Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

3D-modellering av dendritiska spines med synaptisk plasticitet

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/60896
* These authors contributed equally

Summary

Protokollet utvecklar en tredimensionell (3D) modell av en dendritisk segment med dendritiska spines för modellering synaptisk plasticitet. Den konstruerade nät kan användas för beräkningsmodellering av AMPA-receptorhandel i den långsiktiga synaptisk plasticitet med hjälp av mjukvaruprogrammet Blender med CellBlender och MCell.

Abstract

Beräkningsmodellering av diffusion och reaktion av kemiska arter i en tredimensionell (3D) geometri är en grundläggande metod för att förstå mekanismerna för synaptisk plasticitet i dendritiska spines. I detta protokoll modelleras den detaljerade 3D-strukturen hos dendriterna och dendritiska taggarna med maskor på programvaran Blender med CellBlender. De synaptiska och extrasynaptiska regionerna definieras på nätet. Därefter definieras den synaptiska receptorn och de synaptiska ankarmolekylerna med sina diffusionskonstanter. Slutligen ingår de kemiska reaktionerna mellan synaptiska receptorer och synaptiska ankare och beräkningsmodellen löses numeriskt med programvaran MCell. Denna metod beskriver spatiotemporal vägen för varje enskild molekyl i en 3D geometrisk struktur. Således är det mycket användbart att studera handeln med synaptiska receptorer in och ut ur dendritiska taggar under förekomsten av synaptisk plasticitet. En begränsning av denna metod är att det höga antalet molekyler saktar hastigheten på simuleringarna. Modellering av dendritiska taggar med denna metod möjliggör studier av homosynaptisk potentiering och depression inom enstaka taggar och heterosynaptic plasticitet mellan granne dendritiska taggar.

Introduction

Synaptisk plasticitet har associerats med inlärning och minne1. Synaptisk plasticitet, såsom långtidspotentiering (LTP) och långtidsdepression (LTD), associeras respektive med insättning och avlägsnande av AMPA-receptorer (AMPA-receptorer) in och ut ur synapmembranet2. Ampar-synapserna ligger ovanpå de små volymstrukturer som kallas dendritiska taggar3. Varje ryggrad innehåller en proteintät region i det postsynaptiska membranet som kallas postsynaptic densitet (PSD). Förankra proteiner vid PSD-fällan AMPAR i synaptiska regionen. Det finns få kopior av AMPARs inom en enda synaps och människohandel och reaktion av AMPARs med andra arter i dendritiska spines är en stokastisk process2,4. Det finns flera fackmodeller av synaptisk receptorhandel vid dendritiska spines5,6,7,8. Det finns dock en brist på stokastiska beräkningsmodeller av handeln med AMPARs i samband med synaptisk plasticitet vid 3D-strukturer av dendriterna och deras dendritiska taggar.

Beräkningsmodellering är ett användbart verktyg för att undersöka de mekanismer som ligger bakom dynamiken i komplexa system såsom reaktion-diffusion av AMPARs i dendritiska taggar under förekomsten av synaptisk plasticitet9,10,11,12. Modellen kan användas för att visualisera komplexa scenarier, varierande känsliga parametrar och göra viktiga förutsägelser i vetenskapliga förhållanden som involverar många variabler som är svåra eller omöjliga att kontrollera experimentell12,13. Att definiera detaljnivån för en beräkningsmodell är ett grundläggande steg för att få korrekt information om det modellerade fenomenet. En idealisk beräkningsmodell är en känslig balans mellan komplexitet och enkelhet för att fånga naturfenomenens väsentliga egenskaper utan att vara beräkningsmässigt oöverkomliga. Beräkningsmodeller som är för detaljerade kan vara dyra att beräkna. Däremot kan system som är dåligt detaljerade sakna de grundläggande komponenter som är väsentliga för att fånga upp fenomenets dynamik. Även om 3D-modellering av dendritiska taggar är beräkningsmässigt dyrare än 2D och 1D, finns det villkor, såsom i komplexa system med många ickelinjära variabler reagerar och sprider i tid och 3D-rymden, för vilka modellering på en 3D-nivå är viktigt att få insikter om systemets funktion. Vidare kan komplexiteten minskas noggrant för att bevara de väsentliga egenskaperna hos en lägre dimensionell modell.

I ett stokastiskt system med få kopior av en given art inom en liten volym avviker den genomsnittliga dynamiken i systemet från den genomsnittliga dynamiken hos en stor population. I detta fall är den stokastiska beräkningsmodellering av reaktionsspridande partiklar krävs. Detta arbete introducerar en metod för stokastisk modellering reaktion-diffusion av några kopior av AMPARs i 3D dendritiska spines. Syftet med denna metod är att utveckla en 3D-beräkningsmodell av ett dendritisk segment med dendritiska spines och deras synapser för modellering synaptisk plasticitet.

Metoden använder programvaran MCell för att lösa modellen numeriskt, Blender för att konstruera 3D-maskor, och CellBlender för att skapa och visualisera MCell-simuleringarna, inklusive spatiotemporal reaktion-diffusion av molekyler i 3D-maskor14,15,16. Blender är en svit för skapandet av maskor och CellBlender är ett tillägg för basen programvara Blender. MCell är en Monte Carlo-simulator för reaktion-diffusion av enstaka molekyler17.

Logiken bakom användningen av denna metod består av modellering synaptisk plasticitet för att uppnå en bättre förståelse av detta fenomen i den mikrofysiologiska miljön i dendritiska spines14. Särskilt, denna metod tillåter simulering av homosynaptisk potentiering, homosynaptisk depression, och heterosynaptic plasticitet mellan dendritiska spines14.

