Summary
نحن وصف بروتوكولات لتقييم درجة نقل بواسطة الببتيدات اختراق الخلايا باستخدام أنظمة التصوير فيفو السابق تليها البارافين تضمين، والقسم، والمجهر الفلورسنت confocal باستخدام الببتيد استهداف القلب كمثال. في بروتوكولنا، يمكن استخدام واحد للحصول على كلا النوعين من تقييم التصوير لنفس الأعضاء، وبالتالي خفض عدد الحيوانات اللازمة للدراسات إلى النصف.
Abstract
منذ الوصف الأولي للمجالات تحويل البروتين، والمعروف أيضا باسم الخلايا اختراق الببتيدات، منذ أكثر من 25 عاما، كان هناك اهتمام شديد في تطوير هذه الببتيدات، وخاصة الخلايا الخاصة منها، ونواقل جديدة لتقديم المواد التشخيصية والعلاجية. عملنا الماضي التي تنطوي على عرض phage حددت رواية, تحدث nonnaturally, 12 الببتيد الأحماض الأمينية طويلة التي سميناها الببتيد استهداف القلب (CTP) بسبب قدرته على تحويل أنسجة القلب الطبيعية في الجسم الحي مع امتصاص الذروة ينظر في أقل من 15 دقيقة بعد الحقن الوريدي. لقد قمنا بدراسات تفصيلية لdisdistribution البيولوجية عن طريق حقن CTP المسمى بالفلوروفور سيانين5.5، مما يسمح لها بالتعمّر لفترات زمنية مختلفة، والقتل الرحيم، وتحديد، وتحجيم أجهزة متعددة متبوعة بتصوير المجهر الفلورسنت. في هذا المنشور ، ونحن وصف هذه العمليات وكذلك السابقين الجسم الحي التصوير للأعضاء المقطوعة باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي بالتفصيل. نحن نقدم منهجيات وممارسات مفصلة للقيام بعمليات نقل المعلومات وكذلك دراسات توزيع المعلومات البيولوجية باستخدام CTP كمثال.
Introduction
غشاء البلازما الخلية هو حاجز شبه قابل للنفاذ وضروري لسلامة الخلية والبقاء على قيد الحياة ويعمل على تنظيم داخل الخلية عن طريق السيطرة على حركة المواد في الخلية. وعلى الرغم من حيويته للبقاء على قيد الحياة، فإنه يشكل أيضا عائقا أمام تسليم البضائع إلى الزنزانة. في عام 1988، تبين أن عبر المنشط للنسخ (تات) بروتين فيروس نقص المناعة البشرية لدخول الخلايا المستزرعة وتعزيز التعبير الجيني الفيروسي1،2، مع المجالات المسؤولة عن هذا النقل تقتصر على أرجينين وليسين الغنية 13-حمض أميني المنطقة من الحلزون الثالث3 هذه وهكذا سميت الخلايا اختراق الببتيدات (CPPs). وأعقب ذلك من خلال البحوث التي تبين قدرة الببتيد تات على حمل وظيفية β-galactosidase في أنواع الخلايا المتعددة4. منذ الوصف الأولي ، زاد عدد الببتيدات اختراق الخلايا بشكل كبير. هذه المجالات نقل هي التي تحدث بشكل طبيعي أو الببتيدات القصيرة الاصطناعية، عادة 6-20 الأحماض الأمينية طويلة، التي هي قادرة على حمل الشحنات الوظيفية عبر أغشية الخلايا. يمكن أن تتراوح هذه الشحنات من الببتيدات الصغيرة الأخرى، والبروتينات الكاملة الطول، والأحماض النووية، والجسيمات النانوية، والجسيمات الفيروسية، والجزيئات الفلورية، والنظائر المشعة5. لم تكن CPPs الأولية الموصوفة خلية محددة ، مع تات التي يجري تناولها من قبل أنواع الخلايا المتعددة وحتى عبور حاجز الدم في الدماغ4، وبالتالي الحد من إمكاناتها العلاجية. من أجل تحديد CPPs الخلية محددة، وقد اضطلع المحققون عرض phage باستخدام مكتبات phage كبيرة، ومتاحة تجاريا6. عملنا الخاص باستخدام الجمع بين في المختبر وفي الجسم الحي phage منهجية العرض أدى إلى تحديد CPP اسمه الببتيد استهداف القلب (CTP)7, 12-amino acid, الببتيد التي تحدث nonnaturally (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) التي تستهدف القلب مع امتصاص الذروة في 15 دقيقة بعد حقنة في الوريد الوريدي8. باستخدام الكولوكية المناعية مع actin ، علامة داخل الخلايا ، واستبعاد اللامينين ، علامة غشاء الخلية ، أظهرنا أن CTP يتم استيعابه في cardiomyocytes الماوس بعد الحقن الوريدي7. بالإضافة إلى ذلك، نحن احتضان الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة الضرب cardiomyocytes مع CTP المزدوج المسمى، وصفت مع 6-carboxyfluorescein في لها C-terminus والرودامين في لها N-terminus من خلال وصلة استستير التي لا يمكن إلا أن تشقوق قبالة من قبل استوراسيس داخل الخلايا. لوحظ تراكم سريع للرودامين في ضرب cardiomyocytes في غضون 15 دقيقة على المجهر confocal8.
