Summary
Fornecemos protocolos e dados representativos para projetar, montar e caracterizar micelas complexas de polieletrólito, nanopartículas de casca de núcleo formadas por polieletrólitos e copolímeros de blocos não carregados hidrofílicos.
Abstract
Micelios complexos de polieletrólito (PCMs), nanopartículas de concha soca formadas pela automontagem de polímeros carregados em solução aquosa, fornecem uma plataforma poderosa para explorar a física das interações de polieletrólitos e também oferecem uma solução promissora para o problema premente de entregar oligonucleotídeos terapêuticos in vivo. O desenvolvimento de relações preditivas de estrutura-propriedade para PCMs tem se mostrado difícil, em parte devido à presença de fortes armadilhas cinéticas durante a auto-montagem da nanopartículas. Este artigo discute critérios para a escolha de polímeros para construção de PCM e fornece protocolos baseados em aanneling de sal que permitem a montagem de nanopartículas repetitivas e de baixa polidispersão. Também discutimos a caracterização do PCM usando dispersão de luz, dispersão de raios-X de pequeno ângulo e microscopia eletrônica.
Introduction
Quando politrólitos carregados opostomente são misturados em solução aquosa, o ganho de entropia com a liberação de suas contra-ataques causa a desmistura da solução em uma fase condensada rica em polímeros e um supernatante empobrecido de polímero1,2,3,4,5, um fenômeno conhecido como complexo de polieletrólito. Se um bloco hidrofílico neutro for conjugado a um ou ambos os polieletrólitos, ocorre a separação da fase nanoescala (Figura 1A). As nanopartículas de conchas de conchas de núcleo automontadas resultantes são várias vezes referidas como micelis complexos de polieletrólito (PCMs), micelis complexas de poliionion, complexos de ionômeros de blocos ou micelles coacervate-core por analogia à micellização surfactante, mesmo que todos os componentes do sistema sejam hidrofílicos6,7. A capacidade de um PCM de encapsular moléculas hidrofônicas como proteínas e ácidos nucleicos, bem como a extensa tunability oferecida pela arquitetura portadora de copolímero do bloco torna-os candidatos atraentes para o parto de moléculas terapêuticas no vivo8,9,10,11,12,13.
Fornecer ácidos nupcleicos terapêuticos para alvos celulares é um desafio particularmente importante, e para o qual os PCMs oferecem várias vantagens. Os ácidos nucleicos terapêuticos (DNA genético, mRNA e oligonucleotídeos como o siRNA) têm imenso potencial para melhorar a saúde humana, mas devem superar inúmeras barreiras biológicas e físicas para perceber que potenciais14,15,16. Os ácidos nucleicos nus nus são degradados por núcleos soro e celulares, são rapidamente retirados de circulação, e sua forte carga negativa torna difícil para eles penetrar em membranas celulares sem assistência. As abordagens atuais para superar essas barreiras incluem modificações químicas dispendiosas para evitar danos causados por nucleases e/ou encapsulamento em várias nanopartículas lipídicas montadas através de interações hidrofóbicas15,17,18. Embora esses métodos tenham se mostrado eficazes para injeções locais e segmentação hepática, o uso sistêmico apresenta limitações significativas de toxicidade, imunogenicidade e biodistribuição limitada16. Em contrapartida, os PCMs usam a carga negativa de ácidos nucleicos para condensar-os dentro do núcleo separado de fase, enquanto a coroa neutra fornece uma barreira estérica contra a degradação, bem como uma plataforma para incorporar ligands para melhorar a segmentação ou internalização11,19. Estudos in vitro e animais mostraram que os PCMs podem efetivamente entregar várias cargas de ácido nucleico20,21,22,23,24,mas fraquezas em nossa capacidade de prever propriedades de PCM, como tamanho, forma e estabilidade das propriedades dos polímeros constituintes, têm dificultado sua adoção mais ampla.
Trabalhos recentes do nosso grupo e de outros no campo começaram a abordar esse problema desenvolvendo estrutura-propriedade, e em alguns casos relações estrutura-propriedade-função para PCMs formados a partir de ácidos nucleicos e vários polímeros cationic neutros7,25,26,27. Dois temas consistentes que surgiram desses estudos são a importância do desenvolvimento de protocolos bem controlados e repetitivos para a montagem do PCM e o benefício do uso de múltiplas técnicas para caracterizar as nanopartículas resultantes. Polieletrólitos, particularmente aqueles com alta densidade de carga como ácidos nucleicos, interagem uns com os outros com muita força, e parecem prontamente ficar presos kineticamente ao misturar, resultando em preparações pcm que são altamente sensíveis a pequenas variações no procedimento e exibem alta polidispersão e má repetibilidade de lote a lote. Os PCMs também têm se mostrado adotar uma ampla gama de formas e tamanhos, dependendo das configurações de nível atômico de seus componentes, e capturar essa diversidade com qualquer técnica de caracterização individual é muito difícil, especialmente porque algumas técnicas comuns como dispersão dinâmica de luz (DLS) exigem suposições sobre a forma de partículas para sua interpretação.
Neste artigo, discutimos o design de materiais e a seleção para PCMs, com foco em oligonucleotídeos e copolímeros de dibloco neutros. Descrevemos então um protocolo de acaração de sal que usa altas concentrações de sal seguidas de diálise lenta para evitar armadilhas cinéticas durante o conjunto pcm. Os polieletrólitos são misturados em altas condições de sal onde atrações eletrostáticas são exibidas, então a concentração de sal é lentamente reduzida para permitir que os polieletrólitos se instalem em suas configurações mais energeticamente favoráveis, análogos ao processo de resfriamento lento do acarinamento térmico. Usando este protocolo, somos regularmente capazes de alcançar excepcionalmente baixa polidispersão e alta repetibilidade para PCMs oligonucleotídeos7,26. Por fim, descrevemos como quatro técnicas de medição separadas podem ser usadas para caracterizar PCMs em uma ampla gama de escalas de comprimento, da morfologia externa à estrutura interna: DLS, dispersão de luz multi-ângulo (MALS), dispersão de raios-X de pequeno ângulo (SAXS) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Esperamos que esses protocolos permitam que mais pesquisadores explorem efetivamente as capacidades dessas nanopartículas interessantes.
