서 내부 구조에 이르기까지 매우 광범위한 길이 척도에서 DLS, 다각형 광 산란(MALS), 소형 각도 X선 산란(SAXS), 투과 전자 현미경(TEM)에 이르기까지 4가지 개별 측정 기술을 사용하여 PCM을 특성화하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 이 프로토콜이 더 많은 연구자들이 이 흥미로운 나노입자의 기능을 효과적으로 탐구할 수 있기를 바랍니다.

폴리머 선택 및 준비
PCM 특성은 구성 폴리머의 물리적 및 화학적 특성에 의해 크게 영향을 받아 폴리머 선택을 설계 공정에서 중요한 단계로 만듭니다. 핵산 PCMs를 위한 가장 잘 특징지어진 블록 공중합체는 폴리(lysine)-폴리(ethylene glycol)(pLys-PEG)와 같은 선형 디블록이지만, PCM은 폴리전해질과 다양한 친수성 중화기 사이에서 형성될 수 있으며, 이는 높은 처리량 방식으로 생성될 수 있다28. 충전된 그룹의 선택은미셀(26)의이온 페어링 및 형상의 안정성에 강하게 영향을 미치며, PCM 크기는 충전된 블록5,7,26(도 26)의길이에 따라 증가하는 것으로 나타났으며, 따라서 원하는 애플리케이션의 요구 사항에 맞게 PCM 특성을 조정할 수 있도록 한다. 선형 디블록의 경우, 충전된 블록에 최소 10개의 충전이 있어야 하며 원하는 pH에서 강하게 충전되어야 합니다. 더 오래 충전된 블록은 siRNA와 같은 올리고뉴클레오티드를 가진 PCM 형성을 촉진할 수 있고, 이는 더 짧은블록(21)과함께 복잡하기 어렵다. 우리는 성공적으로 200까지 블록 길이와 PCM 형성을 관찰하고, 문헌은 더 긴 중합체를 기술합니다. 더 많은 유연성은 중립 블록(24)의선택에서 사용할 수 있지만, 경험은 매우 짧은 중립 블록이 나노 입자 형성보다는 응집으로 이어질 것으로 나타났습니다, 충전 된 블록 길이에 따라 최소 중립 길이가 증가한다는 것을. plys-PEG의 경우 최소 3,000~5,000의 PEG MW가 ~50 이하의 plys 길이에 필요하며, 충전된 블록이 더 증가함에 따라 더 긴 길이가 필요합니다. 중립 블록 길이가 증가하면 중성 중합체의 입체 밀집성 군집으로 인해 PCM 크기, 특히 쉘 두께가 증가합니다.

이 원고는 동질성 고순도 pLys-PEG 및 알려진 수량의 올리고뉴클레오티드에서 PCM을 준비하기위한 프로토콜을 제공하지만 다른 시스템에도 쉽게 적응할 수 있어야합니다. 우리는 폴리 아르 기닌과 폴리 글루타믹 산을 포함한 여러 충전 된 폴리 펩티드뿐만 아니라 폴리 아크릴 산 및 폴리 (비닐 벤질 트리메틸 라모늄)와 같은 여러 합성 폴리 전해질로 성공적으로 테스트했습니다. 우리는 또한 다전기 분해 전하의 stoichiometric 비율로 PCM을 준비하는 것을 기술합니다, 그러나 이것은 쉽게 수정됩니다. 우리는 또한 자연적으로 완전히 충전되지 않은 폴리머를 수용 충전 농도 단위 (c.c.)에서 작동하는 것이 가장 쉬운 찾을 수 있습니다. 중합체 중 어느 하나도 잘 특성화되지 않은 경우, 폴리머 길이/질량을 정확하게 결정하고 투석에 의한 전하 중화에 필요한 것 이상으로 과도한 염분이 존재하지 않도록 주의해야 합니다. 농도가 계산될 때 보유수의 존재도 고려해야 합니다. 핵산 농도는 260 nm에서의 흡광도에 의해 편리하게 정량화될 수 있으며, c.c를 계산할 때 말단 인산염의 유무를 고려해야 한다.

올리고뉴클레오티드를 폴리아나온으로 사용하는 경우, 혼성화 상태 및 화학적 구조는 자가 조립에 대한 성향 및 생성된 PCM5,7,26의특성을 결정하는 데 도움이 됩니다. 이들을 최적화하면 PCM을 사용하여 전달을 위해 사용하는 경우 생물학적 효능에 대한 요구 사항 내에서 원하는 구조를 형성할 가능성이 높아집니다. 혼성화를 분석하기 위한 유용한 도구로는 핵산용 MATLAB 기능, NUPACK29및 IDT 올리고분석기 등이 있습니다. 후보 서열을 분석하여 1) 헤어핀 형성에 대한 결합 강도를 이해하는 것이 좋습니다. 2) 동일한 시퀀스의 또 다른 사본(자가 이광); 및 3) 시스템에 존재하는 다른 올리고뉴클레오티드에. 특정 서열에 대한 DNA 및 RNA 용융 온도는 또한 가장 가까운 이웃 방법30,31을사용하여 계산될 수 있다. 핵산의 열 어닐링 (단계 2.3)은 개별 뉴클레오티드에서 임의의 잔류 이차 구조를 변성시키고 평형 폴딩을 촉진합니다.

PCM 특성화 및 분석
정적 및 동적 광 산란, 전자 또는 중성자의 작은 각도 산란 및 전자 현미경을 포함한 나노 입자를 특성화하는 데 다양한 기술이 제공됩니다. 이 문서에서는, 우리는 2개의 광 산란 기술, 작은 각 엑스레이 산란 및 2개의 전자 현미경 기술에 대한 프로토콜을 제공합니다.