Funktionerna i denna metod inkluderar modellering av 3D geometriska strukturen av dendriten och dess synapser, diffusionen genom slumpmässig promenad, och de kemiska reaktionerna hos de molekyler som är involverade med synaptisk plasticitet. Denna metod ger fördelen att skapa rika miljöer för att testa hypoteser och göra förutsägelser om hur ett komplext ickelinjärt system med ett stort antal variabler. Dessutom kan denna metod tillämpas inte bara för att studera synaptisk plasticitet utan också för att studera stokastisk reaktion-diffusion av molekyler i 3D-nätstrukturer i allmänhet.

Alternativt kan 3D-maskor av dendritiska strukturer konstrueras direkt i Blender från elektronmikroskop seriella rekonstruktioner18. Även om maskor baserade på seriella rekonstruktioner ger 3D-strukturer, är tillgång till de experimentella data inte alltid tillgänglig. Således ger konstruktionen av maskor anpassade från grundläggande geometriska strukturer, som beskrivs i det föreliggande protokollet, flexibilitet att utveckla kundanpassade dendritiska segment med dendritiska taggar.

En annan alternativ beräkningsmetod är bulksimuleringen av väl blandade reaktioner i en vanlig volym9,10,11,19,20,21,22. Bulksimuleringarna är mycket effektiva för att lösa reaktionerna hos många arter inom en enda väl blandad volym23, men bulkstrategin är extremt långsam för att lösa molekylernas reaktionsdiffoföring inom många väl blandade voxels i en högupplöst 3D-mesh. Å andra sidan fungerar den föreliggande metoden med hjälp av MCell-simuleringar av reaktionsdiffusion av enskilda partiklar effektivt i högupplösta 3D-maskor15.

Innan man använder denna metod bör man fråga sig om det undersökta fenomenet kräver en stokastisk reaktionsdiffusionsansats i ett 3D-nät. Om fenomenet har få kopior (mindre än 1 000) av minst en av de reagerande arterna som sprider sig i en komplex geometrisk struktur med små volymfack som dendritiska taggar, då är stokastisk modellering av reaktionsdiffusion i 3D-maskor lämplig för applikationen.

Det finns flera steg som krävs för att konstruera en 3D-beräkningsmodell av ett dendritisk segment som innehåller dendritiska taggar med synaptisk plasticitet. De viktigaste stegen är installationen av rätt programvara för konstruktion av modellen, byggandet av en enda dendritisk ryggrad som ska användas som en mall för att skapa flera taggar, och skapandet av en dendritisk segment som är ansluten med flera dendritiska taggar. Steget för modellering av synaptisk plasticitet består av att sätta in ankare vid PSD-regionen och AMPAR i det dendritiska segmentet och dendritiska taggar. Därefter definieras kinetiska reaktioner mellan de ankare som ligger vid PSD och AMPARs för att producera komplexa ankar-AMPAR-arter som fångar ampaperna vid synapsregionen. Respektive, ökningen och minskningen av samhörigheten mellan ankare och de synaptiska AMPARs skapa processen för LTP och LTD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Se tilläggsfilen 1 för ordlistan över termer som används i detta protokoll.

1. Installera Blender, CellBlender och MCell

OBS: Detta protokoll kräver installation av MCell, Blender, och Cell Blender.

  1. Ladda ner och installera programvaran på MCells hemsida (https://mcell.org/tutorials_iframe.html). Gå till nedladdningar på sidans övre del och följ sedan steg-för-steg-instruktionerna för att hämta och installera programvaran i den miljö som du väljer (t.ex. Linux, Mac OSX eller Windows).
    OBS: Alla beräkningsmodeller och simuleringar som beskrivs i detta protokoll testades på en CellBlender 1.1-bunt som inkluderar Blender 2.78 med MCell 3.4 och CellBlender 1.1. Det fungerade också på Blender 2.79b. Alla dessa programvaror är öppna åtkomst och kräver inte återutskriftsbehörighet för att användas. Anvisningarna för konstruktion och simulering av modellen kan ändra något från en version till en annan. Delar av detta protokoll har anpassats från tjeckiska m.fl.16.

2. Skapa en enda dendritisk ryggrad

OBS: Detta förfarande skapar ett nät av en enda dendritisk ryggrad med en ryggrad huvud och en ryggrad hals med hjälp av en modifierad sfär.