Seleção e Preparação de Polímeros
As propriedades pcm são fortemente influenciadas pelas características físicas e químicas dos polímeros constituintes, tornando a seleção de polímeros um passo crítico no processo de design. Os copolímeros de bloco mais bem caracterizados para PCMs ácidonusão desbloqueios lineares, como poli (lisina)-poli (glicol de etileno) (pLys-PEG), mas pcMs podem ser formados entre polieletrólitos e uma variedade de polímeros hidrofílicos neutros, que podem ser gerados de alta forma de absorção28. A escolha do grupo carregado afeta fortemente a estabilidade da emparelhamento e forma de micelles26, e o tamanho do PCM tem se mostrado para aumentar com o comprimento do bloco carregado5,7,26 (Figura 2),permitindo que as propriedades pcm sejam sintonizadas para os requisitos de um aplicativo desejado. Para bloqueios lineares, descobrimos que o bloco carregado deve ter pelo menos 10 cargas e ser fortemente cobrado no pH desejado. Blocos mais carregados podem promover a formação de PCM com oligonucleotídeos como o siRNA, que são difíceis de complexos com blocos mais curtos21. Observamos com sucesso a formação de PCM com comprimentos de bloco até 200, e a literatura descreve polímeros mais longos. Mais flexibilidade está disponível na escolha dos blocos neutros24,mas a experiência mostrou que blocos neutros muito curtos levam à agregação em vez da formação de nanopartículas, e que o comprimento mínimo neutro aumenta com o comprimento do bloco carregado. Para pLys-PEG, um PEG MW de pelo menos 3.000-5.000 é necessário para comprimentos de pLys abaixo de ~50, e comprimentos mais longos são necessários à medida que o bloco carregado é aumentado ainda mais. O aumento do comprimento do bloco neutro resulta no aumento do tamanho do PCM, particularmente na espessura da concha, devido à aglomeração estérica dos polímeros neutros.
Este manuscrito apresenta um protocolo para preparar PCMs de pLys-PEG de alta pureza liofilizada e oligonucleotídeos de quantidade conhecida, mas deve ser facilmente adaptável a outros sistemas também. Testamos com sucesso com vários polipeptídeos carregados, incluindo poliarginina e ácido poliglutâmico, bem como vários polieletrolitos sintéticos, como ácido poliacrílico e poli(trimetilamônio de vinilbenzyl). Também descrevemos o preparo de PCMs com uma razão stoichiométrica de cargas de polieletrólito, mas isso é facilmente modificado. Achamos mais fácil trabalhar em unidades de concentração de carga (c.c.), que também acomoda naturalmente polímeros que não estão totalmente carregados. Se qualquer polímero não for bem caracterizado, deve-se tomar cuidado para determinar com precisão os comprimentos/massas de polímeros e garantir que o excesso de sal não esteja presente além do necessário para a neutralização da carga por diálise, por exemplo. A presença de qualquer água retida também deve ser contabilizada quando as concentrações forem calculadas. A concentração de ácido nucleico pode ser convenientemente quantificada pela absorção a 260 nm, e a presença ou ausência de fosfatos terminais deve ser considerada no cálculo do c.c.
Ao utilizar oligonucleotídeos como polianions, o estado de hibridização e estrutura química ajudam a determinar a propensão à automontagem e às características do PCM5,7,26. A otimização deles, dentro dos requisitos de eficácia biológica se usar PCMs para entrega, aumentará a probabilidade de formar as estruturas desejadas. Ferramentas úteis para analisar a hibridização incluem funções MATLAB para ácidos nucleicos, NUPACK29e IDT OligoAnalyzer. Recomendamos analisar uma sequência de candidatos para entender a força da vinculação a 1) em si mesmo em uma formação de grampo de cabelo; 2) outra cópia da mesma sequência (auto-dimer); e 3) a outros oligonucleotídeos presentes no sistema. As temperaturas de derretimento de DNA e RNA para uma sequência específica também podem ser calculadas usando o método vizinho mais próximo30,31. O aperto térmico de ácidos nucleicos (passo 2.3) desnatura qualquer estrutura secundária residual nos nucleotídeos individuais e promove o equilíbrio dobrável.
Caracterização e Análise do PCM
Uma ampla gama de técnicas estão disponíveis para caracterizar nanopartículas, incluindo dispersão de luz estática e dinâmica, pequena dispersão de ângulo suporitados de elétrons ou nêutrons e microscopia eletrônica. Neste artigo, fornecemos protocolos para duas técnicas de dispersão de luz, dispersão de raios-X de pequeno ângulo e duas técnicas de microscopia eletrônica.
O DLS mede a autocorrelação das flutuações temporais na intensidade de dispersão em um ângulo do movimento browniano da amostra. A montagem destes dados pode fornecer raio hidrodinâmico e polidispersão para micelas esféricas(Figura 3). A dispersão de luz de múltiplos ângulos (MALS) mede a intensidade de dispersão estática em muitos ângulos. Esta dependência angular descreve a forma da nanopartículas, mas limita-se a escalas de comprimento maiores que ~50 nm para luz visível, o que limita sua eficácia para nanopartículas menores. Ambas as técnicas são baseadas na incompatibilidade de índicerefrativo e descrevem principalmente as dimensões externas da nanopartícula.
A dispersão de raios-X de pequeno ângulo (SAXS) usa raios-X como sonda de dispersão, e seu comprimento de onda mais curto permite medições sobre uma faixa de ~0,1-100 nm. Encaixar a intensidade de dispersão observada versus ângulo (convencionalmente expresso como momentum transfer q) fornece informações sobre morfologia PCM (ou seja, tamanho e forma) e também estrutura interna. Se uma calibração de intensidade absoluta estiver disponível, e se a intensidade de dispersão pode ser extrapolada para ângulo zero, a massa pcm e o número de agregação também podem ser estimados32, tornando o SAXS um método extremamente versátil e valioso. A dispersão de nêutrons de pequeno ângulo (SANS) é sensível em uma gama semelhante de escalas de comprimento, mas só está disponível em instalações especializadas e não será explicitamente discutida neste artigo33,34,35.