DLS는 샘플의 브라운 모션에서 한 각도로 산란 강도의 시간 적 변동의 자기 상관을 측정합니다. 이 데이터를 피팅하면 구형 미셀에 대한 유체역학적 반지름 및 다분산성을 제공할 수있습니다(그림 3). 다중 각도 라이트 산란(MALS)은 여러 각도에서 정적 산란 강도를 측정합니다. 이 각도 의존성은 나노 입자의 모양을 설명하지만 가시 광선의 경우 ~ 50 nm보다 긴 길이 스케일로 제한되어 더 작은 나노 입자에 대한 효과를 제한합니다. 두 기술은 굴절률 불일치를 기반으로 하며 주로 나노입자의 외부 치수를 설명합니다.

작은 각도 X선 산란(SAXS)은 X선을 산란 프로브로 사용하며 파장이 짧을수록 ~0.1-100nm 범위에서 측정할 수 있습니다. 관찰된 산란 강도 대 각도(통상적으로 운동량 전달 q로표현)를 피팅하면 PCM 형태(즉, 크기 및 모양)와 내부 구조에 대한 정보를 제공합니다. 절대 강도 교정을 사용할 수 있고 산란 강도를 0 각도로 추정할 수 있는 경우 PCM 질량 및 집계 번호도32로추정할 수 있으므로 SAXS는 매우 다양하고 가치 있는 방법입니다. 작은 각도 중성자 산란 (SANS)은 길이 스케일의 유사한 범위에 민감하지만 전문 시설에서만 사용할 수 있으며 이조33,34,35에서명시적으로 논의되지 않습니다.

최근 몇 년 동안 벤치 탑 SAXS 계측기의 출현을 보았지만, 싱크로트론 소스가 PCM 특성화에 더 적합하다는 것을 알게되었습니다. 고급 광자 소스(아르곤 국립 연구소, 미국)의 Beamline 12-ID-B에서 PCM SAXS 데이터를 사용자 관점에서 수집하기 위한 간단한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 대부분의 싱크로트론 소스에 적용되어야 하지만 실험을 제안하기 전에 현지 직원과 상의하는 것이 좋습니다. 우리는 또한 Irena36,Igor Pro를 위해 작성된 매크로의 무료 세트를 사용하여 데이터 감소 및 분석 프로토콜을 제공합니다. Irena는 SAXS 데이터를 모델링하기 위한 다양한 폼 팩터 세트를 포함하고 있으며 PCM의 복잡한 산란 프로파일을 설명할 수 있는 다성분 모델을 구성할 수 있습니다(대표 결과, 그림 4참조). Irena는 또한 포괄적인 문서와 자습서를 온라인으로 사용할 수 있습니다. 아래 절차를 시도 하기 전에 이러한, 특히 자습서 "두 개의 주요 분산 모집단SS 데이터 모델링"에 익숙해 하는 것이 좋습니다.

방사선 손상은 X선 산란의 문제이지만 이를 최소화하기 위해 여러 가지 조치를 취할 수 있습니다. 특히, 밀폐된 모세관이 아닌 데이터 수집 중에 흐르는 주사기 펌프 및 PCM 샘플이 있는 유량 셀 설정을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 또한 크게 배경 뺄셈을 단순화. 우리는 또한 샘플의 단일 볼륨이 보는 플럭스를 제한하고 노출 데이터를 비교하여 손상을 식별 할 수 있도록하기 위해 흐르는 샘플의 여러 노출을 하나이상 복용하는 것이 좋습니다.

일반적으로 해석하기 위해 피팅을 필요로 하는 산란 기술과는 달리, 투과 전자 현미경(TEM)은 샘플을 통해 전자 빔을 통과하고 침전 스크린상에 이미지를 투사함으로써 나노입자의 실제 공간 시각적 이미지를제공한다(도 5). 이 문서에서는 두 가지 TEM 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다. Cryo TEM은 미셀 샘플을 유리체 얼음의 얇은 층으로 동결시켜 최소한의 이물질로 구조적 변형을 보존하여 반경 미셀 ≤~10-100 nm에 최적입니다. 네거티브 스테인 TEM은 중금속 염(예: 우라늄)을 사용하여 그리드 표면에서 건조된 후 시료를 둘러싸습니다. 조밀 한 얼룩은 대비를 추가하고 샘플의 부정적인 이미지를 생성, 샘플보다 더 많은 전자를 산란합니다. 고품질 이미지에는 Cryo TEM이 권장됩니다. 그러나 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리며 대비가 충분하지 않을 수 있습니다. 이것이 우려되는 경우, 부정적인 염색 샘플을 사용해야합니다. 각각의 예는 그림 5에도시되어 있습니다.

이러한 각 기술은 서로 다른 강점과 한계를 가진 나노 입자의 약간 다른 양상에 보고합니다. 광 산란은 쉽게 사용할 수 있으며 종종 가장 빠른 접근 방식이지만 크기와 형상 해상도에는 상당한 제한이 있습니다. SAXS는 합리적으로 높은 처리량으로 광범위한 길이 스케일에 대한 정보를 제공할 수 있지만 데이터를 수집하기 위한 특수 장비와 이를 해석하기 위한 모델링이 필요합니다. TEM 이미지는 해석하기 쉽지만 대조적으로 제한될 수 있으며 본질적으로 처리량이 낮습니다. 우리의 경험은 특성화를 위해 여러 기술을 사용하면 PCM 속성에 대해 얻을 수있는 정보가 크게 증가하고 각 기술에서 얻은 데이터 세트의 해석을 단순화하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어 SAXS와 TEM은 주로 PCM의 조밀한 코어를 검사하는 반면, 광 산란은 나노 입자의 전체 치수에 대한 보고서를 작성합니다. 따라서 이를 결합하면 코어와 코로나 크기를 모두 측정할 수 있습니다. 실제 공간 이미지를 획득하는 TEM의 기능은 근거 자료 데이터를 제공하여 모호할 수 있는 SAXS 데이터를 모델링하는 데 적합한 폼 팩터를 선택할 수 있도록 합니다. 이 문서에서는 네 가지 기술에 대한 프로토콜에 대해 설명하고 이를 사용하여 알 수 없는 샘플을 특성화하는 예제 프로세스가 토론 섹션에 제공됩니다.