  1. Ställ in Blender 3D-vy på huvudpanelen.
    1. Öppna Blender med CellBlender redan installerat. Tryck på 5 på knappsatsen för att ändra från Perspektiv till Ortogonal vy och tryck på 1 för att ändra till framläge. Perspektivvyn har djup, men detta behövs inte nu. Ändra från Perspektiv till Ortogonal vy möjliggör bättre visualisering av nätet. Tryck på Skift+C för att centreramarkören ( Bild 1A).
  2. Skapa ryggraden huvudet.
    1. Tryck på Skift+A för att öppna nätpaletten. Välj maskan och välj sedan UV-sfär. En UV-sfär är ett nät som mappas till 3D-ytan på en sfär. UV-sfären representerar det sfäriska huvudet av en svamp dendritisk ryggrad. Programvaran förutsätter enheterna i UV-sfären är mikrometer.
    2. Ändra parametrarna på panelen Lägg till UV-sfär. Ändra Storlek till 0,25 och Ringar till 32 (Bild 1B). Tryck på + eller på knappsatsen för att respektive zooma in och zooma ut ur visualiseringen av nätet. Alternativt kan du använda rullningsknappen i musen för att zooma in och ut (Bild 1C).
      OBS: Parameterstorleken skalar storleken på den ursprungliga sfären och parameterringarna definierar upplösningen på nätet.
  3. Gör toppen av huvudet platt.
    1. Tryck på Tabb för att växla Blender från objektläget, standardläget för objektinteraktion, till Redigeringsläge. Arbeta i Redigeringsläge för att ändra komponenterna i ett befintligt nät.
    2. När det skapade nätet har valts automatiskt, tryck på a för att avmarkera det skapade nätet. Tryck på z för att göra nätet genomskinligt, vilket hjälper till att visualisera de delar som kommer att redigeras. Zooma in på nätet. Tryck b för att välja den översta 3/4 av sfären med musen (Bild 2A). Tryck delete , markera vertices, och ange för att ta bort de vertices (Bild 2B).
    3. Tryck på b och välj överdelen. Tryck på e, s, 0, och ange att täta toppen med de vertices fortfarande markerad. Flytta den blå pilen nedåt för att justera till toppen av ryggradshuvudet (Bild 2C). Tryck på z för att ändra till heldragen vy ( Bild3A). Tryck på 7 för att ändra till toppvy.
      OBS: Toppen av sfären görs platt för att modellera PSD-regionen i ryggraden huvudet.
  4. För att öka mesh-upplösningen högst upp i ryggraden först väljer Verktyg och kniv. Skär en cirkel med kniven runt mitten av toppen (Bild 3B). Välj Verktyg och Slinga Klipp och Skjut. Upprepa detta steg fyra gånger för att skapa fyra koncentriska cirklar runt mitten av den övre (Bild 3C).
    OBS: De koncentriska cirklarna används för att lägga till nya voxels som kommer att öka upplösningen på PSD.
  5. Skapa ryggraden hals.
    1. Tryck på a för att avmarkera nätet. Tryck på 1 för att ändra till den främre vyn. Tryck z för att göra nätet genomskinligt. Tryck på b och välj sedan undersidan av nätet ( Bild4A). Tryck på delete och vertices (bild 4B). Tryck på b och välj undersidan av nätet ( Bild4C). Tryck på e och z, -0,45 för att skapa en extrudering (Bild 4D).
      OBS: Detta skapar en extrudering till z-axelns position vid -0,45 μm. Tryck på a för att avmarkera hela nätet.
    2. Tryck på b och välj botten av halsen. Tryck på e, s, och 0 för att täta botten (Bild 4E). Tryck på a för att välja hela nätet.
  6. Gör nätet kompatibelt med MCell.
    1. Tryck på Crtl+T för att triangulera nätet. Nätet omvandlas till en uppsättning sammankopplade trianglar. Detta är ett obligatoriskt förfarande för att göra nätet kompatibelt med MCell. Välj Verktyg och Ta bort dubblar. Använd verktygen Ta bort dubblar för att ta bort duplicerade vertices, om några, som har samma koordinater eller är mycket nära varandra, för att göra nätet kompatibelt med MCell.
      OBS: Dubbla superposed vertices kan ha av misstag skapats under processen för mesh skapande och redigering.
    2. Markera Modellobjektcellblenderpanelen. Ändra namnet på Active Object till ryggraden och tryck på + för att skapa objektsryggen. På cellblenderpanelen väljerdu Nätanalys och klickar sedan på Analysera nät (Bild 4F). Denna procedur kommer att analysera egenskaperna hos det skapade nätet, inklusive antalet vertices, kanter, ansikten, yta, volym och mesh topologi.
      OBS: Analysen kommer att skriva ut informationen i Mesh Analysis Panel och det bör vara Vattentät, Grenrör, och Utåtriktad Normals. Detta steg krävs för att säkerställa att nätet kommer att fungera på MCell. Annars missades nog ett steg. I så fall tar du bort nätet och startar från steg 2.1 igen.
    3. Tryck på z för att visualisera den fasta synen på ryggraden. Tryck på Arkiv och Spara för att ha en kopia av din mixerfil med ryggraden på disken.
      OBS: Maskornas mått (dvs. längd, diameter, storlek) är i mikrometer. Se ordlistan för innebörden av varje kortkommando.

3. Skapa en dendrit med flera taggar

  1. Generera en ryggrad som beskrivits tidigare i avsnitt 2.1–2.6. Tryck på a för att avmarkera ryggraden. Skriv Skift+C för att centrera markören.
  2. Skapa en dendrit. Tryck på Skift+A för att öppna nätpaletten. Välj Nät och sedan Cylinder. Ändra parametrarna på Menyn Add Cylinder: Radie = 0,3 μm, Djup = 2 μm. Tryck på Retur.
    OBS: Parametrarna radie och djup definieras enligt dendritens geometriska egenskaper.
  3. Sätt in en ryggrad i dendriten.
    1. Tryck på r och skriv 90 för att rotera cylindern 90° (Bild 5A). Använd den blå pilen för att dra cylindern ner till botten av ryggraden. Tryck 3 på knappsatsen för att ha en framifrån av cylindern.
    2. Tryck z för att göra nätet genomskinligt. Använd musen för att flytta den blå normala pilen av cylindern nedåt för att flytta basen av ryggraden till insidan av cylindern (Figur 5B). Tryck på a för att avmarkera alla objekt.
    3. Använd höger knapp för musen för att välja dendriten (Bild 5C). Välj Modifier på panelen Mixer (Bild 5D), välj Add Modifier. Välj sedan Boolean( välj Operation Union, och välj Objekts spine. Tryck På Använd för att skapa ett lednät av dendriten och ryggraden ( Bild5E). Den här åtgärden skapar ett nytt nät som sammanfogar två maskor till en enda.
      OBS: Det nya nätet kommer att vara den kombinerade dendrit och ryggrad. Den isolerade dendriten försvinner när de olika maskorna kombineras, men det isolerade ryggradsnätet förblir överlappat med det nya nätet och används för att generera flera kopior av samma ryggrad. Ta bort alla isolerade taggar efter avslutad nätet. Det är viktigt att ha en fullständig överlappning mellan ryggraden hals och dendrite, annars kommer nätet inte vara vattentät.
  4. Ställ in dendriteobjektet i CellBlender-miljön.
    1. Tryck på a för att avmarkera maskorna. Högerklicka i dendriten med musen för att välja dendriten bara. Markera CellBlender, Modellobjektoch ändra Aktivt objekt till Dendrite och tryck på + för att skapa Dendrite-objektet.
  5. Sätt in nya taggar i dendriten.
    1. Tryck 1 för att ändra till cylinderns sidovy. Använd musen för att välja nätet av den isolerade ryggraden. För att infoga fler taggar, följ steg 3.3, ändra position och vinkeln för att infoga var och en för att få en fysiologisk fördelning.
  6. Gör nätet kompatibelt med MCell. Gör det genom att trycka på Tabb för att gå till redigeringsläget. Tryck på a för att välja hela nätet. Tryck på Crtl+T för att triangulera nätet. Välj Verktygpanelen Mixer och välj Ta bort dubblar.
  7. Stilisera maskorna.
    1. Släta ut nätet. Tryck på Tabb för att ändra till objektläge. Välj Verktygpanelen Mixer och välj Utjämna. Markera CellBlender, Modellobjektoch välj Lägg till ett material.
    2. Gör nätet genomskinligt genom att markera Objekt transparent och Material transparent. Ändra alfa till 0,5 och ange för att göra nätet delvis transparent. Tryck på z för att ändra till heldragen vy.
  8. Bekräfta om nätet fortfarande är kompatibelt med MCell. Om du vill göra det väljer du Nätanalyscellblenderpanelen för att kontrollera att nätet fortfarande är vattentätt, grenrörsnätoch utåtriktad normal.
  9. Spara mixerfilen som dendrite_with_spines.blandning.