في هذه المقالة، نقدم منهجيتين متكاملتين يمكن استخدامهما لتتبع التوزيع البيولوجي وتأكيد استيعاب أنواع معينة من أنواع المعالجة بالـ CPPs باستخدام CTP كمثال. لهذه المنهجيات، تم توليف CTP، وصفت الفلورسنت في N-دلفينوس مع سيانين5.5 (CY5.5)، و Amide-توج في سي-دلفينوس لمزيد من الاستقرار الببتيد. والمنهجيتان المستخدمتان هما في نظم التصوير البصرية الفلورية في الجسم الحي والمجهر الفلوري من أقسام الأنسجة. وكلتا الطريقتين مفيدتان جداً في دراسة التوزيع البيولوجي، والإقبال، والقضاء على المصابيح ذات العلامات الفلورية. وميزة تقييم التوزيع البيولوجي باستخدام هذه الأساليب على غيرها، مثل التصوير المقطعي للانبعاثات أحادية الفوتون أو التصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية (PET)، هي أنه ليست هناك حاجة إلى التسمية الإشعاعية الكثيفة التوقيت من كلورابس مقارنة مع وضع العلامات الفلورية، وهو أمر سهل نسبياً وفي الاستخدام الروتيني في جميع مرافق تخليد الببتيد. إن استخدام التصوير في الجسم الحي ينتج بسرعة بيانات توزيع بيولوجي في سياق نظام حي، بينما يوفر القسم معلومات أكثر تعمقاً حول امتصاص الببتيد والتوطين داخل الخلايا عن طريق الحفاظ على التفاصيل المورفولوجية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على مجموعة واسعة من الأعضاء والأنسجة مثل القلب والرئة والكبد والكلى والدماغ والطحال والمعدة والأمعاء الغليظة والأمعاء الدقيقة والعضلات الهيكلية والعظام والخصيتين / المبيضين والعينين.
Protocol
وافقت لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها التابعة لجامعة بيتسبرغ على جميع البروتوكولات الحيوانية المحددة في هذا المنشور قبل إجراء أي من هذه التجارب الحيوانية.
ملاحظة: هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تنفيذ الدراسات السابقة vivo التوزيع البيولوجي باستخدام التصوير الفلوري البصري السابق vivo تليها في دراسات التفاحية الحيوية من خلال تضمين الأجهزة في البارافين، والقسمة، وإجراء المجهر الفلورسنت. على الرغم من استخدام CTP كمثال، يمكن تطبيق هذا الأسلوب على أي الفلورسنت المسمى CPP.
1. في التصوير الحي
- توليف CTP باستخدام تقنيات توليف المرحلة الصلبة9,10 من منشأة تخليق الببتيد باستخدام الأحماض الأمينية L مع N-terminus المسمى مع Cy5.5 و C-ا-هدفينوس-اوسم-توج لزيادة الاستقرار.
ملاحظة: ينبغي أن تتميز جميع اخصاط المعالجة بالطباعة باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) و/أو المصفوفة بمساعدة الليزر desorption/تأين (MALDI) قبل استخدام11. - جعل 1 mM أو 10 mM حل الأسهم من CTP في ثنائيات الكبريت (DMSO)، aliquot، وتخزينها في -80 درجة مئوية، والضوء المحمية.