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Protocol

1. 재료준비

  1. 동약 성 디블록 폴리머를 계량하고 10 mg/mL 최종 농도의 재고 용액에 필요한 거의 부피까지 물을 추가하십시오. 최대 속도로 소용돌이 2분.
  2. 5 분 동안 초음파 처리. 매우 긴 디블록은 추가 초음파 처리가 필요할 수 있습니다. 스톡 솔루션은 완전히 투명하고 균일하게 나타납니다.
  3. 필요에 따라 NaOH 또는 HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 최종 볼륨에 물을 추가합니다. pLys-PEG 솔루션은 상당히 안정적이지만 장기간 보관을 위해 냉장 보관해야 하며 사용하기 전에 pH를 확인해야 합니다. 동결하는 것이 바람직하다.
  4. 원하는 스톡 농도에서 동형성 올리고뉴클레오티드(들)를 재중단하고, 전형적으로 50 nt 이하의 길이에 대해 2-5 mM 분자 농도를 재중단한다. 완전히 용해를 보장하기 위해 철저히 소용돌이.
  5. 소개서에 설명된 대로 분자량 또는 길이를 사용하여 어금니 농도를 계산합니다.
  6. 어금니 전하 농도(c.c.)를 계산합니다.

Equation 1

다연화전하전하는 전하단량의 수이며, 핵산 전하는 염기의 수에서 인산이 없다고 가정하여 마이너스 1이다. 이중 가닥 DNA는 단일 가닥 DNA에 비해 분자 당 두 배 많은 전하를 가질 것이라는 점을 명심하십시오.

  1. 각 폴리머에 대해 20 mM c.c.에서 희석 된 스톡을 만듭니다.

2. 핵산 다연산 미셀 제제

  1. 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에서 다음을 총 부피 280 μL로 혼합하십시오.
    1. 200 μL의 뉴클레아제 없는 물 (핵산을 포함하지 않는 PCM용 초순수).
    2. 40 μL의 10x 인산완충식염수(PBS, 137 mM 염화나트륨, 10 mM 인산염, pH 7.4 시 1x로 희석시) 또는 기타 적합한완충액(37).
    3. 40 μL 의 20 mM c.c. 올리고뉴클레오티드. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 경우, 20 mM c.c.에서 각 가닥의 20 μL을 추가하십시오.
  2. 70°C에서 5분 동안 올리고뉴클레오티드 용액을 배양한다. 올리고뉴클레오티드에 대한 계산된 용융 온도가 높으면, 그에 따라 온도를 증가시켜야 한다. RNA는 높은 온도에서 저하되므로 이 단계나 다른 민감한 구성 요소가 존재하는 경우 이 단계가 더 이상 나타나지 않아야 합니다.
  3. 15분 동안 식히세요. 20 mM c.c. 디블록의 40 μL을 추가한 다음 최대 속도로 20초 동안 즉시 소용돌이를 치세요. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 소금 어닐을 수행합니다.
    1. 80 μL의 5M 염화나트륨을 첨가하여 1 M NaCl의 최종 농도와 400 μL의 최종 부피를 넣습니다. 최대 속도로 10초 동안 소용돌이.
    2. 실온에서 10 분 동안 배양 한 다음 투석 카트리지에로드하십시오. 나열된 분자량 차단은 구형 단백질에 대해 결정되며 선형 폴리머의 경우 정확하지 않습니다. 우리는 2k MWCO 카트리지가 샘플 손실을 방지하고 또한 이온 강도의 점진적 변화를 제공한다는 것을 발견합니다.
    3. 투석 목욕을 준비하십시오.
      1. 필요한 투석 목욕의 볼륨을 계산 :
        Equation 2
      2. 10x PBS (또는 다른 원하는 버퍼), 5 M NaCl 및 초순수를 혼합하여 1x PBS 및 0.5M NaCl의 최종 용액과 1x PBS의 두 가지 용액을 혼합합니다.
    4. 투석 카트리지를 로드합니다.
      1. 영구 마커가 있는 카트리지에 레이블을 지정합니다. 카트리지를 버퍼에 2분 이상 담그면 멤브레인에 수분을 공급합니다.
      2. 시계 반대 방향으로 비틀어 캡을 제거합니다. 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 샘플을 로드합니다. 멤브레인을 부드럽게 압착하여 여분의 공기를 제거합니다. 캡을 교체합니다.
      3. 카트리지를 1x PBS, 0.5 M 염화나트륨 투석 욕조에 넣습니다. 카트리지는 욕조에 노출 된 두 멤브레인과 함께 떠 있어야합니다. 필요한 경우 폼 수레를 사용할 수 있습니다.
    5. 투 석
      1. 마그네틱 교반 막대로 천천히 교반하는 24시간 동안 배양합니다.
      2. 카트리지를 1x PBS 또는 기타 원하는 작업 버퍼의 새 욕조로 이동합니다. 24 시간 동안 배양하고 자석 교반 막대로 천천히 저어줍니다. 이 단계를 반복합니다.
    6. 샘플을 복구합니다.
      1. 욕조에서 카트리지를 분리합니다. 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 캡을 제거하고 샘플을 복구합니다. 회수된 부피는 막 부종으로 인해 초기 400 μL보다 높을 수 있습니다. 약간의 희석이 우려되는 경우 복구된 볼륨을 기록합니다.
      2. 깨끗한 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 샘플을 넣습니다. 이런 식으로 제조된 PCM은 뉴클레아제 오염을 피할 수 있는 경우 냉장 보관할 때 몇 달 동안 안정적이어야 합니다.