4. Definiera ytregioner

OBS: Denna procedur skapar de ytregioner av nätet som senare kommer att användas för att ställa in hur regionerna interagerar med molekylerna.

  1. Öppna filen dendrite_with_spines i Blender-miljön. Gör det genom att välja Arkiv, Öppna, dendrite_with_spines.blandningoch Öppna mixerfil.
  2. Förbered nätet för att definiera ytregionerna. Det gör du genom att trycka på Tabb för att ändra till redigeringsläge. Tryck på z för att ändra till genomskinlig vy (Viewport-skuggning, wireframe). Tryck på a för att välja hela nätet av dendriten med taggar. Välj Modellobjekt. Välj Dendrite. Tryck på t för att dölja CellBlender-panelen och visualisera hela nätet bättre i huvudpanelen.
    1. Använd + och på knappsatsen för att zooma in och ut eller rulla med musen. Detta krävs för bättre visualisering av toppen av taggarna för att välja och definiera ytan regioner. Tryck på a för att avmarkera objektet. Tryck på Tabb för att ändra till Redigeringsläge. Tryck på t för att visa CellBlender-panelen igen.
  3. Definiera PSD-ytregionen. För att göra det, tryck b och välj toppen av en dendritisk ryggrad med musen (Bild 6A,6B). Tryck på + på definierade ytregioner. Ändra Regionnamn till PSD1 och klicka på Tilldela (Bild 6C). Tryck på a för att avmarkera objektet.
  4. Definiera den extrasynaptiska ytan regionen. För att göra det, tryck b och välj regionen runt toppen av dendritiska ryggraden med musen (Bild 6D). Upprepa steg 4.3 för regionnamnet till Extra_syn1. Upprepa steg 4.3 för de andra taggarna för att definiera de andra regionerna i nätet (PSD2, PSD3, PSD4, Extra_syn2, Extra_syn3, och Extra_syn4) (Bild 6F). Tryck på a för att avmarkera objektet.
  5. Definiera ytregionerna för dendritens ändar. För att göra det, tryck på b och välj den vänstra änden av dendriten. Ändra regionnamnet till Left_end klicka på Tilldela. Tryck på a för att avmarkera objektet. Tryck på b och välj dendritens högra ände ( Bild6E). Ändra regionnamnet till Right_end klicka på Tilldela.
    OBS: Flytta nätet för att hitta den bästa positionen för att välja varje Definierad region.

5. Skapa molekyler

  1. Skapa AMPAR. Om du vill göra det väljer du Molekyler på CellBlender-panelen. Välj +Definierade molekyler för att infoga en ny molekyl och ändra Namn till AMPAR. Ändra Molekyltyp till Ytmolekyl och Diffusion Konstant till 0,05e-8 cm2/s14 för att definiera diffusionskonstanten av AMPAR i membranet ( Bild7A).
  2. Skapa Ankare. Om du vill göra det väljer du Molekyler på CellBlender-panelen. Välj +Definierade molekyler för att infoga en ny molekyl och ändra Namn för att förankra. Ändra Molekyltyp till Ytmolekyl och ändra Diffusion Constant till 0,001e-8 cm2/s14 för att definiera diffusionskonstanten hos ankare i membranet ( Bild7A).
  3. Skapa Ankare bundna till AMPAR:er genom att välja MolekylerCellBlender-panelen. Välj +Definierade molekyler för att infoga en ny molekyl. Ändra Namn till anchor_AMPAR. Ändra Molekyltyp till Surface Molecule. Ändra Diffusion Constant till 0.001e-8 cm2/s14.
  4. Skapa anchor_LTP och anchor_AMPAR_LTP. För att göra det, upprepa steg 5.2. Namnge molekylen anchor_LTP. Upprepa steg 5.3. Namnge molekylen anchor_AMPAR_LTP.
    OBS: Anchor_LTP har en hög affinitet för AMPAR; sålunda ökar AMPARs i de synaptiska regionerna.
  5. Skapa anchor_LTD och anchor_AMPAR_LTD. Om du vill skapa_LTDkan du upprepa steg 5.2. Namnge molekylen anchor_LTD. Upprepa steg 5.3. Namnge molekylen anchor_AMPAR_LTD.
    OBS: Den anchor_LTD har en låg affinitet för AMPAR; sålunda minskar AMPARs i synapsregionen.