Nos últimos anos, vimos o advento dos instrumentos SAXS, mas descobrimos que as fontes síncrotrons são mais adequadas para a caracterização do PCM, pois sua maior intensidade permite que os dados sejam coletados muito mais rapidamente para essas amostras de baixo contraste. Fornecemos um breve protocolo para a aquisição de dados PCM SAXS na Beamline 12-ID-B no Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, EUA) de uma perspectiva de usuário. Este protocolo deve ser aplicável à maioria das fontes síncrotrons, mas consultar a equipe local antes de propor um experimento é altamente recomendado. Também fornecemos um protocolo de redução e análise de dados utilizando irena36, um conjunto gratuito de macros escritas para Igor Pro. Irena inclui um conjunto versátil de fatores de forma para modelar dados SAXS e permite a construção de modelos multicomponentes capazes de descrever o complexo perfil de dispersão de PCMs (ver Resultados Representativos, Figura 4). Irena também tem documentação abrangente e tutoriais disponíveis online. Antes de tentar os procedimentos abaixo, recomendamos a familiarização com estes, particularmente o tutorial "Modelagem de dados SAXS com duas populações principais de dispersão".
Danos causados por radiação são uma preocupação para a dispersão de raios-X, mas várias medidas podem ser empregadas para minimizá-lo. Em particular, recomendamos o uso de uma configuração de célula de fluxo com uma bomba de seringa e amostra de PCM fluindo durante a aquisição de dados, em vez de um capilar selado. Isso também simplifica muito a subtração de fundo. Também sugerimos tomar múltiplas exposições da amostra fluindo em vez de uma mais longa, a fim de limitar o fluxo que qualquer volume único de amostra vê e permitir a comparação dos dados de exposição para identificar qualquer dano.
Em contraste com as técnicas de dispersão, que geralmente requerem a adaptação para interpretar, a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornece uma imagem visual espacial real das nanopartículas, passando um feixe de elétrons através da amostra e projetando uma imagem em uma tela cintilante(Figura 5). Apresentamos protocolos para duas técnicas tem neste artigo. Cryo TEM congela amostras de micelle em uma fina camada de gelo víreso, preservando conformação estrutural com substâncias estrangeiras mínimas, ótima para micelles ≤~10-100 nm em raio. A mancha negativa TEM usa um sal de metal pesado (por exemplo, urânio) para cercar a amostra depois de ter sido seca na superfície de uma grade. A densa mancha espalhará mais elétrons do que a amostra, adicionando contraste e produzindo uma imagem negativa da amostra. Cryo TEM é recomendado para imagens de alta qualidade. No entanto, é mais caro, demorado, e pode não fornecer contraste suficiente. Quando isso é uma preocupação, amostras manchadas negativas devem ser usadas. Exemplos de cada um são mostrados na Figura 5.
Cada uma dessas técnicas relata aspectos ligeiramente diferentes das nanopartículas, com diferentes pontos fortes e limitações. A dispersão de luz está prontamente disponível, e muitas vezes é a abordagem mais rápida, mas tem limitações substanciais em tamanho e resolução de forma. O SAXS pode fornecer informações sobre uma grande gama de escalas de comprimento a um throughput razoavelmente alto, mas requer equipamentos especializados para adquirir os dados, bem como modelá-los para interpretá-los. As imagens TEM são simples de interpretar, mas podem ser limitadas em contraste e são inerentemente baixas. Nossa experiência mostrou que o uso de múltiplas técnicas para caracterização aumenta muito as informações que podem ser obtidas sobre propriedades pcm e simplifica a interpretação de conjuntos de dados obtidos de cada um sozinho. Por exemplo, saxs e TEM examinam principalmente o núcleo denso de um PCM, enquanto a dispersão de luz relata as dimensões globais da nanopartícula. Assim, combiná-los permite a medição do tamanho do núcleo e da coroa. A capacidade da TEM de adquirir imagens espaciais reais pode fornecer dados de verdade terrestre para permitir a seleção de fatores de formulário apropriados para a modelagem de dados SAXS que poderiam ser ambíguos. Este artigo descreve protocolos para todas as quatro técnicas, e um processo de exemplo para usá-las para caracterizar uma amostra desconhecida é dado na seção discussão.
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Protocol
1. Preparação de Materiais
- Pesar o polímero de diblock liofilizado e adicione água até quase o volume necessário para uma solução de estoque de 10 mg/mL concentração final. Vórtice em velocidade máxima por 2 min.
- Sonicate por 5 min. Desbloqueios muito longos podem exigir sonsoação adicional. A solução de estoque deve parecer completamente transparente e homogênea.
- Ajuste o pH para 7,4 usando NaOH ou HCl conforme necessário. Adicione água ao volume final. as soluções pLys-PEG são bastante estáveis, mas devem ser refrigeradas para armazenamento a longo prazo e o pH deve ser verificado antes do uso. A liofilização é preferível ao congelamento.
- Resuspender oligonucleotídeo liofilizado na concentração de estoque desejada, tipicamente concentração molecular de 2-5 mM para comprimentos de 50 nt ou abaixo. Vórtice completamente para garantir a dissolução completa.
- Calcule as concentrações de molar usando peso molecular ou comprimento conforme descrito na Introdução.
- Calcular concentrações de carga molar (c.c.), onde
A carga de polieletrólito é o número de monômeros carregados, enquanto a carga de ácido nucleico é o número de bases menos 1, supondo nenhuma fosforilação. Tenha em mente que o DNA duplo encalhado terá o dobro de cargas por molécula em comparação com o DNA de uma única cadeia.
- Crie estoque diluído a 20 mM c.c. para cada polímero.
2. Preparação de Micelle de Polieletrolito ácido nuclítico
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, misture o seguinte a um volume total de 280 μL:
- 200 μL de água livre de nuca (água ultrapura para PCMs que não contêm ácidos nucleicos).
- 40 μL de soro-soro tampão tampão de fosfato de 10x (PBS, cloreto de sódio de 137 mM, fosfato de 10 mM, pH 7.4 quando diluído a 1x) ou outro buffer adequado37.
- 40 μL de 20 mM c.c. oligonucleotídeo. Para oligonucleotídeos de fio duplo, adicione 20 μL de cada fio a 20 mM c.c.
- Incubar a solução oligonucleotídeo por 5 min a 70 °C. Se a temperatura calculada de derretimento para os oligonucleotídeos for maior, a temperatura deve ser aumentada em conformidade. Observe que o RNA se degradará a temperaturas elevadas, de modo que este passo não deve demorar mais se este ou outros componentes sensíveis estiverem presentes.
- Esfrie por 15 min. Adicione 40 μL de 20 mM c.c. diblock, em seguida, vórtice imediatamente para 20 s em velocidade máxima. Incubar 5 min à temperatura ambiente (RT).
- Realize a anrnea salgada.
- Adicione 80 μL de cloreto de sódio de 5 M para uma concentração final de 1 M NaCl e volume final de 400 μL. Vórtice por 10 s em velocidade máxima.