3. 동적 빛 산란

  1. 먼지가 없는 상태를 보장하기 위해 버퍼는 신중하게 여과(0.22 μm 주사기 또는 진공 필터를 통해 3배 필터링) 및 샘플 간에 철저히 세척된 유리 제품을 세척해야 합니다. 또한 측정을 수행하기 전에 시료가 열 평형에 도달했는지 확인하는 것도 중요합니다.
  2. PCM 샘플을 원하는 작업 버퍼로 0.2 mM c.c.(위에서 설명한 프로토콜을 사용하는 경우 10배)로 희석하고 적합한 큐벳에 로드합니다. 우리는 희석 후 시료의 ~ 200 μL을 필요로하는 소량의 큐벳을 사용합니다.
  3. DLS 검출기 위치를 90°로 설정합니다.
  4. 가능하면 레이저 전력 및/또는 감쇠기 속도를 초당 100,000-200,000카운트(cps)로 조정합니다. 카운트 속도는 10kcps까지 사용할 수 있지만 좋은 통계를 얻으려면 측정 시간을 연장해야 할 수 있습니다(4.1단계). 다중 산란이 측정을 혼동하므로 더 높은 개수 율을 피해야 합니다.
  5. 1분 동안 데이터를 수집합니다. 카운트 속도는 전체 수집 시간에 걸쳐 일정해야 합니다. 그렇지 않은 경우 샘플 또는 계측기의 일부 구성 요소가 아직 평형화되지 않은 것을 나타냅니다.
  6. 자기 상관 데이터를 검사합니다. 장시간 기준선은 매우 평평해야 하며, 그림 3A와같이 자기 상관 곡선은 최소한의 산란으로 원활해야 합니다. 기준선 드리프트는 평형이 부족했음을 나타내며, 더 많은 데이터를 수집하여 데이터의 노이즈를 개선할 수 있습니다.
  7. 자기 상관 함수에 맞춥습니다.
    1. REPES38,39를 사용하여 정규화된 역 라플라스 변환을 수행하여 이완 시간 및 확산 계수D의 분포를 제공합니다. 이 방법은 스토크스 - 아인슈타인 방정식을 사용하여 유체 역학 반지름, Rh를계산합니다.
      Equation 3
      도 1B는 Rh의 표현을 나타내고 도 3B는 REPES의 결과를 나타낸다.
    2. 또는 CONTIN40,41(대체 정규화 알고리즘) 또는 음수가 아닌 최소 제곱 피팅(NNLS)을 포함한 다른 방법을 사용합니다. 여러 피팅 방법의 일관된 결과는 고품질 데이터의 서명입니다. 누적 해석(많은 계측기의 표준)은 다중 모달 크기/길이 분포에 대해 비물리적 값을 제공합니다.

4. 멀티 앵글 라이트 산란

참고: 광 산란 강도 대 각도는 다양한 계측기에서 측정할 수 있습니다. 우리는 배치 모드에서 실행, 고니 오미터 기반 의장비와 다중 검출기 악기를 모두 사용하여 좋은 결과를 얻었다.

  1. PCM 농도와 조명 강도를 조정하여 검출기를 포화하지 않고도 모든 각도에서 충분한 신호/잡음 과 버퍼 전용 샘플을 제공합니다. 후자는 다양한 희석 인자에서 샘플을 준비하고 강도 대 농도의 선형성을 확인하여 테스트 할 수 있습니다 (PCM 간의 최소한의 상호 작용을 가정).
  2. 광 산란 속도를 15°에서 135°로 1분당 1분 동안 기록합니다. 시료와 계측기의 균형이 적절히 조정되면 측정 시간 동안 산란 속도가 일정하게 유지됩니다.
  3. 정규화 된 산란 속도를 플롯, 나는죄 (θ), 대 q, 나는 산란 속도입니다. q는 에 의해 정의된 산란 벡터(광자 운동량 전달)입니다.

Equation 4

여기서 θ = 용매 굴절률, θ = 측정 각도 및 λ = 광원의 파장. 도 4는 MALS 산란 강도의 플롯을 나타낸다.

