Summary
我们描述了利用前活体成像系统进行细胞穿透肽的转导程度，然后采用心脏靶向肽进行石蜡嵌入、切片和共聚焦荧光显微镜的协议。在我们的协议中，单个动物可用于获得同一器官的两种成像评估，从而将研究所需的动物数量减少一半。
Abstract
自25年前对蛋白质转导域（也称为细胞穿透肽）的最初描述以来，人们一直对开发这些肽，特别是细胞特异性肽，作为提供诊断和治疗材料的新型载体产生了浓厚的兴趣。我们过去涉及噬菌体显示的工作发现了一种新颖的、非自然发生的12种氨基酸长肽，我们将其命名为心脏靶向肽（CTP），因为它能够在静脉注射后15分钟内在体内转导正常心脏组织，峰值服用率。我们进行了详细的生物分布研究，注射标有荧光荧光环丙氨酸5.5的CTP，允许它循环不同时期，并安乐死，固定和切片多个器官，然后荧光显微镜成像。在本出版物中，我们详细介绍了这些过程以及利用体内成像系统对收获器官进行活体成像。我们以CTP为例，为进行转导以及生物分布研究提供了详细的方法和做法。
Introduction
细胞等离子膜是一种半渗透屏障，对细胞的完整性和生存至关重要，通过控制物质进入细胞的运动来调节细胞内部。虽然对生存至关重要，但它也为向牢房运送货物提供了障碍。1988年，人体免疫机能丧失病毒转录蛋白的转活剂（Tat）被证明进入培养细胞，促进病毒基因表达11、2，2负责这种转导的域仅限于第三螺旋3的精氨酸和裂氨酸丰富的13氨基酸区域，因此被命名为细胞穿透肽（CPPs）。随后的研究表明，Tat肽能够将功能β-加拉西西酶带入多种细胞类型4。自最初描述以来，细胞穿透肽的数量急剧增加。这些转导域是自然存在的或合成的短肽，通常6-20个氨基酸长，能够携带功能性货物跨细胞膜。这些货物可包括其他小肽、全长蛋白质、核酸、纳米粒子、病毒颗粒、荧光分子和放射性同位素5。描述的初始CPPs不是细胞特异性，Tat被多种细胞类型所吸收，甚至跨越了血脑屏障4，从而限制了其治疗潜力。为了识别细胞特定的CPP，调查人员利用大型商业上可用的噬菌体库6进行了噬菌体显示。我们自己的工作使用组合体外和体内噬菌体显示方法，导致识别一个CPP命名心脏靶向肽（CTP）7，一个12氨基酸，7非自然发生的肽（NH 2-APWHSSQSQSRT-COOH），针对心脏的峰值上升在15分钟后，外围静脉注射8。2利用免疫荧光与细胞内标记，和排除拉米宁，细胞膜标记，我们表明，CTP内化成小鼠心肌细胞后静脉注射7。此外，我们孵育人类诱导多能干细胞衍生的跳动心肌细胞与双标签CTP，标记在它的C-terminus和红胺在其N总站通过酯链接，只能由细胞内酯解切。在共聚焦显微镜8中，在15分钟内观察到红胺快速积累成跳动的心肌细胞。
在本文中，我们提出了两种免费方法，可用于跟踪生物分布，并使用 CTP 确认 CPP 的组织特异性内化。对于这些方法，CTP被合成，荧光标记在N-terminus与氰化物5.5（CY5.5），并在C-terminus中盖，以提高肽稳定性。使用的两种方法是体内荧光光学成像系统和组织部分的荧光显微镜。这两种方法在研究生物分布、吸收和消除荧光标记的CPP方面非常有用。使用这些方法评估生物分布比其他方法（如单光子发射断层扫描 （SPECT） 或正电子发射断层扫描 （PET） 的优点是，与荧光标记相比，不需要对 CPP 进行耗时的放射标记，这在所有肽合成设施中相对容易且在常规使用中都相对容易。在体内成像的使用可在生活系统环境中快速生成生物分布数据，而切片通过保存形态细节，提供有关细胞内肽吸收和定位的更深入信息。该协议可应用于各种器官和组织，如心脏、肺、肝、肾、脑、脾脏、胃、大肠、小肠、骨骼肌、骨骼、骨骼、睾酮/卵巢和眼睛。
Protocol
匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会在进行任何此类动物实验之前，批准了本出版物中规定的所有动物协议。
注：本协议详细介绍了如何利用体内光学荧光成像进行体内生物分布研究，通过将器官嵌入石蜡、切片和执行荧光显微镜进行。尽管 CTP 用作示例，但此方法可应用于任何荧光标记的 CPP。
1. 体内成像
- 使用固体相合成技术99，1010从肽合成设施使用L-氨基酸与N-terminus标记为Cy5.5和C-terminus中间盖，以提高稳定性。
注：所有合成的CPCP在使用11之前应使用高性能液相色谱（HPLC）和/或矩阵辅助激光解散/电化（MALDI）进行特征分析。 - 在二甲基硫氧化物 （DMSO） 中制作 1 mM 或 10 mM 库存溶液，在 -80°C 下储存，并储存在-80°C，防光。
注：肽作为冻干粉输送。嗜热粉末可在-20°C下长期（6个月-2年）储存，在20°C下，在吸湿条件下进行防光。当在 DMSO 中引用并存储时，应避免冻结-解冻循环。 - 使用氯胺酮/锡拉辛溶液（100mg/kg氯胺酮和20毫克/千克氯胺酮）组织重量2 μL/g的6周大CD1雌性小鼠进行称重和麻醉，肌内（后腿）或内腹（左下象限）。
注：氯胺酮/锡拉辛溶液应在使用当天新鲜。未使用的氯胺酮/辛烷应适当处置，使用量与日志中丢弃的体积相比应适当处理，因为氯胺酮是一种受控物质。麻醉水平将在5-7分钟内达到，根据对脚趾捏缺乏反应来评估。 - 计算10mg/kg剂量的Cy5.5-CTP，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释至不超过200μL，并使用胰岛素注射器进行追溯或通过尾静脉注射（图1A）。
- 让肽在预指定的时间内循环，从15分钟-6小时开始。
- 使用机构动物护理和使用委员会指定的高CO2吸入方法对小鼠进行安乐死，并使用剪刀打开胸腔（图1B）。
- 使用剪刀在右中庭的横向自由壁上放置一个小刻痕，并使用26 G针注射3 mL的10%缓冲磷酸盐，用于灌注固定小鼠器官和冲洗红血球的双重目的（图1C）。
- 解剖心脏，肺，肝脏，肾脏，脾脏，大肠，小肠，膀胱，卵巢/睾口，大脑和位置到单个孔的12孔板前活体光学成像（图1D）。
- 启动图像采集软件，然后单击初始化按钮，为成像示例准备系统。打开成像向导，选择荧光，然后过滤对，然后从染料列表中选择 Cy5.5 染料以应用 580 nm 激励和 620 nm 发射滤光片。选择曝光参数的手动设置，然后将舞台位置设置为 B，将曝光时间设置为 1 秒，将 F/stop 设置为 8，然后将分箱设置为小。
注：激励发射滤清器会因使用的标签而异。可手动输入所用标签的激励和发射，供软件分配激励和发射过滤器。确保计数在 600-60，000 之间，以避免饱和。根据所使用的系统，自动采集优化可能可用。如果系统具有用于比较使用不同设置获取的图像的补偿，则可以使用自动设置。如果没有可用的补偿，则需要跨示例确定、保存和一致使用设置。 - 当系统完全初始化时，将感兴趣的器官排列在12孔板中，并将其放置在光学成像室内，确保样品按图像需要排列。选择"获取"，然后为图像选择保存位置。有关鼠标的信息可以写入编辑图像标签弹出窗口。
- 成像后，从造型室中取出样品，以10%的缓冲形式磷酸盐储存在一个体积中至少20倍于在室温（RT）下具有光保护的闪烁小瓶中的组织体积的20倍。
- 通过将单位设置为辐射效率来量化图像，然后选择 4x3 ROI 并调整以均匀地将每个井合二于一个正方形，然后单击度量。打开网格 ROI 度量选项卡，选择导出，并将度量值另存为 .cvs 文件。
2. 学法
注：按照步骤 1.1_1.8 获得不同的器官。或者，图像相同的器官可以立即放置在正式中，并用于切片，详见下文。
- 在组织学处理之前，将每个器官单独储存在10%缓冲的磷酸盐中，至少48小时。
- 当器官在48小时后完全固定时，将器官转移到组织处理中并嵌入盒式磁带，并放入组织处理机（图1E）。
- 将加工机在70%乙醇中脱水30分钟，后用80%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，100%乙醇15分钟，100%乙醇20分钟，最后100%乙醇20分钟。
- 清除二甲苯2x中的组织，每次二甲苯处理用30分钟。
- 每次治疗时，在60°C下用石蜡蜡4x渗透清除组织30分钟。
- 使用金属模具嵌入石蜡中。用熔融石蜡填充模具（保存在 65°C 处），然后转移到冷板中。当模具底部的石蜡开始凝固时，将器官放入石蜡中（图1F）。
- 将带标签的盒式磁带放在模具顶部作为衬垫，并加满熔融石蜡。冷却至固体。然后将块存放在 -20°C 冰柜中过夜，使蜡进一步收缩，以便从模具中轻松去除。
注：这些块现在可以存储在RT中，具有光保护。 - 准备一个38°C的水浴与蒸馏水。设置刀片角度为 6° 且截面厚度为 10 μm 的微托姆。
- 将组织块安装在微微体中，然后开始切割，直到获得包含组织的部分。然后，将方块朝下放在水中 5 分钟，或直到组织吸收一些水分（例如，当组织的白色薄轮廓出现在方块中时 [ 图 1Figure 1G]）。
注： 应频繁更换刀片，以确保截面的质量。 - 将组织放在平坦的冰块上 10 分钟，然后以与步骤 2.9 相同的方向将其返回到微孔。开始获取节，并允许截断的截面形成每个 6-10 个节的长功能区。丢弃次优石蜡带，直到产生足够长度的高质量带子以覆盖幻灯片。通过调整切割速度、组织保湿和水浴温度来优化切片，以避免组织部分的剪切或起皱。
注：组织中有孔脱落、组织裂裂或组织中皱纹和褶皱的部分应丢弃。 - 小心地选择使用钝边钳子选择的质量色带，并漂浮在 38 °C 水浴的表面。让截面坐在表面上，直到它们平滑，注意不要离开他们太久，以防止石蜡分解和撕裂部分。
- 将扁平部分浮动到干净的玻璃幻灯片表面。将幻灯片放入 65°C 烤箱 30 分钟以熔化蜡。
注：这些幻灯片可以存储在 RT 中，具有防光功能。 - 将二甲苯 3x 中的幻灯片除石化，每次处理 10 分钟。
- 将组织在100%乙醇中再加5分钟，然后用95%乙醇5分钟，70%乙醇5分钟，50%乙醇5分钟，最后1x三酯缓冲盐水（TBS）5分钟（图1H）。让幻灯片干燥过夜。
注：只要这些幻灯片是受光保护的，就可以在 RT 中长期存储。 - 使用含有4°6二酰胺-2-苯胺酚（DAPI）的核荧光探针（图1I）的安装介质安装带盖玻片的滑板。干滑在RT过夜，光保护。
注：干滑片可长期储存在4°C，防光。 - 使用荧光显微镜进行图像幻灯片。
注：应避免饱和图像，因为它们在定量上没有用。可以降低曝光和增益设置，以避免饱和。注意在要比较的样本中使用相同的设置。通过限制接触时间，避免组织漂白。
Representative Results
使用这种协议，我们通过回轨道注射治疗了三只剂量为10mg/kg的Cy5.5-CTP的小鼠（图1A）。在允许肽循环15分钟后，小鼠使用CO2腔进行安乐死，胸部通过中位鼻腔切开打开，右中庭被划破，小鼠灌注使用3 mL的10%磷酸盐缓冲形式素（图1B，C）。固定后，心脏、肺、肝、肾、脾脏和大脑被解剖出来，并安排在12孔板中进行前活体光学荧光成像（图1D和图2A）。三个没有注射的控制小鼠也被渗透、解剖和成像（图1B+D和图2B）。由于计数转化为辐射效率（成像软件的相对荧光单元），因此可以比较每组器官获得的荧光数据。这些数据可以量化，以产生定性图像和定量数据，每个器官的有关机构（图2C）在不同的时间点进行生物分布研究。图3A+E显示了不同器官对不同激发波长的自荧光。较短的激发波长，如增强的绿色荧光蛋白（EGFP），与更高的自荧光，特别是在肝脏和大脑，比远红色（Cy5.5）或附近的红外（Cy7）激发波长（图3）相关。成像器官在RT上固定在10%磷酸盐缓冲形式中，至少48小时，然后转移到组织加工和嵌入盒式磁带（图1E）。这些器官在组织处理机中加工和石蜡，放置在充满石蜡的模具中，冷冻在-20°C的阶段，并在-20°C（图1F）下过夜储存。样本被分割（图1G），并处理溶液交换，以补充组织（图1H）。然后，制备的幻灯片与DAPI荧光安装介质一起安装（图1I）。一旦干燥，通常通宵，幻灯片使用荧光显微镜成像。鼠标中每个器官的代表性图像如图 4 Figure 4A所示。来自不同器官的图像是使用相同的设置获得的，以便对小鼠进行比较，并允许定量（图4B）。
图1：采集小鼠器官进行外活体光学荧光成像和切片。（A） 野生型小鼠以CTP-Cy5.5逆轨注入。（B） 用胸部打开解剖的老鼠，右中庭被剪掉，用于灌注。（C） 心脏注射3 mL的10%缓冲磷酸盐，用于动物灌注。（D） 收集并排列在 12 孔板中用于荧光光学成像的兴趣器官。（E） 心脏装进盒中，并使用组织处理器进行处理。（F） 心脏嵌入石蜡中。（G） 心脏分在微缩子上.（H） 通过一系列解决方案交换进行滑轨化。（I） 使用 DAPI 安装带盖玻片的部分。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：来自处理和控制器官的代表性图像。（A） 用 10 mg/kg CTP-Cy5.5 处理小鼠的器官。（B） 未经处理的控制鼠标的器官。（C） 每组器官的荧光量量化。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：未经处理的小鼠器官以不同的激发发射波长进行成像，以演示波长较长的产生较少自荧光。（A） Cy7： 740~790.（B） Cy5.5： 660~710.（C） Cy5： 620~670.（D） Cy3： 520~570.（E） EGFP： 480~520.请点击此处查看此图形的较大版本。
图4：小鼠静脉注射后心脏、肺、肝、肾的转导。野生型小鼠注射10mg/kgCy5.5-CTP，或随机肽（RAN-Cy5.5），并在指定的时间点安乐死。（A） 心脏组织的峰值转导在15分钟时出现，随着时间的推移，荧光量稳步下降。一些毛细管吸收注意到在肺部与强转在肝脏以及肾球状毛细血管，后者意味着排泄的肾脏机制。（B） 荧光强度的定量显示，与 RAN-Cy5.5 的 CTP-Cy5.5 显著增强心脏摄取量。刻度柱 = 500 μm。这个数字是从扎希德等人8.请点击此处查看此图形的较大版本。
Discussion
动物模型对于临床前药物开发的每一阶段都是必不可少的，从识别新型CPP、生物分布研究、转导机制，到最终使用这些新CPP作为载体的交付货物的功效测试。有许多常用的方法可用于评估生物分布，如组织学、核医学成像（SPECT和PET）和体内光学成像12。核成像方法可能很麻烦，因为小型动物SPECT和PET系统的可用性有限，以及生产放射性标签药物共聚物的能力，这需要放射化学家的专门知识。相比之下，荧光标签要简单得多，而且使用起来效率高。本文所述的协议允许使用多种方法快速分析生物分布。Ex vivo 全器官荧光光学成像允许对不同组织和治疗组的荧光进行即时比较，并能以半定量的方式识别器官的摄取量和达到患者器官峰值的时间。定量组织组织学需要更广泛的处理来治疗、截面、图像和分析组织，但它提供了更多的微观层面的数据，是当前的标准技术。值得注意的是，不可能对两种技术进行直接的定量比较，因为每种技术对不同器官和激发波长的自荧光差异很大。
该协议的一个重要部分是选择正确的荧光波来标记实验的候选CPP。一个潜在的问题是光谱重叠，当需要多个荧光波时，这可能是有问题的。DAPI 荧光安装介质和 Cy5.5 没有重叠的光谱。但是，对于需要多个荧光波的某些应用，需要仔细考虑光谱重叠的风险。根据所使用的系统，氟磷的选择可能会受到限制。因此，了解系统的能力是关键。荧光光学系统最好用于远红色或近红外荧光波，因为较短波长13的组织吸收度很高。增强型绿色荧光蛋白范围内的荧光球有一个主要限制，因为在其激发波长上，特别是在大脑和肝脏组织中，可以看到显著的器官自荧光。根据实验的条件，最好避免一些氟脑。一些水溶性有机氟脑生物与脂质双层有很强的相互作用，可引起假阳性。因此，采取措施确定氟磷是否对感兴趣的组织有很强的亲和力是可取的。另一个需要考虑的因素是选择适当的氟磷结合方法，这可能是影响结果的重要参数。CPP可通过肽的N-terminus和染料的卡博基基组（如Cy5.5-NHS）之间的共价键在N-或C-terminus上荧光标记。应小心谨慎，因为大多数CP的转导机制没有详细理解，一端的合并对接受机制的影响可能比另一端更大。标记CPP的另一种可能性是通过生物化处理N-terminus，使结合到荧光标记链球菌。使用这种策略便于使用不同的荧光链球菌。然而，这种策略的一个可能限制是生物种菌-链球菌复合体是一个大型构造，可能干扰转导。
荧光光学成像系统是有效生成不同器官和治疗中荧光比较的有效策略，但无法定量测量组织的绝对浓度。这是由于组织内的光散射效应，由于组织大小和密度的自然变化，以及血管差异，以及可变荧光散射，进一步加重了这种效应。组织自荧光也可以是一个因素，由于自然产生的生化来源，如胶原蛋白，或饮食来源，如叶绿素在食物13。
组织学是测量生物分布最常用的方法，可能用于精确测量和比较不同组织的随时间的摄入。使用这种方法可以避免光散射问题，因为所有组织都分割到相同的厚度15。这种方法的一个主要优点是能够在切除后加入额外的荧光标签，用于免疫组化学。虽然添加另一个荧光磷可以使成像更具挑战性，但荧光标签的使用可用于将CPP定位到特定的细胞内隔间，如淋索体或线粒体。抗体可用于共聚焦显微镜实验，以确定传感器候选CPP是否与感兴趣的结构共存，从而显示CPP作为传递剂的潜力。这种方法的一个局限性是，从器官样本制备幻灯片既耗时，劳动密集，又容易出现人为错误12、15。12,成像幻灯片时，应注意不要长时间拍摄同一位置，以免出现光漂白。根据氟磷的敏感性，一些光漂白是不可避免的。在该协议的每一步都应小心谨慎，以保护样品免受环境光的影响，并妥善储存它们。我们建议将幻灯片存储在 4°C，防光，以便将来成像。
有多种方法可用于测量候选 CPP 的生物分布，这些方法需要专门设备，并可以产生类似的结果，尽管它们可能需要更复杂的 CPP 标记。本文中描述的协议采用两种兼容方法，在活系统范围内有效地生成生物分布数据，同时允许从同一样本中获取有关细胞内化的更深入信息，从而将研究所需的动物数量减少一半。这些方法用于生成上述数据，这表明这两种方法可以按顺序在同一动物中使用，并且每个方法生成的数据的质量。我们的结果也突出表明，无法以定量的方式直接关联这两种技术之间的结果。
Disclosures
M.Z. 和 Paul D. Robbins（美国明尼苏达州明尼苏达大学，明尼苏达州）持有一项专利，禁止使用心脏靶向肽作为心脏载体（心脏特定蛋白靶向领域，美国专利序列号 9，249，184）。M.Z. 还担任首席科学官，并担任初创公司 Vivasc 治疗公司的董事会成员，并持有该公司未来大量股权。
Acknowledgments
M.Z.和K.S.F.由美国心脏协会科学家发展奖17SDG33411180以及匹兹堡大学临床和转化科学研究所根据皮特创新挑战（PInCh®授予的赠款提供支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
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