- Incubar por 10 min à temperatura ambiente, depois carregue em cartuchos de diálise. Observe que os cortes de peso molecular listados são determinados para proteínas globulares e não serão precisos para polímeros lineares. Descobrimos que um cartucho de 2k MWCO evita a perda de amostra e também prevê mudanças graduais na força iônica.
- Prepare banhos de diálise.
- Calcule o volume de banho de diálise necessário:
- Misture 10x PBS (ou outro buffer desejado), 5 M NaCl e água ultrapura para uma solução final de 1x PBS e 0,5M NaCl, além de duas soluções de 1x PBS.
- Calcule o volume de banho de diálise necessário:
- Carregue cartuchos de diálise.
- Assique cartuchos com marcador permanente. Demolho cartuchos em tampão por pelo menos 2 min para hidratar membranas.
- Remova a tampa torcendo no sentido anti-horário. Amostra de carga usando ponta de tubulata de carregamento de gel. Remova o excesso de ar apertando suavemente as membranas. Substitua a tampa.
- Coloque cartuchos no banho de diálise de cloreto de sódio de 0,5 M. Os cartuchos devem flutuar, com ambas as membranas expostas ao banho. Carros alegóricos de espuma podem ser usados se necessário.
- Diálise
- Incubar por 24 h mexendo lentamente com uma barra de agitação magnética.
- Mova os cartuchos para um novo banho de 1x PBS ou outro buffer de trabalho desejado. Incubar por 24 h, mexendo lentamente com uma barra de agitação magnética. Repita este passo.
- Recupere a amostra.
- Remova os cartuchos do banho. Remova a tampa e recupere a amostra usando uma dica de tubulata de carregamento de gel. Observe que o volume recuperado pode ser maior do que os 400 μL iniciais devido ao inchaço da membrana. Volume recuperado recorde se uma leve diluição é uma preocupação.
- Coloque a amostra em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpo. Os PCMs preparados dessa forma devem ficar estáveis por vários meses quando refrigerados, desde que a contaminação por nuclease tenha sido evitada.
3. Dispersão dinâmica de luz
- Para garantir condições livres de poeira, os buffers devem ser cuidadosamente filtrados (filtrados 3x através de uma seringa de 0,22 μm ou filtro de vácuo) e vidros completamente limpos entre amostras. Também é importante garantir que a amostra tenha atingido o equilíbrio térmico antes de realizar a medição.
- Diluir a amostra pcm para 0,2 mM c.c. (10x se usar o protocolo descrito acima) com o buffer de trabalho desejado e carregar em um cuvette adequado. Usamos um cuvette de pequeno volume, que requer ~200 μL de amostra após diluição.
- Defina a posição do detector DLS para 90°.
- Ajuste a potência laser e/ou atenuador para que a taxa de contagem seja de 100.000-200.000 contagens por segundo (cps), se possível. Taxas de contagem tão baixas quanto 10 kcps podem ser usadas, mas os tempos de medição podem precisar ser estendidos para obter boas estatísticas (etapa 4.1). Taxas de contagem mais altas devem ser evitadas, pois a dispersão múltipla confundirá a medição.
- Obter dados por 1 min. A taxa de contagem deve ser constante durante todo o tempo de aquisição; se não, isso indica que algum componente da amostra ou instrumento ainda não se equilibrou.
- Examine os dados de autocorrelação. A linha de base de longa data deve ser muito plana, e a curva de autocorrelação deve ser suave, com dispersão mínima, como mostrado na Figura 3A. A deriva da linha de base indica falta de equilíbrio, e o ruído nos dados pode ser melhorado adquirindo mais dados.
- Ajuste a função de autocorrelação.
- Use REPES38,39 para realizar a transformação laplace inversa regularizada para entregar uma distribuição de tempos de relaxamento e um coeficiente de difusão, D. Este método então calcula o raio hidrodinâmico, Rh,usando a equação Stokes-Einstein:
A Figura 1B mostra uma representação de Rh e Figura 3B mostra o resultado de REPES. - Alternativamente, use outros métodos, incluindo CONTIN40,41 (um algoritmo alternativo de regularização) ou encaixe não negativo de quadrados mínimos (NNLS). Resultados consistentes de múltiplos métodos de montagem são uma assinatura de dados de alta qualidade. Observe que a análise cumuante (padrão em muitos instrumentos) dá valores não físicos para distribuições multimodais de tamanho/comprimento.
- Use REPES38,39 para realizar a transformação laplace inversa regularizada para entregar uma distribuição de tempos de relaxamento e um coeficiente de difusão, D. Este método então calcula o raio hidrodinâmico, Rh,usando a equação Stokes-Einstein:
4. Dispersão de luz multi-ângulo
NOTA: Intensidade de dispersão de luz vs. ângulo pode ser medido em uma variedade de instrumentos. Obtivemos bons resultados usando instrumentos baseados em goniômetros e instrumentos de detector múltiplo, executados no modo lote.
- Ajuste a concentração e intensidade de iluminação pcm para fornecer sinal/ruído suficiente versus uma amostra somente tampão em todos os ângulos sem saturar qualquer detector. Este último pode ser testado preparando amostras em vários fatores de diluição e verificando a linearidade da intensidade versus concentração (assumindo interação mínima entre os PCMs).
- Registre a taxa de dispersão de luz de 15° a 135° para 1 min por ângulo. Se a amostra e o instrumento estiverem devidamente equilibrados, a taxa de dispersão será constante ao longo do tempo de medição.
- Traçar a taxa de dispersão normalizada, eusin (φ), vs. q, onde eu estou a taxa de dispersão. q é o vetor de dispersão (transferência de momento fóton) como definido por
onde ele = o índice refrativo solvente, φ = o ângulo de medição, e λ = o comprimento de onda da fonte de luz. A Figura 4 mostra um enredo de intensidade de dispersão mals.
5. Dispersão de raios-X de pequeno ângulo
- Aquisição de dados
- Prepare amostras de PCM como descrito acima na concentração de carga de 2 mM para PCMs oligonucleotídeos para ampla dispersão acima do fundo. Para pcms sem átomos pesados (por exemplo, fósforo em ácidos nucleicos), podem ser necessárias concentrações mais altas. Densidades de comprimento de dispersão podem ser estimadas usando calculadoras como o SASSIE42.