5. 작은 각도 X 선 산란

  1. 데이터 수집
    1. 배경 위의 충분한 산란을 위해 올리고뉴클레오티드 PCM에 대한 2 mMM 전하 농도에서 위에서 설명한 바와 같이 PCM 샘플을 준비합니다. 무거운 원자가 부족한 PCM의 경우 (예 : 핵산의 인) 더 높은 농도가 필요할 수 있습니다. 산란 길이 밀도는 SASSIE42와같은 계산기를 사용하여 추정될 수 있다.
    2. 자유 라디칼을 청소하여 방사선 손상을 최소화하기 위해 농축 된 글리세롤 (예 : 50 %)을 추가하십시오. 미셀 용액에 1 % (v / v) 글리세롤이 들어 있도록 스톡 솔루션. 깔끔한 글리세롤은 점성이 높고 정확하게 측정하기가 어렵습니다. 물이나 버퍼로 희석하는 것이 좋습니다.
    3. 배경 모니터로 사용하기 위해 1 % 글리세롤로 많은 양의 작업 버퍼를 준비하십시오.
    4. 빔라인 특정 유량 셀 장치 및 교정 검출기를 준비합니다. 이 프로토콜은 직경이 작은 컴퓨터 제어 주사기 펌프에 연결된 3mm 직경의 석영 모세관을 사용하며 최소 길이의 폴리에틸렌 튜브를 사용합니다. 이 설정에서는 샘플당 ~140 μL의 최소 부피가 필요합니다.
    5. 샘플 노출 매개 변수를 결정합니다. 최적 노출은 빔 강도, 검출기 감도 및 농도, 산란 강도 및 샘플의 손상 감수성에 따라 달라질 수 있지만, 목표는 관심 있는 q 범위에 걸쳐 충분한 산란 강도를 얻기 위해 필요한 최소한의 플럭스에 샘플을 노출시키는 것이다.
    6. 올리고뉴클레오티드/플리스-PEG PCM의 경우 1Hz 반복 속도로 30x 0.2의 노출이 지각 가능한 손상으로 양호한 데이터 품질을 생성합니다. 새 샘플의 경우 다음 절차가 도움이 될 수 있습니다.
      1. 다양한 농도(예: 10-10,000 μM c.c.)에 걸쳐 PCM 샘플을 준비합니다.
      2. 중간 농도에서 시작하여 다양한 노출 시간을 가진 대체 PCM 및 버퍼 전용 샘플. 데이터 수집 및 감소 절차는 아래를 참조하십시오. 샘플 신호는 양호한 통계(작은 통계 적 오차 또는 q에대한 원활한 변동)가 있어야 합니다. 통계가 좋지 않으면 노출 시간이 증가 될 수 있습니다.
      3. 샘플 신호는 또한 관심의 q 범위에 걸쳐 배경에서 명확하게 구별되어야한다. 신호/배경 비율을 계산하고 플롯하여 (신호-배경)/배경 비율 과 q를 계산하여 신호/배경 비율을 결정합니다. 신호/배경 비율이 낮으면 샘플 농도를 늘려야 합니다.
      4. 산란 강도(농도로 정규화)가 더 높고 낮은 농도에서 데이터를 수집하여 시료 농도와 무관하며 필요한 경우 노출 시간을 조정하는지 확인합니다. 입자 간 상호 작용(농도 의존성의 가장 가능성이 높은 원인)은 낮은 q 범위에서 가장 두드러집니다.
    7. PCM 샘플 및 배경(즉, 글리세롤로 버퍼링)에 대한 데이터를 수집합니다.
      1. 주사기 펌프를 트리거하여 모세관을 통해 샘플을 이동시다. 양방향 또는 한 번 스루 모션은 허용되지만 각 샘플을 격리하는 데 주의를 기울여야 합니다(예: 샘플 사이에 기포를 삽입). 시료는 회수될 수 있으며 방사선 손상이 보이지 않으면 재사용할 수 있습니다.
      2. 흐름이 시작되면 위에서 설명한 X선 노출 및 데이터 수집 프로그램을 트리거합니다. 유체 흐름이 발생하기 전에 빔 노출이 끝나야 합니다.
    8. 각 샘플 후, azimuthal 평균을 수행하고 함께 각 노출에 대한 1D 프로파일 (즉, 강도 대 q)을플롯. 통계적 오류 내에서 동일해야 합니다. 시간이 지남에 따라 신호를 변경하면 방사선 손상을 나타낼 수 있습니다.
      1. 격리된 비정상적인 프로파일은 마이크로버블의 존재를 나타낼 수 있다. 거품이 자주 관찰되면 유량을 줄이면 도움이 될 수 있습니다.
    9. 1D 산란 프로파일의 평균값입니다.
    10. 버퍼 전용 샘플에 대한 데이터를 자주 수집(4~5개의 PCM 샘플마다 한 번) 시간이 지남에 따라 이를 비교합니다. 버퍼 전용 샘플에서 증가된 신호는 모세관이 방사선 손상 샘플로 오염될 수 있음을 나타냅니다.
      1. 오염이 발견되면 표백제로 모세관을 씻고 가능하면 노출 시간을 줄이는 것이 좋습니다.
  2. 이레나를 이용한 데이터 감소 및 분석
    1. 미셀 및 배경 ASCII 데이터 세트 가져오기(SAS / 데이터 가져오기 및 내보내기 / 가져오기 ASCII SAS 데이터).
    2. 샘플 데이터에서 배경 분산을 뺍니다. 전형적으로 가장 높은 q 값(예: q > 0.5)은 신호를 지배하는 용매로부터의 비일관성 산란을 보여준다. 이 q 범위에 걸쳐 샘플 데이터와 일치하도록 배경 데이터를 배율 조정하면 빔 강도 변화와 샘플 농도로 인한 변형이 제거됩니다.
      1. 로그 배율에 샘플과 배경을 함께 플로팅합니다. 높은q(SAS/데이터 조작/데이터 조작 I)에서평평한 강도를 확인합니다. 샘플/배경비율(Data1/Data 2)을계산하고 선형 로그 축척으로 플롯하고 높은면적을 확인합니다.
      2. 이 q 범위에 대한 평균(샘플/배경) 비율을 계산합니다(사용자 지정 매크로 사용 또는 데이터 브라우저의 스프레드시트에 복사/붙여넣기).
      3. 데이터 조작 매크로를 사용하여 위에서 계산한 비율을 사용하여 배경(예: 데이터 수정 2)을확장하고 배경 빼기 신호비율을 백그라운드 대 q([Data1-Data2]/Data2)로 플롯하여 이제 높은 q에서0으로 점액처리되는지 확인합니다. 이 비율을 기록합니다. 각 샘플에 대해 1.0에서 1-2% 떨어져 있어야 합니다.
      4. 배경 빼기 신호(Data1-Data2)대 q를 플롯하고 새 이름으로 데이터를 저장합니다. 원본 데이터를 덮어쓰지 마십시오.
      5. 높은q 데이터를 사용할 수 없는 경우 배경 빼기에는 1의 배율 계수를 사용하지만 신호/배경 비율이 작은 q 범위에서 부정확성이 발생할 수 있습니다.
    3. 모델링 매크로(SAS/모델링)를연 다음 백그라운드 에서 빼는데이터(데이터 cntrls/데이터 추가)를로드하고 플로팅합니다. 이 매크로에서는 크기를 조정하지 마십시오.
    5. 다음으로, PCM 코어 내의 개별 폴리머의 산란을 모델링한다. 이는 전력 법칙 모델(예: 이상적인 체인의 경우q-2, 부은 체인의 경우q-5/3 등)으로 캡처할 수 있습니다. 이레나는 보케이지 모델43을통해 이를 구현합니다.
      Equation 6
      P가 전력법칙이고 G와 B가 선행인자입니다.
      1. 전체 q 범위를 커버하도록 데이터 컨트롤을 조정하고 모델을 다시 플롯합니다(모델계산). 전형적으로, 과잉 산란은 중간 에서 높은 q 범위(예를 들어, q> ~0.1Å-1)에서 관찰될 것이다.
      2. 데이터 컨트롤을 사용하여 초과 산란(폼 팩터 모델의 10배)이 관찰되는 q 범위를 선택합니다.
      3. 두 번째 산란모집단(2P)을추가하고 사용 중 유일한 모집단인지 확인합니다(1P의 경우 사용 해제?
      4. 모델의 통합 수준을 선택합니다. B와 P는 관련 매개 변수입니다. 플로팅 지원 도구 또는 csrs 매크로 사이의 맞춤 P/B를 사용하여 이러한 매개 변수에 대한 초기 추측을 얻고, 모델이 낮은 q에서과도한 산란을 예측하지 않도록 Ginier 계수 G 및 Rg를 조정합니다.
      5. 폼 팩터에 관해서는 비선형 맞춤을 수행하고 매개변수 및 모델을 기록합니다.
    6. 다음으로, 도 4에서와같이 회절 피크가 존재하는 경우, 관심의 q 범위에서 회절 피크에 대한 제 3 모델을 추가한다(q = ~0.22Å-1).
    7. 개별 산란 모집단에 대해 대략적인 맞춤 값을 얻은 후 세 가지 를 모두 함께 켜고(각각에 대해 사용? 선택) 결합된 맞춤을 최적화합니다.
    8. 각 값이 물리적으로 합리적으로 유지되는지 확인합니다. 이 절차의 결과는 그림 4에설명된 대로 넓은 크기 스케일에 걸쳐 SAXS 데이터를 잘 설명하는 복합 모델이어야 합니다. Igor 내에 저장할 폴더에 있는 저장소 단추를 사용하여 맞춤을 저장합니다.