6. Definiera ytklasser

OBS: Den här proceduren definierar klasserna med de egenskaper som är kopplade till ytregionerna. De extrasynaptiska regionerna återspeglar de fria ankare och ankare som är bundna till AMPAR. Dendritens laterala ändar reflekterar alla molekyler.

  1. Definiera egenskaperna för de extrasynaptiska regionerna.
    1. Tryck på Tabb för att ändra till objektläge. Välj YtklasserCellBlender-panelen. Tryck på +Surface-klassen för att definiera en ny ytklass.
    2. Få den extrasynaptiska regionen att återspegla ampar-bunden till ankarmolekylerna.
      OBS: Detta förfarande kommer att fälla ankare och allt som är bundna till dem inom synapsregionen.
      1. Ändra Namn på Surface-klass till reflective_extra_syn. Tryck på + på reflective_extra_syn Egenskaper för Properties att associera den med en molekyl. Välj Molekyler | Enda Molekyl. Välj anchor_AMPAR. Välj Orientering = Ignorera. Välj Typ = Reflekterande för att regionen ska visa anchor_AMPAR molekyler.
      2. Upprepa steg 6.1.2.1 för anchor_AMPAR_LTP och anchor_AMPAR_LTD.
    3. Få den extrasynaptiska regionen att återspegla ankaret.
      1. Tryck på + på reflective_extra_syn Egenskaper för Properties att associera den med en molekyl. Välj Molekyler | Enda Molekyl. Välj ankare. Välj Orientering = Ignorera. Välj Typ = Reflekterande för att regionen ska återspegla ankarmolekylerna.
      2. Upprepa steg 6.1.3.1 för anchor_LTP och anchor_LTD.
  2. Definiera egenskaperna för dendritsluten. Om du vill göra det trycker du på + på Surface Class för att definiera en ny ytklass. Ändra Namn på Surface-klass till reflective_ends. Tryck på + på Egenskaper för att associera den med en molekyl. Välj Molekyler | Alla Ytmolekyler. Välj Orientering | Ignorera. Välj Typ | Reflekterande för att få den att reflektera alla ytmolekyler.

7. Tilldela de skapade klasserna till varje område med yta

OBS: Det här steget tilldelar ytklasserna till ytregionerna.

  1. Tilldela egenskaperna för dendritens ändar.
    1. Tryck på + för att tilldela en ytklass med en region. Välj reflective_ends för Ytklassnamn (Bild 7C). Välj Dendrite för Objektnamn. Välj Angiven region för regionval. Välj Left_end för Regionnamn.
    2. Upprepa steg 7.1.1 för Right_end (bild 7D).
  2. Tilldela egenskaperna för de extrasynaptiska regionerna.
    1. Tryck på + för att tilldela en ytklass med en region. Välj reflective_extra_syn för Namn på Surface-klass. Välj Dendrite för Objektnamn. Välj Angiven region för regionval. Välj Extra_syn1 för Regionnamn.
    2. Upprepa steg 7.2.1 för Extra_syn2, Extra_syn3och Extra_syn4.

8. Placera molekyler på nätet

OBS: Detta steg placerar AMPARs, ankare, och AMPAR bunden till ankare på nätet.

  1. Om du vill placera AMPAR-molekyler på nätet väljer du MolekylplaceringCellBlender-panelen. AMPAR Tryck på +release-/placeringswebbplatserna för att skapa en ny utgivningswebbplats. Ändra Site Name till relAMPAR (Bild 7B). Välj Molekyl = AMPAR. Objekt/Region = Dendrit[ALL]-(Dendrite[Left_end]+Dendrite[Right_end]). Mängd till Frisättning = 1 000.
  2. Placera anchor ankarmolekyler på Mesh.
    1. Välj Molekylplaceringcellblenderpanelen. Tryck på +release-/placeringswebbplatserna för att skapa en ny utgivningswebbplats. Ändra Webbplatsnamn till rel_anchor_PSD1. Välj Molekylankare. Objekt/Region = Dendrite[PSD1]. Antal till Frisättning = 200.
    2. Upprepa steg 8.2.1 för PSD2, PSD3och PSD4.
  3. Placera anchor_LTP molekyler på Nätet. Gör det genom att välja MolekylplaceringCellBlender-panelen. Tryck på +release-/placeringswebbplatserna för att skapa en ny utgivningswebbplats. Ändra Webbplatsnamn till rel_anchor_LTP_PSD1. Välj Molekyl = anchor_LTP. Objekt/Region = Dendrite[PSD1]. Antal till Frisättning = 0.
    OBS: anchor_LTP är ett ankare med hög bindningsaffinitet för ampar.
  4. Placera anchor_LTD Molekyler på Nätet genom att upprepa steg 8.3 för anchor_LTD.
    OBS: anchor_LTD är ett ankare med låg bindningsaffinitet för AMPARs.

9. Skapa de kemiska reaktionerna

  1. Skapar reaktionen mellan ankare och AMPAR.
    1. Välj Reaktioner (Bild 7D) för att skapa reaktionerna. Tryck på + för att inkludera en ny reaktion. Reaktanter = ankare' + AMPAR'. Reaktionstyp = <->. Detta definierar en dubbelriktad reaktion. Produkter = anchor_AMPAR". Framåt kurs = 0,03. Bakåt Rate = 0,05.
  2. Skapa reaktionen mellan ANCHOR_LTP och AMPAR. Gör det genom att upprepa steg 9.1, men ersätt ankare med anchor_LTP, och använd en Bakåthastighet = 0,005 för att öka tillhörigheten mellan reaktanterna.
  3. Skapa reaktionen mellan anchor_LTD och AMPAR:er och spara filen. Gör det genom att upprepa steg 9.2, men ersätt ankare med anchor_LTD, och använd en Bakåthastighet = 0,5 för att minska tillhörigheten mellan reaktanterna. Spara sedan filen.