- A fim de minimizar os danos à radiação, limpando radicais livres, adicione glicerol de concentrado (por exemplo, 50%) solução de estoque para que a solução micelle contenha 1% (v/v) glicerol. Observe que o glicerol puro é altamente viscoso e difícil de medir com precisão. Diluir com água ou tampão é altamente recomendado.
- Prepare um grande volume de buffer de trabalho com 1% de glicerol para uso como monitor de fundo.
- Prepare o aparelho de célula de fluxo específico da linha de feixe e calibrar o detector. O protocolo usa um capilar de quartzo de 3 mm de diâmetro conectado a uma bomba de seringa controlada por computador com um pequeno diâmetro, e tubos de polietileno de comprimento mínimo. Um volume mínimo de ~140 μL por amostra é necessário com esta configuração.
- Determine parâmetros de exposição da amostra. A exposição ideal variará com base na intensidade do feixe, sensibilidade ao detector e concentração, força de dispersão e suscetibilidade de danos da amostra, mas o objetivo é expor a amostra ao fluxo mínimo necessário para obter intensidade de dispersão suficiente sobre a faixa q de interesse.
- Para PCMs oligonucleotídeos/pLys-PEG, exposições de 30x 0,2 a uma taxa de repetição de 1 Hz produzem boa qualidade de dados com pouco dano perceptível. Para novas amostras, o seguinte procedimento pode ser útil:
- Prepare amostras de PCM sobre uma gama de concentrações (por exemplo, 10-10.000 μM c.c.).
- Começando em uma concentração intermediária, PCM alternativo e amostras somente tampão com tempos de exposição variados. Veja abaixo o procedimento de aquisição e redução de dados. O sinal amostral deve ter boas estatísticas (pequeno erro estatístico, ou variação suave em q). Se as estatísticas são ruins, o tempo de exposição pode ser aumentado.
- O sinal de amostra também deve ser claramente distinguível do fundo sobre a faixa q de interesse. Calcular e traçar a relação (sinal-background)/background vs. q para determinar a relação sinal/fundo. Se a relação sinal/fundo for baixa, a concentração amostral deve ser aumentada.
- Verifique se a intensidade de dispersão (normalizada à concentração) é independente da concentração amostral, adquirindo dados em concentrações cada vez menores, dimensionando o tempo de exposição, se necessário. As interpartículas (a causa mais provável de dependência de concentração) serão mais acentuadas na faixa q baixa.
- Adquirir dados para amostras de PCM e fundo (ou seja, tampão com glicerol).
- Acione a bomba de seringa para mover a amostra através do capilar. Ou o movimento bidirecional ou uma vez é aceitável, mas deve-se tomar cuidado para isolar cada amostra (por exemplo, inserindo uma bolha de ar entre amostras). As amostras podem ser recuperadas e podem ser reutilizadas se nenhum dano de radiação for visto.
- Uma vez iniciado o fluxo, acione o programa de exposição de raios-X e aquisição de dados descrito acima. Deve-se tomar cuidado para que a exposição do feixe termine antes do fluxo de fluidos.
- Após cada amostra, realize a média azimutal e plote os perfis 1D (ou seja, intensidade versus q) para cada exposição em conjunto. Eles devem ser idênticos dentro do erro estatístico. Mudar o sinal ao longo do tempo pode indicar danos à radiação.
- Perfis anômalos isolados podem indicar a presença de microbolhas. Se as bolhas forem observadas com frequência, diminuir a vazão pode ajudar.
- Média dos perfis de dispersão 1D.
- Adquirir dados para amostras somente tampão com frequência (uma vez por cada amostra de 4-5 PCM) e compará-los ao longo do tempo. O aumento do sinal de amostras somente tampão indica que o capilar pode estar contaminado com amostra danificada por radiação.
- Quando a contaminação é notada, lave o capilar com alvejante e considere reduzir o tempo de exposição, se possível.
- Redução e análise de dados usando Irena
- Dados de dados de micelle de importação e fundo ASCII (dados sas/data import & exportação/importação/importação ASCII SAS).
- Subtraia a dispersão de antecedentes dos dados da amostra. Normalmente, os valores q mais altos (por exemplo, q > 0,5) mostram dispersão incoerente do solvente dominando o sinal. O dimensionamento dos dados de fundo para combinar os dados da amostra sobre este intervalo q remove qualquer variação devido à variação de intensidade do feixe e concentração amostral.
- Plote a amostra e o fundo em uma escala de log-log. Verifique a intensidade plana em alta q (SAS/Manipulação de Dados/Manipulação de Dados I). Calcule a proporção de amostra/fundo(Data1/Data 2),traçar em escala linear e verificar o asymptotehigh-q.
- Calcule a proporção média (amostra/fundo) sobre essa faixa q (use uma macro ou cópia/cola personalizada em uma planilha do navegador de dados).
- Usando a macro manipulação de dados, dimensione o fundo (por exemplo, Modifique dados 2) usando a proporção calculada acima e plote a razão do sinal subtraído em segundo plano para fundo vs. q ([Data1-Data2]/Data2), verificando se ele agora assimptotes a zero em qalto . Registre essa proporção; deve ser <1-2% longe de 1,0 para cada amostra.
- Plote o sinal subtraído em segundo plano(Data1-Data2) vs. q e salve os dados com um novo nome. Não escreva os dados originais.
- Se os dados de q de altaq não estão disponíveis, use um fator de escala de 1 para subtração de fundo, mas esteja ciente de que imprecisões podem ser introduzidas em faixas q onde a razão de sinal/fundo é pequena.
- Abra a macro de modelagem (SAS/Modeling),em seguida, carregue e plote os dados subtraídos em segundo plano (Dados cntrls/Adicionar dados). Não dimensione nesta macro.
- Primeiro, encontre um modelo aproximado para a superfície externa do PCM (tamanho/forma micelle):
- Em Data cntrls,selecione faixa q baixa a moderada (por exemplo, ~0,003Å-1 < q < ~0.1Å-1). Se as oscilações forem visíveis, inclua-as.
- Escolha um fator de formulário apropriado para os dados. A inclinação em q baixo é indicativo de forma de nanopartículas, que também pode ser verificada através de TEM e/ou MALS. Use os modelos Schulz-Zimm esferoide(q0),cilindro(q-1),ou cilindro flexível (q-2). A Irena fornece ferramentas para adequação das leis de energia (SAS/Ferramentas de Suporte para parcelas e tabelas).