6. 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)

  1. 크라이오 TEM
    1. 그리드를 선택합니다. 표준 TEM 그리드또는 레이스 카본에 구멍이 뚫리탄소 지지 필름을 대체할 것을 권장합니다. 두 경우 모두, 탄소 사이의 구멍은 순수한 유리체 얼음과 샘플의 이미징 영역과 필름을 제공하지 않습니다.
    2. 그리드 카본 면을 깨끗한 유리 슬라이드에 글로우 방전 장치에 올려 놓습니다. 슬라이드를 실험실 필름으로 래핑하면 그리드 처리에 도움이 될 수 있습니다. 핀셋으로 그리드의 중심을 건드리지 말고 항상 그리드 가장자리 근처를 꼬집습니다.
    3. 30s에 대한 그리드를 노출합니다.
    4. 시료 증착을 위해 유리화 로봇을 준비합니다.
      1. 습도와 RT를 100% 설정하고 블로팅 용지를 추가합니다. 로봇의 기지에서 액체 에탄 및 액체 질소 욕조를 준비합니다. 유리화 로봇 준비 및 사용에 대한 추가 도움말은 온라인 자습서 및 비디오를 참조하십시오.
    5. 샘플을 5x 희석합니다.
    6. 유리화 로봇과 함께 제공되는 음의 동작 핀셋을 사용하여 그리드를 선택한 다음 핀셋을 로봇에 부착하고 핀셋을 챔버로 이동합니다.
    7. 로봇에 있는 동안, 기계 의 측면에 있는 구멍을 통해 파이펫을 사용하여 그리드의 탄소 측에 샘플의 4 μL을 추가합니다.
    8. 4 분 동안 배양하십시오.
    9. 로봇을 사용하여 필터 용지로 3-5 s를 얼룩지세요.
    10. 유리화 로봇은 그리드를 액체 에탄으로 떨어급시다.
    11. 핀셋을 제거하고 그리드를 액체 질소로 옮기고 액체 질소 아래에 있어야 하는 저장 용기로 이동합니다. 이 과정은 유리체 얼음의 얇은 층으로 샘플을 고정합니다. 이 단계에서 그리드가 액체 에탄 또는 액체 질소에서 소비하는 시간을 최소화합니다.
    12. 액체 질소를 사용하여 저온 샘플 홀더를 식힙니다. 드와르와 저수지를 가득 채워 두십시오.
    13. 이미지를 준비할 때 그리드를 저온 샘플 홀더에 로드합니다. 샘플을 액체 질소 아래에 보관하거나 액체 표면 바로 위의 매우 차가운 질소 증기에 잠시 보관하십시오.
    14. 다른 크기의 미셀이 특정 얼음 두께를 선호 할 수 있기 때문에 얇고 두꺼운 얼음에 75kx와 150kx 사이의 120 kV에서 그리드를 이미지.
      1. 얼음이 녹고 시료가 손상되지 않도록 빔 노출을 제한하십시오. 이미지 에 계획 하는 곳에 직접 초점을 하지 마십시오; 근처에 초점을 맞춥니다. 이미지를 캡처하는 동안 관심 영역만 노출합니다.
      2. 이미지를 볼 때 샘플에서 액체 에탄 방울을 구별해야 합니다(그림 5참조).
  2. 네거티브 염색을 이용한 종래의 TEM
    1. 얼룩을 준비합니다.
      1. ~ 10 mL의 초순수를 끓입니다. 15 mL 원추형 튜브에 0.1 g의 우라벨 포메이트 (UFo)를 무게.
      2. 2% 용액을 위해 UFo 분말에 5 mL의 뜨거운 물을 추가하십시오. 단단히 닫고 알루미늄 호일에 싸서 빛을 차단합니다. 1% 우라니엘 아세테이트 얼룩도 일반적으로 사용됩니다.
      3. 소용돌이 또는 5 분 동안 힘차게 흔들어. 0.2 μm 주사기 필터를 통해 깨끗한 원엽 튜브로 필터링합니다.
      4. RT에 10 분 동안 식히십시오. 5M NaOH의 25 μL을 추가하고 즉시 2 분 동안 소용돌이.
        1. 또는 2% UFo의 200 μL aliquots를 동결합니다. 사용할 준비가 되면, 알리쿼트(aliquot)를 해동하고, 5 M NaOH 의 1 μL을 추가하고, 소용돌이를 2분 동안 추가합니다.
      5. 얼룩을 호일에 싸거나 빛으로부터 멀리 하십시오.
    2. 샘플을 1x PBS(또는 원하는 완충제)에 10x 희석합니다.
    3. 그리드를 선택합니다. 구리 그리드에 탄소 지원 필름을 권장합니다. 그리드의 더 어둡고 빛나는 면은 탄소 코팅 면으로, 시료를 증착하고 염색합니다.
    4. 그리드 카본 면을 깨끗한 유리 슬라이드에 글로우 방전 장치에 올려 놓습니다. 6.1.2단계를 참조하십시오.
    5. 30s에 대한 그리드를 노출합니다.
    6. 카본 쪽이 여전히 위를 향하고 있는 그리드를 선택하고 중앙의 이미징 영역이 찢어지는 것을 방지하기 위해 그리드 가장자리에 음의 액션 핀셋을 붙들고 있습니다. 격자로 핀셋을 내려 놓고 여전히 탄소 면을 위로 유지합니다.
    7. 파이펫으로 그리드의 상단(탄소 측)에 시료 4 μL 방울을 바칩니다.
    8. 4 분 인큐베이션.
    9. ~1분 왼쪽으로, 파이펫 10 μL, UFo 용액 20 μL 드롭을 깨끗한 실험실 필름 에 놓습니다.
    10. 필터 용지를 사용하여 이미징 표면과의 접촉을 피하기 위해 그리드의 가장자리(수직 접촉)에서 샘플을 심지 마십시오.
    11. 핀셋을 사용하여 (여전히 그리드를 잡고) 즉시 그리드의 샘플 측면을 10 μL UFo 액적에 내려 놓고 즉시 액체 (세척 단계)를 심지 십시오. 그리드가 건조하지 않도록하는 것이 중요합니다, 그래서 단계 사이에 중지하지 마십시오.
    12. 이와 유사한 방식으로 20 μL UFo 액적을 그리드에 적용합니다. 40 s. 액체를 심지 하 고 그리드 건조 하자 UFo에 그리드를 유지 합니다.
    13. 20,000x와 100,000x 사이의 120 kV에서 건조 그리드를 이미지화합니다.
    14. 방사성 폐기물에 대한 기관의 안전 서비스를 사용하여 모든 UFo 오염 물질을 적절하게 폐기하십시오.
    15. 필요한 경우 배경 노이즈를 줄이기 위해 ImageJ의 TEM 이미지에 밝기/대비 향상 및 중앙값 필터를 적용할 수 있습니다. 후처리는 강도와 같은 정량적 측정에 사용되지 않는 이미지에 대해서만 균일하게 수행되어야 하며 항상 보고되어야 합니다.