10. Rita utmatningen av modellen

  1. Rita ankare bundna till AMPARs vid PSD1 under basal villkoret. Om du vill göra det väljer du Utdatainställningar för tomter. Tryck på + för att definiera molekylerna. Välj anchor_AMPARMolecule. Välj dendritObjekt. Välj PSD1Region. Upprepa steg 10.1 för alla PSD-regioner.
    OBS: Det är användbart att observera det basala antalet fångade AMPARs till PSD av varje dendritisk ryggrad. Antalet ankare som är bundna till ampar kan öka eller minska i jämförelse med de basala förhållandena under LTP och LTD.
  2. Rita ankare bundna till AMPARs vid PSD1 under LTP. Gör detta genom att upprepa steg 10.1. Ersätt anchor_AMPAR med anchor_AMPAR_LTP, sedan rita ankare bundna till AMPARs vid PSD1 under LTD och slutligen upprepa steg 10,1, men ersätta anchor_AMPAR_LTP med anchor_AMPAR_LTD.

11. Kör simuleringarna

  1. Om du vill köra det basala villkoret väljer du Kör simulering. Välj Iterationer = 30 000. Ställ tidssteg = 1e-3 s. Tryck på Exportera och kör. Vänta tills simuleringen är. Det kan ta från minuter till timmar.
    OBS: I det basala tillståndet finns det ingen frisättning av anchor_LTP och rel_anchor_LTD molekyler. När det gäller parametrarna för simuleringen, måste antalet iterationer vara tillräckligt länge för att kunna observera diffusionen av AMPARs från dendriterna och deras förankring på PSD. Små tidssteg är mer exakta men långsammare för att slutföra simuleringen.
  2. Välj Ladda om visualiseringsdata. Välj spela animation för att visualisera spatiotemporalresultaten ( Bild8). Välj Inställningar för utmatning av observationsområden. Tryck Plot.
    OBS: De grafer som genereras av CellBlender är isolerade tidsserier av den valda kemiska arten. Tredjepartsprogram kan användas för att importera de data som sparats från flera simuleringar för att skapa överlagrad tomter av flera villkor (t.ex. basala, LTP, LTD; se bild 8).
  3. Kör homosynaptisk potentieringstillstånd (dvs. LTP; se bild 8). Gör det genom att välja MolekylplaceringCellBlender-panelen. Välj rel_anchor_LTP_PSD1 på platserna för Släpp/placering.
  4. Ändra kvantitet till frisläppning = 200. Välj rel_anchor_LTD_PSD1 på platserna för Släpp/placering. Ändra kvantitet till frisläppning = 0. Välj rel_anchor _PSD1 på platserna för Släpp/placering. Ändra kvantitet till frisläppning = 0. Upprepa steg 11.1–11.2.
  5. Kör homosynaptiska depression villkoret (dvs., LTD; se figur 8). För att göra det, Släpp 200 rel_anchor_LTD_PSD1 istället för rel_ANCHOR_LTP_PSD1. Ställ rel_anchor och rel_anchor_LTP_PSD1 till noll. Upprepa steg 11.1–11.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dessa resultat ger stegen för byggandet av en 3D-mesh som simulerar en dendritisk ryggrad med en ryggrad huvud och ryggrad hals (Figur 1 till figur 4). Dessutom kan flera dendritiska taggar sättas in i ett enda dendritiska segment (Figur 5) för att studera heterosynaptisk plasticitet av AMPARs14. PSD på övre delen av ryggradshuvudet (Figur 6) är den plats där synaptiska ankare binder till AMPARs och fälla dem tillfälligt vid synapsen (Bild 7, Bild 8).

Synaptisk plasticitet kan verifieras ungefär genom förändringar i antalet arter av anchor_AMPAR, anchor_AMPAR_LTP, och anchor_AMPAR_LTD vid varje ryggrad. För den exakta beräkningen av förekomsten av synaptisk plasticitet rekommenderas att beräkna variationen i det totala antalet förankrade och fria AMPAR vid synapsen. Detta kan utföras med hjälp av program från tredje part för att öppna de sparade uppgifterna för simuleringen för att summera tidsserierna för de fria AMPAR:erna och de förankrade AMPAR-programmen vid varje PSD (Bild 8).

Frisläppandet av AMPARs på nätet får observation av deras diffusion av en stokastisk slumpmässig promenad längs dendrit och dendritiska taggar. Faktorer som modifierar affiniteten av AMF för ankare, såsom posttranslationell ändringar och förändringar av andelen endocytos och exocytos, kan fälla de extratros på PSD24,25,26. Bindningen av AMPARs med ankare som ligger vid PSD fångade en hög densitet av AMPARs vid synapsen. Homosynaptisk potentiering (Figur 9) och depression (Figur 10) skulle kunna verifieras respektive genom ökningar och minskningar av antalet förankrade amparier som orsakas av förändringar i amfärka dernas affinitet med ankare i jämförelse med det basala tillståndet (figur 11). Faktorer som minskade affiniteten av AMPARs med ankare släppt flera AMPARs från en dendritisk ryggrad (dvs. homosynaptisk depression) och inducerad heterosynaptic potentiering vid de angränsande ryggarna. Också faktorer som ökade affiniteten av AMPARs för ankare vid en ryggrad inducerad homosynaptisk potentiering vid den ryggraden och heterosynapisk depression vid de angränsandetaggarna 14. På detta sätt observerades heterosynaptic plasticitet som motsatt effekt vid de angränsande ryggarna av homosynaptisk plasticitet inducerad vid en given ryggrad. Till exempel, homosynaptiska LTP induktion vid en enda ryggrad skapat en heterosynaptic LTD effekt vid de angränsande ryggarna (Figur 8E,F,G).