- No Modelo cntrls,selecione a primeira população dispersa (1P) e certifique-se de que é a única em uso (Selecione o Uso?
- Selecione Tamanho dist. para Modelo e escolha o tipo de distribuição desejado e fator de formulário. Defina os parâmetros iniciais para a pesquisa inserindo valores nos campos de Escala, Tamanho Médioe Largura e clique em Calcular o Modelo para desenhar o fator de forma resultante.
NOTA: O fator de forma de cilindro flexível pode ser adicionado como fator de formulário do usuário e baixado a partir de https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. Os parâmetros 1 e 2 correspondem ao comprimento do cilindro e ao comprimento de Kuhn, respectivamente. - Uma vez que parâmetros razoáveis tenham sido encontrados, clique em Fit Model para executar um menos-quadrado não linear adequado aos dados. O modelo de distribuição tamanho dá raio e largura médios.
Para calcular o uso de polidispersão (PDI)
Como em qualquer procedimento de encaixe não linear, pode ser necessário ajustar o alcance de dados (regiãoq) e iniciar parâmetros para obter um ajuste estável e fisicamente razoável. - Uma vez obtido um ajuste razoável, salve-o(Loja em Notebook/Lojaem Pasta).
- Em seguida, modele a dispersão dos polímeros individuais dentro do núcleo PCM. Isso pode ser capturado por um modelo de direito de energia (por exemplo, q-2 para cadeias ideais, q-5/3 para cadeias inchadas, etc.). Irena implementa isso através de um modelo Beaucage43:
onde P é a lei do poder e G e B são prefatores.- Ajuste os controles de dados para cobrir toda a gama q e retraçar o modelo (Calcular Modelo). Normalmente, o excesso de dispersão será observado na faixa q moderada a alta (por exemplo, q > ~0.1Å-1).
- Use os controles de dados para selecionar a faixa q onde o excesso de dispersão (>10x o modelo de fator de forma) é observado.
- Adicione uma segunda população de dispersão (2P) e certifique-se de que é o único em uso (desmarcar Use? para 1P).
- Selecione Nível Unificado para o modelo. B e P são os parâmetros relevantes. Use as ferramentas de suporte de plotagem ou o Fit P/B entre csrs macro para obter um palpite inicial para esses parâmetros, e ajuste os fatores Guinier G e Rg para garantir que o modelo não preveja dispersão excessiva em qbaixo .
- Quanto ao fator de forma, realize um ajuste não linear e grave os parâmetros e o modelo.
- Em seguida, se um pico de difração estiver presente, como na Figura 4,adicione um terceiro modelo para um pico de difração na faixa q de juros (q = ~0,22 Å-1 neste caso).
- Uma vez que os valores de ajuste aproximados sejam obtidos para as populações individuais de dispersão, ligue os três juntos (selecione Use? para cada) e otimize o ajuste combinado.
- Verifique se cada valor permanece fisicamente razoável. O resultado deste procedimento deve ser um modelo composto que descreve os dados SAXS bem acima de uma grande gama de escalas de tamanho, como ilustrado na Figura 4. Salve o ajuste usando o botão Store in Folder para armazenar dentro de Igor.
6. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
- Cryo TEM
- Selecione a grade. Recomendamos uma filme de suporte de carbono furado em uma grade TEM padrão ou carbono lacuda como alternativa. Em ambos os casos, os buracos entre o carbono fornecerão uma área de imagem de gelo e amostra pura e nenhuma amostra e nenhum filme.
- Coloque o lado carbono da grade em um aparelho de descarga de brilho em um slide de vidro limpo. Embrulhar o slide em filme de laboratório pode ajudar com o manuseio da grade. Evite tocar no centro da grade com pinças e sempre beliscar perto da borda da grade.
- Exponha a grade por 30 s.
- Prepare um robô vitrificação para depoimento de amostra.
- Coloque em 100% de umidade e RT e adicione papel manchado. Prepare banhos de etano líquido e nitrogênio líquido na base do robô. Consulte tutoriais e vídeos online para obter ajuda adicional com a preparação e o uso de robôs de vitrificação.
- Diluir a amostra 5x.
- Usando as pinças de ação negativas fornecidas com o robô vitrificação, pegue uma grade, em seguida, conecte as pinças ao robô e mova as pinças para a câmara.
- Enquanto estiver no robô, adicione 4 μL da amostra ao lado carbono da grade usando uma pipeta através do orifício na lateral da máquina.
- Incubar por 4 min.
- Usando o robô, blot 3-5 s com papel filtro.
- O robô vitrificação mergulhará a grade em etano líquido.
- Remova as pinças e mova a rede para nitrogênio líquido e para um recipiente de armazenamento, que também deve estar nitrogênio líquido. Este processo fixa a amostra em uma fina camada de gelo vívido. Minimize o tempo que a rede passa do etano líquido ou nitrogênio líquido durante esta etapa.
- Esfrie o suporte de amostra criocrio usando nitrogênio líquido. Mantenha um Dewar e um reservatório cheios.
- Quando estiver pronto para imagem, carregue a grade no suporte da amostra de criocrio. Mantenha a amostra nitrogênio líquido ou brevemente no vapor de nitrogênio extremamente frio logo acima da superfície líquida.
- Imagem da grade a 120 kV entre 75kx e 150kx em gelo fino e grosso, porque micelles de tamanho diferente podem preferir uma certa espessura de gelo.
- Limitar a exposição ao feixe para evitar derreter gelo e danificar a amostra. Não se concentre diretamente onde planeja imaginar; foco nas proximidades. Apenas exponha a área de interesse ao capturar uma imagem.
- Certifique-se de diferenciar gotas de etano líquido da amostra ao visualizar imagens (ver Figura 5).
- TEM convencional usando coloração negativa
- Prepare a mancha.
- Ferva ~10 mL de água ultrapura. Pesar 0,1 g de formato uranyl (UFo) em um tubo cônico de 15 mL.
- Adicione 5 mL da água quente ao pó UFo para uma solução de 2%. Feche firmemente e enrole em papel alumínio para bloquear a luz. Uma mancha de acetato de 1% de uranyl também é comumente usada.
- Vórtice ou sacudir vigorosamente por 5 min. Fixar o tubo para o vórtice ajudará. Filtre através de um filtro de seringa de 0,2 μm em um tubo cônico limpo.
- Deixe esfriar 10 min para RT. Adicione 25 μL de 5M NaOH e vórtice imediatamente por 2 min.
- Alternativamente, congele 200 alíquotas μL de 2% de UFo. Quando estiver pronto para uso, descongele uma alíquota, adicione 1 μL de 5 M NaOH e vórtice por 2 min.
- Mantenha a mancha envolta em papel alumínio ou longe da luz.
- Diluir a amostra de 10x em 1x PBS (ou buffer desejado).
- Selecione a grade. Recomendamos filme de suporte de carbono em grades de cobre. O lado mais escuro e brilhante da rede é o lado revestido de carbono onde a amostra será depositada e manchada.
- Coloque o lado carbono da grade em um aparelho de descarga de brilho em um slide de vidro limpo. Veja o passo 6.1.2.
- Exponha a grade por 30 s.
- Pegue a grade com o lado do carbono ainda voltado para cima e segure com pinças de ação negativas na borda da grade para evitar rasgar a área de imagem no centro. Abaixe as pinças com a grade ainda mantida lado carbono para cima.
- Aplique uma gota de 4 μL de amostra na parte superior (lado carbono) da grade com uma pipeta.
- Incubar 4 min.
- Com ~1 min à esquerda, pipette a 10 μL e uma gota de 20 μL de solução UFo em um pedaço de filme de laboratório limpo.
- Use papel filtro para retirar a amostra da borda da grade (contato perpendicular) para evitar qualquer contato com a superfície da imagem.
- Usando as pinças (ainda segurando a grade), coloque imediatamente o lado amostral da grade para baixo na gotícula UFo de 10 μL e, em seguida, imediatamente pavo fora do líquido (passo de lavagem). É importante não deixar a grade secar, por isso não pare entre as etapas.
- Da mesma forma, aplique a gotícula UFo de 20 μL na grade. Segure a grade no UFo por 40 s. Wick o líquido desligado e deixe a grade secar.
- Imagem da grade seca em 120 kV entre 20.000x e 100.000x.
- Certifique-se de descartar adequadamente todos os materiais contaminados pela UFo usando o serviço de segurança da instituição para resíduos radioativos.
- Quando necessário, o aprimoramento do brilho/contraste e um filtro mediano podem ser aplicados às imagens TEM no ImageJ para reduzir o ruído de fundo. O pós-processamento deve ser feito uniformemente, apenas para imagens que não são utilizadas para medições quantitativas, como intensidade, e devem ser sempre relatadas.
- Prepare a mancha.
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Representative Results
Para ilustrar os métodos de caracterização descritos acima, mostramos resultados típicos para PCMs montados a partir de oligonucleotídeos e blocos de copolímeros de vários comprimentos e químicas(Figura 1). A Figura 2 fornece um exemplo de como o tamanho do núcleo PCM (conforme determinado a partir de SAXS e TEM, Figura 4 e Figura 5) variou com comprimento de bloco carregado. A Figura 3 mostra dados de DLS e resultados adequados para PCMs esféricos formados a partir de copolímeros de blocos relativamente longos e oligonucleotídeos curtos de uma só vez. A Figura 4 ilustra como o complexo espectra de intensidade SAXS poderia ser ajustado com precisão combinando modelos para as múltiplas correlações espaciais que estavam presentes (superfície externa, dispersão intra-núcleo, pedido inter-hélice), e como o MALS poderia ser usado para estender medidas de dispersão para escalas de comprimento mais longas. Finalmente, a Figura 5 mostra dados representativos de microscopia eletrônica para PCMs de morfologia variável.
Figura 1: Montagem e caracterização de PCMs ácido nucleicos. (A)Polímeros aniônicos, como oligonucleotídeos, formavam complexos separados de fase com regiões cationic de copolímeros de blocos. A presença de um bloco neutro hidrofílico (cinza) resultou na formação de nanopartículas pcm estáveis. (B)PcMs foram nanopartículas de casca de núcleo com múltiplos parâmetros para caracterizar. O tamanho geral (raio hidrodinâmico, Rh) poderia ser determinado usando DLS, o raio central (Rc) poderia ser encontrado usando SAXS e TEM, o tamanho da coroa poderia ser calculado como Rh-Rc, e a morfologia poderia ser determinada em múltiplas escalas de comprimento combinando SAXS, MALS e TEM. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Dependência do tamanho micelle. O tamanho do núcleo micelle foi determinado principalmente pelo comprimento do bloco carregado do copolímero do bloco, e em grande parte independente do comprimento do homopolímero7,26. Isso permite o controle do tamanho do PCM por escolha de polímero de bloco. Os dados aqui mostrados são para pLys-PEG com DNA de 88 nt/bp e foram relatados anteriormente26. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Dispersão dinâmica da luz. (A) Função de autocorrelação (unidades arbitrárias) para 10 nt DNA de uma única cadeia + pLys (100)-PEG(10k) PCM. (B)Distribuição de raios hidrodinâmicos (histograma) de REPES se encaixam. A função de autocorrelação decai a um valor plano com uma única escala de tempo, resultando em um pico de tamanho único na distribuição de tamanho REPES. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Dados SAXS representativos e MALS e adequados para uma micelle cilíndrica. Os dados SAXS (círculos cinzentos) são mostrados para PCMs montados a partir de pLys (50)-PEG(5k) e DNA de 88 bp de dupla-cadeia. Em q baixo (< 10-2 Å-1), a intensidade mostrou uma dependência aproximadamente q-2 na transferência de impulso, implicando uma forma flexível de cilindro (micelle semelhante a verme). Os dados do MALS (círculos negros abertos) mostram a mesma dependência, indicando que as micelis tinham pelo menos vários micrômetros de comprimento (corroborados por imagem TEM, Figura 5C,D). Micelles spheroidal mostrariam uma dependência plana (q0) de intensidade em q nesta faixa. As linhas coloridas ilustram o procedimento de encaixe multicomponente para dados PCM SAXS descritos na seção 5. A dispersão a baixo q (grandes escalas de distância) foi dominada pela superfície externa do PCM, e se encaixava bem por um modelo flexível de cilindro (vermelho). Em valores q mais elevados (menor escala de comprimento), a dispersão foi dominada pelos polímeros individuais dentro do núcleo PCM, cabem aqui por uma lei de energia (verde) com baixo corte q. Também observamos embalagem paralela de helices de DNA de dupla cadeia dentro do núcleo PCM, resultando em um pico de difração quase-Bragg (azul). A linha preta mostra que a combinação desses modelos descreveu com precisão os dados SAXS, e a adição de dados de dispersão de luz (círculos abertos) estendeu o alcance de tamanho em quase quatro ordens de magnitude. Os resultados adequados deram a uma população de PCM com raio médio = 11,0 nm e PDI = 0,03, direito de energia em alto q = 1,81 e o pico de difração representa o espaçamento inter-hélice de 2,71 nm. Os dados do SAXS foram relatados anteriormente26 e estão disponíveis publicamente44. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Imagens TEM de PCMs ácido nucleic. (A–B) Crio TEM de 22 nt DNA de fio único + pLys (50)-PEG(5k) PCMs, mostrando morfologia predominantemente esférica. As setas azuis indicam gotículas de etano líquido, para não serem confundidas com os PCMs (objetos esferoidatextizados). (A)é ligeiramente pouco focado, adicionando ligeiro contraste ao preservar a resolução. (B)está substancialmente subfocado, adicionando mais contraste, mas sacrificando clareza. Ajustes de brilho e contraste e um filtro mediano de dois pixels foram aplicados em ambas as imagens. (C-D) Tem manchado negativo de 88 bp DNA duplo-encalhado + pLys (50)-PEG(5k) PCMs, que são longos cilindros flexíveis. Em ambos os casos, o core radii da TEM foi consistente com os valores obtidos a partir da montagem de dados SAXS. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Como mencionado acima, os protocolos aqui apresentados são escritos com foco em oligonucleotídeos como componente de polianion e pLys-PEG como copolímero de bloco cationic neutro, mas nós os testamos com uma variedade de polímeros, como poli (ácido acrílico), poliglutamato e PEG-poly (trimetilamônio de vinilbenzyl), e acreditamos que eles serão geralmente aplicáveis para a maioria dos pares polieletrotrólitos. Um parâmetro que pode precisar ser otimizado é a concentração de sal usada para aveia, pois deve ser alto o suficiente para que os PCMs não se formem no início da anneal. Isso pode ser verificado experimentalmente pelo DLS, ou em comparação com a observação da separação de fase apenas com os polieletrólitos (sem bloco neutro). O acarinamento térmico pode ser usado se o acarinamento de sal for indesejável, embora as polidispersões resultantes sejam maiores7. As concentrações utilizadas para caracterização também podem precisar ser otimizadas, pois nanopartículas maiores espalham mais luz do que as pequenas, e os ácidos nucleicos são mais eficientes na dispersão de raios-X do que muitos outros polímeros devido à presença de átomos de fósforo densos na espinha dorsal. Também pode ser necessário controlar mais de perto o pH do buffer se qualquer polieletrólito tiver um pKa perto da condição de trabalho.
Neste artigo apresentamos protocolos para duas técnicas de dispersão de luz (ou seja, dispersão de luz multi-ângulo/estática e dispersão dinâmica de luz), bem como dispersão de raios-X de pequeno ângulo, além de microscopia eletrônica de transmissão de manchas negativas e criogênica convencional, com dados representativos para cada um. Nem todas as técnicas são necessárias para todos os cenários, e outras também estão disponíveis, levantando a questão de que devem ser empregadas quando. Existe uma ampla revisão sobre este assunto45,46,mas sugerimos o seguinte ao caracterizar um novo PCM ou nanopartículas semelhantes. Comece verificando a agregação, tanto por inspeção visual para turbidez quanto por microscopia óptica. Se não for observada nenhuma agregação, o próximo passo é determinar se existem alguma nanopartículas. O DLS é uma maneira rápida de determinar isso porque os PCMs espalham a luz vigorosamente, e a dispersão de luz fraca ou inexistente é um forte indicador de má formação de nanopartículas. Embora o DLS possa confirmar a presença de nanopartículas, é difícil determinar seu tamanho e forma sem referência a outros dados, já que a maioria dos métodos de análise dependem da relação Stokes-Einstein, que assume partículas esféricas. O MALS pode confirmar formas esféricas (intensidade normalizada plana vs. ângulo), mas pode não ser capaz de determinar a forma de partículas não esféricas, a menos que a distribuição de tamanho seja estreita e caia no alcance correto para resolução. Como resultado, recomendamos realizar TEM, SAXS ou ambos em qualquer amostra de PCM, a fim de caracterizar totalmente suas propriedades.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Phil Griffin e Tera Lavoie do Soft Matter Characterization Facility e advanced Electron Microscopy Facility, respectivamente, na Universidade de Chicago. Agradecemos também a Xiaobing Zuo e Soenke Seifert da Fonte De fótons Avançada do Laboratório Nacional de Argonne e do Centro NIST de Design de Materiais Hierárquicos (CHiMaD). Agradecemos a Jeff Ting e Michael Lueckheide por suas contribuições para este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 mm circle filter paper | Whatman | 1001-070 | Filter paper for wicking during grid prep |
| Carbon Film TEM grid | Electron Microscopy Sciences | CF200-Cu | TEM grid |
| DAWN | Wyatt Technology | DAWN | MALS instrument |
| DNA oligonucleotide | Integrated DNA Nanotechnologies Inc | Custom oligonucleotide | |
| Lacey Carbon TEM grid | Electron Microscopy Sciences | LC200-Cu | TEM grid |
| Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 | Alamanda Polymers Inc | mPEG5K-b-PLKC50 | Example block copolymer |
| Milli-Q | Millipore Sigma | Ultrapure water | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | For measuring nucleic acid concentration | |
| negative-action tweezers | Dumont | N7 | Tweezers for grid preparation |
| Parafilm "M" | Bemis Company Inc | PM996 | Laboratory film |
| Quantifoil Holey Carbon TEM grid | Electron Microscopy Sciences | Q210CR1.3 | TEM grid |
| Research Goniometer and Laser Light Scattering System | Brookhaven Instruments | BI-200SM | DLS/MALS instrument |
| Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL | Thermo Scientific Pierce Protein Biology | 87723 | Dialysis cartridge |
| small volume cuvette | Brookhaven Instruments | BI-SVC | Cuvette for DLS/MALS |
| Solarus 950 Advanced Plasma System | Gatan | Solarus 950 | Plasma system for TEM grids |
| Talos TEM | FEI | Talos | TEM used for cryo samples |
| Tecnai Spirit TEM | FEI | Spirit | TEM used for dry samples |
| Uranyl Formate | SPI-Chem | 16984-59-1 | For negative staining samples for TEM |
| Vitrobot | FEI | Vitrobot | Vitrification robot for cryo grid preparation |
References
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