ملاحظة: يتم تسليم الببتيدات كما مسحوق مبيد. يمكن تخزين مسحوق اللوفيلي على المدى الطويل (6 أشهر-2 سنوات) في -20 درجة مئوية، وحماية الضوء، وتحت ظروف الغشاء المغناطيسي. عندما ali نقلت في DMSO وتخزينها، وينبغي تجنب دورات التجميد ذوبان. - وزن ومجلة 6 أسابيع من العمر CD1 الفئران الإناث باستخدام 2 ميكرولتر / غرام من وزن الأنسجة من محلول الكيتامين / xylazine (100 ملغ / كجم الكيتامين و 20 ملغم / كغ xylazine) تدار في العضل (الساق الخلفية) أو intraperitoneally (أسفل الربع الأيسر).
ملاحظة: يجب أن تكون حلول الكيتامين/الزيلازين طازجة في يوم الاستخدام. وينبغي التخلص من الكيتامين/الزيلازين غير المستخدم بشكل مناسب، كما ينبغي التخلص من الكميات المستخدمة مقابل الكميات التي يتم التخلص منها في سجل، لأن الكيتامين مادة خاضعة للرقابة. وسيتم تحقيق مستوى مناسب من التخدير في 5-7 دقيقة، كما هو مقدر من عدم الاستجابة لقرصة إصبع قدم. - حساب جرعة 10 ملغم / كغ من Cy5.5-CTP، وتمييع مع الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) إلى ما لا يزيد عن 200 ميكرولتر، وحقن إما الرجعية المدارية أو عن طريق حقن الوريد الذيل باستخدام حقنة الأنسولين(الشكل 1ألف).
- السماح الببتيد لتعميم الوقت المحدد، تتراوح بين 15 دقيقة-6 ساعة.
- القتل الرحيم الماوس باستخدام CO2 عالية طريقة استنشاق كما حددتها لجنة الرعاية واستخدام الحيوان المؤسسية وفتح تجويف الصدر باستخدام مقص (الشكل 1B).
- استخدام مقص لوضع صغيرة في الجانبي، جدار حر من الأذين الأيمن وحقن 3 مل من 10٪ buffered الفوسفات باستخدام إبرة 26 G لغرض مزدوج من الضخ تحديد أعضاء الماوس وطرد خلايا الدم الحمراء(الشكل 1ج).
- تشريح القلب والرئة والكبد والكلى والطحال والأمعاء الغليظة والأمعاء الدقيقة والمثانة والمبايض / الخصيتين والدماغ ومكان في الآبار الفردية من 12 لوحة جيدا للتصوير البصري السابقين vivo (الشكل 1D).
- بدء تشغيل برنامج الحصول على الصورة وانقر فوق الزر تهيئة لإعداد النظام للحصول على عينات التصوير. افتح معالج التصوير، حدد الفلوريسنس، ثم زوج التصفية، ثم حدد الصبغة Cy5.5 من قائمة الأصباغ لتطبيق 580 نانومتر وفلاتر الانبعاثات 620 نانومتر. حدد الإعدادات اليدوية لمعلمات التعريض الضوئي ثم قم بتعيين موضع المرحلة إلى B، وقم بتعيين وقت التعريض الضوئي على ثانية واحدة، وتعيين F/stop إلى 8، وتعيين binning إلى صغير.
ملاحظة: تختلف مرشحات الانبعاثات الإثارة تبعاً للتسمية المستخدمة. ويمكن إدخال الإثارة وانبعاث الملصق المستخدم يدويًا لكي يقوم البرنامج بتعيين مرشحات الإثارة والانبعاثات. تأكد من أن العد بين 600-60،000 من أجل تجنب التشبع. اعتماداً على النظام المستخدم، قد يكون التحسين التلقائي للاقتناء متوفراً. إذا كان النظام لديه تعويض لمقارنة الصور المكتسبة مع إعدادات مختلفة، يمكن استخدام الإعدادات التلقائية. إذا لم يتوفر أي تعويض، ستحتاج الإعدادات إلى تحديدها وحفظها واستخدامها بشكل متناسق عبر العينات. - عندما يتم تهيئة النظام بالكامل، وترتيب الأجهزة من مصلحة في لوحة 12 جيدا ووضعها داخل غرفة التصوير البصري، وضمان أن يتم ترتيب العينات حسب الرغبة للصور. حدد الحصول على، ثم حدد موقع حفظ للصور. يمكن كتابة معلومات حول الماوس في الإطار المنبثق لتسميات الصور.