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Representative Results

위에서 설명한 특성화 방법을 설명하기 위해, 우리는 올리고뉴클레오티드로부터 조립된 PCM에 대한 전형적인 결과를 보여주고 다양한 길이 및 화학의 공중합체를 차단한다(그림1). 그림 2는 PCM 코어 크기(SAXS 및 TEM에서 결정된 대로, 그림 4 및 그림 5)가충전된 블록 길이로 어떻게 다양한지 에 대한 예를 제공합니다. 도 3은 상대적으로 긴 블록 공중합체 및 짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로부터 형성된 구형 PCM에 대한 DLS 데이터 및 피팅 결과를 나타낸다. 그림 4는 존재하는 여러 공간 상관 관계(외부 표면, 인트라 코어 산란, 간 간 정렬)에 대한 모델을 결합하여 복잡한 SAXS 강도 스펙트럼이 얼마나 정확하게 맞을 수 있는지, 그리고 MALS를 사용하여 산란 측정을 더 긴 길이 스케일로 확장하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 그림 5는 다양한 형태학의 PCM에 대한 대표적인 전자 현미경 데이터를 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 핵산 PCM의 조립 및 특성화. (A)올리고뉴클레오티드와 같은 항이온성 중합체는 디블록 공중합체의 양이온 성 영역과 함께 상 분리 복합체를 형성했다. 친수성 중성 블록 (회색)의 존재는 안정적인 PCM 나노 입자의 형성을 초래했다. (B)PCM은 특성화하기 위해 다중 파라미터를 가진 코어 쉘 나노입자였다. 전체 크기(유체역학 적 반경, Rh)는DLS를 사용하여 결정될 수 있고, 코어 반경(Rc)은SAXS 및 TEM을 사용하여 발견될 수 있고, 코로나 크기는 Rh-Rc로계산될 수 있으며, 형태는 SAXS, MALS 및 TEM을 결합하여 여러 길이 스케일에서 결정될 수 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 미셀 크기 의존성. 미셀 코어 크기는 주로 블록 공중합체의 충전된 블록의 길이에 의해 결정되었고, 호모폴리머7,26의길이와 는 크게 독립적이었다. 이를 통해 블록 폴리머의 선택에 의해 PCM 크기를 제어할 수 있습니다. 여기에 표시된 데이터는 88 nt /bp DNA를 가진 pLys-PEG를 위한 것이고 이전에보고된 26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 동적 광산란. (A)10 nt 단일 가닥 DNA + pLys(100)-PEG(10k) PCM에 대한 자기 상관 기능(임의 단위). (B)REPES에서 유체 역학 반경 분포 (히스토그램). 자기 상관 함수는 단일 시간 배율로 플랫 값으로 붕괴되어 REPES 크기 분포에서 단일 크기 피크가 발생했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 대표적인 SAXS 및 MALS 데이터를 원통형 미셀에 적합합니다. SAXS 데이터(회색 원)는 pLys(50)-PEG(5k) 및 88bp 이중 가닥 DNA로부터 조립된 PCM에 대해 표시됩니다. 낮은 q (<10-2 Å-1)에서강도는 탄력 전달에 대한 약q-2 의존성을 보였으며, 이는 유연한 실린더 형상(웜유사 미셀)을 암시하였다. MALS 데이터(오픈 블랙 서클)는 미셀 길이가 적어도 몇 마이크로미터(TEM 이미징에 의해 부식되었음을 나타내는 동일한 의존성을 나타내며, 도 5C,D). 구형 미셀은 이 범위에서 q에 대한 평탄한 의존성(q0)을 나타내었다. 컬러 선은 섹션 5에 설명된 PCM SAXS 데이터에 대한 다중 구성 요소 피팅 절차를 보여 줍니다. 낮은 q(large distance scales)에서 산란하는 것은 PCM의 외부 표면에 의해 지배되었고, 유연한 실린더 모델(적색)에 의해 잘 맞았다. 더 높은 q 값(더 작은 길이 스케일)에서, 산란은 PCM 코어 내부의 개별 폴리머에 의해 지배되었고, 낮은 q 컷오프를 가진 전력 법칙(녹색)에 의해 여기에 적합하였다. 우리는 또한 PCM 코어 내의 이중 가닥 DNA 나선의 병렬 포장을 관찰하여 준 브래그 회절 피크 (파란색)를 초래했습니다. 검은색 파선은 이러한 모델을 결합하여 SAXS 데이터를 정확하게 설명하고 광 산란 데이터(오픈 서클)를 추가하여 거의 4배의 크기로 크기 범위를 확장했다는 것을 보여줍니다. 피팅 결과는 평균 반경 = 11.0 nm 및 PDI = 0.03을 가진 PCM 인구를 주었고, 높은 q = 1.81의 전력 법칙및 회절 피크는 2.71 nm의 나선 간 간격을 나타낸다. SAXS 데이터는 이전에26으로 보고되었으며 공개적으로44. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 핵산 PCM의 TEM 이미지. (A–B) 22 nt 단일 가닥 DNA의 Cryo TEM + pLys (50)-PEG (5k) PCM, 주로 구형 형태를 보여주는. 파란색 화살표는 PCM(질감이 있는 구형 개체)과 혼동되지 않는 액체 에탄 방울을 나타냅니다. (A)는해상도를 유지하면서 약간의 대비를 추가하여 약간 초점이 맞지 않습니다. (B)실질적으로 초점을 맞추고, 더 많은 대비를 추가하지만 선명도를 희생. 밝기 및 대비 조정과 두 픽셀 중앙값 필터가 두 이미지모두에 적용되었습니다. (C-D) 88 bp 이중 가닥 DNA + pLys (50)-PEG (5k) PCM의 부정적인 스테인드 TEM, 이는 긴 유연한 실린더입니다. 두 경우 모두 TEM의 코어 반경은 SAXS 데이터 피팅에서 얻은 값과 일치했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

