Summary
हम एक उदाहरण के रूप में पेप्टाइड को लक्षित करते हुए कार्डियक टार्गेटिंग पेप्टाइड का उपयोग करके पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के बाद पूर्व वीवो इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करते हुए सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड द्वारा ट्रांसडक्शन की डिग्री का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हमारे प्रोटोकॉल में, एक ही जानवर का उपयोग एक ही अंगों के दोनों प्रकार के इमेजिंग मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, जिससे अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या में आधे से कटौती की जा सकती है ।
Abstract
25 साल पहले प्रोटीन ट्रांसडक्शन डोमेन के प्रारंभिक विवरण के बाद से, जिसे सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स के रूप में भी जाना जाता है, नैदानिक और चिकित्सीय सामग्री देने के लिए उपन्यास वैक्टर के रूप में इन पेप्टाइड्स, विशेष रूप से सेल-विशिष्ट लोगों को विकसित करने में गहन रुचि रही है। हमारे पिछले काम फेज प्रदर्शन शामिल एक उपंयास की पहचान की, nonnaturally होने वाली, 12 अमीनो एसिड लंबी पेप्टाइड है कि हम कार्डियक लक्ष्यीकरण पेप्टाइड (सीटीपी) के कारण अपने को पीक तेज के साथ वीवो में सामांय दिल के ऊतकों को स्थानांतरित करने की क्षमता के कारण एक नसों में इंजेक्शन के बाद के रूप में छोटे रूप में 15 मिनट में देखा । हमने फ्लोरोफोर साइनाइन5.5 के साथ लेबल किए गए सीटीपी को इंजेक्ट करके विस्तृत बायोडिलिएब्यूशन अध्ययन शुरू किया है, जिससे यह विभिन्न अवधियों के लिए प्रसारित हो सकता है, और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के बाद कई अंगों को इच्छामृत्यु, फिक्सिंग और सेक्शनिंग कर सकता है। इस प्रकाशन में, हम इन प्रक्रियाओं के साथ-साथ काटे गए अंगों के पूर्व वीवो इमेजिंग का विस्तार से वीवो इमेजिंग सिस्टम में उपयोग करके वर्णन करते हैं। हम एक उदाहरण के रूप में सीटीपी का उपयोग करके ट्रांसडक्शन के साथ-साथ बायोडिब्यूशन अध्ययन करने के लिए विस्तृत तरीके और प्रथाएं प्रदान करते हैं।
Introduction
सेल प्लाज्मा झिल्ली एक अर्धपरिष्ठान बाधा है जो कोशिका अखंडता और अस्तित्व के लिए आवश्यक है और कोशिका में पदार्थों के आंदोलन को नियंत्रित करके सेल के इंटीरियर को विनियमित करने का कार्य करती है। हालांकि अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी सेल के लिए कार्गो की डिलीवरी के लिए एक बाधा प्रस्तुत करता है । 1 9 88 में, मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस के ट्रांस-एक्टिवेटर (Tat) प्रोटीन को सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रवेश करने और वायरल जीन अभिव्यक्ति1,2को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गयाथा,इस ट्रांसडक्शन के लिए जिम्मेदार डोमेन के साथ एक आर्जिनिन और लिसाइन समृद्ध 13-अमीनो एसिड क्षेत्र के तीसरे हेलिक्स3 के इन्हें इस प्रकार सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड्स (सीपीपीएस) नाम दिया गया था। इसके बाद शोध किया गया जिसमें टैट पेप्टाइड की क्षमता को कई सेल प्रकार4में कार्यात्मक ले जाने के लिए दिखाया गया था। प्रारंभिक विवरण के बाद से, सेल-मर्मज्ञ पेप्टाइड्स की संख्या में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई है। ये ट्रांसडक्शन डोमेन स्वाभाविक रूप से होने वाले या सिंथेटिक शॉर्ट पेप्टाइड्स होते हैं, आमतौर पर 6−20 अमीनो एसिड लंबे होते हैं, जो कोशिका झिल्ली में कार्यात्मक कार्गो ले जाने में सक्षम होते हैं। ये कार्गो अन्य छोटे पेप्टाइड्स, पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, नैनोकणों, वायरल कणों, फ्लोरोसेंट अणुओं और रेडियोआइसोटोप5से लेकर हो सकते हैं। प्रारंभिक CPPs वर्णित सेल विशिष्ट नहीं थे, Tat के साथ कई सेल प्रकार द्वारा उठाए जा रहे है और यहां तक कि रक्त मस्तिष्क बाधा4पार, इसलिए अपनी चिकित्सीय क्षमता सीमित । सेल-विशिष्ट सीपीपी की पहचान करने के लिए, जांचकर्ताओं ने बड़े, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध फाज पुस्तकालयों 6 का उपयोग करतेहुएफेज डिस्प्ले शुरू किया है। हमारे अपने काम में एक संयोजन में विट्रो और