Figure 1
Figur 1: Skapande av det dendritiska ryggradshuvudet med hjälp av ett sfäriskt nät. (A) Lägga till UV-sfären. (B) Ställa in sfärmåtten. (C) Observera den skapade sfären. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Byggandet av toppregionen. (A) Välja den översta regionen i sfären. (B) Ta bort den valda regionen för att göra den platt. (C) Tätning av den platta toppen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Skapa koncentriska områden på ryggradens ovankant. (A) Visualisera toppen. (B) Använda en kniv för att definiera en koncentrisk region. (C) Skapa flera koncentriska regioner. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Att skapa dendritryggens nacke. (A) Välja botten av den modifierade sfären. (B) Ta bort de markerade vertices. (C) Välja botten. (D) Extrudering av botten för att skapa ryggraden hals. (E) Tätning botten av ryggraden halsen. (F) Analysera den skapade ryggraden. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Skapande av dendriten med flera taggar. (A) Använda det cylindriska nätet för att skapa en dendrit. (B) Rikta dendritryggen med cylindern. (C) Sammanfogning av cylindern med ryggraden. (D) Den booleska operationen att ansluta sig till maskorna. (E) Den nya kombinerade maskan. (F) Lägga till den andra ryggraden. (G) Lägga till tredje ryggraden. (H) Lägga till fjärde ryggraden. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Bild 6: Definiera PSD-regionen och den perisynaptiska zonen. (A) Välja PSD-region. (B) Detaljerad bild av den skapade PSD. (C) Definiera PSD-ytregionen. (D) Välja och definiera den perisynaptiska zonen runt PSD. (E) Välja och definiera dendrites laterala yta. (F) Definierade ytregioner. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 7
Bild 7: Att definiera ytmolekylerna. (A) Definiera AMPAR, ankare, och AMPAR bunden till ankare. (B) Definiera placering och mängd av AMPAR kopior. (C) Definiera Ytklasserna. (D) Tilldela Ytklasserna. (E) Skapa de kemiska reaktionerna mellan molekylerna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Representativa resultat av synaptisk plasticitet. (A) Olika maskor av ett dendritiska segment med två, fyra, eller åtta taggar. (B) En annan syn på det dendritiska segmentet med åtta taggar. (C) Detaljerad bild av en dendritisk ryggrad med AMPARs och ankare vid PSD. (D) Diagram över handeln med AMF-systemet in och ut ur PSD genom deras interaktioner med ankare. (E-G) Kurvorna visar antalet synaptiska AMPAR vid varje PSD för det basala tillståndet och under LTP och LTD. Induktionen av homosynaptiska LTP eller LTD vid en enda ryggrad skapade en heterosynapisk effekt i de närliggande taggarna för nätet med två taggar (E), fyra taggar (F), och åtta spines (G). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 9
Bild 9: Representativt resultat av LTP-villkoret. (A) X-axeln är tiden och y-axeln är numret på den komplexa anchor_LTP_AMPAR PSD1. Det fanns en frigörare av 200 anchor_LTP i början av simuleringen. Ett högre antal bindningar med ankare bildades i jämförelse med det basala tillståndet (Bild 11) Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: Representativt resultat av villkoret LTD. (A) X-axeln är tiden och y-axeln är numret på den komplexa anchor_LTD_AMPAR PSD1. Det fanns en release av 200 anchor_LTD i början av simuleringen. Ett lägre antal bindningar med ankare bildades i jämförelse med det basala tillståndet (figur 11). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 11
Bild 11: Representativt resultat under basalt tillstånd. (A) X-axeln är tiden och y-axeln är numret på den komplexa anchor_AMPAR PSD1. Det fanns en release av 200 fria ankare i början av simuleringen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna artikel presenterar en metod för konstruktion av 3D-maskor för modellering reaktion-diffusion synaptisk plasticitet processer i en dendritic segment med dendritic spines. Den utvecklade modellen innehåller ett dendritiskt segment med få dendritiska taggar. Den laterala diffusion och reaktion av AMPARs med synaptiska ankare möjliggör simulering av den basala dynamiken. De kritiska stegen i protokollet skär sfären för skapandet av toppen av ryggraden huvudet (Figur 1, Figur 2, Figur 3), den extrudering att skapa ryggraden hals (Figur 4), och sammanfogning av dendrit och taggarna i ett enda nät (Figur 5). Det är kritiskt att ha en fullständig överlappning mellan ryggraden halsar och dendriten; annars kommer nätet inte att vara vattentätt. Andra kritiska steg är valet av membranregionerna och definitionen av ytklasserna (Figur 6, Bild 7). Spara filerna för varje kritiskt steg med ett annat namn.

Använd mesh analysera verktyget för att säkerställa att nätet är vattentät, grenrör, och utåtriktad normal efter att skapa den enda ryggraden och efter att skapa den kombinerade dendrit med ryggraden. Om maskan misslyckas med den här analysen återgår du till den senast korrekta versionen som sparats. Vissa steg kan vara något olika beroende på vilken version av programvaran som är installerad, operativsystemet och vilken typ av tangentbord.

Detta protokoll simulerar handeln med AMPAR-molekyler i 3D-nät (Figur 8, Figur 9, Figur 10, Figur 11), som är nyckeln för neuronal excitatorisk överföring och synaptisk plasticitet. Handeln med enstaka molekyler i ett 3D-nät är ett värdefullt inslag i denna modell med avseende på befintliga metoder som bygger på väl blandade volymer med homogena fördelningarav molekyler 21,22, vilket inte är det fysiologiska tillståndet vid synapserna27. En begränsning av denna teknik är den höga beräkningskostnaden och den långsamma hastigheten hos simuleringar som använder ett stort antal kopior av varje molekyl och ett stort antal kemiska reaktioner mellan dem. Denna begränsning kan övervinnas genom att minska antalet kopior av varje art.