위에서 언급 한 바와 같이, 여기에 제시 된 프로토콜은 양온 중성 블록 공중합체로 폴리안 이온 성분 및 pLys-PEG로 올리고 뉴클레오티드에 초점을 맞추고 작성하지만, 우리는 폴리 (아크릴 산), 폴리 글루타메이트 및 PEG 폴리 (비닐 벤질 트리메틸 라몬)와 같은 다양한 폴리머로 테스트했으며, 일반적으로 폴리에 적용 될 것이라고 믿습니다. 최적화해야 할 한 가지 매개 변수는 어닐링에 사용되는 염 농도입니다. 이것은 DLS에 의해 실험적으로 확인될 수 있고, 또는 폴리전해질 단독과의 상 분리의 관찰과 비교하여(중성 블록 없음). 열 어닐링은 소금 어닐링이 바람직하지 않은 경우 사용할 수 있지만 결과 다분산성은7보다큽합니다. 특성화에 사용되는 농도는 또한 더 큰 나노 입자가 작은 것보다 더 많은 빛을 산란하기 때문에 최적화되어야 할 수도 있으며, 핵산은 백본에 전자 조밀 한 인 원자의 존재로 인해 다른 많은 중합체보다 X 선을 산란하는 데 더 효율적입니다. 또한 폴리전해질이 작업 조건에 가까운 pKa를 가지고 있는 경우 버퍼의 pH를 보다 면밀히 제어해야 할 수도 있습니다.

이 문서에서는 두 가지 광 산란 기술(즉, 다각/정적 광 산란 및 동적 광 산란)뿐만 아니라 작은 각도 X선 산란, 저온 및 기존 네거티브 얼룩 투과 전자 현미경 검사법에 대한 프로토콜을 각각 대표데이터를 제공합니다. 모든 시나리오에 모든 기술이 필요한 것은 아니며 다른 기술도 사용할 수 있어 언제 사용해야 하는지에 대한 의문이 제기됩니다. 충분한 검토 문헌은 이 주제에존재45,46,그러나 우리는 새로운 PCM 또는 유사한 나노 입자를 특성화 할 때 다음을 제안한다. 탁도 및 광학 현미경 검사법에 의하여 육안 검사를 통해 집계를 검사하는 것으로 시작합니다. 집계가 관찰되지 않으면 다음 단계는 나노 입자가 존재하는지 여부를 확인하는 것입니다. DLS는 PCM이 빛을 활발하게 산란하고 약하거나 존재하지 않는 광 산란이 나노 입자 형성불량의 강력한 지표이기 때문에 이를 빠르게 확인할 수 있는 방법입니다. DLS는 나노 입자의 존재를 확인할 수 있지만 대부분의 분석 방법은 구형 입자를 가정하는 스토크스 - 아인슈타인 관계에 의존하기 때문에 다른 데이터를 참조하지 않고 크기와 모양을 결정하기가 어렵습니다. MALS는 구형 모양(평평한 정규화 강도 대 각도)을 확인할 수 있지만 크기 분포가 좁고 해상도가 올바른 범위에 있지 않으면 비구면 입자의 모양을 결정하지 못할 수 있습니다. 따라서 특성을 완전히 특성화하려면 모든 PCM 샘플에서 TEM, SAXS 또는 둘 다 수행하는 것이 좋습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

우리는 시카고 대학에서 소프트 물질 특성화 시설과 고급 전자 현미경 검사 시설의 필 그리핀과 테라 라부아에게 각각 감사드립니다. 또한 아르곤 국립 연구소와 NIST 계층 재료 설계 센터(CHiMaD)의 고급 광자 소스의 샤오빙 주오와 소엔케 세이퍼트에게 감사를 표합니다. 이 작품에 기여한 제프 팅과 마이클 루에하이드에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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화학 문제 157 핵산 전달 폴리 전해질 복합체 미셀 나노 입자 상 분리 올리고뉴클레오티드
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Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

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