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Chemistry

Montaje y caracterización de micelas complejas de polielectrolitos

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60894
Automatic Translation
1, 1, 1
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

Proporcionamos protocolos y datos representativos para diseñar, ensamblar y caracterizar micelas complejas de polielectrolitos, nanopartículas de carcasa central formadas por polielectrolitos y copolímeros de bloques hidrofílicos sin carga.

Abstract

Las micelas complejas de polielectrolitos (PCM), las nanopartículas de carcasa central formadas por el autoensamblaje de polímeros cargados en solución acuosa, proporcionan una potente plataforma para explorar la física de las interacciones de polielectrolitos y también ofrecen una solución prometedora para el problema apremiante de la administración de oligonucleótidos terapéuticos in vivo. El desarrollo de relaciones estructura-propiedad predictivas para PCM ha resultado difícil, en parte debido a la presencia de fuertes trampas cinéticas durante el autoensamblaje de nanopartículas. En este artículo se describen los criterios para la elección de polímeros para la construcción de PCM y se proporcionan protocolos basados en el recocido de sal que permiten el montaje de nanopartículas repetibles de baja polidispersidad. También discutimos la caracterización de PCM mediante dispersión de luz, dispersión de rayos X de ángulo pequeño y microscopía electrónica.

Introduction

Cuando los polielectrolitos cargados de forma opuesta se mezclan en solución acuosa, la ganancia de entropía por la liberación de sus contraiones provoca la desmezcla de la solución en una fase condensada rica en polímeros y un sobrenadante agotado por polímeros1,2,3,4,5, un fenómeno conocido como complejo de polielectrolitos. Si un bloque hidrófilo neutro se conjuga con uno o ambos polielectrolitos, se produce una separación de fase a nanoescala en su lugar(Figura 1A). Las nanopartículas autoensambladas resultantes de la cáscara del núcleo se conocen como micelas complejas de polielectrolito (PCM), micelas complejas de polión, complejos de ionómeros de bloques o micelas de núcleo de coacervate por analogía a la micelar surfactante, aunque todos los componentes del sistema sean hidrófilos6,7. La capacidad de un PCM para encapsular moléculas hidrófilas como proteínas y ácidos nucleicos, así como la amplia afinación que ofrece la arquitectura portadora de copolímero sin bloques los convierte en candidatos atractivos para la entrega de moléculas terapéuticas in vivo8,9,10,11,12,13.

La entrega de ácidos nucleicos terapéuticos a las dianas celulares es un desafío particularmente importante, y uno para el que los PCM ofrecen varias ventajas. Los ácidos nucleicos terapéuticos (ADN genético, ARNm y oligonucleótidos como el siRNA) tienen un inmenso potencial para mejorar la salud humana, pero deben superar numerosas barreras biológicas y físicas para darse cuenta de que el potencial14,15,16. Los ácidos nucleicos desnudos se degradan por nucleasas séricas y celulares, se eliminan rápidamente de la circulación, y su fuerte carga negativa hace que sea difícil para ellos penetrar las membranas celulares sin ayuda. Los enfoques actuales para superar estas barreras incluyen costosas modificaciones químicas para prevenir daños causados por nucleasas y/o encapsulación en varias nanopartículas lipídicas ensambladas a través de interacciones hidrofóbicas15,17,18. Si bien estos métodos han demostrado ser eficaces para las inyecciones locales y la segmentación hepática, el uso sistémico presenta limitaciones significativas de toxicidad, inmunogenicidad, y la biodistribución limitada16. Por el contrario, los PCM utilizan la carga negativa de los ácidos nucleicos para condensarlos dentro del núcleo separado por fases, mientras que la corona neutra proporciona una barrera esterica contra la degradación, así como una plataforma para incorporar ligandos para mejorar la orientación o internalización11,19. Estudios in vitro y en animales han demostrado que los PCM pueden entregar eficazmente varias cargas útiles de ácido nucleico20,21,22,23,24, pero las debilidades en nuestra capacidad para predecir las propiedades de PCM como el tamaño, la forma, y la estabilidad de las propiedades de los polímeros constituyentes han obstaculizado su adopción más amplia.

El trabajo reciente de nuestro grupo y otros en el campo ha comenzado a abordar este problema mediante el desarrollo de estructura-propiedad, y en algunos casos relaciones estructura-propiedad-función para PCM formados a partir de ácidos nucleicos y diversos polímeros catiónicos neutros7,25,26,27. Dos temas consistentes que han surgido de estos estudios son la importancia de desarrollar protocolos bien controlados y repetibles para el ensamblaje de PCM y la ventaja de utilizar múltiples técnicas para caracterizar las nanopartículas resultantes. Los polielectrolitos, particularmente aquellos con alta densidad de carga como los ácidos nucleicos, interactúan entre sí con mucha fuerza, y parecen quedar fácilmente atrapados cinéticamente al mezclar, lo que resulta en preparaciones PCM que son altamente sensibles a pequeñas variaciones en el procedimiento y muestran alta polidispersidad y mala repetibilidad de lote a lote. También se ha demostrado que los PCM adoptan una amplia gama de formas y tamaños dependiendo de las configuraciones de nivel atómico de sus componentes, y capturar esta diversidad con cualquier técnica de caracterización individual es muy difícil, particularmente porque algunas técnicas comunes como la dispersión dinámica de la luz (DLS) requieren suposiciones sobre la forma de las partículas para su interpretación.

En este artículo, discutimos el diseño de materiales y la selección para PCMs, con un enfoque en oligonucleótidos y copolímeros dibloque catiónicos neutros. A continuación, describimos un protocolo de recocido de sal que utiliza altas concentraciones de sal seguidas de diálisis lenta para evitar la captura cinética durante el montaje de PCM. Los polielectrolitos se mezclan en condiciones de alta sal donde se examinan las atracciones electrostáticas, luego la concentración de sal se reduce lentamente para permitir que los polielectrolitos se asienten en sus configuraciones más favorables energéticamente, análogas al lento proceso de enfriamiento del recocido térmico. Utilizando este protocolo, somos regularmente capaces de lograr una polidispersidad excepcionalmente baja y alta repetibilidad para PCMs de oligonucleótidos7,26. Por último, describimos cómo se pueden utilizar cuatro técnicas de medición separadas para caracterizar los PCM en una amplia gama de escalas de longitud, desde la morfología externa hasta la estructura interna: DLS, dispersión de luz multiángulo (MALS), dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Esperamos que estos protocolos permitan a más investigadores explorar eficazmente las capacidades de estas nanopartículas interesantes.

