Summary
Wir beschreiben Protokolle zur Bewertung des Grades der Transduktion durch zelldurchdringende Peptide unter Verwendung von Ex-vivo-Bildgebungssystemen, gefolgt von Paraffineinbettung, Schnitt- und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie am Beispiel von Kardial-Targeting-Peptid. In unserem Protokoll kann ein einzelnes Tier verwendet werden, um beide Arten der bildgebenden Bewertung der gleichen Organe zu erwerben, wodurch die Anzahl der Tiere, die für Studien benötigt werden, um die Hälfte wird.
Abstract
Seit der ersten Beschreibung von Proteintransduktionsdomänen, auch bekannt als zelldurchdringende Peptide, vor über 25 Jahren besteht großes Interesse an der Entwicklung dieser Peptide, insbesondere zellspezifischer, als neuartige Vektoren für die Bereitstellung diagnostischer und therapeutischer Materialien. Unsere bisherige Arbeit mit Phagen-Display identifizierte ein neuartiges, nicht natürlich vorkommendes, 12 Aminosäure-langes Peptid, das wir als Herz-Targeting-Peptid (CTP) bezeichneten, aufgrund seiner Fähigkeit, normales Herzgewebe in vivo mit Spitzenaufnahme in nur 15 min nach einer intravenösen Injektion zu transduzieren. Wir haben detaillierte Bioverteilungsstudien durchgeführt, indem wir CTP mit Fluorophorcyan5.5 gekennzeichnet injiziert haben, so dass es für verschiedene Zeiträume zirkulieren kann, und mehrere Organe einschläfern, fixieren und sektionieren, gefolgt von fluoreszierender Mikroskopie-Bildgebung. In dieser Publikation beschreiben wir diese Prozesse sowie die Ex-vivo-Bildgebung von geernteten Organen mittels eines In-vivo-Bildgebungssystems im Detail. Wir bieten detaillierte Methoden und Praktiken für die Durchführung von Transduktions- und Bioverteilungsstudien am Beispiel von CTP.
Introduction
Die Zellplasmamembran ist eine semipermeable Barriere, die für die Zellintegrität und das Überleben unerlässlich ist und dazu dient, das Innere der Zelle zu regulieren, indem sie die Bewegung von Substanzen in die Zelle steuert. Obwohl überlebenswichtig, stellt es auch eine Barriere für die Lieferung von Fracht an die Zelle dar. 1988 wurde gezeigt, dass der Transaktivator des Transkriptionsproteins (Tat) des humanen Immundefizienzvirus in kultivierte Zellen gelangte und die virale Genexpression1,2förderte, wobei die für diese Transduktion verantwortlichen Domänen auf eine Arginin- und Lysin-reiche 13-Aminosäure-Region der dritten Helix3 beschränkt waren. Es folgten Untersuchungen, die die Fähigkeit des Tat-Peptids zeigten, funktionelle Galactosidase in mehrere Zelltypen zu tragen4. Seit der ersten Beschreibung hat die Anzahl der zelldurchdringenden Peptide dramatisch zugenommen. Diese Transduktionsdomänen sind natürlich vorkommende oder synthetische kurze Peptide, typischerweise 6 bis 20 Aminosäuren lang, die in der Lage sind, funktionelle Ladungen über Zellmembranen zu transportieren. Diese Ladungen können von anderen kleinen Peptiden, Volllängenproteinen, Nukleinsäuren, Nanopartikeln, Viruspartikeln, fluoreszierenden Molekülen und Radioisotopen5reichen. Die anfänglichen CPPs beschrieben waren nicht zellspezifisch, mit Tat von mehreren Zelltypen aufgenommen und sogar die Blut - Hirn-Schranke4überqueren , wodurch sein therapeutisches Potenzial begrenzt. Um zellspezifische CPPs zu identifizieren, haben die Forscher phagendisplay unter Verwendung großer, kommerziell erhältlicher Phagenbibliotheken6durchgeführt. Unsere eigene Arbeit mit einer kombinatorischen In-vitro- und In-vivo-Phagenanzeige-Methodik führte zur Identifizierung eines CPP namens Cardiac Targeting Peptid (CTP)7, eines 12-Aminosäure- und nicht natürlich vorkommenden Peptids (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH), das das Herz mit Spitzenaufnahme bei 15 min nach einer peripheren intravenösen Injektion8angreift. Mit immunfluoreszierender Kolokalisierung mit Actin, einem intrazellulären Marker, und Ausschluss von Laminin, einem Zellmembranmarker, zeigten wir, dass CTP nach einer intravenösen Injektion in Maus-Kardiomyozyten verinnerlicht wird7. Zusätzlich inkubierten wir vom Menschen induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete schlagende Kardiomyozyten mit dual-labeled CTP, gekennzeichnet mit 6-Carboxyfluorescein an seinem C-Terminus und Rhodamine an seinem N-Terminus durch eine Esterverbindung, die nur durch intrazelluläre Esterasen abgeführt werden konnte. Schnelle Ansammlung von Rhodinin in schlagende Kardiomyozyten wurde innerhalb von 15 min bei der konfokalen Mikroskopie8beobachtet.
In diesem Artikel stellen wir zwei ergänzende Methoden vor, mit denen die Bioverteilung verfolgt und die gewebespezifische Internalisierung von CPPs am Beispiel von CTP bestätigt werden kann. Für diese Methoden wurde CTP synthetisiert, am N-Terminus fluoreszierend mit Cyanin5.5 (CY5.5) und Amid-capped am C-Terminus für eine höhere Peptidstabilität gekennzeichnet. Die beiden verwendeten Methoden sind in vivo fluoreszierende optische Bildgebungssysteme und fluoreszierende Mikroskopie von Gewebeabschnitten. Beide Methoden sind sehr nützlich bei der Untersuchung der Bioverteilung, Aufnahme und Eliminierung von fluoreszierend markierten CPPs. Der Vorteil der Bewertung der Bioverteilung mit diesen Methoden gegenüber anderen, wie der Einzelphotonen-Emissionstomographie (SPECT) oder der Positronenemissionstomographie (PET), besteht darin, dass eine zeitintensive Radiokennzeichnung von CPPs im Vergleich zur fluoreszierenden Kennzeichnung, die relativ einfach und in allen Peptidsyntheseanlagen im Routineeinsatz ist, nicht erforderlich ist. Der Einsatz von In-vivo-Bildgebung erzeugt schnell Bioverteilungsdaten im Kontext eines lebenden Systems, während die Schnitte über die Erhaltung morphologischer Details detailliertere Informationen über die Peptidaufnahme und Lokalisierung innerhalb der Zellen liefern. Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Organen und Geweben wie Herz, Lunge, Leber, Niere, Gehirn, Milz, Magen, Dickdarm, Dünndarm, Skelettmuskel, Knochen, Hoden/Eierstöcke und Augen angewendet werden.
Protocol
Der Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigte alle in dieser Veröffentlichung aufgeführten Tierprotokolle, bevor er eines dieser Tierversuche durchführte.
HINWEIS: In diesem Protokoll wird erläutert, wie Ex-vivo-Bioverteilungsstudien unter Verwendung von ex vivo optischer Fluoreszenz-Bildgebung durchgeführt werden können, gefolgt von In-vivo-Bioverteilungsstudien, indem die Organe in Paraffin einbetten, schneiden und fluoreszierende Mikroskopie durchführen. Obwohl CTP als Beispiel verwendet wird, kann diese Methode auf jede fluoreszierende CPP angewendet werden.
1. In-vivo-Bildgebung
- Synthetisieren CtP mit Festphasensynthesetechniken9,10 aus einer Peptidsynthese-Anlage mit L-Aminosäuren mit einem N-Terminus mit Cy5.5 und C-terminus amid-capped für erhöhte Stabilität.
HINWEIS: Alle synthetisierten CPPs sollten vor der Anwendung11mit einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und/oder matrixgestützter Laserdesorption/Ionisierung (MALDI) charakterisiert werden. - Eine 1 mM oder 10 mM Stammlösung von CTP in Dimethylsulfoxid (DMSO), aliquot, aliquot herstellen und bei -80 °C lichtgeschützt lagern.
HINWEIS: Peptide werden als lyophilisiertes Pulver geliefert. Lyophilisiertes Pulver kann langfristig (6 Monate-2 Jahre) in -20 °C, lichtgeschützt und unter hygroskopischen Bedingungen gelagert werden. Wenn in DMSO aliquoted und gespeichert, Einfrieren-Tau-Zyklen sollten vermieden werden. - Wiegen und anästhesieren 6 Wochen alte CD1-Mäuse mit 2 L/g Gewebegewicht einer Ketamin/Xylazin-Lösung (100 mg/kg Ketamin und 20 mg/kg Xylazin), die intramuskulär (Hind-Bein) oder intraperitoneal (unteres linkes Quadrant) verabreicht werden.
HINWEIS: Ketamin/Xylazin-Lösungen sollten am Tag der Anwendung frisch hergestellt werden. Nicht verwendetes Ketamin/Xylazin sollte entsprechend entsorgt und Mengen verwendet werden, die im Vergleich zu den in einem Protokoll zurückgeworfenen Mengen verwendet werden, da Ketamin eine kontrollierte Substanz ist. Angemessene Anästhesie wird in 5-7 min erreicht werden, wie durch mangelnde Reaktion auf eine Zehenprise beurteilt. - Berechnen Sie eine Dosis von 10 mg/kg Cy5,5-CTP, verdünnen Sie sie mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) auf nicht mehr als 200 l und injizieren Sie entweder retroorbital oder durch Eine Injektion der Schwanzvene mit einer Insulinspritze(Abbildung 1A).
- Peptid für die vorgegebene Zeit zirkulieren lassen, die zwischen 15 min-6 h liegt.
- Euthanisieren Sie die Maus mit der hohenBCO2-Inhalationsmethode, wie vom Institutional Animal Care and Use Committee angegeben, und öffnen Sie die Brusthöhle mit einer Schere (Abbildung 1B ).2
- Verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Nick in die seitliche, freie Wand des rechten Vorhofs zu legen und 3 ml 10% gepuffertes Formalinphosphat mit einer 26 G Nadel für den doppelten Zweck der Perfusion fixieren die Organe der Maus und Ausspülung roter Blutkörperchen (Abbildung 1C) zu injizieren.
- Sezieren Sie Herz, Lunge, Leber, Nieren, Milz, Dickdarm, Dünndarm, Blase, Eierstöcke/Hoden und Gehirn und legen Sie sie in einzelne Brunnen einer 12 Brunnenplatte für die ex vivo optische Bildgebung(Abbildung 1D).
- Starten Sie die Bildaufnahmesoftware, und klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, um das System für Bildbeispiele vorzubereiten. Öffnen Sie den Bildgebungsassistenten, wählen Sie Fluoreszenz und dann Filterpaar aus, und wählen Sie dann den Cy5.5-Farbstoff aus der Liste der Farbstoffe aus, um 580 nm Anregung und 620 nm Emissionsfilter anzuwenden. Wählen Sie manuelle Einstellungen für Belichtungsparameter aus, legen Sie dann die Bühnenposition auf B fest, legen Sie die Belichtungszeit auf 1 Sekunde fest, setzen Sie die F/Stop auf 8 und setzen Sie die Binning auf klein.
HINWEIS: Die Anregungsemissionsfilter variieren je nach verwendeter Bezeichnung. Die Anregung und Emission des verwendeten Etiketts kann manuell eingegeben werden, damit die Software Anregungs- und Emissionsfilter zuordnen kann. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl zwischen 600-60.000 liegt, um Eine Sättigung zu vermeiden. Je nach eingesetzter Anlage kann eine automatische Erfassungsoptimierung möglich sein. Wenn das System über eine Kompensation zum Vergleich von Bildern verfügt, die mit verschiedenen Einstellungen aufgenommen wurden, können die automatischen Einstellungen verwendet werden. Wenn keine Kompensation verfügbar ist, müssen die Einstellungen in allen Beispielen festgelegt, gespeichert und konsistent verwendet werden. - Wenn das System vollständig initialisiert ist, ordnen Sie die von Interesse interessierten Organe in eine 12 Wellplatte und legen Sie sie in die optische Bildkammer, um sicherzustellen, dass die Proben für die Bilder nach Belieben angeordnet sind. Wählen Sie Erfassen aus, und wählen Sie dann einen Speicherort für die Bilder aus. Informationen über die Maus können in das Popup-Fenster "Bildbeschriftungen bearbeiten" geschrieben werden.
- Nach der Bildgebung die Proben aus der Kammer entfernen und in 10% gepuffertem Formalinphosphat in einem Volumen mindestens 20 Mal so viel Volumen des Gewebes in Szintillationsfläschchen mit Lichtschutz bei Raumtemperatur (RT) aufbewahren.
- Quantifizieren Sie die Bilder, indem Sie Einheiten auf Radiant Efficiency einstellen, dann den 4x3 ROI auswählen und sich anpassen, um jedes Gut in ein Quadrat des ROI gleichmäßig zu passen, gefolgt von einem Klick auf Maß. Öffnen Sie die Registerkarte Grid ROI-Messungen, wählen Sie Export aus, und speichern Sie die Messungen als .cvs-Datei.
2. Histologie
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 1.1-1.8 aus, um verschiedene Organe zu erhalten. Alternativ können die gleichen Organe, die abgebildet wurden, sofort in Formalin gelegt und für die Schnitte verwendet werden, wie unten beschrieben.
- Bewahren Sie jedes Organ einzeln in 10% gepuffertem Formalinphosphat für mindestens 48 h auf, bevor es für die Histologie verarbeitet wird.
- Wenn die Organe nach 48 h ausreichend fixiert sind, übertragen Sie die Organe in Gewebeverarbeitungs- und Einbettkassetten und legen Sie sie in eine Gewebeverarbeitungsmaschine(Abbildung 1E).
- Stellen Sie die Verarbeitungsmaschine so ein, dass das Gewebe für 30 min in 70% Ethanol entwässert wird, gefolgt von 80% Ethanol für 30 min, 95% Ethanol für 30 min, 95% Ethanol für 30 min, 100% Ethanol für 15 min, 100% Ethanol für 20 min und schließlich 100% Ethanol für 20 min.
- Löschen Sie das Gewebe in Xylol 2x, mit 30 min für jede Xylol-Behandlung.
- Infiltrieren Sie das gereinigte Gewebe mit Paraffinwachs 4x bei 60 °C für 30 min bei jeder Behandlung.
- Einbetten in Paraffin mit Metallformen. Füllen Sie die Form mit geschmolzenem Paraffin (bei 65 °C gehalten) und auf eine kalte Platte übertragen. Wenn das Paraffin am unteren Rand der Form zu erstarren beginnt, legen Sie das Organ in das Paraffin (Abbildung 1F).
- Legen Sie eine beschriftete Kassette als Unterlage auf die Form und überfüllen Sie sie mit geschmolzenem Paraffin. Abkühlen lassen, bis es fest ist. Dann lagern Sie den Block über Nacht in einem -20 °C Gefrierschrank, so dass das Wachs weiter schrumpfen kann, um es einfach von den Formen zu entfernen.
HINWEIS: Die Blöcke können nun bei RT mit Lichtschutz gelagert werden. - Bereiten Sie ein 38 °C-Wasserbad mit destilliertem Wasser vor. Richten Sie das Mikrotom mit einem Klingenwinkel von 6° und einer Schnittdicke von 10 m ein.
- Montieren Sie die Gewebeblöcke in das Mikrotome und beginnen Sie zu schneiden, bis Gewebeabschnitte erhalten sind. Legen Sie die Blöcke dann 5 min nach unten ins Wasser oder bis das Gewebe etwas Feuchtigkeit aufgenommen hat (z. B. wenn im Block eine dünne weiße Umrisslinie des Gewebes erscheint [Abbildung 1G]).
HINWEIS: Die Klinge sollte häufig ausgetauscht werden, um die Qualität der Abschnitte zu gewährleisten. - Legen Sie das Gewebe 10 min auf einen flachen Eisblock und geben Sie es dann in der gleichen Ausrichtung wie in Schritt 2.9 in das Mikrotom zurück. Beginnen Sie mit der Ausführung von Abschnitten, und lassen Sie abgeschnittene Abschnitte lange Abschnitte mit jeweils 6 bis 10 Abschnitten bilden. Entsorgen Sie suboptimale Paraffinbänder, bis ein hochwertiges Band von ausreichender Länge für einen Schlitten hergestellt wird. Optimieren Sie die Schnitte, indem Sie Schnittgeschwindigkeiten, Gewebefeuchtigkeit und Wasserbadtemperatur anpassen, um das Scheren oder Falten der Gewebeabschnitte zu vermeiden.
HINWEIS: Abschnitte, in denen Löcher entstehen, in denen Gewebe herausgefallen ist, risse im Gewebe oder enge Falten und Falten im Gewebe sollten verworfen werden. - Wählen Sie vorsichtig das Qualitätsband der Wahl mit stumpfen Kantenzangen und schweben Sie auf der Oberfläche des 38 °C Wasserbades. Lassen Sie die Abschnitte auf der Oberfläche sitzen, bis sie glätten, wobei darauf geachtet wird, dass sie nicht zu lange bleiben, um zu verhindern, dass das Paraffin zerfällt und den Abschnitt auseinanderreißt.
- Schwimmen Sie die abgeflachten Abschnitte auf die Oberfläche von sauberen Glasgleitern. Legen Sie die Dias 30 min in einen 65 °C-Ofen, um das Wachs zu schmelzen.
HINWEIS: Diese Dias können bei RT mit Lichtschutz gelagert werden. - Deparaffinieren Sie die Dias in Xylol 3x, 10 min für jede Behandlung.
- Rehydrieren Sie das Gewebe in 100% Ethanol für 5 min, gefolgt von 95% Ethanol für 5 min, 70% Ethanol für 5 min, 50% Ethanol für 5 min und schließlich 1x Tris-gepufferter Salin (TBS) für 5 min (Abbildung 1H). Lassen Sie die Rutschen über Nacht trocknen.
HINWEIS: Diese Dias können langfristig bei RT gelagert werden, solange sie lichtgeschützt sind. - Montieren Sie die Dias mit Abdeckungen mit 125 l Montagemedien, die 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), eine Kernfluoreszenzsonde enthalten (Abbildung 1I). Trockenrutschen über Nacht bei RT, lichtgeschützt.
HINWEIS: Getrocknete Dias können langfristig bei 4 °C, lichtgeschützt gelagert werden. - Bilddiagleitet mittels Fluoreszenzmikroskopie.
HINWEIS: Gesättigte Bilder sollten vermieden werden, da sie quantitativ nicht nützlich sind. Die Einstellung der Belichtungs- und Verstärkungseinstellungen kann gesenkt werden, um eine Sättigung zu vermeiden. Achten Sie darauf, die gleichen Einstellungen in den verglichenen Beispielen zu verwenden. Vermeiden Sie das Bleichen des Gewebes, indem Sie die Expositionszeiten begrenzen.
Representative Results
Mit diesem Protokoll behandelten wir drei Mäuse mit einer Dosis von 10 mg/kg Cy5,5-CTP durch eine retroorbitale Injektion (Abbildung 1A). Nachdem das Peptid 15 min zirkulieren konnte, wurden die Mäuse mit einerCO2-Kammer eingeschläfert, die Brust durch einen mittleren Sternotomieschnitt geöffnet, das rechte Vorhof genickt und die Mäuseperfusion mit 3 ml 10% phosphatgepuffertem Formalin fixiert (Abbildung 1B,C). Nach der Fixierung wurden Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz und Gehirn seziert und in einer 12-Well-Platte für ex vivo optische Fluoreszenz-Bildgebung angeordnet(Abbildung 1D und Abbildung 2A). Drei Kontrollmäuse ohne Injektionen wurden ebenfalls durchblutet, seziert und abgebildet(Abbildung 1B-D und Abbildung 2B). Die für jeden Organsatz erfassten Fluoreszenzdaten können verglichen werden, da die Anzahl in die Strahlungseffizienz, die relative Fluoreszenzeinheit der Bildgebungssoftware, umgewandelt wird. Diese Daten können quantifiziert werden, um sowohl qualitative Bilder als auch quantitative Daten für jedes betreffende Organ(Abbildung 2C) über verschiedene Zeitpunkte für Bioverteilungsstudien hinweg zu liefern. Die Autofluoreszenz verschiedener Organe als Reaktion auf unterschiedliche Anregungswellenlängen wird in Abbildung 3A-Egezeigt. Kürzere Anregungswellenlängen, wie z. B. verbessertes grünes fluoreszierendes Protein (EGFP), sind mit einer höheren Autofluoreszenz, insbesondere in Leber und Gehirn, verbunden als weitrote (Cy5.5) oder nahe Infrarot (Cy7) Anregungswellenlängen (Abbildung 3). Die abgebildeten Organe wurden in 10% Phosphat gepuffertes Formalin bei RT für mindestens 48 h fixiert, gefolgt von einer Übertragung auf Gewebeverarbeitungs- und Einbettkassetten (Abbildung 1E). Die Organe wurden in einer Gewebeverarbeitungsmaschine verarbeitet und paraffiniert, in mit Paraffin gefüllten Formen positioniert, auf einer Stufe von -20 °C eingefroren und über Nacht bei -20 °C gelagert (Abbildung 1F). Die Proben wurden geschnitten (Abbildung 1G) und mit Lösungsaustausch behandelt, um das Gewebe zu rehydrieren (Abbildung 1H). Die vorbereiteten Dias wurden dann mit DAPI-Fluoreszenz-Montagemedium montiert (Abbildung 1I). Einmal trocken, in der Regel über Nacht, wurden die Dias mit fluoreszierender Mikroskopie abgebildet. Repräsentative Bilder jedes Organs von einer Maus sind in Abbildung 4Adargestellt. Die Bilder von verschiedenen Organen wurden mit identischen Einstellungen aufgenommen, um einen Vergleich zwischen Mäusen zu ermöglichen und eine Quantifizierung zu ermöglichen (Abbildung 4B).
Abbildung 1: Ernte von Mausorganen für ex vivo optische Fluoreszenz-Bildgebung und -Schnitte. (A) Wild-Typ-Maus retro-orbital mit CTP-Cy5.5 injiziert. (B) Maus seziert mit Brust geöffnet, rechte Vorhof geschnappt, für Perfusionsfixierung. (C) Herz injiziert mit 3 ml 10% gepuffertem Formalinphosphat zur Perfusionsfixierung des Tieres. (D) Von Interesse verwendete und in einer 12-Well-Platte angeordnete Organe für die fluoreszierende optische Bildgebung. (E) Herz in eine Kassette geladen und mit einem Gewebeprozessor verarbeitet. (F) Herz eingebettet in Paraffin. (G) Herz auf einem Mikrotom geschnitten. (H) Dias, die durch eine Reihe von Lösungsaustauschen entparaffiniert werden. (I) Abschnitte, die mit Abdeckungen mit DAPI eingehängt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von behandelten und Kontrollorganen. (A) Organe einer Maus, die mit 10 mg/kg CTP-Cy5.5 behandelt wurden. (B) Organe einer unbehandelten Steuermaus. (C) Quantifizierung der Fluoreszenz für jeden Organsatz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Unbehandelte Mausorgane, die mit unterschiedlichen Anregungsemissionswellenlängen abgebildet sind, um zu zeigen, wie längere Wellenlängen weniger Autofluoreszenz erzeugen. (A) Cy7: 740-790. (B) Cy5.5: 660-710. (C) Cy5: 620-670. (D) Cy3: 520-570. (E) EGFP: 480-520. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Transduktion von Herz, Lunge, Leber und Niere nach intravenöser Injektion bei Mäusen. Wildtyp-Mäuse wurden mit 10 mg/kg Cy5,5-CTP oder einem zufälligen Peptid (RAN-Cy5.5) injiziert und zu den angegebenen Zeitpunkten eingeschläfert. (A) Die Peak-Transduktion des Herzgewebes wurde bei 15 min mit einer stetigen Abnahme der Fluoreszenz im Laufe der Zeit beobachtet. Einige Kapillaraufnahme wurde in der Lunge mit robuster Transduktion in der Leber sowie an den Nierenglomerularkapillaren festgestellt, letztere impliziert einen nierenrenalen Mechanismus der Ausscheidung. (B) Die Quantifizierung der fluoreszierenden Intensität zeigt eine signifikant erhöhte Herzaufnahme von CTP-Cy5.5 gegenüber RAN-Cy5.5. Skalenbalken = 500 m. Diese Zahl wurde von Zahid et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Tiermodelle sind für die präklinische Arzneimittelentwicklung in jeder Phase des Prozesses von der Identifizierung neuartiger CPPs, Bioverteilungsstudien, Transduktionsmechanismus bis hin zu tests auf Wirksamkeit der gelieferten Ladung unter Verwendung dieser neuartigen CPPs als Vektoren unerlässlich. Es gibt viele häufig verwendete Methoden zur Bewertung der Bioverteilung wie Histologie, nuklearmedizinische Bildgebung (SPECT und PET) und optische Bildgebung in vivo12. Nukleare Bildgebungsverfahren können aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von SPECT- und PET-Kleintiersystemen sowie der Fähigkeit zur Herstellung von Radiolabel-Wirkstoff-Konjugaten, die das Fachwissen eines Radiochemikers erfordern, umständlich sein. Im Gegensatz dazu sind fluoreszierende Etiketten viel einfacher und können kostengünstig mit ihnen arbeiten. Das in diesem Dokument beschriebene Protokoll ermöglicht eine schnelle Analyse der Bioverteilung mit mehreren Methoden. Ex vivo ganze Organ fluoreszierende optische Bildgebung ermöglicht den sofortigen Vergleich der Fluoreszenz über verschiedene Gewebe und Behandlungsgruppen hinweg und kann Organaufnahme und Zeit bis zur Aufnahme von Organen semiquantitativ identifizieren. Quantitative Gewebehistologie erfordert eine umfangreichere Verarbeitung zur Behandlung, Schnitt- und Analyse von Geweben, liefert aber mehr Daten auf mikroskopischer Ebene und ist eine aktuelle Standardtechnik. Es lohnt sich zu beachten, dass ein direkter, quantitativer Vergleich zwischen den beiden Techniken nicht möglich ist, da die Autofluoreszenz, die bei jeder Technik für verschiedene Organe und Anregungswellenlängen gesehen wird, erheblich variiert.
Ein wichtiger Teil dieses Protokolls ist die Auswahl des richtigen Fluorophors, um Kandidaten-CPPs für Experimente zu kennzeichnen. Ein potenzielles Problem ist die Spektrenüberlappung, die problematisch sein kann, wenn mehrere Fluorophore benötigt werden. Die DAPI-Fluoreszenz-Montagemedien und Cy5.5 haben keine überlappenden Spektren. Bei bestimmten Anwendungen, bei denen mehrere Fluorophore benötigt werden, muss jedoch das Risiko von spektralen Überschneidungen sorgfältig geprüft werden. Je nach verwendetem System kann die Fluorophorauswahl eingeschränkt sein. Daher ist die Kenntnis der Systemfähigkeiten von entscheidender Bedeutung. Fluoreszierende optische Systeme werden am besten mit weitroten oder nahinfraroten Fluorophoren aufgrund der hohen Gewebeabsorption kürzerer Wellenlängen13eingesetzt. Fluorophore im Bereich des verbesserten grünen fluoreszierenden Proteins haben eine große Einschränkung, da es eine signifikante Organautofluoreszenz gibt, die bei seiner Anregungswellenlänge gesehen wird, insbesondere im Gehirn- und Lebergewebe. Je nach den Bedingungen eines Experiments werden einige Fluorophore am besten vermieden. Einige wasserlösliche organische Fluorophore haben eine starke Wechselwirkung mit Lipid-Doppelschichten, die falsche Positivwerte verursachen können. Daher ist es ratsam, Schritte zu unternehmen, um festzustellen, ob ein Fluorophor eine starke Affinität zum Gewebe von Interesse hat14. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist die Auswahl der geeigneten Methode der Fluorophorkonjugation, die ein wichtiger Parameter sein kann, der die Ergebnisse beeinflusst. CPPs können am N- oder C-Terminus fluoreszierend durch eine kovalente Bindung zwischen dem N-Terminus des Peptids und der Carboxylgruppe des Farbstoffs wie Cy5.5-NHS gekennzeichnet werden. Es sollte Vorsicht geboten sein, da der Mechanismus der Transduktion der meisten CPPs nicht im Detail verstanden wird und die Konjugation an einem Ende den Aufnahmemechanismus stärker als am anderen Ende beeinflussen kann. Eine weitere Möglichkeit zur Kennzeichnung von CPPs besteht darin, dass der N-Terminus zur Konjugation zu fluoreszierend markiertem Streptavidin biotinylatiert wird. Die Verwendung dieser Strategie hat den Komfort, verschiedene fluoreszierende Streptavidin-Konjugate verwendet werden zu lassen. Eine mögliche Einschränkung dieser Strategie besteht jedoch darin, dass ein Biotin-Streptavidin-Komplex ein großes Konstrukt ist, das möglicherweise die Transduktion beeinträchtigen könnte.
Fluoreszierende optische Bildgebungssysteme sind eine effektive Strategie, um einen effizienten Vergleich der Fluoreszenz zwischen verschiedenen Organen und Behandlungen zu erzeugen, sind aber nicht in der Lage, ein quantitatives Maß für absolute Konzentrationen im Gewebe zu erzeugen. Dies ist auf Lichtstreuungseffekte im Gewebe zurückzuführen, die durch die natürlich vorkommende Vielfalt in Gewebegrößen und Dichten und Unterschiede in der Vaskularität mit variabler Fluoreszenzstreuung noch verstärkt werden. Gewebe-Autofluoreszenz kann auch ein Faktor sein, aufgrund natürlich vorkommenden biochemischen Quellen wie Kollagen, oder diätetische Quellen wie Chlorophyll in Lebensmitteln13.
Histologie ist die am häufigsten verwendete Methode zur Messung der Bioverteilung und kann potenziell verwendet werden, um die Aufnahme in verschiedenen Geweben im Laufe der Zeit genau zu messen und zu vergleichen. Lichtstreuungsprobleme werden mit dieser Methode vermieden, da alle Gewebe auf die gleiche Dicke15geschnitten sind. Ein großer Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, zusätzliche fluoreszierende Etiketten nach der Sektionierung für die Immunhistochemie einzubeziehen. Obwohl die Zugabe eines anderen Fluorophors die Bildgebung schwieriger machen könnte, kann die Verwendung von Fluoreszenzetiketten für die Lokalisierung eines CPP in bestimmten intrazellulären Kompartimenten wie Lysosomen oder Mitochondrien nützlich sein. Ein Antikörper könnte in einem konfokalen Mikroskopieexperiment verwendet werden, um festzustellen, ob ein transduzierter Kandidat CPP mit einer Interessenstruktur kolokalisiert, die das Potenzial eines CPP als Zustellmittel aufzeigen kann. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass die Vorbereitung von Dias aus Organproben zeitaufwändig, arbeitsintensiv und anfällig für menschliches Versagen sein kann12,15. Bei der Abbildung von Dias sollte darauf geachtet werden, dass nicht zu lange derselbe Ort abbildt wird, um Photobleichungen zu vermeiden. Einige Photobleichungen sind je nach Empfindlichkeit des Fluorophors unvermeidlich. Bei jedem Schritt dieses Protokolls ist darauf zu achten, dass die Proben vor Umgebungslicht geschützt und ordnungsgemäß gelagert werden16. Wir empfehlen, Dias bei 4 °C, lichtgeschützt, für zukünftige Bildgebung zu lagern.
Es gibt eine Vielzahl von Methoden zur Messung der Bioverteilung eines KPP-Kandidaten, die spezielle Ausrüstung erfordern und vergleichbare Ergebnisse liefern können, obwohl sie eine komplexere CPP-Kennzeichnung erfordern können. Das in diesem Papier beschriebene Protokoll verwendet zwei kompatible Methoden, um Bioverteilungsdaten im Kontext eines lebenden Systems effizient zu produzieren und gleichzeitig den Erwerb größerer detaillierter Informationen über die Peptidinternalisierung innerhalb von Zellen aus derselben Probe zu ermöglichen und so die Anzahl der für eine Studie benötigten Tiere zu reduzieren. Diese Methoden wurden verwendet, um die oben genannten Daten zu generieren, die zeigen, dass beide Methoden sequenziell bei demselben Tier verwendet werden können, und die Qualität der von jedem erzeugten Daten. Unsere Ergebnisse unterstreichen auch die Unfähigkeit, die Ergebnisse zwischen den beiden Techniken in quantitativer Weise direkt zu korrelieren.
Disclosures
M.Z. und Paul D. Robbins (University of Minnesota, Minnesota, MN, USA) besitzen ein Patent auf die Verwendung von Kardial-Targeting-Peptid als Herzvektor (Herzspezifische Protein-Targeting-Domain, U.S. Patent Serial No. 9,249,184). M.Z. ist auch chief Scientific Officer und mitglied im Verwaltungsrat des Startups Vivasc Therapeutics Inc. und hält erhebliches zukünftiges Eigenkapital.
Acknowledgments
M.Z. und K.S.F. werden vom American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180 und einem Stipendium der Pitt Innovation Challenge (PInCh®) durch das Clinical and Translational Science Institute der University of Pittsburgh unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
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