Konstruktionen av ett system med en realistisk 3D-nät- och spatiotemporal spårning av molekyler är ett kraftfullt verktyg för att testa mekaniska scenarier som kan ge stora insikter om hur system med ett högt antal ickelinjära variabler fungerar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av Sao Paulo State Science Foundation (FAPESP) bidrag #2015/50122-0 och IRTG-GRTK 1740/2, av IBM / FAPESP bidrag #2016/18825-4, och av FAPESP bevilja #2018/06504-4.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blender Blender Foundation https://www.blender.org/
CellBlender University of Pittsburgh https://mcell.org/
Mcell University of Pittsburgh https://mcell.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sweatt, J. D. Neural plasticity and behavior - sixty years of conceptual advances. Journal of Neurochemistry. 139, 179-199 (2016).
  2. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320 (5873), 201-205 (2008).
  3. Buonarati, O. R., Hammes, E. A., Watson, J. F., Greger, I. H., Hell, J. W. Mechanisms of postsynaptic localization of AMPA-type glutamate receptors and their regulation during long-term potentiation. Science Signaling. 12 (562), 6889 (2019).
  4. Nair, D., et al. Super-Resolution Imaging Reveals That AMPA Receptors Inside Synapses Are Dynamically Organized in Nanodomains Regulated by PSD95. Journal of Neuroscience. 33 (32), 13204-13224 (2013).
  5. Czöndör, K., et al. Unified quantitative model of AMPA receptor trafficking at synapses. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (9), 3522-3527 (2012).
  6. Triesch, J., Vo, A. D., Hafner, A. S. Competition for synaptic building blocks shapes synaptic plasticity. eLife. 7, 37836 (2018).
  7. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Biophysical model of AMPA receptor trafficking and its regulation during long-term potentiation/long-term depression. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12362-12373 (2006).
  8. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Modeling the role of lateral membrane diffusion in AMPA receptor trafficking along a spiny dendrite. Journal of Computational Neuroscience. 25 (2), 366-389 (2008).
  9. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Stochastic Induction of Long-Term Potentiation and Long-Term Depression. Scientific Reports. 6, 30899 (2016).
  10. Kotaleski, J. H., Blackwell, K. T. Modelling the molecular mechanisms of synaptic plasticity using systems biology approaches. Nature Reviews Neuroscience. 11 (4), 239-251 (2010).
  11. Bhalla, U. S. Molecular computation in neurons: a modeling perspective. Current Opinion in Neurobiology. 25, 31-37 (2014).
  12. Czöndör, K., Thoumine, O. Biophysical mechanisms regulating AMPA receptor accumulation at synapses. Brain Research Bulletin. 93, 57-68 (2013).
  13. Bromer, C., et al. Long-term potentiation expands information content of hippocampal dentate gyrus synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2410-2418 (2018).
  14. Antunes, G., Simoes-de-Souza, F. M. AMPA receptor trafficking and its role in heterosynaptic plasticity. Scientific Reports. 8 (1), 10349 (2018).
  15. Kerr, R. A., et al. Fast monte carlo simulation methods for biological reaction-diffusion systems in solution and on surfaces. SIAM Journal on Scientific Computing. 30 (6), 3126 (2008).
  16. Czech, J., Dittrich, M., Stiles, J. R. Rapid Creation, Monte Carlo Simulation, and Visualization of Realistic 3D Cell Models. Systems Biology. 500, 237-287 (2009).
  17. Stiles, J., Bartol, T., et al. Monte Carlo Methods for Simulating Realistic Synaptic Microphysiology Using MCell. Computational Neuroscience. De Schutter,, et al. , CRC Press. (2000).
  18. Jorstad, A., et al. NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks. Neuroinformatics. 13 (1), 83-92 (2015).
  19. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes de Souza, F. M. Modelling intracellular competition for calcium: kinetic and thermodynamic control of different molecular modes of signal decoding. Scientific Reports. 6, 23730 (2016).
  20. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Molecular mechanisms of detection and discrimination of dynamic signals. Scientific Reports. 8 (1), 2480 (2018).
  21. Hoops, S., et al. COPASI--a COmplex PAthway SImulator. Bioinformatics. 22 (24), 3067-3074 (2006).
  22. Faeder, J. R., Blinov, M. L., Hlavacek, W. S. Rule-based modeling of biochemical systems with BioNetGen. Methods in Molecular Biology. 500, 113-167 (2009).
  23. Gillespie, D. T. Exact stochastic simulation of coupled chemical reactions. Journal of Physical Chemistry. 81 (25), 21 (1977).
  24. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
  25. Matsuda, S., Launey, T., Mikawa, S., Hirai, H. Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons. EMBO Journal. 19 (12), 2765-2774 (2000).
  26. Ahmad, M., et al. Postsynaptic Complexin Controls AMPA Receptor Exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
  27. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annual Review of Biochemistry. 76, 823-847 (2007).

Tags

Neurovetenskap AMPA-receptorhandel reaktionsdiffusion synaptisk plasticitet dendritiska taggar beräkningsmodellering långsiktig potentiering långtidsdepression heterosynaptisk plasticitet
3D-modellering av dendritiska spines med synaptisk plasticitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Antunes, G., Simoes de Souza, F. M.More

Antunes, G., Simoes de Souza, F. M. 3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity. J. Vis. Exp. (159), e60896, doi:10.3791/60896 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter