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Neuroscience

Modelado 3D de espinas dendríticas con plasticidad sináptica

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/60896
Automatic Translation
*1, *1
1Center for Mathematics, Computation and Cognition, Federal University of ABC
* These authors contributed equally

Summary

El protocolo desarrolla un modelo tridimensional (3D) de un segmento dendrítico con espinas dendríticas para modelar plasticidad sináptica. La malla construida se puede utilizar para el modelado computacional del tráfico de receptores AMPA en la plasticidad sináptica a largo plazo utilizando el programa de software Blender con CellBlender y MCell.

Abstract

El modelado computacional de la difusión y la reacción de las especies químicas en una geometría tridimensional (3D) es un método fundamental para entender los mecanismos de plasticidad sináptica en las espinas dendríticas. En este protocolo, la estructura 3D detallada de las dendritas y espinas dendríticas se modela con mallas en el software Blender con CellBlender. Las regiones sinápticas y extrasinápticas se definen en la malla. A continuación, el receptor sináptico y las moléculas de anclaje sináptica se definen con sus constantes de difusión. Por último, se incluyen las reacciones químicas entre los receptores sinápticos y los anclajes sinápticos y el modelo computacional se resuelve numéricamente con el software MCell. Este método describe la ruta espaciotemporal de cada molécula en una estructura geométrica 3D. Por lo tanto, es muy útil estudiar el tráfico de receptores sinápticos dentro y fuera de las espinas dendríticas durante la aparición de plasticidad sináptica. Una limitación de este método es que el alto número de moléculas ralentiza la velocidad de las simulaciones. El modelado de espinas dendríticas con este método permite el estudio de la potenciación homosináptica y la depresión dentro de espinas individuales y plasticidad heterosináptica entre las espinas dendríticas vecinas.

Introduction

La plasticidad sináptica se ha asociado con el aprendizaje y la memoria1. La plasticidad sináptica, como la potenciación a largo plazo (LTP) y la depresión a largo plazo (LTD), se asocia respectivamente con la inserción y eliminación de receptores AMPA (AMPAR) dentro y fuera de la membrana sináptica2. Las sinapsis AMPAR se encuentran en la parte superior de las estructuras de pequeño volumen llamadas espinas dendríticas3. Cada columna vertebral contiene una región densa de proteína en la membrana postsináptica llamada densidad postsináptica (PSD). Las proteínas de anclaje en los AMPAR de DSP en la región sináptica. Hay pocas copias de AMPAR dentro de una sola sinapsis y el tráfico y la reacción de AMPAR con otras especies en espinas dendríticas es un proceso estocástico2,,4. Existen varios modelos compartimentales de tráfico de receptores sinápticos en espinas dendríticas5,6,7,8. Sin embargo, hay una falta de modelos computacionales estocásticos del tráfico de AMPAR asociados con la plasticidad sináptica en las estructuras 3D de las dendritas y sus espinas dendríticas.

El modelado computacional es una herramienta útil para investigar los mecanismos subyacentes a la dinámica de sistemas complejos como la reacción-difusión de AMPAR en espinas dendríticas durante la aparición de plasticidad sináptica9,,10,,11,,12. El modelo se puede utilizar para visualizar escenarios complejos, variando parámetros sensibles y haciendo predicciones importantes en condiciones científicas que implican muchas variables que son difíciles o imposibles de controlarexperimentales 12,,13. Definir el nivel de detalle de un modelo computacional es un paso fundamental para obtener información precisa sobre el fenómeno modelado. Un modelo computacional ideal es un delicado equilibrio entre complejidad y simplicidad para capturar las características esenciales de los fenómenos naturales sin ser computacionalmente prohibitivo. Los modelos computacionales demasiado detallados pueden ser costosos de calcular. Por otro lado, los sistemas que están mal detallados pueden carecer de los componentes fundamentales que son esenciales para capturar la dinámica del fenómeno. Aunque el modelado 3D de espinas dendríticas es computacionalmente más caro que 2D y 1D, hay condiciones, como en sistemas complejos con muchas variables no lineales que reaccionan y difunden en el tiempo y el espacio 3D, para lo cual el modelado a un nivel 3D es esencial para obtener información sobre el funcionamiento del sistema. Además, la complejidad se puede reducir cuidadosamente para preservar las características esenciales de un modelo de menor dimensión.

En un sistema estocástico con pocas copias de una especie determinada dentro de un pequeño volumen, la dinámica media del sistema se desvían de la dinámica media de una gran población. En este caso, se requiere el modelado computacional estocástico de partículas difusoras de reacciones. Este trabajo introduce un método para el modelado estocástico de reacción-difusión de algunas copias de AMPAR en espinas dendríticas 3D. El propósito de este método es desarrollar un modelo computacional 3D de un segmento dendrítico con espinas dendríticas y sus sinapsis para modelar plasticidad sináptica.

El método utiliza el software MCell para resolver el modelo numéricamente, Blender para la construcción de mallas 3D, y CellBlender para crear y visualizar las simulaciones MCell, incluyendo la reacción-difusión espaciotemporal de moléculas en mallas 3D14,,15,,16. Blender es una suite para la creación de mallas y CellBlender es un complemento para el software base Blender. MCell es un simulador de Monte Carlo para la reacción-difusión de moléculas individuales17.

La razón de ser detrás del uso de este método consiste en modelar la plasticidad sináptica para lograr una mejor comprensión de este fenómeno en el entorno microfisiológico de las espinas dendríticas14. En particular, este método permite la simulación de potenciación homosináptica, depresión homosináptica y plasticidad heterosináptica entre espinas dendríticas14.

Las características de este método incluyen el modelado de la estructura geométrica 3D de la dendrita y sus sinapsis, la difusión por caminata aleatoria, y las reacciones químicas de las moléculas implicadas con plasticidad sináptica. Este método proporciona la ventaja de crear entornos enriquecidos para probar hipótesis y hacer predicciones sobre el funcionamiento de un sistema no lineal complejo con un gran número de variables. Además, este método se puede aplicar no sólo para el estudio de la plasticidad sináptica, sino también para el estudio de la reacción estocástica-difusión de moléculas en estructuras de malla 3D en general.

Alternativamente, las mallas 3D de estructuras dendríticas se pueden construir directamente en Blender a partir de reconstrucciones seriales de microscopio electrónico18. Aunque las mallas basadas en reconstrucciones en serie proporcionan estructuras 3D, el acceso a los datos experimentales no siempre está disponible. Así, la construcción de mallas adaptadas a partir de estructuras geométricas básicas, como se describe en el presente protocolo, proporciona flexibilidad para desarrollar segmentos dendríticos personalizados con espinas dendríticas.

Otro método computacional alternativo es la simulación a granel de reacciones bien mezcladas en un volumen regular9,10,11,19,20,21,22. Las simulaciones a granel son muy eficientes en la resolución de las reacciones de muchas especies dentro de un solo volumen bien mezclado23,pero el enfoque a granel es extremadamente lento para resolver la reacción-difusión de moléculas dentro de muchos voxels bien mezclados en una malla 3D de alta resolución. Por otro lado, el método actual que utiliza simulaciones MCell de reacción-difusión de partículas individuales funciona eficientemente en mallas 3D de alta resolución15.

Antes de utilizar este método, uno debe preguntarse si el fenómeno estudiado requiere un enfoque estocástico de reacción-difusión en una malla 3D. Si el fenómeno tiene pocas copias (menos de 1.000) de al menos una de las especies que reaccionan difuminando en una estructura geométrica compleja con compartimentos de pequeño volumen como espinas dendríticas, entonces el modelado estocástico de la reacción-difusión en mallas 3D es apropiado para la aplicación.

Hay varios pasos necesarios para construir un modelo computacional 3D de un segmento dendrítico que contiene espinas dendríticas con plasticidad sináptica. Los pasos principales son la instalación del software adecuado para la construcción del modelo, la construcción de una sola columna vertebral dendrítica que se utilizará como plantilla para crear múltiples espinas, y la creación de un segmento dendrítico que está conectado con múltiples espinas dendríticas. El paso para modelar la plasticidad sináptica consiste en insertar anclajes en la región PSD y AMPAR en el segmento dendrítico y espinas dendríticas. Luego, las reacciones cinéticas entre los anclajes situados en el PSD y los AMPAR se definen para producir especies complejas de anclaje-AMPAR que atrapan los AMPAR en la región sináptica. Respetuosamente, el aumento y la disminución de la afinidad entre los anclajes y los AMPAR sinápticos crean el proceso de LTP y LTD.

