Summary
Vi beskriver protokoller til vurdering af graden af transduktion ved celle-gennemtrængende peptider udnytte ex vivo billeddannelse systemer efterfulgt af paraffin indlejring,sektion, og konfokal fluorescerende mikroskopi ved hjælp af hjerte-målretning peptid som et eksempel. I vores protokol kan et enkelt dyr bruges til at erhverve begge typer billeddiagnostisk vurdering af de samme organer og derved halvere antallet af dyr, der er nødvendige til undersøgelser.
Abstract
Siden den oprindelige beskrivelse af proteintransduktion domæner, også kendt som celle gennemtrængende peptider, over 25 år siden, har der været intens interesse i at udvikle disse peptider, især celle-specifikke dem, som nye vektorer til at levere diagnostiske og terapeutiske materialer. Vores tidligere arbejde med fagdisplay identificeret en roman, nonnaturally forekommende, 12 aminosyre-lange peptid, som vi kaldte hjerte målretning peptid (CTP) på grund af sin evne til at transduce normale hjertevæv in vivo med peak uptake set i så lidt som 15 min efter en intravenøs injektion. Vi har foretaget detaljerede biodistribution undersøgelser ved at injicere CTP mærket med fluorophore cyanin5.5, gør det muligt at cirkulere i forskellige perioder, og euthanizing, fastsættelse, og cirkulation flere organer efterfulgt af fluorescerende mikroskopi billeddannelse. I denne publikation beskriver vi disse processer samt ex vivo billeddannelse af høstede organer ved hjælp af et in vivo billeddannelsessystem i detaljer. Vi leverer detaljerede metoder og praksis for udførelse af transduktion samt biodistribution undersøgelser ved hjælp af CTP som et eksempel.
Introduction
Cellplasmamembranen er en semipermeabel barriere, der er afgørende for celleintegritet og overlevelse og tjener til at regulere cellens indre ved at kontrollere bevægelsen af stoffer ind i cellen. Selv om afgørende for overlevelse, det præsenterer også en barriere for levering af gods til cellen. I 1988 viste transaktiveringen af transskriptionsprotein (Tat) af humant immundefektvirus sig at komme ind i dyrkede celler og fremme virale genekspression1,2, med de domæner, der er ansvarlige for denne transduktion begrænset til en arginin og lysin rig 13-aminosyre region af tredje helix3 Disse blev således navngivet celle gennemtrængende peptider (CPPs). Dette blev efterfulgt af forskning, der viste Tatpeptids evne til at bære funktionel β-galactosidase i flere celletyper4. Siden den oprindelige beskrivelse er antallet af cellegennemtrængende peptider steget dramatisk. Disse transduktionsdomæner er naturligt forekommende eller syntetiske korte peptider, typisk 6−20 aminosyrer lange, som er i stand til at bære funktionelle laster på tværs af cellemembraner. Disse laster kan variere fra andre små peptider, fuld-længde proteiner, nukleinsyrer, nanopartikler, virale partikler, fluorescerende molekyler, og radioisotoper5. De første CPPs beskrevet var ikke celle specifikke, med Tat bliver taget op af flere celletyper og endda krydser blod - hjerne barrieren4,og dermed begrænse dens terapeutiske potentiale. For at identificere cellespecifikke CPP'er har efterforskere foretaget fagvisning ved hjælp af store, kommercielt tilgængelige fagbiblioteker6. Vores eget arbejde ved hjælp af en kombinatorisk in vitro og in vivo display metode førte til identifikation af en CPP opkaldt hjerte målretning peptid (CTP)7, en 12-aminosyre, nonnaturalt forekommende peptid (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH), der er rettet mod hjertet med maksimal optagelse på 15 min efter en intra perifervenøs injektion8. Ved hjælp af immunfluorescerende colocalization med actin, en intracellulær markør, og udelukkelse af laminin, en cellemembran markør, vi viste, at CTP er internaliseret i mus kardiomyocytter efter en intravenøs injektion7. Derudover inkuberede vi humant induceret pluripotente stamceller-afledte slå kardiomyocytter med dobbelt-mærket CTP, mærket med 6-carboxyfluorescein på sin C-endestation og rhodamin på sin N-endeinus gennem en ester kobling, der kun kunne kløves ud af intracellulære esterases. Hurtig ophobning af rhodamin til at slå kardiomyocytter blev observeret inden for 15 min på konfokal mikroskopi8.