- بعد التصوير، وإزالة العينات من الغرفة وتخزينها في 10٪ buffered الفوسفات في حجم ما لا يقل عن 20 مرة حجم الأنسجة في قوارير التلألؤ مع حماية خفيفة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- كمّي الصور عن طريق تعيين وحدات إلى كفاءة مشع ثم اختيار العائد على الاستثمار 4x3 والتكيف لتناسب كل بئر في مربع واحد من العائد على الاستثمار بالتساوي، تليها النقر على قياس. افتح علامة التبويب قياسات عائد الاستثمار بالشبكة، وحدد التصدير، واحفظ القياسات كملف .cvs.
2. علم الأنسجة
ملاحظة: اتبع الخطوات 1.1−1.8 للحصول على أعضاء مختلفة. بدلا من ذلك، يمكن وضع نفس الأجهزة التي تم تصويرها في الفور و تستخدم للقطع كما هو مفصل أدناه.
- تخزين كل جهاز على حدة في 10% buffered الفوسفات formalin لمدة لا تقل عن 48 ح قبل معالجة الأنسجة.
- عندما تكون الأجهزة ثابتة بما فيه الكفاية بعد 48 ساعة، نقل الأعضاء إلى تجهيز الأنسجة وتضمين الكاسيتات ووضعها في آلة معالجة الأنسجة(الشكل 1هاء).
- تعيين آلة المعالجة لتجفيف الأنسجة في 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة، تليها 80٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة، 95٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة، 95٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة، 100٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة، 100٪ الإيثانول لمدة 20 دقيقة، وأخيرا 100٪ الإيثانول لمدة 20 دقيقة.
- مسح الأنسجة في إكسيلين 2x، مع 30 دقيقة لكل علاج إكسيلين.
- التسلل إلى الأنسجة مسح مع الشمع البارافين 4x في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع كل علاج.
- تضمين في البارافين باستخدام قوالب معدنية. املأ القالب بالبارافين المنصهر (يتم الاحتفاظ به عند 65 درجة مئوية)، ونقله إلى طبق بارد. كما البارافين في الجزء السفلي من القالب يبدأ في ترسيخ، ووضع الجهاز في البارافين (الشكل 1F).
- ضع كاسيتًا يحمل علامة على رأس القالب كدعم وملء مع البارافين المنصهر. السماح لتبرد حتى الصلبة. ثم تخزين كتلة في -20 درجة مئوية الفريزر بين عشية وضحاها، مما يسمح الشمع لتقليص مزيد من أجل إزالة سهلة من القوالب.
ملاحظة: يمكن الآن تخزين الكتل في RT مع حماية خفيفة. - إعداد حمام مائي 38 درجة مئوية مع الماء المقطر. إعداد microtome مع زاوية شفرة من 6 ° وسمك قسم من 10 ميكرومتر.
- جبل كتل الأنسجة في microtome والبدء في قطع حتى يتم الحصول على أقسام تحتوي على الأنسجة. ثم ضع الكتل في وجهها لأسفل في الماء لمدة 5 دقائق أو حتى تمتص الأنسجة بعض الرطوبة (على سبيل المثال ، عندما يظهر مخطط أبيض رفيع للأنسجة في الكتلة [الشكل 1G]).
ملاحظة: يجب استبدال النصل بشكل متكرر لضمان جودة المقاطع. - ضع الأنسجة على كتلة ثلج مسطحة لمدة 10 دقائق، ثم أعيدها إلى الميكراتوم بنفس الاتجاه كما هو الحال في الخطوة 2.9. ابدأ بأخذ المقاطع واسمح للمقاطع المبتورة بأن تشكل أشرطة طويلة تتكون من 6−10 أقسام لكل منها. تجاهل شرائط البارافين دون المستوى الأمثل حتى يتم إنتاج شريط عالي الجودة من الطول الكافي لتغطية شريحة. تحسين القطاعات عن طريق ضبط سرعات القطع، وترطيب الأنسجة، ودرجة حرارة حمام الماء من أجل تجنب القص أو تجعد أقسام الأنسجة.
ملاحظة: يجب التخلص من الأقسام التي تحتوي على ثقوب حيث سقطت الأنسجة أو تمزقات في الأنسجة أو التجاعيد الضيقة والطيات في الأنسجة. - اختيار بعناية الشريط نوعية الاختيار مع ملقط حافة حادة وتعويم على سطح حمام الماء 38 درجة مئوية. دع الأقسام تجلس على السطح حتى تنعيم ، مع الحرص على عدم تركها لفترة طويلة جدًا لمنع البارافين من التفكك وتمزيق القسم.
- تعويم المقاطع المسطحة على سطح الشرائح الزجاجية النظيفة. ضعي الشرائح في فرن 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإذابة الشمع.
ملاحظة: يمكن تخزين هذه الشرائح في RT مع حماية خفيفة. - Deparaffinize الشرائح في إكسيلين 3x، 10 دقيقة لكل علاج.
- 1. إعادة ترطيب الأنسجة في 100% إيثانول لمدة 5 دقائق، تليها 95% الإيثانول لمدة 5 دقائق، 70% الإيثانول لمدة 5 دقائق، 50% الإيثانول لمدة 5 دقائق، وأخيرا 1x tris-bufferline (TBS) لمدة 5 دقائق(الشكل 1H). السماح للشرائح لتجف بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن تخزين هذه الشرائح على المدى الطويل في RT طالما أنها محمية للضوء. - جبل الشرائح مع coverlips باستخدام 125 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام التي تحتوي على 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), مسبار الفلورسنت النووية(الشكل 1I). الشرائح الجافة بين عشية وضحاها في RT، محمية بالضوء.
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح المجففة على المدى الطويل عند 4 درجة مئوية، ومحمية من الضوء. - شرائح الصورة باستخدام المجهر الفلورسنت.
ملاحظة: يجب تجنب الصور المشبعة، لأنها ليست مفيدة كمياً. ضبط التعرض و مكاسب يمكن خفض الإعدادات لتجنب التشبع. الحرص على استخدام نفس الإعدادات عبر العينات التي يتم مقارنتها. تجنب تبييض الأنسجة عن طريق الحد من مرات التعرض.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول، عالجنا ثلاثة فئران بجرعة 10 ملغم/كغ من Cy5.5-CTP من خلال حقنة مدارية(الشكل 1أ). بعد السماح للببتيد لتعميم لمدة 15 دقيقة، تم القتل الرحيم الفئران باستخدام غرفة CO2، فتح الصدر من خلال شق القص المتوسط، تم الأذين الأيمن، والفئران ضخ ثابتة باستخدام 3 مل من 10٪ الفوسفات المخزنة رسميان(الشكل 1B, C). بعد التثبيت، تم تشريح القلب والرئتين والكبد والكلى والطحال والدماغ وترتيبها في لوحة 12 بئرا للتصوير الفلوري البصري السابقين في الجسم الحي(الشكل 1D والشكل 2A). كما تم حقن ثلاثة فئران تحكم بدون حقن، وتشريحها، وصورتها(الشكل 1B−D والشكل 2B). ويمكن مقارنة بيانات الفلوريسنس المكتسبة لكل مجموعة من الأعضاء بسبب التحويلات إلى كفاءة إشعاعية، وهي وحدة الفلورسنسي النسبية لبرنامج التصوير. ويمكن قياس هذه البيانات كمياً لتسفر عن صور نوعية وبيانات كمية لكل جهاز موضع البحث(الشكل 2ج)عبر نقاط زمنية مختلفة لدراسات التوزيع البيولوجي. يظهر الflufluorescence من مختلف الأجهزة استجابة لأطوال موجية مختلفة في الشكل 3A−E. إن الأطوال الموجية الأقصر، مثل بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP)، ترتبط بارتفاع الفلوروس، خاصة في الكبد والدماغ، مقارنة بأطوال الموجات الموجية (Cy5.5) أو الأشعة تحت الحمراء القريبة (Cy7)(الشكل 3). تم إصلاح الأجهزة المصورة في 10٪ الفوسفات buffered formalin في RT لمدة لا تقل عن 48 ساعة، تليها نقل إلى تجهيز الأنسجة وتضمين الكاسيتات (الشكل 1E). تمت معالجة الأجهزة وparffinized في آلة معالجة الأنسجة، وضعت في قوالب مليئة البارافين، المجمدة على مرحلة -20 درجة مئوية، وتخزينها بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية(الشكل 1F). تم تقسيم العينات(الشكل 1G) وتم التعامل معها مع تبادلات الحل لإعادة هيدرات الأنسجة (الشكل 1حاء). ثم شنت الشرائح المعدة مع DAPI الفلورسنت تصاعد المتوسطة(الشكل 1I). مرة واحدة جافة، وعادة ما تكون بين عشية وضحاها، تم تصوير الشرائح باستخدام المجهر الفلورسنت. تظهر الصور التمثيلية لكل جهاز من فأرة في الشكل 4A. تم الحصول على الصور من مختلف الأجهزة باستخدام إعدادات متطابقة للسماح للمقارنة عبر الفئران، والسماح لتحديد كمي (الشكل 4B).
الشكل 1: حصاد أعضاء الماوس للتصوير الفلوري البصري السابق vivo والقطع. (أ)الماوس نوع البرية حقن الرجعية المدارية مع CTP-Cy5.5. (B) ماوس تشريح مع فتح الصدر، الحق الأذين مقصوصة، لتثبيت الضخ. (C) القلب حقن مع 3 مل من 10٪ buffered الفوسفات الفورفورمين لتثبيت perfusion من الحيوان. (د)أعضاء ذات فائدة حصادها وترتيبها في 12 بئر للتصوير البصري الفلورسنت. (E) القلب محملة في كاسيت ومعالجتها باستخدام معالج الأنسجة. (F) القلب جزءا لا يتجزأ من البارافين. (G) القلب مقطعة على microtome. (H) الشرائح deparaffinized من خلال سلسلة من التبادلات الحلول. (I) مقاطع مثبتة مع أغطية باستخدام DAPI. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور تمثيلية من الأجهزة المعالجة والتحكم. (أ)أجهزة من فأر تعامل مع 10 ملغم / كغ CTP-Cy5.5. (ب) أجهزة من فأر تحكم غير معالج. C)القياس الكمي للفلورس لكل مجموعة من الأعضاء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أجهزة الماوس غير المعالجة التي تُصوَّر في أطوال موجية مختلفة لانبعاثات الإثارة لإثبات مدى طول الموجات تنتج قدراً أقل من الفلورا التلقائية. (أ) Cy7: 740−790. (ب) Cy5.5: 660−710. (C) Cy5: 620−670. (د) Cy3: 520−570. (E) EGFP: 480−520. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نقل القلب والرئة والكبد والكلى بعد الحقن الوريدي في الفئران. تم حقن الفئران من النوع البري مع 10 ملغ / كجم من Cy5.5-CTP، أو ببتيد عشوائي (RAN-Cy5.5)، والقتل الرحيم في النقاط الزمنية المشار إليها. (أ)شهدت ذروة نقل أنسجة القلب في 15 دقيقة مع انخفاض مطرد في الفلوريسنس مع مرور الوقت. ولوحظ امتصاص بعض الشعيرات الدموية في الرئتين مع تحويل قوية في الكبد وكذلك في الشعيرات الدموية الكبيات في الكلى, وهذا الأخير يعني آلية الكلى من إفراز. (ب)يظهر القياس الكمي لكثافة الفلورسنت زيادة كبيرة في امتصاص القلب من CTP-Cy5.5 على RAN-Cy5.5. شريط مقياس = 500 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من الزاهد وآخرون8. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
النماذج الحيوانية ضرورية لتطوير المخدرات قبل الإكلينيكية في كل مرحلة من مراحل العملية من تحديد رواية CPPs، دراسات التوزيع البيولوجي، آلية النقل، لاختبار في نهاية المطاف لفعالية البضائع تسليم باستخدام هذه CPPs رواية كمواقل. هناك العديد من الطرق المستخدمة عادة المتاحة لتقييم التوزيع البيولوجي مثل علم الأنسجة والتصوير الطب النووي (SPECT وPET) ، والتصوير البصري في الجسم الحي12. يمكن أن تكون أساليب التصوير النووي مرهقة بسبب محدودية توافر أنظمة SPECT الحيوانية الصغيرة وPET ، وكذلك القدرة على إنتاج مترافقات من المخدرات المشعة ، والتي تتطلب خبرة أخصائي كيمياء الراديو. في المقابل، تسميات الفلورسنت هي أبسط بكثير ويمكن أن تكون فعالة من حيث التكلفة للعمل مع. ويسمح البروتوكول الوارد وصفه في هذه الورقة بتحليل سريع لdisdistributioned البيولوجي باستخدام أساليب متعددة. السابقين فيفو كامل الجهاز التصوير البصري fluorescent يسمح للمقارنة الفورية من الفلوريسنس عبر الأنسجة المختلفة ومجموعات العلاج ويمكن تحديد امتصاص الجهاز والوقت لأقصى امتصاص في الجهاز من مصلحة بطريقة شبه بيانية. الأنسجة الكمية الأنسجة يتطلب معالجة أكثر شمولا لعلاج، قسم، صورة، وتحليل الأنسجة، لكنه يوفر المزيد من البيانات على المستوى المجهري، وهو تقنية قياسية الحالية. ومن الجدير بالذكر أن نلاحظ أن مباشرة، مقارنة كمية عبر اثنين من التقنيات غير ممكن، لأن autofluorescence ينظر مع كل تقنية لمختلف الأعضاء وأطوال موجية الإثارة يختلف اختلافا كبيرا.
جزء مهم من هذا البروتوكول هو اختيار الفلوروفور المناسب لتسمية CPPs المرشحة للتجارب. وإحدى القضايا المحتملة هي تداخل الأطياف، الذي يمكن أن يكون إشكالياً عندما تكون هناك حاجة إلى عدة فلوريات. لا تحتوي وسائط الفلورسنت DAPI على الفلورسنت و Cy5.5 على أطياف متداخلة. ومع ذلك، بالنسبة لبعض التطبيقات التي تحتاج إلى عدة فلوريات، يجب النظر بعناية في خطر التداخل الطيفي. وقد يكون اختيار الفلوروفور محدوداً، حسب النظام المستخدم. ولذلك، فإن معرفة قدرات النظام أمر أساسي. أفضل استخدام الأنظمة البصرية الفلورية مع الفلوروفورات الحمراء أو القريبة من الأشعة تحت الحمراء بسبب امتصاص الأنسجة العالية للأطوال الموجية الأقصر13. الفلوروفور في مجموعة من البروتين الفلورسنت الخضراء المعززة لها قيود كبيرة، لأن هناك فلورة الجهاز كبيرة ينظر في الطول الموجي الإثارة، وتحديدا في أنسجة الدماغ والكبد. اعتمادا على ظروف التجربة، يتم تجنب بعض الفلوروفورات أفضل. بعض الفلوروفورات العضوية القابلة للذوبان في الماء لديها تفاعل قوي مع ثنائيات الدهون ، والتي يمكن أن تسبب إيجابيات كاذبة. وبالتالي ، فإن اتخاذ خطوات لتحديد ما إذا كان الفلوروهور له صلة قوية مع الأنسجة ذات الاهتمام هو المستحسن14. وثمة عامل آخر يجب مراعاته هو اختيار الطريقة المناسبة لتقارن الفلوروفور، والتي يمكن أن تكون معلمة هامة تؤثر على النتائج. يمكن تسمية CPPs بالفلورسنت في N- أو C-terminus من خلال رابطة تساهم بين N-terminus من الببتيد ومجموعة الكربوكسيل من الصبغة مثل Cy5.5-NHS. وينبغي توخي الحذر، لأن آلية نقل معظم الملوثات المكلّية غير مفهومة بالتفصيل، وقد يؤثر التقارن في أحد طرفيه على آلية الاستيعاب أكثر مما تؤثر عليه في الطرف الآخر. وهناك احتمال آخر لوضع العلامات CPPs من خلال biotinylating N-terminus لتقارن إلى الفلورسنت المسمى streptavidin. باستخدام هذه الاستراتيجية لديه راحة للسماح مختلف الفلورسنت streptavidin conjugates لاستخدامها. ومع ذلك، فإن أحد القيود المحتملة على هذه الاستراتيجية هو أن مركب البيوتين-streptavidin هو بناء كبير، والتي يمكن أن تتداخل مع النقل.
أنظمة التصوير البصري الفلورسنت هي استراتيجية فعالة لتوليد مقارنة الفلوريسانس عبر مختلف الأجهزة والعلاجات بكفاءة ولكنها غير قادرة على إنتاج قياس كمي من التركيزات المطلقة في الأنسجة. ويرجع ذلك إلى آثار تشتت الضوء داخل الأنسجة ، والتي تتفاقم بسبب التنوع الطبيعي في أحجام الأنسجة وكثافاتها ، والاختلافات في الأوعية الدموية ، مع تشتت الفلورانس المتغير. يمكن أن تكون الأنسجة autofluorescence عاملا كذلك، وذلك بسبب مصادر كيميائية حيوية تحدث بشكل طبيعي مثل الكولاجين، أو المصادر الغذائية مثل الكلورو في الغذاء13.
النسيج هو الأسلوب الأكثر شيوعا لقياس التوزيع البيولوجي ويمكن أن تستخدم لقياس بدقة ومقارنة امتصاص عبر الأنسجة المختلفة مع مرور الوقت. يتم تجنب قضايا تشتت الضوء باستخدام هذه الطريقة لأن جميع الأنسجة يتم تقسيمها إلى نفس سمك15. ميزة رئيسية من هذه الطريقة هي القدرة على تضمين تسميات الفلورسنت إضافية postsectioning للكيمياء المناعية. على الرغم من أن إضافة فلورية أخرى يمكن أن تجعل التصوير أكثر تحديًا ، فإن استخدام تسميات الفلورسنت يمكن أن يكون مفيدًا لتوطين CPP إلى مقصورات معينة داخل الخلايا ، مثل الليسوسومات أو الميتوكوندريا. ويمكن استخدام جسم مضاد في تجربة مجهرية مجهرية عابرة لتحديد ما إذا كان المرشح المتحول لـ CPP يُستخدم في حوسبة هيكل الاهتمام ، والذي يمكن أن يظهر إمكانات CPP كعامل توصيل. أحد القيود على هذه الطريقة هو أن إعداد الشرائح من عينات الأعضاء يمكن أن يكون مضيعة للوقت ، كثيفة العمالة ، وعرضة للخطأ البشري12،15. عند عرض شرائح التصوير، يجب الحرص على عدم تصوير نفس الموقع لفترة طويلة جدًا لتجنب التحسس الضوئي. بعض الاحتراق الضوئي سيكون حتميًا ، اعتمادًا على حساسية الفلوروفور. وينبغي توخي الحذر في كل خطوة من هذا البروتوكول لحماية العينات من الضوء المحيط وتخزينها بشكل صحيح16. نوصي بتخزين الشرائح في 4 درجة مئوية، محمية بالضوء، للتصوير في المستقبل.
هناك مجموعة متنوعة من الأساليب المتاحة لقياس التوزيع البيولوجي لمرشح حزب الشعب الكمبودي التي تتطلب معدات متخصصة ويمكن أن تسفر عن نتائج مماثلة، على الرغم من أنها قد تتطلب وضع علامات أكثر تعقيدا من حزب الشعب الكمبودي. يستخدم البروتوكول الموصوف في هذه الورقة طريقتين متوافقتين لإنتاج بيانات التوزيع البيولوجي بكفاءة في سياق نظام حي مع السماح بالحصول على معلومات أكثر تعمقاً حول استيعاب الببتيد داخل الخلايا من نفس العينة، وبالتالي خفض عدد الحيوانات اللازمة للدراسة بمقدار النصف. وقد استخدمت هذه الأساليب لتوليد البيانات المذكورة أعلاه، والتي تبين أنه يمكن استخدام كلا الأسلوبين بالتتابع في نفس الحيوان، ونوعية البيانات التي يولدها كل منهما. كما تسلط نتائجنا الضوء على عدم القدرة على الربط المباشر بين النتائج بين التقنيتين بطريقة كمية.
Disclosures
M.Z. وبول د. روبنز (جامعة مينيسوتا، مينيسوتا، MN، الولايات المتحدة الأمريكية) عقد براءة اختراع على استخدام الببتيد استهداف القلب باعتباره ناقل القلب (مجال استهداف البروتين خاص بالقلب، الولايات المتحدة براءات الاختراع رقم المسلسل 9،249،184). كما يشغل M.Z. منصب كبير المسؤولين العلميين، وهو عضو في مجلس إدارة شركة Vivasc Therapeutics Inc. الناشئة، كما أنه يمتلك أسهمًا كبيرة في المستقبل فيها.
Acknowledgments
M.Z. وK.S.F. مدعومة من قبل جمعية القلب الأمريكية جائزة تطوير العلماء 17SDG33411180، ومنحة قدمت في إطار تحدي الابتكار بيت (PInCh®)، من خلال معهد العلوم السريرية والترجمة في جامعة بيتسبرغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