Selección y preparación de polímeros
Las propiedades de PCM están fuertemente influenciadas por las características físicas y químicas de los polímeros constituyentes, haciendo que la selección de polímeros sea un paso crítico en el proceso de diseño. Los copolímeros de bloque más bien caracterizados para PCM de ácido nucleico son dibloques lineales como poli(lisina)-poli(etilenglicol) (pLys-PEG), pero los PCM se pueden formar entre polielectrolitos y una variedad de polímeros hidrofílicos con carga neutra, que se pueden generar de una manera de alto rendimiento28. Se ha demostrado que la elección del grupo cargado afecta en gran medida a la estabilidad del emparejamiento iónico y la forma de las micelas26,y se ha demostrado que el tamaño de PCM aumenta con la longitud del bloque cargado5,7,26 (Figura 2), lo que permite ajustar las propiedades pcM a los requisitos de una aplicación deseada. Para los bloques lineales, hemos encontrado que el bloque cargado debe tener al menos 10 cargas y ser fuertemente cargado en el pH deseado. Los bloques cargados más largos pueden promover la formación de PCM con oligonucleótidos como el siRNA, que son difíciles de complejos con bloques más cortos21. Hemos observado con éxito la formación de PCM con longitudes de bloque de hasta 200, y la literatura describe polímeros más largos. Hay más flexibilidad disponible en la elección de los bloques neutros24,pero la experiencia ha demostrado que los bloques neutros muy cortos conducen a la agregación en lugar de la formación de nanopartículas, y que la longitud neutra mínima aumenta con la longitud de bloque cargada. Para pLys-PEG, se requiere un MW PEG de al menos 3.000–5.000 para longitudes de pLys inferiores a 50 euros, y se requieren longitudes más largas a medida que el bloque cargado se incrementa aún más. El aumento de la longitud del bloque neutro da como resultado un mayor tamaño de PCM, particularmente el espesor de la cáscara, debido al hacinamiento escorésico de los polímeros neutros.

Este manuscrito presenta un protocolo para preparar PCMs a partir de pLys-PEG liofilizados de alta pureza y oligonucleótidos de cantidad conocida, pero debe ser fácilmente adaptable a otros sistemas también. Lo hemos probado con éxito con varios polipéptidos cargados, incluyendo poliarginina y ácido poliglutámico, así como varios polielectrolitos sintéticos, como el ácido poliacrílico y el poli(trimetilamonio de vinilobencilo). También describimos la preparación de PCM con una relación estequiométrica de cargas de polielectrolito, pero esto se modifica fácilmente. Nos resulta más fácil trabajar en unidades de concentración de carga (c.c.), que también acomodan naturalmente polímeros que no están completamente cargados. Si alguno de los polímeros no está bien caracterizado, se debe tener cuidado de determinar con precisión las longitudes/masas de polímeros y asegurarse de que el exceso de sal no está presente más allá del necesario para la neutralización de la carga mediante diálisis, por ejemplo. La presencia de cualquier agua retenida también debe tenerse en cuenta cuando se calculan las concentraciones. La concentración de ácido nucleico puede cuantificarse convenientemente mediante absorbancia a 260 nm, y se debe considerar la presencia o ausencia de fosfatos terminales al calcular el c.c.

Cuando se utilizan oligonucleótidos como poliolaiones, el estado de hibridación y la estructura química ayudan a determinar la propensión al autoensamblaje y las características del PCM5resultante,7,26. Optimizarlos, dentro de los requisitos de eficacia biológica si se utilizan PCMs para la entrega, aumentará la probabilidad de formar las estructuras deseadas. Las herramientas útiles para analizar la hibridación incluyen funciones de MATLAB para ácidos nucleicos, NUPACK29e IDT OligoAnalyzer. Recomendamos analizar una secuencia candidata para entender la fuerza de la unión a 1) sí mismo en una formación de horquilla; 2) otra copia de la misma secuencia (autodimer); y 3) a otros oligonucleótidos presentes en el sistema. Las temperaturas de fusión de ADN y ARN para una secuencia específica también se pueden calcular utilizando el método de vecino más cercano30,31. El recocido térmico de ácidos nucleicos (paso 2.3) desnaturaliza cualquier estructura secundaria residual en los nucleótidos individuales y promueve el plegado de equilibrio.

Caracterización y análisis de PCM
Una amplia gama de técnicas están disponibles para caracterizar nanopartículas, incluyendo dispersión de luz estática y dinámica, dispersión de pequeños ángulos de electrones o neutrones, y microscopía electrónica. En este artículo, proporcionamos protocolos para dos técnicas de dispersión de luz, dispersión de rayos X de ángulo pequeño y dos técnicas de microscopía electrónica.

DLS mide la autocorrelación de fluctuaciones temporales en la intensidad de dispersión en un ángulo desde el movimiento Browniano de la muestra. La colocación de estos datos puede proporcionar radio hidrodinámico y polidispersidad para las micelas esféricas(Figura 3). La dispersión de luz de múltiples ángulos (MALS) mide la intensidad de dispersión estática en muchos ángulos. Esta dependencia angular describe la forma de la nanopartícula, pero se limita a escalas de longitud superiores a 50 nm para la luz visible, lo que limita su eficacia para nanopartículas más pequeñas. Ambas técnicas se basan en la discordancia del índice de refracción y describen principalmente las dimensiones externas de la nanopartícula.

La dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) utiliza rayos X como sonda de dispersión, y su longitud de onda más corta permite mediciones en un rango de 0,1 a 100 nm. El ajuste de la intensidad de dispersión observada frente al ángulo (expresada convencionalmente como transferencia de impulso q) proporciona información sobre la morfología de PCM (es decir, tamaño y forma) y también la estructura interna. Si se dispone de una calibración de intensidad absoluta, y si la intensidad de dispersión se puede extrapolar a ángulo cero, la masa PCM y el número de agregación también se pueden estimar32,lo que convierte a SAXS en un método extremadamente versátil y valioso. La dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS) es sensible en un rango similar de escalas de longitud, pero sólo está disponible en instalaciones especializadas y no se discutirá explícitamente en este artículo33,34,35.

En los últimos años se ha advenido los instrumentos SAXS de sobremesa, pero nos encontramos con que las fuentes de sincrotrón son más adecuadas para la caracterización de PCM, ya que su mayor intensidad permite que los datos se recopilen mucho más rápido para estas muestras de bajo contraste. Proporcionamos un breve protocolo para adquirir datos PCM SAXS en Beamline 12-ID-B en la Fuente Avanzada de Fotones (Argonne National Laboratory, USA) desde la perspectiva del usuario. Este protocolo debe ser aplicable a la mayoría de las fuentes de sincrotrón, pero es muy recomendable consultar con el personal local antes de proponer un experimento. También proporcionamos un protocolo de reducción y análisis de datos utilizando Irena36,un conjunto gratuito de macros escritas para Igor Pro. Irena incluye un conjunto versátil de factores de forma para modelar datos SAXS y permite la construcción de modelos multicomponente que son capaces de describir el perfil de dispersión complejo de los PCM (ver Resultados Representativos, Figura 4). Irena también tiene documentación completa y tutoriales disponibles en línea. Antes de intentar los procedimientos siguientes, se recomienda familiarizarse con estos, especialmente el tutorial "Modelado de datos SAXS con dos poblaciones principales de dispersores".

El daño por radiación es una preocupación para la dispersión de rayos X, pero se pueden emplear varias medidas para minimizarlo. En particular, recomendamos utilizar una configuración de celda de flujo con una bomba de jeringa y una muestra de PCM que fluya durante la adquisición de datos, en lugar de un capilar sellado. Esto también simplifica en gran medida la resta de fondo. También sugerimos tomar múltiples exposiciones de la muestra que fluye en lugar de una más larga con el fin de limitar el flujo que ve cualquier volumen único de la muestra y para permitir la comparación de los datos de exposición para identificar cualquier daño.

A diferencia de las técnicas de dispersión, que generalmente requieren ajuste para interpretar, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporciona una imagen visual de espacio real de las nanopartículas pasando un haz de electrones a través de la muestra y proyectando una imagen en una pantalla de centelleo(Figura 5). Presentamos protocolos para dos técnicas TEM en este artículo. Cryo TEM congela las muestras de micelas en una fina capa de hielo vítreo, preservando la conformación estructural con sustancias extrañas mínimas, óptima para micelas de 10-100 nm de radio. La tetina negativa TEM utiliza una sal de metal pesado (por ejemplo, uranio) para rodear la muestra después de que se haya secado en la superficie de una rejilla. La mancha densa dispersará más electrones que la muestra, añadiendo contraste y produciendo una imagen negativa de la muestra. Cryo TEM se recomienda para imágenes de alta calidad. Sin embargo, es más costoso, consume mucho tiempo y puede no proporcionar suficiente contraste. Cuando esto es una preocupación, se deben utilizar muestras manchadas negativas. Ejemplos de cada uno se muestran en la Figura 5.

Cada una de estas técnicas informa sobre aspectos ligeramente diferentes de las nanopartículas, con diferentes fortalezas y limitaciones. La dispersión de la luz está fácilmente disponible, y a menudo es el enfoque más rápido, pero tiene limitaciones sustanciales en el tamaño y la resolución de la forma. SAXS puede proporcionar información en una amplia gama de escalas de longitud a un rendimiento razonablemente alto, pero requiere equipos especializados para adquirir los datos, así como modelarlos para interpretarlos. Las imágenes TEM son fáciles de interpretar, pero pueden limitarse en contraste y tienen un rendimiento inherentemente bajo. Nuestra experiencia ha demostrado que el uso de múltiples técnicas de caracterización aumenta en gran medida la información que se puede obtener sobre las propiedades de PCM y simplifica la interpretación de los conjuntos de datos obtenidos de cada uno solo. Por ejemplo, SAXS y TEM examinan principalmente el núcleo denso de un PCM, mientras que los informes de dispersión de luz sobre las dimensiones globales de la nanopartícula. Por lo tanto, combinarlos permite la medición del tamaño del núcleo y corona. La capacidad de TEM para adquirir imágenes de espacio real puede proporcionar datos de la verdad del suelo para permitir la selección de factores de forma adecuados para modelar datos SAXS que de otro modo podrían ser ambiguos. En este artículo se describen los protocolos para las cuatro técnicas y se proporciona un proceso de ejemplo para usarlos para caracterizar una muestra desconocida en la sección Discusión.

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Protocol

1. Preparación de materiales

  1. Pesar el polímero dibloque liofilizado y añadir agua hasta casi el volumen necesario para una solución en stock de 10 mg/ml de concentración final. Vórtice a máxima velocidad durante 2 min.
  2. Sonicato durante 5 min. Los bloques muy largos pueden requerir sonicación adicional. La solución en stock debe parecer completamente transparente y homogénea.
  3. Ajuste el pH a 7.4 usando NaOH o HCl según sea necesario. Agregue agua al volumen final. Las soluciones pLys-PEG son bastante estables, pero deben refrigerarse para un almacenamiento a largo plazo y el pH debe comprobarse antes de su uso. La liofilización es preferible a la congelación.
  4. Resuspender oligonucleótidos liofilizados a la concentración de stock deseada, típicamente 2-5 mM de concentración molecular para longitudes de 50 nt o menos. Vórtice a fondo para asegurar la disolución completa.
  5. Calcular las concentraciones molares utilizando peso molecular o longitud como se describe en la Introducción.
  6. Calcular las concentraciones de carga molar (c.c.), donde

Equation 1

La carga de polielectrolito es el número de monómeros cargados, mientras que la carga de ácido nucleico es el número de bases menos 1, suponiendo que no haya fosforilación. Tenga en cuenta que el ADN de doble cadena tendrá el doble de cargas por molécula en comparación con el ADN de una sola cadena.

  1. Cree material diluido a 20 mM c.c. para cada polímero.

2. Preparación de micelas de polielectrolito de ácido nucleico

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezcle lo siguiente con un volumen total de 280 ml:
    1. 200 l de agua libre de nucleasas (agua ultrapura para PCM sin ácidos nucleicos).
    2. 40 l de solución salina tamponada con fosfato de 10x (PBS, cloruro sódico de 137 mM, fosfato de 10 mM, pH 7,4 cuando se diluye a 1x) u otro tampón adecuado37.
    3. 40 oL de 20 mM c.c. oligonucleótido. Para los oligonucleótidos de doble cadena, agregue 20 ml de cada hebra a 20 mM c.c.
  2. Incubar la solución de oligonucleótido durante 5 min a 70 oC. Si la temperatura de fusión calculada para los oligonucleótidos es mayor, la temperatura debe aumentarse en consecuencia. Tenga en cuenta que el ARN se degradará a temperaturas elevadas, por lo que este paso no debe ser más largo si este u otros componentes sensibles están presentes.
  3. Enfriar durante 15 min. Añadir 40 s de 20 mM c.c. dibloque, a continuación, vórtice inmediatamente durante 20 s a la velocidad máxima. Incubar 5 min a temperatura ambiente (RT).
  4. Realice el salado.
    1. Añadir 80 ml de cloruro sódico de 5 M para una concentración final de 1 M de NaCl y un volumen final de 400 ml. Vórtice para 10 s a máxima velocidad.
    2. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego cargar en cartuchos de diálisis. Tenga en cuenta que los cortes de peso molecular enumerados se determinan para las proteínas globulares y no serán precisos para los polímeros lineales. Encontramos que un cartucho MWCO de 2k evita la pérdida de muestra y también proporciona cambios graduales en la resistencia iónica.
    3. Preparar baños de diálisis.
      1. Calcule el volumen de baño de diálisis necesario:
        Equation 2
      2. Mezclar 10pbS (u otro tampón deseado), 5 M NaCl y agua ultrapura para una solución final de 1x PBS y 0.5M NaCl, así como dos soluciones de 1x PBS.
    4. Cargue cartuchos de diálisis.
      1. Etiquetar cartuchos con marcador permanente. Remoje los cartuchos en tampón durante al menos 2 minutos para hidratar las membranas.
      2. Retire la tapa girando en sentido contrario a las agujas del reloj. Cargue la muestra con la punta de la pipeta de carga en gel. Elimine el exceso de aire apretando suavemente las membranas. Vuelva a colocar la tapa.
      3. Coloque los cartuchos en el baño de diálisis de 1x PBS, 0,5 M de cloruro sódico. Los cartuchos deben flotar, con ambas membranas expuestas al baño. Los flotadores de espuma se pueden utilizar si es necesario.
    5. Diálisis
      1. Incubar durante 24 horas revolviendo lentamente con una barra de agitación magnética.
      2. Mueva los cartuchos a un nuevo baño de 1x PBS u otro búfer de trabajo deseado. Incubar durante 24 horas, revolviendo lentamente con una barra de agitación magnética. Repita este paso.
    6. Recuperar la muestra.
      1. Retire los cartuchos del baño. Retire la tapa y recupere la muestra con una punta de pipeta de carga en gel. Tenga en cuenta que el volumen recuperado puede ser superior a los 400 oL iniciales debido a la hinchazón de la membrana. Registre el volumen recuperado si la dilución leve es una preocupación.
      2. Coloque la muestra en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml. Los PCM preparados de esta manera deben ser estables durante varios meses cuando se refrigeran, siempre que se haya evitado la contaminación por nucleasas.

3. Dispersión dinámica de la luz

  1. Para garantizar condiciones libres de polvo, los tampones deben filtrarse cuidadosamente (filtrarse 3 veces a través de una jeringa o filtro de vacío de 0,22 m) y limpiarse a fondo entre las muestras. También es importante asegurarse de que la muestra ha alcanzado el equilibrio térmico antes de realizar la medición.
  2. Diluir la muestra de PCM a 0,2 mM c.c. (10x si se utiliza el protocolo descrito anteriormente) con el búfer de trabajo deseado y cargar en una cubeta adecuada. Utilizamos una cubeta de pequeño volumen, que requiere 200 s de muestra después de la dilución.
  3. Ajuste la posición del detector DLS a 90o.
  4. Ajuste la potencia del láser y/o el atenuador para que la tasa de recuento sea de 100.000 a 200.000 recuentos por segundo (cps), si es posible. Se pueden utilizar tasas de recuento tan bajas como 10 kcps, pero es posible que sea necesario ampliar los tiempos de medición para obtener buenas estadísticas (paso 4.1). Se deben evitar tasas de recuento más altas, ya que la dispersión múltiple confundirá la medición.
  5. Adquirir datos durante 1 min. La tasa de recuento debe ser constante durante todo el tiempo de adquisición; si no es así, esto indica que algún componente de la muestra o instrumento aún no se ha equilibrado.
  6. Examine los datos de autocorrelación. La línea de base de largo plazo debe ser muy plana, y la curva de autocorrelación debe ser suave, con una dispersión mínima, como se muestra en la Figura 3A. La deriva de línea base indica falta de equilibrio y el ruido en los datos se puede mejorar adquiriendo más datos.
  7. Ajuste la función de autocorrelación.
    1. Utilice REPES38,39 para realizar la transformación inversa regularizada de Laplace para ofrecer una distribución de los tiempos de relajación y un coeficiente de difusión, D. Este método calcula el radio hidrodinámico, Rh, utilizando la ecuación Stokes-Einstein:
      Equation 3
      El cuadro 1B muestra una representación de Rh y el cuadro 3B muestra el resultado de los REPES.
    2. Alternativamente, utilice otros métodos, incluyendo CONTIN40,41 (un algoritmo de regularización alternativo) o ajuste de mínimos cuadrados no negativos (NNLS). Los resultados coherentes de varios métodos de ajuste son una firma de datos de alta calidad. Tenga en cuenta que el análisis cumulante (estándar en muchos instrumentos) proporciona valores no físicos para distribuciones multimodales de tamaño/longitud.

4. Dispersión de luz multiángulo

NOTA: La intensidad de dispersión de la luz frente al ángulo se puede medir en una variedad de instrumentos. Hemos obtenido buenos resultados utilizando tanto instrumentos basados en goniómetro sortorómetro como instrumentos de detector múltiple, ejecutados en modo por lotes.

  1. Ajuste la concentración del PCM y la intensidad de la iluminación para proporcionar suficiente señal/ruido frente a una muestra solo de búfer en todos los ángulos sin saturar ningún detector. Este último se puede probar preparando muestras en diversos factores de dilución y comprobando la linealidad de la intensidad frente a la concentración (suponiendo una interacción mínima entre los PCM).
  2. Registre la velocidad de dispersión de la luz de 15o a 135o durante 1 min por ángulo. Si la muestra y el instrumento están correctamente equilibrados, la velocidad de dispersión será constante durante el tiempo de medición.
  3. Trazar la velocidad de dispersión normalizada, Isin(o), vs. q, donde yo es la tasa de dispersión. q es el vector de dispersión (transferencia de impulso de foton) según lo definido por

Equation 4

donde el índice de refracción del disolvente, el ángulo de medición, y la longitud de onda de la fuente de luz. La Figura 4 muestra una gráfica de intensidad de dispersión MALS.

5. Dispersión de rayos X de ángulo pequeño

  1. Adquisición de datos
    1. Prepare muestras de PCM como se describió anteriormente a una concentración de carga de 2 mM para PCM de oligonucleótidos para una dispersión amplia por encima del fondo. Para los PCM que carecen de átomos pesados (por ejemplo, fósforo en ácidos nucleicos), pueden ser necesarias concentraciones más altas. Las densidades de longitud de dispersión se pueden estimar utilizando calculadoras como SASSIE42.
    2. Para minimizar el daño por radiación mediante la eliminación de radicales libres, agregue glicerol de un concentrado (por ejemplo, 50%) solución de stock para que la solución de micelas contenga 1% (v/v) glicerol. Tenga en cuenta que el glicerol limpio es muy viscoso y difícil de medir con precisión. Se recomienda diluir con agua o tampón.
    3. Prepare un gran volumen de búfer de trabajo con un 1% de glicerol para su uso como monitor en segundo plano.
    4. Prepare el aparato de celda de flujo específico de la línea de viga y calibre el detector. El protocolo utiliza un capilar de cuarzo de 3 mm de diámetro conectado a una bomba de jeringa controlada por ordenador con un diámetro pequeño y un tubo de polietileno de longitud mínima. Con esta configuración se necesita un volumen mínimo de 140 s por muestra.
    5. Determine los parámetros de exposición de la muestra. La exposición óptima variará en función de la intensidad del haz, la sensibilidad del detector y la concentración, la resistencia a la dispersión y la susceptibilidad al daño de la muestra, pero el objetivo es exponer la muestra al flujo mínimo necesario para obtener suficiente intensidad de dispersión sobre el rango q de interés.
    6. Para PCM de oligonucleótido/pLys-PEG, las exposiciones de 30x 0,2 s a una velocidad de repetición de 1 Hz producen una buena calidad de datos con poco daño perceptible. Para las muestras nuevas, el siguiente procedimiento puede ser útil:
      1. Preparar muestras de PCM en un rango de concentraciones (por ejemplo, 10–10.000 m c.c.).
      2. A partir de una concentración intermedia, pcM alternativo y muestras solo de búfer con diferentes tiempos de exposición. Consulte a continuación el procedimiento de adquisición y reducción de datos. La señal de muestra debe tener buenas estadísticas (pequeño error estadístico o variación suave a través de q). Si las estadísticas son deficientes, el tiempo de exposición puede aumentar.
      3. La señal de muestra también debe distinguirse claramente del fondo sobre el rango q de interés. Calcular y trazar la relación (señal-fondo)/fondo frente a q para determinar la relación señal/fondo. Si la relación señal/fondo es baja, se debe aumentar la concentración de la muestra.
      4. Compruebe que la intensidad de dispersión (normalizada a la concentración) es independiente de la concentración de la muestra mediante la adquisición de datos a concentraciones más altas y más bajas, escalando el tiempo de exposición si es necesario. Las interacciones entre partículas (la causa más probable de dependencia de la concentración) serán más pronunciadas en el rango q bajo.
    7. Adquirir datos para muestras de PCM y fondo (es decir, búfer con glicerol).
      1. Active la bomba de la jeringa para mover la muestra a través del capilar. Ya sea el movimiento bidireccional o de una sola vez es aceptable, pero se debe tener cuidado de aislar cada muestra (por ejemplo, insertando una burbuja de aire entre muestras). Las muestras se pueden recuperar y se pueden reutilizar si no se ve ningún daño por radiación.
      2. Una vez que el flujo ha comenzado, active el programa de exposición de rayos X y adquisición de datos descrito anteriormente. Se debe tener cuidado de que la exposición del haz termine antes de que el flujo de fluidos lo haga.
    8. Después de cada muestra, realice un promedio acimutal y trace los perfiles 1D (es decir, intensidad frente a q) para cada exposición juntos. Deben ser idénticos dentro del error estadístico. Cambiar la señal con el tiempo puede indicar daños por radiación.
      1. Los perfiles anómalos aislados pueden indicar la presencia de microburbujas. Si se observan burbujas con frecuencia, la disminución del caudal puede ayudar.
    9. Promedio de los perfiles de dispersión 1D.
    10. Adquiera datos para muestras solo de búfer con frecuencia (una vez por cada 4-5 muestras de PCM) y compárelos con el tiempo. El aumento de la señal de las muestras solo de búfer indica que el capilar puede estar contaminado con una muestra dañada por la radiación.
      1. Cuando se note la contaminación, lave el capilar con lejía y considere reducir el tiempo de exposición si es posible.
  2. Reducción y análisis de datos con Irena
    1. Importar micelas y conjuntos de datos ASCII en segundo plano (SAS/Data import & export/Import ASCII SAS data).
    2. Restar la dispersión de fondo de los datos de muestra. Típicamente, los valores q más altos (por ejemplo, q > 0.5) muestran la dispersión incoherente del disolvente que domina la señal. Al escalar los datos de fondo para que coincidan con los datos de la muestra a lo largo de este rango q, se elimina cualquier variación debida a la variación de intensidad del haz y la concentración de la muestra.
      1. Trazar el ejemplo y el fondo juntos en una escala de registro. Verifique la intensidad plana a alta q (SAS/Manipulación de datos/Manipulación de datos I). Calcular la relación muestra/fondo (Data1/Data 2), trazar en una escala de registro lineal y verificar la asíntota de alta q.
      2. Calcular la proporción promedio (muestra/fondo) en este rango q (utilizar una macro personalizada o copiar /pegar en una hoja de cálculo desde el explorador de datos).
      3. Usando la macro Manipulación de datos, escale el fondo (por ejemplo, Modificar datos 2) utilizando la relación calculada anteriormente y trace la relación de señal sustraído en segundo plano con fondo frente a q ([Data1-Data2]/Data2), verificando que ahora se asimptotea a cero a alto q. Registre esta proporción; debe ser <1–2% de distancia de 1.0 para cada muestra.
      4. Trazar la señal sustrae en segundo plano (Data1-Data2) frente a q y guardar los datos con un nuevo nombre. No sobrescriba los datos originales.
      5. Si losdatos de alta q no están disponibles, utilice un factor de escala de 1 para la resta de fondo, pero tenga en cuenta que se pueden introducir imprecisiones en rangos q donde la relación señal/fondo es pequeña.
    3. Abra la macro Modelado (SAS/Modeling) y, a continuación, cargue y trace los datos sustraídos en segundo plano (Datos cntrls/Agregar datos). No escale en esta macro.
    4. En primer lugar, busque un modelo aproximado para la superficie externa del PCM (tamaño/forma de las micelas):
      1. En Datos cntrls, seleccione rango q bajo a moderado (p. ej., 0,003 á-1 < q < .0,1 o-1). Si las oscilaciones son visibles, inérquelas.
      2. Elija un factor de forma adecuado para los datos. La pendiente en q baja es indicativa de la forma de nanopartículas, que también se puede verificar a través de TEM y / o MALS. Utilice los modelos Schulz-Zimm spheroid (q0), cilindro (q-1) o cilindro flexible (q-2). Irena proporciona herramientas para las leyes de potencia de ajuste(SAS/Herramientas de soporte para parcelas y tablas).
      3. En Modelo cntrls, seleccione la primera población de dispersión (1P) y asegúrese de que es la única en uso (Seleccione la casilla Usar? ).
      4. Seleccione Tamaño dist. para Modelo y elija el tipo de distribución y el factor de forma deseados. Establezca los parámetros iniciales para la búsqueda introduciendo valores en los campos Escala, Tamaño medioy Ancho y haga clic en Calcular modelo para dibujar el factor de forma resultante.
        NOTA: El factor de forma Cilindro flexible se puede agregar como factor de forma de usuario y descargar desde https://usaxs.xray.aps.anl.gov/software/irena. Los parámetros 1 y 2 corresponden a la longitud del cilindro y a la longitud de Kuhn, respectivamente.
      5. Una vez encontrados parámetros razonables, haga clic en Ajustar modelo para realizar un mínimo cuadrado no lineal que se ajuste a los datos. El modelo de distribución Tamaño proporciona el radio y la anchura medios.
        Para calcular la polidispersidad (PDI) utilice
        Equation 5
        Al igual que con cualquier procedimiento de ajuste no lineal, puede ser necesario ajustar el rango de datos (regiónq) y los parámetros de inicio para obtener un ajuste estable y físicamente razonable.
      6. Una vez que se obtenga un ajuste razonable, guárdelo(Almacenar en Notebook/Almacenar en carpeta).
    5. A continuación, modele la dispersión de los polímeros individuales dentro del núcleo PCM. Esto puede ser capturado por un modelo de ley de energía (por ejemplo, q-2 para cadenas ideales, q-5/3 para cadenas hinchadas, etc.). Irena implementa esto a través de un Beaucage modelo43:
      Equation 6
      donde P es la ley de poder y G y B son prefactores.
      1. Ajuste los controles de datos para cubrir todo el rango q y vuelva a trazar el modelo (Calcular modelo). Típicamente, el exceso de dispersión se observará en el rango q moderado a alto (por ejemplo, q > .0.1 -1).
      2. Utilice los controles de datos para seleccionar el rango q donde se observa el exceso de dispersión (>10x el modelo de factor de forma).
      3. Agregue una segunda población de dispersión (2P) y asegúrese de que es la única en uso (deseleccione Usar? para 1P).
      4. Seleccione Nivel unificado para el modelo. B y P son los parámetros relevantes. Utilice las herramientas de soporte de trazado o la macro Ajustar P/B entre csrs para obtener una conjetura inicial de estos parámetros, y ajuste los factores Guinier G y Rg para asegurarse de que el modelo no predice la dispersión excesiva a baja q.
      5. En cuanto al factor de forma, realice un ajuste no lineal y registre los parámetros y el modelo.
    6. A continuación, si hay un pico de difracción, como en la Figura 4,agregue un tercer modelo para un pico de difracción en el rango q de interés (q - 0,22 --1 en este caso).
    7. Una vez que se obtienen valores de ajuste aproximados para las poblaciones de dispersión individuales, active los tres juntos (seleccione Usar? para cada uno) y optimice el ajuste combinado.
    8. Compruebe que cada valor sigue siendo físicamente razonable. El resultado de este procedimiento debe ser un modelo compuesto que describa los datos SAXS en una amplia gama de escalas de tamaño, como se muestra en la Figura 4. Guarde el ajuste con el botón Almacenar en carpeta para almacenarlo en Igor.

6. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

  1. Cryo TEM
    1. Seleccione la cuadrícula. Recomendamos una película de soporte de carbono agujereada en una rejilla TEM estándar o carbono de encaje como alternativa. En cualquier caso, los agujeros entre el carbono proporcionarán un área de imagen de hielo vítreo puro y muestra y ninguna película.
    2. Coloque el lado de carbono de la rejilla hacia arriba en un aparato de descarga de resplandor en un portaobjetos de vidrio limpio. Envolver la diapositiva en película de laboratorio puede ayudar con el manejo de la rejilla. Evite tocar el centro de la rejilla con pinzas y pellizca siempre cerca del borde de la rejilla.
    3. Exponga la rejilla durante 30 s.
    4. Prepare un robot de vitrificación para la deposición de muestras.
      1. Ajuste al 100% de humedad y RT y agregue papel hinchado. Prepare baños de etano líquido y nitrógeno líquido en la base del robot. Vea tutoriales y videos en línea para obtener ayuda adicional con la preparación y el uso de robots de vitrificación.
    5. Muestra diluida 5x.
    6. Usando las pinzas de acción negativa provistas con el robot de vitrificación, recoger una rejilla, luego fijar las pinzas al robot y mover las pinzas a la cámara.
    7. Mientras esté en el robot, agregue 4 s de la muestra al lado de carbono de la rejilla utilizando una pipeta a través del orificio en el lado de la máquina.
    8. Incubar durante 4 min.
    9. Usando el robot, blot 3–5 s con papel de filtro.
    10. El robot de vitrificación sumergirá la rejilla en etano líquido.
    11. Retire las pinzas y mueva la rejilla al nitrógeno líquido y a un recipiente de almacenamiento, que también debe estar bajo nitrógeno líquido. Este proceso fija la muestra en una fina capa de hielo vítreo. Minimice el tiempo que la rejilla pasa fuera del etano líquido o nitrógeno líquido durante este paso.
    12. Enfríe el soporte de la muestra criocrya con nitrógeno líquido. Mantenga un Depósito y un depósito llenos.
    13. Cuando esté listo para la imagen, cargue la rejilla en el soporte de muestra crio. Mantenga la muestra bajo nitrógeno líquido o brevemente en el vapor de nitrógeno extremadamente frío justo por encima de la superficie líquida.
    14. Imagen de la cuadrícula a 120 kV entre 75kx y 150kx en hielo delgado y grueso, porque las micelas de diferentes tamaños pueden preferir un cierto espesor de hielo.
      1. Limite la exposición al haz para evitar el derretimiento del hielo y dañar la muestra. No se enfoque directamente donde la planificación para la imagen; enfoque cerca. Exponga solo el área de interés mientras captura una imagen.
      2. Asegúrese de diferenciar las gotas de etano líquido de la muestra al ver imágenes (consulte la figura 5).
  2. TEM convencional con tinción negativa
    1. Prepara la mancha.
      1. Hervir 10 ml de agua ultrapura. Pesar 0,1 g de formatede de uranilo (UFo) en un tubo cónico de 15 ml.
      2. Añadir 5 ml de agua caliente al polvo UFo para una solución del 2%. Cierre firmemente y envuelva en papel de aluminio para bloquear la luz. Una mancha de acetato de ursionl 1% también se utiliza comúnmente.
      3. Vórtice o agitar vigorosamente durante 5 min. La fijación del tubo al vórtice le ayudará. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 m en un tubo cónico limpio.
      4. Añadir 10 min a RT. Añadir 25 sL de 5M NaOH y vórtice inmediatamente durante 2 min.
        1. Alternativamente, congele 200 alícuotas de 2% de UFo. Cuando esté listo para su uso, descongelar una alícuota, añadir 1 l de 5 M NaOH y vórtice durante 2 min.
      5. Mantenga la mancha envuelta en papel de aluminio o lejos de la luz.
    2. Diluir la muestra 10vecer en 1x PBS (o búfer deseado).
    3. Seleccione la cuadrícula. Recomendamos película de apoyo al carbono en rejillas de cobre. El lado más oscuro y brillante de la rejilla es el lado recubierto de carbono donde la muestra será depositada y manchada.
    4. Coloque el lado de carbono de la rejilla hacia arriba en un aparato de descarga de resplandor en un portaobjetos de vidrio limpio. Consulte el paso 6.1.2.
    5. Exponga la rejilla durante 30 s.
    6. Recoja la rejilla con el lado de carbono todavía mirando hacia arriba y sostenga con pinzas de acción negativa por el borde de la rejilla para evitar que se rompa el área de imagen en el centro. Ponga las pinzas con la rejilla todavía sostenida lado carbono hacia arriba.
    7. Aplique una gota de muestra de 4 l de muestra en la parte superior (lado carbono) de la rejilla con una pipeta.
    8. Incubar 4 min.
    9. Con 1 minuto a la izquierda, pipetea una solución de UFo de 10 ml y una gota de 20 l sobre una pieza de película de laboratorio limpia.
    10. Utilice papel de filtro para absorber la muestra desde el borde de la rejilla (contacto perpendicular) para evitar cualquier contacto con la superficie de imagen.
    11. Usando las pinzas (todavía sosteniendo la rejilla), coloque inmediatamente el lado de la muestra de la rejilla hacia abajo en la gota de 10 ol UFo, luego retire inmediatamente el líquido (paso de lavado). Es importante no dejar que la rejilla se seque, por lo que no se detenga entre los pasos.
    12. De manera similar, aplique la gota de 20 UFo a la cuadrícula. Sostenga la rejilla en el UFo durante 40 s. Salte el líquido y deje que la rejilla se seque.
    13. Imagen de la rejilla seca a 120 kV entre 20.000x y 100.000x.
    14. Asegúrese de desechar correctamente todos los materiales contaminados con UFo utilizando el servicio de seguridad de residuos radiactivos de la institución.
    15. Cuando sea necesario, la mejora del brillo/contraste y un filtro de mediana se pueden aplicar a las imágenes TEM en ImageJ para reducir el ruido de fondo. El procesamiento posterior debe realizarse de forma uniforme, solo para imágenes que no se utilicen para mediciones cuantitativas, como la intensidad, y siempre deben notificarse.

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Representative Results

Con el fin de ilustrar los métodos de caracterización descritos anteriormente, mostramos resultados típicos para los PCM ensamblados a partir de oligonucleótidos y copolímeros de bloque sin varias longitudes y químicas(Figura 1). La Figura 2 proporciona un ejemplo de cómo el tamaño del núcleo PCM (según lo determinado a partir de SAXS y TEM, Figura 4 y Figura 5)varió con la longitud de bloque cargada. La Figura 3 muestra los datos DE DLS y los resultados de adaptación para LOS PCM esféricos formados a partir de copolímeros de bloque relativamente largos y oligonucleótidos cortos de una sola cadena. La Figura 4 ilustra cómo se podrían ajustar con precisión los espectros de intensidad SAXS complejos combinando modelos para las múltiples correlaciones espaciales que estaban presentes (superficie externa, dispersión intranúcleo, orden entre hélices) y cómo se podría utilizar MALS para extender las mediciones de dispersión a escalas de longitud más larga. Por último, la Figura 5 muestra datos representativos de microscopía electrónica para PCM de diversa morfología.

Figure 1
Figura 1: Montaje y caracterización de PCM de ácido nucleico. (A) Los polímeros aniónicos, como los oligonucleótidos, formaban complejos separados por fases con regiones catiónicas de copolímeros dibloqueal. La presencia de un bloque neutro hidrófilo (gris) dio lugar a la formación de nanopartículas PCM estables. (B) los PCM eran nanopartículas de carcasa de núcleo con múltiples parámetros para caracterizar. El tamaño total (radio hidrodinámico, Rh) podría determinarse utilizando DLS, el radio del núcleo (Rc) podría encontrarse utilizando SAXS y TEM, el tamaño corona podría calcularse como Rh-Rc, y la morfología podría determinarse en múltiples escalas de longitud mediante la combinación de SAXS, MALS y TEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Dependencia del tamaño de las micelas. El tamaño del núcleo de micelas se determinó principalmente por la longitud del bloque cargado del copolímero de bloque, y en gran medida independiente de la longitud del homopolímero7,26. Esto permite el control del tamaño de PCM mediante la elección de polímero de bloque. Los datos que se muestran aquí son para pLys-PEG con ADN de 88 nt/bp y se han notificado previamente26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Dispersión dinámica de la luz. (A) Función de autocorrelación (unidades arbitrarias) para ADN de una sola cadena de 10 nt + pLys(100)-PEG(10k) PCM. (B) Distribución del radio hidrodinámico (histograma) del ajuste REPES. La función de autocorrelación se desintegró a un valor plano con una sola escala de tiempo, lo que dio como resultado un pico de tamaño único en la distribución de tamaño REPES. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Datos representativos de SAXS y MALS y ajuste para una micela cilíndrica. Los datos SAXS (círculos grises) se muestran para PCM ensamblados a partir de pLys(50)-PEG(5k) y 88 bp de ADN de doble cadena. A q bajo (< 10-2 -1), la intensidad mostró una dependencia aproximada de q-2 en la transferencia de impulso, lo que implica una forma de cilindro flexible (micela similar a un gusano). Los datos MALS (círculos negros abiertos) muestran la misma dependencia, lo que indica que las micelas tenían al menos varios micrómetros de longitud (corroborados por imágenes TEM, Figura 5C,D). Las micelas esferoidales mostrarían una dependencia plana (q0) de intensidad en q en este rango. Las líneas de color ilustran el procedimiento de ajuste multicomponente para los datos PCM SAXS descritos en la sección 5. La dispersión a baja q (grandes escalas de distancia) estaba dominada por la superficie externa del PCM, y encajaba bien con un modelo de cilindro flexible (rojo). A valores q más altos (escala de longitud más pequeña), la dispersión fue dominada por los polímeros individuales dentro del núcleo PCM, encajan aquí por una ley de energía (verde) con corte q bajo. También observamos el embalaje paralelo de hélices de ADN de doble cadena dentro del núcleo pcM, lo que resultó en un pico de difracción cuasi-Bragg (azul). La línea discontinua negra muestra que la combinación de estos modelos describió con precisión los datos SAXS, y la adición de datos de dispersión de luz (círculos abiertos) amplió el rango de tamaño en casi cuatro órdenes de magnitud. Los resultados de la adaptación dieron a una población de PCM con un radio medio de 11,0 nm y un PDI a 0,03, una ley de potencia a la altura de q a 1,81 y el pico de difracción representa un espaciado entre hélices de 2,71 nm. Los datos de SAXS se han comunicado previamente26 y están a disposición del público44. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes TEM de PCM de ácido nucleico. (A–B) Cryo TEM de 22 nt DE ADN de una sola cadena + pLys(50)-PEG(5k) PCM, mostrando predominantemente morfología esférica. Las flechas azules indican gotas de etano líquido, que no deben confundirse con los PCM (objetos esferoidales texturizados). (A) está ligeramente debajo de la concentración, añadiendo un ligero contraste mientras se conserva la resolución. (B) está sustancialmente desenfocado, añadiendo más contraste pero sacrificando la claridad. Se aplicaron ajustes de brillo y contraste y un filtro mediano de dos píxeles a ambas imágenes. (C-D) TEM teñido negativo de ADN de doble cadena de 88 bp + pLys(50)-PEG(5k) PCMs, que son cilindros flexibles largos. En ambos casos, los radios centrales de TEM eran coherentes con los valores obtenidos a partir de la adaptación de los datos SAXS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Como se mencionó anteriormente, los protocolos presentados aquí están escritos con un enfoque en oligonucleótidos como el componente de polianión y pLys-PEG como el copolímero de bloque catiónico-neutral, pero los hemos probado con una variedad de polímeros, tales como poli(ácido acrílico), poliglutamato, y PEG-poly(trimetilamonio de vinilo-vinilobenzil), y creemos que serán generalmente aplicables para la mayoría de los pares de polielectrolitos. Un parámetro que puede necesitar ser optimizado es la concentración de sal utilizada para el recocido, porque debe ser lo suficientemente alta como para que los PCM no se formen al principio del. Esto puede ser comprobado experimentalmente por DLS, o en comparación con la observación de la separación de fase con los polielectrolitos solos (sin bloque neutro). El recocido térmico se puede utilizar si el recocido de sal no es deseable, aunque las polidispersidades resultantes son más grandes7. Las concentraciones utilizadas para la caracterización también pueden necesitar ser optimizadas, porque las nanopartículas más grandes dispersan más luz que las pequeñas, y los ácidos nucleicos son más eficientes en la dispersión de rayos X que muchos otros polímeros debido a la presencia de átomos de fósforo densos en electrones en la columna vertebral. También puede ser necesario controlar más de cerca el pH del tampón si cualquiera de los polielectrolitos tiene un pKa cercano a la condición de trabajo.

En este artículo presentamos protocolos para dos técnicas de dispersión de luz (es decir, dispersión de luz multiángulo/estática y dispersión dinámica de la luz), así como dispersión de rayos X de ángulo pequeño, y microscopía electrónica de transmisión de manchas negativas crioyal, con datos representativos para cada una. No todas las técnicas son necesarias para todos los escenarios, y otras también están disponibles, lo que plantea la cuestión de cuál debe emplearse cuando. Existe una amplia revisión sobre este tema45,46, pero sugerimos lo siguiente al caracterizar un nuevo PCM o nanopartícula similar. Comience comprobando la agregación, tanto por inspección visual para la turbidez como por microscopía óptica. Si no se observa ninguna agregación, el siguiente paso es determinar si existen nanopartículas. DlS es una forma rápida de determinar esto porque los PCM dispersan la luz vigorosamente, y la dispersión de luz débil o inexistente es un fuerte indicador de mala formación de nanopartículas. Mientras que el DLS puede confirmar la presencia de nanopartículas, es difícil determinar su tamaño y forma sin referencia a otros datos, ya que la mayoría de los métodos de análisis se basan en la relación Stokes-Einstein, que asume partículas esféricas. MALS puede confirmar formas esféricas (intensidad normalizada plana frente a ángulo) pero puede no ser capaz de determinar la forma de las partículas no esféricas a menos que la distribución del tamaño sea estrecha y caiga en el rango correcto para la resolución. Como resultado, recomendamos realizar TEM, SAXS o ambos en cualquier muestra de PCM con el fin de caracterizar completamente sus propiedades.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Phil Griffin y Tera Lavoie de soft Matter Characterization Facility y Advanced Electron Microscopy Facility, respectivamente, en la Universidad de Chicago. También agradecemos a Xiaobing Zuo y Soenke Seifert de la Fuente de Fotones Avanzados en el Laboratorio Nacional de Argonne y el Centro NIST para el Diseño de Materiales Jerárquicos (CHiMaD) por su apoyo. Agradecemos a Jeff Ting y Michael Lueckheide por sus contribuciones a este trabajo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Montaje y caracterización de micelas complejas de polielectrolitos
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Marras, A. E., Vieregg, J. R.,… More

Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

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