वीवो फाज प्रदर्शन पद्धति में एक सीपीपी नाम कार्डियक लक्ष्यीकरण पेप्टाइड (सीटीपी)7,एक 12-अमीनो एसिड, nonnaturally होने वाले पेप्टाइड (एनएच 2-APWHLSSQYSRT-COOH) की पहचान के लिए नेतृत्व किया है कि एक परिधीय इंजेक्शन28 केबाद 15 मिनट पर चोटी के साथ दिल को निशाना बनाता है । एक इंट्रासेलुलर मार्कर, और लेमिनिन, एक सेल झिल्ली मार्कर के बहिष्कार के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट कोलोकैलाइजेशन का उपयोग करके, हमने दिखाया कि सीटीपी को नसों में इंजेक्शन 7 के बाद माउस कार्डियोमायोसाइट्स में आंतरिक रूप दियाजाताहै। इसके अतिरिक्त, हमने मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीटिंग कार्डियोमायोसाइट्स को दोहरे लेबल वाले सीटीपी के साथ, अपने सी-टर्मिनस पर 6-कार्बोक्सीफ्लोरेसीइन के साथ लेबल किया और एक एस्टर लिंकेज के माध्यम से अपने एन-टर्मिनस पर रोडमाइन को केवल इंट्रासेलर एस्टेर द्वारा बंद किया जा सकता है। कार्डियोमायोसाइट्स को पीटने में रोडामाइन का तेजी से संचय कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 8 पर 15 मिनट के भीतरदेखागया ।
इस लेख में, हम दो मानार्थ तरीके पेश करते हैं जिनका उपयोग जैव वितरण को ट्रैक करने और एक उदाहरण के रूप में सीटीपी का उपयोग करके सीपीपी के ऊतक-विशिष्ट आंतरिककरण की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। इन पद्धतियों के लिए, सीटीपी को संश्लेषित किया गया था, फ्लोरोसेंट रूप से साइनाइन5.5 (CY5.5) के साथ एन-टर्मिनस पर लेबल किया गया था, और अधिक पेप्टाइड स्थिरता के लिए सी-टर्मिनस पर अमीड-कैप्ड था। उपयोग की जाने वाली दो पद्धतियां वीवो फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम और ऊतक वर्गों की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में हैं। दोनों विधियां बायोडिब्यूशन, तेज और फ्लोरोसेंटी लेबल वाले सीपीपी के उन्मूलन का अध्ययन करने में बहुत उपयोगी हैं। दूसरों पर इन तरीकों का उपयोग करके जैव वितरण का आकलन करने का लाभ, जैसे एकल-फोटॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (स्पेक्ट) या पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), यह है कि फ्लोरोसेंट लेबलिंग की तुलना में सीपीपी के समय-गहन रेडियोलाबेलिंग की कोई आवश्यकता नहीं है, जो अपेक्षाकृत आसान है और सभी पेप्टाइड संश्लेषण सुविधाओं पर नियमित उपयोग में है। वीवो इमेजिंग में उपयोग जल्दी से एक जीवित प्रणाली के संदर्भ में बायोडिलिएब्यूशन डेटा पैदा करता है, जबकि सेक्शनिंग रूपात्मक विस्तार के संरक्षण के माध्यम से कोशिकाओं के भीतर पेप्टाइड तेज और स्थानीयकरण के बारे में अधिक गहराई से जानकारी प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को हृदय, फेफड़े, यकृत, गुर्दे, मस्तिष्क, तिल्ली, पेट, बड़ी आंत, छोटी आंत, कंकाल की मांसपेशी, हड्डी, वृषण/अंडाशय और आंखों जैसे विभिन्न प्रकार के अंगों और ऊतकों पर लागू किया जा सकता है।
Protocol
पिट्सबर्ग के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय के सभी पशु इन पशु प्रयोगों में से किसी को शुरू करने से पहले इस प्रकाशन में निर्दिष्ट प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी ।
नोट: यह प्रोटोकॉल विवरण देता है कि पैराफिन, सेक्शनिंग और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में अंगों को एम्बेड करके वीवो बायोडिवेंब्यूशन अध्ययनों में पूर्व वीवो ऑप्टिकल फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करते हुए पूर्व वीवो बायोडिलिएब्यूशन अध्ययन कैसे करें। यद्यपि सीटीपी का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया जाता है, इस विधि को किसी भी फ्लोरोसेंटी लेबल सीपीपी पर लागू किया जा सकता है।
1. वीवो इमेजिंग में
- ठोस चरण संश्लेषण तकनीकों का उपयोग करके सीटीपी संश्लेषण9,,10 एक पेप्टाइड संश्लेषण सुविधा से एल-अमीनो एसिड का उपयोग करके एक एन-टर्मिनस के साथ Cy5.5 और सी-टर्मिनस अमीस अमी-कैप्ड के साथ लेबल किया गया स्थिरता के लिए।
नोट: सभी संश्लेषित CPPs उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (HPLC) और/या मैट्रिक्स सहायता प्राप्त लेजर अवशोषण/आयनीकरण (MALDI) का उपयोग करने से पहले11का उपयोग करने की विशेषता होनी चाहिए । - डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ), एलिकोट में सीटीपी का 1 एमएम या 10 एमएम स्टॉक सॉल्यूशन बनाएं और -80 डिग्री सेल्सियस, लाइट-प्रोटेक्टेड पर स्टोर करें।