I denne artikel præsenterer vi to gratis metoder, der kan bruges til at spore biodistribution og bekræfte vævsspecifik internalisering af CPPs ved hjælp af CTP som et eksempel. For disse metoder blev CTP syntetiseret, fluorescerende mærket ved N-endestationen med cyanin5.5 (CY5.5) og midt i C-endestationen for større peptidsstabilitet. De to anvendte metoder er in vivo fluorescerende optiskbilleddannelsessystemer og fluorescerende mikroskopi af vævssektioner. Begge metoder er meget nyttige i at studere biodistribution, optagelse, og fjernelse af fluorescerende mærket CPPs. Fordelen ved at vurdere biodistribution ved hjælp af disse metoder i forhold til andre, såsom enkeltfoton emissionstomografi (SPECT) eller positronemissionstomografi (PET), er, at der ikke er behov for tidskrævende radiomærkning af CPP'er sammenlignet med fluorescerende mærkning, som er forholdsvis let og rutinemæssig brug på alle peptidsynteseanlæg. Brugen af in vivo-billedbehandling producerer hurtigt biodistributionsdata i forbindelse med et levende system, mens opdeling giver mere dybdegående information om peptidoptagelse og lokalisering i celler via bevarelse af morfologiske detaljer. Denne protokol kan anvendes på en bred vifte af organer og væv såsom hjerte, lunge, lever, nyre, hjerne, milt, mave, tyktarm, tyndtarmen, skeletmuskulatur, knogle, testikler / æggestokke, og øjne.
Protocol
University of Pittsburgh's Institutional Animal Care and Use Committee godkendt alle dyr protokoller, der er angivet i denne publikation forud for udførelsen af nogen af disse dyreforsøg.
BEMÆRK: Denne protokol beskriver, hvordan man udfører ex vivo biodistribution undersøgelser udnytte ex vivo optisk fluorescerende billeddannelse efterfulgt af in vivo biodistribution undersøgelser ved at indlejre organer i paraffin, sektion, og udføre fluorescerende mikroskopi. Selvom CTP bruges som eksempel, kan denne metode anvendes på alle fluorescerende mærker CPP.
1. In vivo billedbehandling
- Syntetisere CTP ved hjælp af solid fase syntese teknikker9,10 fra et peptid syntese facilitet ved hjælp af L-aminosyrer med en N-endestation mærket med Cy5.5 og C-endestation amide-capped for øget stabilitet.
BEMÆRK: Alle syntetiserede CPP'er skal karakteriseres ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC) og/eller matrixassisteret laserdesorption/ionisering (MALDI) før brug11. - Der fremstilles en 1 mM- eller 10 mM-stamopløsning af CTP i dimethylsulfoxid (DMSO), aliquot, og opbevares ved -80 °C, lysbeskyttet.
BEMÆRK: Peptider leveres som frysetørret pulver. Lyophilized pulver kan opbevares på lang sigt (6 måneder-2 år) i -20 °C, lys-beskyttet, og under hygroskopisk forhold. Når der er foretaget en prøve i DMSO og opbevares, bør fryse-tø cyklusser undgås. - Afvejes og anesthetize 6 uger gamle CD1 hunmus med 2 μL/g vævsvægt af en ketamin/xylazinopløsning (100 mg/kg ketamin og 20 mg/kg xylazin) administreret intramuskulært (hind ben) eller intraperitonealt (nederste venstre kvadrant).
BEMÆRK: Ketamin/xylazinopløsninger skal gøres friske på brugsdagen. Ubrugt ketamin/xylazin skal bortskaffes på passende vis, og de anvendte mængder i forhold til de mængder, der er kasseret i en logbog, da ketamin er et kontrolleret stof. Der vil blive opnået tilstrækkeligt anæstesiniveau på 5-7 min., som vurderet ved manglende respons på en tåspids. - Der beregnes en dosis cy5,5-CTP på 10 mg/kg, fortyndes med fosfatbufferet saltvand (PBS) til højst 200 μL, og der injiceres enten retro-orbitally eller gennem haleveneinjektion ved hjælp af en insulinsprøjte (Figur 1A).
- Lad peptidet cirkulere i den forudforeskrivede tid, fra 15 min-6 timer.
- Aflive musen ved hjælp af den høje CO2-inhalationsmetode som angivet af udvalget for behandling og anvendelse af institutioner, og åbn brysthulen ved hjælp af en saks (Figur 1B).
- Brug en saks til at placere et lille hak i den laterale, frie væg i højre atrium og injicere 3 ml 10% buffered formalinphosphat ved hjælp af en 26 G nål med det dobbelte formål at perfusion fastsættelse organer musen og skylle ud røde blodlegemer (Figur 1C).
- Dissekere ud hjerte, lunge, lever, nyrer, milt, tyktarm, tyndtarme, blære, æggestokke / testikler, og hjernen og sted i individuelle brønde af en 12 brønd plade til ex vivo optisk billeddannelse (Figur 1D).
- Start software til hentning af billede, og klik på knappen Initialiser for at forberede systemet til billedprøver. Åbn den billeddiagnostiske guide, vælg fluorescens, og filtrer derefter parret, og vælg derefter Cy5.5-farvestoffet på listen over farvestoffer for at anvende 580 nm excitation og 620 nm emissionsfiltre. Vælg manuelle indstillinger for eksponeringsparametre, og angiv derefter fasepositionen til B, indstil eksponeringstiden til 1 sekund, indstil F/stop til 8, og indstil placeringen til lille.
BEMÆRK: Excitationsemissionsfiltrene varierer afhængigt af den anvendte etiket. Excitation og emission af den anvendte etiket kan indtastes manuelt for softwaren til at tildele excitation og emission filtre. Sørg for, at optællingerne er mellem 600-60.000 for at undgå mætning. Afhængigt af det anvendte system kan automatisk optimering af anskaffelse være tilgængelig. Hvis systemet har kompensation for at sammenligne billeder, der er anskaffet med forskellige indstillinger, kan de automatiske indstillinger bruges. Hvis der ikke er nogen kompensation tilgængelig, skal indstillingerne bestemmes, gemmes og bruges konsekvent på tværs af prøver. - Når systemet er fuldstændig initialiseret, arrangere organer af interesse i en 12 brønd plade og placere den inde i den optiske billeddannelse kammer, sikre, at prøverne er arrangeret som ønsket for billederne. Vælg hent, og vælg derefter en lagringsplacering for billederne. Oplysninger om musen kan skrives ind i pop op-vinduet med redigeringsbillednavne.
- Efter billeddannelse fjernes prøverne fra kammeret og opbevares i 10 % formalinphosphat i et volumen, der er mindst 20 gange større end vævsvolumenet i scintillationshætteglas med lysbeskyttelse ved stuetemperatur (RT).
- Kvantificer billederne ved at indstille enheder til Radiant Efficiency og derefter vælge 4x3 ROI og justere til at passe hver godt ind i et kvadrat af investeringsafkastet jævnt, efterfulgt af at klikke foranstaltning. Åbn fanen målinger af gitterafkastet, vælg eksportér, og gem målingerne som en .cvs-fil.
2. Histologi
BEMÆRK: Følg trin 1.1−1.8 for at få forskellige organer. Alternativt kan de samme organer, der blev afbildet placeres i formalin straks og bruges til stregning som beskrevet nedenfor.
- Opbevar hvert organ individuelt i 10% buffered formalinphosphat i mindst 48 timer før behandling for histologi.
- Når organerne er tilstrækkeligt fastgjort efter 48 timer, overføres organerne til vævsbehandling og indlejring af kassetter og anbringes i en vævsbehandlingsmaskine (figur 1E).
- Indstil forarbejdningsmaskinen til at dehydrere vævet i 70% ethanol i 30 min, efterfulgt af 80% ethanol i 30 min, 95% ethanol i 30 min, 95% ethanol i 30 min, 100% ethanol i 15 min, 100% ethanol i 20 min, og endelig 100% ethanol i 20 min.
- Fjern vævet i xylen 2x, med 30 min for hver xylen behandling.
- Infiltrere det rensede væv med paraffin 4x ved 60 °C i 30 min. ved hver behandling.
- Integrer i paraffin ved hjælp af metal forme. Fyld formen med smeltet paraffin (holdes ved 65 °C), og overføres til en kold plade. Da paraffin i bunden af formen begynder at størkne, placere organet i paraffin (Figur 1F).
- Placer en mærket kassette på toppen af formen som en opbakning og overfylde med smeltet paraffin. Lad det køle af, indtil det er fast. Opbevar derefter blokken i en -20 °C fryser natten over, så voks til at skrumpe yderligere for nem fjernelse fra formene.
BEMÆRK: Blokkene kan nu opbevares på RT med lysbeskyttelse. - Der tilberedes et 38 °C-vandbad med destilleret vand. Opsæt mikrotomen med en klingevinkel på 6° og en sektionstykkelse på 10 μm.
- Monter vævsblokkene i mikrotomen, og begynd at skære, indtil der opnås vævssektioner. Anbring derefter blokkene med forsiden nedad i vandet i 5 min, eller indtil vævet har absorberet noget fugt (f.eks. når der vises en tynd hvid kontur af vævet i blokken [Figur 1G]).
BEMÆRK: Klingen skal udskiftes hyppigt for at sikre kvaliteten af sektionerne. - Placer vævet på en flad isblok i 10 min., og sæt det derefter tilbage til mikrotomen i samme retning som i trin 2.9. Begynd at tage sektioner, og tillad afkortede sektioner at danne lange bånd på 6−10 sektioner hver. Kassér suboptimale paraffinbånd, indtil der produceres et bånd af høj kvalitet af tilstrækkelig længde til at dække et dias. Optimer sektionen ved at justere skærehastigheder, væv fugtgivende, og vandbad temperatur for at undgå klipning eller rynker af væv sektioner.
BEMÆRK: Sektioner, der har huller, hvor vævet faldt ud, flænger i vævet eller stramme rynker og folder i vævet skal kasseres. - Vælg forsigtigt det foretrukne kvalitetsbånd med stump kant pincet og flyde på overfladen af 38 °C vandbad. Lad sektionerne sidde på overfladen, indtil de glatte ud, passe på ikke at forlade dem for længe for at forhindre paraffin i at opløse og rive afsnittet fra hinanden.
- Flyd de flade sektioner på overfladen af rene glasrutsjebaner. Objektglassene anbringes i en 65 °C ovn i 30 minutter for at smelte voksen.
BEMÆRK: Disse dias kan opbevares på RT med lysbeskyttelse. - Deparaffinize dias i xylen 3x, 10 min for hver behandling.
- Rehydrer vævet i 100% ethanol i 5 min, efterfulgt af 95% ethanol i 5 min, 70% ethanol i 5 min, 50% ethanol i 5 min, og endelig 1x tris-buffered saltvand (TBS) i 5 min (Figur 1H). Lad objektglassene tørre natten over.
BEMÆRK: Disse dias kan opbevares på lang sigt på RT, så længe de er lysbeskyttede. - Objektglassene monteres med dækslip ved hjælp af 125 μL monteringsmedier indeholdende 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), en nuklear fluorescerende sonde (Figur 1I). Tørre dias natten over på RT, lysbeskyttet.
BEMÆRK: Tørrede objektglas kan opbevares på lang sigt ved 4 °C, lysbeskyttet. - Billeddias ved hjælp af fluorescerende mikroskopi.
BEMÆRK: Mættede billeder bør undgås, da de ikke er kvantitativt nyttige. Justering af eksponerings- og forstærkningsindstillingerne kan sænkes for at undgå mætning. Vær forsigtig med at bruge de samme indstillinger på tværs af de prøver, der sammenlignes. Undgå blegning af vævet ved at begrænse eksponeringstiden.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol behandlede vi tre mus med en dosis på 10 mg/kg Cy5.5-CTP gennem en retro-orbital injektion (Figur 1A). Efter at peptidet havde kunnet cirkulere i 15 minutter, blev musene aflivet ved hjælp af et CO2-kammer, brystet åbnede sig gennem et median sternotomy-snit, højre atrium blev hugget, og musperfusionen fikseret med 3 ml 10% fosfatbufferet formalin (Figur 1B,C). Efter fiksering blev hjerte, lunger, lever, nyre, milt og hjerne dissekeret ud og anbragt i en 12 brøndplade til ex vivo optisk fluorescerende billeddannelse (Figur 1D og Figur 2A). Tre kontrolmus uden injektioner blev også perfunderet, dissekeret og afbildet (Figur 1B−D og figur 2B). De fluorescensdata, der er erhvervet for hvert sæt organer, kan sammenlignes på grund af de tal, der omdannes til stråleeffektivitet, billedsoftwarens relative fluorescensenhed. Disse data kan kvantificeres for at give både kvalitative billeder og kvantitative data for hvert af de pågældende organer (figur 2C) på tværs af forskellige tidspunkter for biodistributionsundersøgelser. Autofluorescensen hos forskellige organer som reaktion på forskellige excitationsbølgelængder er vist i figur 3A−E. Kortere excitation bølgelængder, såsom øget grøn fluorescerende protein (EGFP), er forbundet med højere autofluorescens, især i lever og hjerne, end langt-rød (Cy5.5) eller i nærheden af infrarød (Cy7) excitation bølgelængder (Figur 3). De afbildede organer blev fastsat i 10% fosfat buffered formalin ved RT i mindst 48 timer, efterfulgt af en overførsel til vævsbehandling og indlejring kassetter (Figur 1E). Organerne blev behandlet og paraffiniseret i en vævsbehandling maskine, placeret i forme fyldt med paraffin, frosset på en -20 °C fase, og opbevares natten over ved -20 °C (Figur 1F). Prøverne blev opdelt (figur 1G) og behandlet med opløsningsudvekslinger for at rehydrere vævet (figur 1H). De forberedte dias blev derefter monteret med DAPI fluorescerende monteringsmedium (Figur 1I). Når tør, normalt natten over, dias blev afbildet ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Repræsentative billeder af hvert organ fra en mus er vist i figur 4A. Billederne fra forskellige organer blev erhvervet ved hjælp af identiske indstillinger for at gøre det muligt at sammenligne på tværs af mus og for at gøre det muligt at kvantificere (figur 4B).
Figur 1: Høst af museorganer til optisk fluorescerende billeddannelse og sektion. (A) Vild type mus injiceres retro-orbitally med CTP-Cy5.5. (B) Mus dissekeret med brystet åbnet, højre atrium snipped, for perfusion fiksering. (C) Hjerte injiceret med 3 ml 10% buffered formalinphosphat til perfusionsfiksering af dyret. (D)Organer af interesse høstet og anbragt i en 12 brønd plade til fluorescerende optisk billeddannelse. (E) Hjerte læsset i en kassette og behandles ved hjælp af en væv processor. (F) Hjerte indlejret i paraffin. (G) Hjerte sektionsopdelt på en mikrotom. (H) Slides deparaffiniseret gennem en række løsning udvekslinger. (I) Sektioner monteret med coverslips ved hjælp af DAPI. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder fra behandlede organer og kontrolorganer. (A) Organer fra en mus behandlet med 10 mg/kg CTP-Cy5.5. (B) Organer fra en ubehandlet kontrol mus. cC) Kvantificering af fluorescens for hvert organsæt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ubehandlede museorganer afbildet ved forskellige excitation emission bølgelængder for at vise, hvordan længere bølgelængder producere mindre autofluorescens. (A) Cy7: 740−790. (B) Cy5.5: 660−710. (C) Cy5: 620−670. (D) Cy3: 520−570. e) EGFP: 480−520. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Transduktion af hjerte, lunge, lever og nyre efter intravenøs injektion hos mus. Vilde mus blev injiceret med 10 mg/kg Cy5.5-CTP eller et tilfældigt peptid (RAN-Cy5.5) og aflivet på de angivne tidspunkter. (A) Peak transduction af hjertevæv blev set på 15 min med støt fald i fluorescens over tid. Nogle kapillær optagelse blev bemærket i lungerne med robust transduktion i leveren samt på nyre glomerular kapillærer, sidstnævnte indebærer en nyre-mekanisme af udskillelse. (B) Kvantificering af fluorescerende intensitet viser signifikant øget optagelse af hjerteoptagelse af CTP-Cy5.5 i forhold til RAN-Cy5.5. Vægtstang = 500 μm. Dette tal er blevet ændret fra Zahid et al.8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dyremodeller er afgørende for præklinisk udvikling af lægemidler i alle faser af processen fra identifikation af nye CPP'er, biodistributionsundersøgelser, transduktionsmekanisme til i sidste ende test for effekten af den leverede last ved hjælp af disse nye CPP'er som vektorer. Der er mange almindeligt anvendte metoder til rådighed til at vurdere biodistribution såsom histologi, nuklearmedicin imaging (SPECT og PET), og in vivo optisk billeddannelse12. Nukleare billeddannelsesmetoder kan være besværlige på grund af den begrænsede tilgængelighed af små SPECT- og PET-systemer samt evnen til at producere radiomærke-lægemiddelkonjugater, som kræver ekspertise fra en radiokemiker. I modsætning hertil er fluorescerende etiketter meget enklere og kan være omkostningseffektive at arbejde med. Den protokol, der er beskrevet i dette papir giver mulighed for hurtig analyse af biodistribution ved hjælp af flere metoder. Ex vivo hele organ fluorescerende optisk billeddannelse giver mulighed for øjeblikkelig sammenligning af fluorescens på tværs af forskellige væv og behandlingsgrupper og kan identificere organoptagelse og tid til at toppe optagelse i organ af interesse i en semiquantitativ måde. Kvantitativ væv histologi kræver mere omfattende behandling til behandling, sektion, billede, og analysere væv, men det giver flere data om mikroskopisk niveau og er en aktuel standard teknik. Det er værd at bemærke, at direkte, kvantitativ sammenligning på tværs af de to teknikker ikke er mulig, fordi autofluorescens set med hver teknik for forskellige organer og excitation bølgelængder varierer betydeligt.
En vigtig del af denne protokol er at vælge den rigtige fluorophore til at mærke kandidat-CPP'er til eksperimenter. Et potentielt problem er spektreoverlapning, som kan være problematisk, når der er behov for flere fluorophores. DAPI fluorescerende monteringsmedier og Cy5.5 har ikke overlappende spektre. For visse anvendelser, hvor der er behov for flere fluorophores, skal risikoen for spektral overlapning dog overvejes nøje. Afhængigt af det anvendte system kan valget af fluoror være begrænset. Derfor er viden om systemets evner nøglen. Fluorescerende optiske systemer udnyttes bedst med langt-røde eller nær-infrarøde fluororer på grund af den høje vævsabsorption af kortere bølgelængder13. Fluorophores i rækken af forbedrede grønne fluorescerende protein har en stor begrænsning, fordi der er betydelig organ autofluorescens ses på sin excitation bølgelængde, specielt i hjernen og levervæv. Afhængigt af betingelserne for et eksperiment, nogle fluorophores er bedst undgås. Nogle vandopløselige organiske fluorophores har en stærk interaktion med lipid tolag, som kan forårsage falske positiver. Derfor tager skridt til at afgøre, om en fluorophore har stærk affinitet til væv af interesse er tilrådeligt14. En anden faktor, der skal overvejes, er at vælge den relevante metode til fluoroforekonjugation, som kan være en vigtig parameter, der påvirker resultaterne. CPP'er kan mærkes fluorescerende på N- eller C-endestationen gennem en kovalent binding mellem Peptidets N-endestation og carboxylgruppen af farvestoffet, såsom Cy5.5-NHS. Der bør udvises forsigtighed, fordi transduktionsmekanismen for de fleste CPP'er ikke forstås i detaljer, og konjugering i den ene ende kan påvirke optagelsesmekanismen mere end i den anden ende. En anden mulighed for mærkning af CPP'er er gennem biotinylating n-endestationen for konjugation til fluorescerende mærket streptavidin. Ved hjælp af denne strategi har den bekvemmelighed at tillade forskellige fluorescerende streptavidin konjugatter, der skal udnyttes. En mulig begrænsning af denne strategi er imidlertid, at et biotin-streptavidin kompleks er en stor konstruktion, som potentielt kan forstyrre transduktionen.
Fluorescerende optiskbilleddannelsessystemer er en effektiv strategi til effektiv sammenligning af fluorescens på tværs af forskellige organer og behandlinger effektivt, men er ude af stand til at producere et kvantitativt mål for absolutte koncentrationer i væv. Dette skyldes lysspredningseffekter i vævet, som yderligere forværres af den naturligt forekommende sort i vævsstørrelser og tætheder og forskelle i vaskularisering med variabel fluorescensspredning. Væv autofluorescens kan være en faktor så godt, på grund af naturligt forekommende biokemiske kilder såsom kollagen, eller kosten kilder som klorofyl i fødevarer13.
Histologi er den mest almindeligt anvendte metode til måling af biodistribution og kan potentielt bruges til præcist at måle og sammenligne optagelsen på tværs af forskellige væv over tid. Lys spredning spørgsmål undgås ved hjælp af denne metode, fordi alle væv er opdelt til sammetykkelse 15. En stor fordel ved denne metode er evnen til at omfatte yderligere fluorescerende etiketter postsectioning for immunhistokemi. Selv om tilsætning af en anden fluorophore kunne gøre billeddannelse mere udfordrende, kan brugen af fluorescerende etiketter være nyttigt for lokalisering af en CPP til bestemte intracellulære rum, som lysosomer eller mitokondrier. Et antistof kan anvendes i en konfokal mikroskopi eksperiment for at afgøre, om en trans induceret kandidat CPP colocalizes med en struktur af interesse, som kan vise potentialet i en CPP som en levering agent. En begrænsning af denne metode er, at forberedelse af dias fra organprøver kan være tidskrævende, arbejdskrævende, og tilbøjelige til menneskelige fejl12,15. Når billeddias glider, skal man sørge for ikke at billedet det samme sted for længe for at undgå photobleaching. Nogle photobleaching vil være uundgåelig, afhængigt af følsomheden af fluorophore. Der skal på hvert trin i denne protokol udvises forsigtighed for at beskytte prøverne mod omgivende lys og opbevare dem korrekt16. Vi anbefaler, at dias opbevares ved 4 °C, lysbeskyttet, til fremtidig billeddannelse.
Der er en række metoder til rådighed til måling af biodistribution af en kandidat CPP, der kræver specialiseret udstyr og kan producere sammenlignelige resultater, selv om de kan kræve mere komplekse CPP mærkning. Den protokol, der er beskrevet i dette dokument, anvender to kompatible metoder til effektivt at producere biodistributionsdata i forbindelse med et levende system, samtidig med at der gives mulighed for at erhverve mere dybdegående oplysninger om peptidinternisering i celler fra samme prøve, hvorved antallet af dyr, der er nødvendige for en undersøgelse, reduceres til det halve. Disse metoder blev anvendt til at generere ovenstående data, som viser, at begge metoder kan anvendes sekventielt i det samme dyr, og kvaliteten af de data, der genereres af hver. Vores resultater fremhæver også den manglende evne til direkte at korrelere resultaterne mellem de to teknikker på en kvantitativ måde.
Disclosures
M.Z. og Paul D. Robbins (University of Minnesota, Minnesota, MN, USA) har patent på brugen af hjertemålretning peptid som en hjertevektor (Hjerte-specifikt protein målretning domæne, US Patent Serial No. 9.249.184). M.Z. fungerer også som Chief Scientific Officer og sidder i bestyrelsen for opstarten Vivasc Therapeutics Inc. og har en betydelig fremtidig egenkapital i den.
Acknowledgments
M.Z. og K.S.F. støttes af American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180, og ved et tilskud tildelt under Pitt Innovation Challenge (PInCh®), gennem Clinical and Translational Science Institute ved University of Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