नोट: पेप्टाइड्स को लियोफिलाइज्ड पाउडर के रूप में वितरित किया जाता है। लियोफिलिज्ड पाउडर को -20 डिग्री सेल्सियस, प्रकाश-संरक्षित और हाइग्रोस्कोपिक स्थितियों में दीर्घकालिक (6 महीने-2 साल) संग्रहीत किया जा सकता है। जब DMSO में aliquoted और संग्रहीत, फ्रीज गल चक्र से बचा जाना चाहिए । - वजन और एनेस्थेटाइज 6 सप्ताह पुरानी सीडी 1 महिला चूहों का उपयोग कर 2 μL/g ऊतक वजन के एक केटामाइन/जाइलाज़ीन समाधान (१०० मिलीग्राम/किलो केटामाइन और 20 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन) प्रशासित इंट्रामस्कुलरली (हिंद पैर) या इंट्रापेरिटोनली (कम बाएं क्वाड्रेंट) का उपयोग करते हुए ।
नोट: केटामाइन/जाइलाज़ीन समाधान उपयोग के दिन ताजा किया जाना चाहिए । अप्रयुक्त केटामाइन/जाइलाज़ीन को उचित रूप से निपटाया जाना चाहिए और एक लॉग में दर्ज की गई मात्रा बनाम उपयोग की जाने वाली मात्राओं का निपटान किया जाना चाहिए, क्योंकि केटामाइन एक नियंत्रित पदार्थ है । संज्ञाहरण का पर्याप्त स्तर 5−7 मिनट में प्राप्त किया जाएगा, जैसा कि एक अंगुली चुटकी के जवाब की कमी से मूल्यांकन किया गया है। - Cy5.5-CTP की 10 मिलीग्राम/किलो खुराक की गणना करें, फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ 200 माइक्रोन से अधिक नहीं, और इंसुलिन सिरिंज(चित्रा 1ए)का उपयोग करके रेट्रो-ऑर्बिटली या पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से इंजेक्ट करें।
- पेप्टाइड को 15 मिनट-6 घंटे से लेकर पूर्वविशेधित समय के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें।
- संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्दिष्ट उच्च सीओ2 इनहेलेशनल विधि का उपयोग करके माउस को इच्छामृत्यु दें और कैंची(चित्रा 1बी)का उपयोग करके छाती गुहा खोलें।
- दाईं ओर के पार्श्व, मुक्त दीवार में एक छोटे से निक जगह और माउस के अंगों फिक्सिंग और लाल रक्त कोशिकाओं(चित्रा1सी)बाहर निस्तब्धता के दोहरे उद्देश्य के लिए एक 26 जी सुई का उपयोग कर 10% बफर formalin फॉस्फेट के 3 ml सुई कैंची का उपयोग करें ।
- दिल, फेफड़े, जिगर, गुर्दे, तिल्ली, बड़ी आंतों, छोटी आंतों, मूत्राशय, अंडाशय/वृषण, और मस्तिष्क और पूर्व वीवो ऑप्टिकल इमेजिंग(चित्रा1डी)के लिए एक 12 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में जगह विच्छेदन ।
- इमेज एक्विजिशन सॉफ्टवेयर शुरू करें और इमेजिंग नमूनों के लिए सिस्टम तैयार करने के लिए इनराइज बटन पर क्लिक करें। इमेजिंग जादूगर खोलें, फ्लोरेसेंस का चयन करें, फिर जोड़ी को फ़िल्टर करें, फिर 580 एनएम एक्सिटेशन और 620 एनएम उत्सर्जन फिल्टर लागू करने के लिए रंगों की सूची से Cy5.5 डाई का चयन करें। एक्सपोजर पैरामीटर्स के लिए मैनुअल सेटिंग्स का चयन करें, फिर चरण की स्थिति को बी में सेट करें, एक्सपोजर समय को 1 सेकंड सेट करें, एफ/स्टॉप को 8 सेट करें, और बिनिंग को छोटे में सेट करें।
नोट: उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर इस्तेमाल लेबल के आधार पर अलग-अलग होंगे। इस्तेमाल किए गए लेबल की उत्तेजन और उत्सर्जन को सॉफ्टवेयर के लिए उत्तेजन और उत्सर्जन फिल्टर आवंटित करने के लिए मैन्युअल रूप से दर्ज किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि संतृप्ति से बचने के लिए गिनती 600-60,000 के बीच हैं। उपयोग की जा रही प्रणाली के आधार पर, स्वचालित अधिग्रहण अनुकूलन उपलब्ध हो सकता है। यदि सिस्टम में विभिन्न सेटिंग्स के साथ अधिग्रहीत छवियों की तुलना करने के लिए मुआवजा है, तो ऑटो सेटिंग्स का उपयोग किया जा सकता है। यदि कोई मुआवजा उपलब्ध नहीं है, तो सेटिंग्स को नमूनों में लगातार निर्धारित, सहेजने और उपयोग करने की आवश्यकता होगी। - जब सिस्टम पूरी तरह से शुरू किया जाता है, तो 12 अच्छी प्लेट में ब्याज के अंगों की व्यवस्था करें और इसे ऑप्टिकल इमेजिंग कक्ष के अंदर रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि नमूनों को छवियों के लिए वांछित के रूप में व्यवस्थित किया जाता है। अधिग्रहण का चयन करें, फिर छवियों के लिए एक सेव स्थान चुनें। माउस के बारे में जानकारी संपादित छवि लेबल पॉप-अप विंडो में लिखी जा सकती है।
- इमेजिंग के बाद, कक्ष से नमूनों को हटा दें और कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रकाश सुरक्षा के साथ प्रस्फुटन शीशियों में ऊतक की मात्रा से कम से कम 20 गुना मात्रा में 10% बफर फॉर्मेलिन फॉस्फेट में स्टोर करें।
- उज्ज्वल दक्षता के लिए इकाइयों की स्थापना के द्वारा छवियों की मात्रा तो 4x3 आरओआई का चयन और समान रूप से आरओआई के एक वर्ग में प्रत्येक अच्छी तरह से फिट करने के लिए समायोजन, उपाय पर क्लिक करने के बाद । ग्रिड आरओआई माप टैब खोलें, निर्यात का चयन करें, और माप को .cvs फ़ाइल के रूप में सहेजें।
2. हिसटोलॉजी
नोट: विभिन्न अंगों को प्राप्त करने के लिए चरण 1.1−1.8 का पालन करें। वैकल्पिक रूप से, उन्हीं अंगों को चित्रित किया गया था, उन्हें तुरंत फॉर्मेलिन में रखा जा सकता है और नीचे विस्तृत के रूप में अनुभागिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है।
- हिस्टोलॉजी के लिए प्रोसेसिंग से पहले कम से कम 48 घंटे के लिए प्रत्येक अंग को 10% बफर फॉर्मेलिन फॉस्फेट में व्यक्तिगत रूप से स्टोर करें।
- जब अंगों को 48 घंटे के बाद पर्याप्त रूप से ठीक किया जाता है, तो अंगों को ऊतक प्रसंस्करण में स्थानांतरित करें और कैसेट एम्बेड करें और एक ऊतक प्रसंस्करण मशीन(चित्रा 1ई)में रखें।
- 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में ऊतक को निर्जलित करने के लिए प्रसंस्करण मशीन सेट करें, इसके बाद 30 मिनट के लिए 80% इथेनॉल, 30 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 30 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 15 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, 20 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, और अंत में 20 मिनट के लिए 100% इथेनॉल।
- प्रत्येक जाइलीन उपचार के लिए 30 मिनट के साथ, जाइलीन 2x में ऊतक को साफ करें।
- प्रत्येक उपचार के साथ 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन वैक्स 4x के साथ मंजूरी दे दी ऊतक घुसपैठ।
- धातु के मोल्डों का उपयोग करके पैराफिन में एम्बेड करें। पिघला हुआ पैराफिन (65 डिग्री सेल्सियस पर रखा) के साथ मोल्ड भरें, और एक ठंडी थाली में स्थानांतरित करें। जैसे ही मोल्ड के तल पर पैराफिन जमना शुरू होता है, अंग को पैराफिन(चित्रा 1एफ)में रखें।
- मोल्ड के शीर्ष पर एक लेबल कैसेट को एक समर्थन के रूप में रखें और पिघला हुआ पैराफिन के साथ ओवरफिल करें। ठोस होने तक ठंडा होने दें। फिर ब्लॉक को रात भर -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें, जिससे मोम मोल्डों से आसान हटाने के लिए आगे सिकुड़ जाता है।
नोट: ब्लॉक अब प्रकाश सुरक्षा के साथ आरटी पर संग्रहीत किया जा सकता है । - आसुत पानी के साथ 38 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान तैयार करें। 6 डिग्री के ब्लेड कोण और 10 माइक्रोन की एक खंड मोटाई के साथ माइक्रोटॉम की स्थापना करें।
- सूक्ष्मटोम में ऊतक ब्लॉक माउंट करें और ऊतक युक्त वर्गों को प्राप्त होने तक काटना शुरू करें। फिर ब्लॉक को 5 मिनट के लिए पानी में सामना करें या जब तक ऊतक कुछ नमी को अवशोषित नहीं कर लेते हैं (उदाहरण के लिए, जब ऊतक की एक पतली सफेद रूपरेखा ब्लॉक[चित्रा 1जी])में दिखाई देती है।
नोट: वर्गों की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए ब्लेड को अक्सर बदला जाना चाहिए। - ऊतक को 10 मिनट के लिए एक फ्लैट आइस ब्लॉक पर रखें, फिर इसे चरण 2.9 में एक ही अभिविन्यास में माइक्रोटोम में वापस करें। अनुभाग लेना शुरू करें और कटे हुए वर्गों को 6−10 वर्गों के लंबे रिबन बनाने की अनुमति दें। एक स्लाइड को कवर करने के लिए पर्याप्त लंबाई के उच्च गुणवत्ता वाले रिबन का उत्पादन होने तक सबऑप्टिमल पैराफिन रिबन त्यागें। ऊतक वर्गों के बाल काटने या झुर्रियों से बचने के लिए काटने की गति, ऊतक मॉइस्चराइजेशन और पानी के स्नान के तापमान को समायोजित करके अनुभाग को अनुकूलित करें।
नोट: जिन वर्गों में छेद होते हैं जहां ऊतक बाहर गिर जाते हैं, ऊतक में रिप्स, या ऊतक में तंग झुर्रियां और सिलवटों को छोड़ दिया जाना चाहिए। - ध्यान से कुंद किनारे संदंश के साथ पसंद की गुणवत्ता रिबन लेने और 38 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान की सतह पर नाव। वर्गों को सतह पर तब तक बैठने दें जब तक कि वे चिकनी न हो जाएं, उन्हें पैराफिन को बिखरने और सेक्शन को अलग करने से रोकने के लिए बहुत लंबा न छोड़ने का ख्याल रखें।
- चपटे वर्गों को साफ ग्लास स्लाइड की सतह पर फ्लोट करें। वैक्स को पिघलाने के लिए 30 मिनट के लिए स्लाइड्स को 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
नोट: इन स्लाइड्स को लाइट प्रोटेक्शन के साथ आरटी पर स्टोर किया जा सकता है । - प्रत्येक उपचार के लिए जाइलीन 3x, 10 मिनट में स्लाइड को डिपैराफिनाइज करें।
- ऊतक को 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में फिर से हाइड्रेट करें, इसके बाद 5 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए 50% इथेनॉल, और अंत में 1x ट्राइस-बफर खारा (टीबीएस) 5 मिनट(चित्रा 1एच)के लिए। स्लाइड्स को रात भर सूखने दें।
नोट: इन स्लाइडों को आरटी में लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि वे हल्के-संरक्षित हों। - 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI), एक परमाणु फ्लोरोसेंट जांच(चित्रा 1I)वाले बढ़ते मीडिया के 125 माइक्रोल का उपयोग करके कवरस्लिप के साथ स्लाइड्स माउंट करें। आर टी, प्रकाश की रक्षा में रात भर सूखी स्लाइड ।
नोट: सूखे स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस, प्रकाश संरक्षित पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है। - फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि स्लाइड।
नोट: संतृप्त छवियों से बचना चाहिए, क्योंकि वे मात्रात्मक रूप से उपयोगी नहीं हैं। संतृप्ति से बचने के लिए एक्सपोजर और गेन सेटिंग्स को समायोजित करना कम किया जा सकता है। तुलना की जा रही नमूनों में एक ही सेटिंग्स का उपयोग करने के लिए ध्यान रखना । एक्सपोजर समय को सीमित करके टिश्यू की ब्लीडिंग से बचें।
Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन (चित्रा 1ए)के माध्यम से Cy5.5-CTP की10मिलीग्राम/किलो खुराक के साथ तीन चूहों का इलाज किया । पेप्टाइड को 15 मिनट तक प्रसारित करने की अनुमति देने के बाद, चूहों को सीओ2 कक्ष का उपयोग करके इच्छामृत्यु दी गई, छाती एक औसत स्टर्नोटॉमी चीरा के माध्यम से खोली गई, सही एट्रियम को निचोड़ दिया गया, और चूहों का परफ्यूजन 10% फॉस्फेट-बफर फॉर्मेलिन(चित्रा 1बी, सी)के 3 एमसीएल का उपयोग करके तय किया गया। निर्धारण के बाद, दिल, फेफड़ों, जिगर, गुर्दे, तिल्ली, और मस्तिष्क को विच्छेदित किया गया और पूर्व वीवो ऑप्टिकल फ्लोरोसेंट इमेजिंग (चित्रा 1डी और चित्रा 2ए)के लिए12अच्छी प्लेट में व्यवस्थित किया गया। कोई इंजेक्शन के साथ तीन नियंत्रण चूहों को भी perfused, विच्छेदित, और छवि(चित्रा 1बी − डी और चित्रा 2बी)थे । अंगों के प्रत्येक सेट के लिए प्राप्त फ्लोरेसेंस डेटा की तुलना इमेजिंग सॉफ्टवेयर की सापेक्ष फ्लोरेसेंस इकाई, उज्ज्वल दक्षता में परिवर्तित किए जाने के कारण की जा सकती है। इस डेटा को जैव वितरण अध्ययन के लिए विभिन्न समय बिंदुओं में प्रश्न में प्रत्येक अंग(चित्रा 2सी)के लिए गुणात्मक छवियों और मात्रात्मक डेटा दोनों को प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है। विभिन्न उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के प्रत्युत्तर में विभिन्न अंगों की ऑटोफ्लोरेसेंस का प्रदर्शन चित्र 3ए−ईमें किया गया है। छोटे उत्तेजन तरंगदैर्ध्य, जैसे कि बढ़ाया हुआ हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी), उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस से जुड़े होते हैं, विशेष रूप से यकृत और मस्तिष्क में, दूर-लाल (Cy5.5) या अवरक्त (Cy7) के पास (Cy7) उत्तेजन तरंगदैर्ध्य(चित्रा 3)। इमेज्ड अंगों को न्यूनतम 48 घंटे के लिए आरटी में 10% फॉस्फेट बफर फॉर्मेलिन में तय किया गया था, जिसके बाद ऊतक प्रसंस्करण और एम्बेडिंग कैसेट(चित्रा 1ई)में स्थानांतरित किया गया था। अंगों को एक ऊतक प्रसंस्करण मशीन में संसाधित और पैराफिनाइज्ड किया गया था, जो पैराफिन से भरे मोल्डों में तैनात थे, जो -20 डिग्री सेल्सियस चरण पर जमे हुए थे, और -20 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 1एफ)पर रात भर संग्रहीत किए गए थे। नमूनों को सेक्शन किया गया(चित्रा 1जी)और ऊतक(चित्रा 1एच)को फिर से हाइड्रेट करने के लिए समाधान एक्सचेंजों के साथ इलाज किया गया। तैयार स्लाइड्स तो DAPI फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम(चित्रा 1मैं)के साथ मुहिम शुरू की गई । एक बार सूखने के बाद, आमतौर पर रात भर, स्लाइड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर चित्रित किया गया । माउस से प्रत्येक अंग की प्रतिनिधि छवियां चित्र 4एमें दिखाई जाती हैं। विभिन्न अंगों से छवियों को चूहों में तुलना के लिए अनुमति देने के लिए समान सेटिंग्स का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, और मात्राकरण(चित्र 4बी)के लिए अनुमति देने के लिए।
चित्रा 1: पूर्व वीवो ऑप्टिकल फ्लोरोसेंट इमेजिंग और सेक्शनिंग के लिए माउस अंगों की कटाई। (A)वाइल्ड टाइप माउस ने सीटीपी-Cy5.5 के साथ रेट्रो-ऑर्बिटली इंजेक्ट किया । (ख)माउस छाती के साथ विच्छेदित खोला, सही आलिंद कटा हुआ, परफ्यूजन निर्धारण के लिए । (ग)जानवर के परफ्यूजन निर्धारण के लिए 10% बफर फॉर्मेलिन फॉस्फेट के 3 एमएल के साथ हार्ट इंजेक्ट किया जाता है। (घ)फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए 12 अच्छी प्लेट में ब्याज के अंगों को काटा और व्यवस्थित किया गया । (ई)दिल एक कैसेट में भरी हुई है और एक ऊतक प्रोसेसर का उपयोग कर संसाधित । (च)पैराफिन में एम्बेडेड हार्ट। (जी)दिल एक माइक्रोटोम पर खंडित । (ज)समाधान एक्सचेंजों की एक श्रृंखला के माध्यम से विपस्त स्लाइड । (I)DAPI का उपयोग कर कवरस्लिप के साथ घुड़सवार अनुभाग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: उपचारित और नियंत्रण अंगों से प्रतिनिधि छवियां। (A)10 मिलीग्राम/किलो सीटीपी-Cy5.5 के साथ इलाज माउस से अंग । (ख)अनुपचारित नियंत्रण माउस से अंग। (ग)अंगों के प्रत्येक सेट के लिए फ्लोरेसेंस का मात्राकरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: अनुपचारित माउस अंगों को विभिन्न उत्तेजन उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर चित्रित करने के लिए यह प्रदर्शित करने के लिए कि अब तरंगदैर्ध्य कम ऑटोफ्लोरेसेंस का उत्पादन कैसे करता है। (A) Cy7: 740−790। (B) Cy5.5: 660−710। (C) Cy5: 620−670। (घ) Cy3: 520−570। (ई) ईजीएफपी: 480−520। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 4: चूहों में नसों में इंजेक्शन के बाद दिल, फेफड़े, जिगर और गुर्दे का लेनदेन। जंगली प्रकार के चूहों को 10 मिलीग्राम/किलो Cy5.5-CTP, या एक यादृच्छिक पेप्टाइड (RAN-Cy5.5) के साथ इंजेक्शन दिया गया था, और संकेत समय बिंदुओं पर इच्छामृत्यु । (A)समय के साथ फ्लोरेसेंस में लगातार कमी के साथ 15 मिनट पर दिल के ऊतकों का पीक ट्रांसडक्शन देखा गया । कुछ केशिका तेज जिगर में मजबूत लेनदेन के साथ फेफड़ों में उल्लेख किया गया था और साथ ही गुर्दे की चमकदार केशिकाओं में, बाद उत्सर्जन का एक गुर्दा तंत्र जिसका अर्थ है । (ख)फ्लोरोसेंट तीव्रता का मात्राकरण से पता चलता है कि आरएएन-Cy5.5 पर सीटीपी-Cy5.5 के दिल में काफी वृद्धि हुई है । स्केल बार = 500 माइक्रोन। इस आंकड़े को जाहिद एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
पशु मॉडल उपन्यास CPPs की पहचान से प्रक्रिया के हर चरण में पूर्व नैदानिक दवा विकास के लिए आवश्यक हैं, जैव वितरण अध्ययन, ट्रांसडक्शन के तंत्र, अंततः वैक्टर के रूप में इन उपन्यास CPPs का उपयोग कर दिया कार्गो की प्रभावकारिता के लिए परीक्षण करने के लिए । हिस्टोलॉजी, न्यूक्लियर मेडिसिन इमेजिंग (स्पेक्ट और पीईटी) और वीवो ऑप्टिकल इमेजिंग12जैसे बायोडिब्यूशन का आकलन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले कई तरीके उपलब्ध हैं। छोटे पशु SPECT और पीईटी सिस्टम की सीमित उपलब्धता के साथ-साथ रेडियोलेबल-ड्रग कंजूगेट्स का उत्पादन करने की क्षमता के कारण परमाणु इमेजिंग विधियां बोझिल हो सकती हैं, जिसके लिए रेडियोकेमिस्ट की विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट लेबल बहुत सरल हैं और साथ काम करने के लिए लागत प्रभावी हो सकते हैं। इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल कई तरीकों का उपयोग करके बायोडिलिएब्यूशन के तेजी से विश्लेषण की अनुमति देता है। पूर्व वीवो पूरे अंग फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल इमेजिंग विभिन्न ऊतकों और उपचार समूहों में फ्लोरेसेंस की तत्काल तुलना के लिए अनुमति देता है और एक अर्धकांश तरीके से ब्याज के अंग में चोटी तेज करने के लिए अंग तेज और समय की पहचान कर सकते हैं । मात्रात्मक ऊतक हिसटोलॉजी के इलाज, अनुभाग, छवि, और ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए और अधिक व्यापक प्रसंस्करण की आवश्यकता है, लेकिन यह सूक्ष्म स्तर पर अधिक डेटा प्रदान करता है और एक वर्तमान मानक तकनीक है। यह ध्यान रखना सार्थक है कि दोनों तकनीकों में प्रत्यक्ष, मात्रात्मक तुलना संभव नहीं है, क्योंकि विभिन्न अंगों और उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के लिए प्रत्येक तकनीक के साथ देखा गया ऑटोफ्लोरेसेंस काफी भिन्न होता है।
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा प्रयोगों के लिए उम्मीदवार सीपीपी लेबल करने के लिए सही फ्लोरोफोर का चयन कर रहा है। एक संभावित मुद्दा स्पेक्ट्रा ओवरलैप है, जो कई फ्लोरोफोरस की आवश्यकता होने पर समस्याग्रस्त हो सकता है। दापी फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया और Cy5.5 में ओवरलैपिंग स्पेक्ट्रा नहीं है। हालांकि, कुछ अनुप्रयोगों के लिए जहां कई फ्लोरोफोरस की आवश्यकता होती है, स्पेक्ट्रल ओवरलैप के जोखिम पर सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता होती है। सिस्टम का उपयोग किए जाने के आधार पर, फ्लोरोफोर चयन सीमित हो सकता है। इसलिए, प्रणाली की क्षमताओं का ज्ञान महत्वपूर्ण है । फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल सिस्टम का सबसे अच्छा उपयोग13छोटे तरंगदैर्ध्य के उच्च ऊतक अवशोषण के कारण दूर-लाल या निकट-अवरक्त फ्लोरोफोरस के साथ किया जाता है। उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सीमा में फ्लोरोफोरस की एक प्रमुख सीमा है, क्योंकि विशेष रूप से मस्तिष्क और यकृत ऊतक में अपनी उत्तेजन तरंगदैर्ध्य में महत्वपूर्ण अंग ऑटोफ्लोरेसेंस देखा जाता है। एक प्रयोग की शर्तों के आधार पर, कुछ फ्लोरोफोरस सबसे अच्छा बचा जाता है। कुछ पानी में घुलनशील कार्बनिक फ्लोरोफोरस लिपिड बिलायर के साथ एक मजबूत बातचीत है, जो झूठी सकारात्मक पैदा कर सकता है । इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए कदम उठाने से कि क्या फ्लोरोफोर में रुचि के ऊतकों के प्रति मजबूत आत्मीयताहै, 14की सलाह दी जाती है । विचार करने के लिए एक और कारक फ्लोरोफोर संवत् की उपयुक्त विधि का चयन कर रहा है, जो परिणामों को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकता है। सीपीपी को पेप्टाइड के एन-टर्मिनस और डाइन के कार्बोक्सिल समूह जैसे Cy5.5-NHS के बीच एक सहसंयोजक बांड के माध्यम से एन-या सी-टर्मिनस में फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किया जा सकता है। देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि अधिकांश सीपीपी के परिवर्तन के तंत्र को विस्तार से नहीं समझा जाता है और एक छोर पर संविलियन दूसरे छोर की तुलना में अधिक तेज तंत्र को प्रभावित कर सकता है । सीपीपी लेबलिंग के लिए एक और संभावना फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए स्ट्रेप्टाविडिन को संयोजित करने के लिए एन-टर्मिनस को बायोटिनाइलेटिंग के माध्यम से है। इस रणनीति का उपयोग करने से विभिन्न फ्लोरोसेंट स्ट्रेप्टाविडिन संजूद्वारा का उपयोग करने की अनुमति देने की सुविधा है। हालांकि, इस रणनीति की एक संभावित सीमा यह है कि एक बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन कॉम्प्लेक्स एक बड़ा निर्माण है, जो संभावित रूप से लेनदेन में हस्तक्षेप कर सकता है।
फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम विभिन्न अंगों और उपचारों में फ्लोरेसेंस की तुलना कुशलता से उत्पन्न करने के लिए एक प्रभावी रणनीति है लेकिन ऊतक में पूर्ण सांद्रता का मात्रात्मक उपाय करने में असमर्थ हैं। यह ऊतक के भीतर प्रकाश बिखरने के प्रभाव के कारण होता है, जो ऊतक आकार और घनत्व में स्वाभाविक रूप से होने वाली विविधता और वैस्कुलरिटी में अंतर, चर फ्लोरेसेंस बिखरने के साथ आगे बढ़ जाता है। ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस एक कारक भी हो सकता है, स्वाभाविक रूप से होने वाले जैव रासायनिक स्रोतों जैसे कोलेजन, या भोजन13में क्लोरोफिल जैसे आहार स्रोतों के कारण।
हिस्टोलॉजी बायोडिब्यूशन को मापने की सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधि है और संभावित रूप से समय के साथ विभिन्न ऊतकों में तेज को सही तरीके से मापने और तुलना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करने से प्रकाश बिखरने वाले मुद्दों को टाला जाता है क्योंकि सभी ऊतकों को एक ही मोटाई के साथ खंडित किया जाता है15. इस विधि का एक प्रमुख लाभ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए अतिरिक्त फ्लोरोसेंट लेबल पोस्टेक्शनिंग को शामिल करने की क्षमता है। यद्यपि एक और फ्लोरोफोर के अलावा इमेजिंग को और अधिक चुनौतीपूर्ण बना सकता है, फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग सीपीपी के स्थानीयकरण के लिए विशेष रूप से इंट्रासेलुलर डिब्बों के लिए उपयोगी हो सकता है, जैसे लाइसोसोम या माइटोकॉन्ड्रिया। एक एंटीबॉडी का उपयोग एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्रयोग में किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या कोई ट्रांसड्यूडेड उम्मीदवार सीपीपी ब्याज की संरचना के साथ कोलोकैलिज़ करता है, जो डिलीवरी एजेंट के रूप में सीपीपी की क्षमता दिखा सकता है। इस विधि की एक सीमा यह है कि अंग के नमूनों से स्लाइड तैयार करने में समय लग सकता है, श्रम गहन हो सकता है, और मानव त्रुटि12,,15से ग्रस्त हो सकता है। जब इमेजिंग स्लाइड, देखभाल के लिए बहुत लंबे समय के लिए एक ही स्थान छवि नहीं फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । फ्लोरोफोर की संवेदनशीलता के आधार पर कुछ फोटोब्लैचिंग अपरिहार्य हो जाएगी। नमूनों को परिवेशी प्रकाश से बचाने और उन्हेंठीकसे स्टोर करने के लिए इस प्रोटोकॉल के हर कदम पर सावधानी बरती जानी चाहिए । हम अनुशंसा करते हैं कि स्लाइड को भविष्य में इमेजिंग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, प्रकाश-संरक्षित पर संग्रहीत किया जाए।
एक उम्मीदवार सीपीपी के बायोवाइड्रीब्यूशन को मापने के लिए विभिन्न प्रकार के तरीके उपलब्ध हैं जिन्हें विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और तुलनीय परिणाम पैदा कर सकते हैं, हालांकि उन्हें अधिक जटिल सीपीपी लेबलिंग की आवश्यकता हो सकती है। इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल एक जीवित प्रणाली के संदर्भ में बायोडिब्यूशन डेटा का कुशलतापूर्वक उत्पादन करने के लिए दो संगत तरीकों का उपयोग करता है, जबकि एक ही नमूने से कोशिकाओं के भीतर पेप्टाइड आंतरिककरण के बारे में अधिक गहराई से जानकारी के अधिग्रहण की अनुमति देता है, इस प्रकार आधे से एक अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या में कटौती । इन तरीकों का उपयोग उपरोक्त डेटा उत्पन्न करने के लिए किया गया था, जो यह प्रदर्शित करता है कि दोनों विधियों का उपयोग एक ही जानवर में क्रमिक रूप से किया जा सकता है, और प्रत्येक द्वारा उत्पन्न डेटा की गुणवत्ता। हमारे परिणाम भी सीधे एक मात्रात्मक तरीके से दो तकनीकों के बीच परिणाम सहसंबंधित करने में असमर्थता को उजागर करते हैं ।
Disclosures
एम.जेड. और पॉल डी रॉबिंस (मिनेसोटा विश्वविद्यालय, मिनेसोटा, एमएन, यूएसए) हृदय वेक्टर (हृदय-विशिष्ट प्रोटीन लक्ष्यीकरण डोमेन, अमेरिकी पेटेंट धारावाहिक संख्या 9,249,184) के रूप में पेप्टाइड को लक्षित करने वाले कार्डियक के उपयोग पर पेटेंट आयोजित करते हैं। M.Z. भी मुख्य वैज्ञानिक अधिकारी के रूप में कार्य करता है और स्टार्टअप Vivasc चिकित्सा इंक के निदेशक मंडल में है और इसमें पर्याप्त भविष्य इक्विटी रखती है ।
Acknowledgments
M.Z. और K.S.F. अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास पुरस्कार 17SDG33411180 द्वारा समर्थित हैं, और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में नैदानिक और ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट के माध्यम से पिट इनोवेशन चैलेंज (PInCh®) के तहत सम्मानित अनुदान द्वारा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
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