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Protocol

NOTA: Consulte el archivo suplementario 1 para ver el glosario de términos utilizados en este protocolo.

1. Instale Blender, CellBlender y MCell

NOTA: Este protocolo requiere la instalación de MCell, Blender y Cell Blender.

  1. Descargue e instale el software en la página principal de MCell (https://mcell.org/tutorials_iframe.html). Vaya a descargas en la parte superior de la página y siga las instrucciones paso a paso para descargar e instalar el software en el entorno de su elección (por ejemplo, Linux, Mac OSX o Windows).
    NOTA: Todos los modelos computacionales y simulaciones descritos en este protocolo se probaron en un paquete CellBlender 1.1 que incluye Blender 2.78 con MCell 3.4 y CellBlender 1.1. También trabajó en Blender 2.79b. Todos estos programas de software son de acceso abierto y no requieren permiso de reimpresión para ser utilizados. Las instrucciones para la construcción y simulación del modelo pueden cambiar ligeramente de una versión a otra. Partes de este protocolo han sido adaptadas de Checo et al.16.

2. Crear una sola columna dendrítica

NOTA: Este procedimiento crea una malla de una sola columna vertebral dendrítica con una cabeza de columna vertebral y un cuello de columna vertebral utilizando una esfera modificada.

  1. Configure la vista 3D de Blender en el panel principal.
    1. Abra Blender con CellBlender ya instalado. Pulse 5 en el teclado para cambiar de Perspectiva a Vista ortogonal y pulse 1 para cambiar a la vista frontal. La vista de perspectiva tiene profundidad, pero esto no es necesario ahora. Cambiar de Perspectiva a vista ortogonal permite una mejor visualización de la malla. Pulse Mayús+C para centrar el cursor(Figura 1A).
  2. Crea la cabeza de la columna vertebral.
    1. Pulse Mayús+A para abrir la paleta de malla. Seleccione la malla y, a continuación, seleccione Esfera UV. Una esfera UV es una malla asignada a la superficie 3D de una esfera. La esfera UV representa la cabeza esférica de una columna dendrítica de setas. El software asume que las unidades de la esfera UV son micrómetros.
    2. Cambie los parámetros en el panel Añadir esfera UV. Cambie Tamaño a 0.25 y Anillos a 32 (Figura 1B). Pulse + o – en el teclado para acercar y alejar, respectivamente, la visualización de la malla. Alternativamente, utilice el botón de desplazamiento del ratón para acercar y alejar (Figura 1C).
      NOTA: El tamaño del parámetro escala el tamaño de la esfera original y los anillos de parámetro definen la resolución de la malla.
  3. Haz que la parte superior de la cabeza sea plana.
    1. Pulse Tab para cambiar Blender desde el modo de objeto,el modo de interacción de objetos estándar,hasta el modo de edición. Trabajar en modo de edición para modificar los componentes de una malla existente.
    2. Una vez seleccionada automáticamente la malla creada, pulse a para anular la selección de la malla creada. Presione z para hacer la malla transparente, lo que ayuda a visualizar las piezas que se editarán. Acercar la malla. Pulse b para seleccionar la parte superior 3/4 de la esfera con el ratón (Figura 2A). Pulse Delete, select verticesy enter para eliminar los vértices (Figura 2B).
    3. Pulse b y seleccione la parte superior. Pulse e, s, 0e introduzca para sellar la parte superior con los vértices todavía seleccionados. Mueva la flecha azul hacia abajo para alinearla a la parte superior de la cabeza de la columna vertebral(Figura 2C). Pulse z para cambiar a vista sólida (Figura 3A). Pulse 7 para cambiar a la vista superior.
      NOTA: La parte superior de la esfera se hace plana para modelar la región PSD de la cabeza de la columna vertebral.
  4. Para aumentar la resolución de malla en la parte superior de la columna vertebral, primero seleccione Herramienta y Cuchillo. Cortar un círculo con el cuchillo alrededor del centro de la parte superior (Figura 3B). Seleccione Herramienta y Corte de bucle y Diapositiva. Repita este paso cuatro veces para crear cuatro círculos concéntricos alrededor del centro de la parte superior (Figura 3C).
    NOTA: Los círculos concéntricos se utilizan para añadir nuevos vóxeles que aumentarán la resolución del PSD.
  5. Crea el cuello de la columna vertebral.
    1. Pulse a para anular la selección de la malla. Pulse 1 para cambiar a la vista frontal. Pulse z para que la malla sea transparente. Pulse b y, a continuación, seleccione la parte inferior de la malla(Figura 4A). Pulse Delete y vertices (Figura 4B). Pulse b y seleccione la parte inferior de la malla(Figura 4C). Pulse e y z, -0,45 para crear una extrusión(Figura 4D).
      NOTA: Esto crea una extrusión a la posición del eje z a -0,45 m. Pulse a a para anular la selección de toda la malla.
    2. Pulse b y seleccione la parte inferior del cuello. Pulse e, sy 0 para sellar la parte inferior(Figura 4E). Pulse a a para seleccionar toda la malla.
  6. Haga que la malla sea compatible con MCell.
    1. Presione Crtl+T para triangular la malla. La malla se transforma en un conjunto de triángulos interconectados. Este es un procedimiento necesario para hacer que la malla sea compatible con MCell. Seleccione Herramienta y Eliminar dobles. Utilice las herramientas Eliminar dobles para eliminar vértices duplicados, si los hay, que tengan las mismas coordenadas o estén muy cerca entre sí, para que la malla sea compatible con MCell.
      NOTA: Es posible que se hayan creado accidentalmente vértices superpuestos dobles durante el proceso de creación y edición de mallas.
    2. Seleccione Objetos de modelo en el panel CellBlender. Cambie el nombre del objeto activo a la columna vertebral y pulse + para crear la columna vertebral del objeto. En el panel CellBlender, seleccione Análisis de malla y, a continuación, haga clic en Analizar malla (Figura 4F). Este procedimiento analizará las propiedades de la malla creada, incluido el número de vértices, aristas, caras, área de superficie, volumen y topología de malla.
      NOTA: El análisis imprimirá la información en el Panel de análisis de malla y debe ser Watertight, Manifoldy Outward-Facing Normals. Este paso es necesario para asegurarse de que la malla funcionará en MCell. De lo contrario, probablemente se perdió un paso. En este caso, elimine la malla y comience desde el paso 2.1 de nuevo.
    3. Pulse z para visualizar la vista sólida de la columna vertebral. Presione Archivo y Guardar para tener una copia de su archivo de licuadora con la columna vertebral en el disco.
      NOTA: Las dimensiones (es decir, longitud, diámetro, tamaño) de las mallas están en micrómetros. Consulte el glosario para conocer el significado de cada método abreviado de teclado.

3. Creación de una dendrita con múltiples espinas

  1. Genere una columna vertebral como se describió anteriormente en las secciones 2.1–2.6. Pulse a a para anular la selección de la columna vertebral. Escriba Mayús+C para centrar el cursor.
  2. Cree una dendrita. Pulse Mayús+A para abrir la paleta de malla. Seleccione Malla y, a continuación, Cilindro. Cambie los parámetros en el menú Añadir cilindro: Radio a 0,3 m, Profundidad a 2 m. Pulse Intro.
    NOTA: El radio y la profundidad de los parámetros se definen según las características geométricas de la dendrita.
  3. Inserte una columna vertebral en la dendrita.
    1. Pulse r y escriba 90 para girar el cilindro 90o(Figura 5A). Utilice la flecha azul para arrastrar el cilindro hacia abajo hasta la parte inferior de la columna vertebral. Pulse 3 en el teclado para tener una vista frontal del cilindro.
    2. Pulse z para que la malla sea transparente. Utilice el ratón para mover la flecha normal azul del cilindro hacia abajo para mover la base de la columna vertebral al interior del cilindro (Figura 5B). Pulse a para anular la selección de todos los objetos.
    3. Utilice el botón derecho del ratón para seleccionar la dendrita (Figura 5C). Seleccione Modificador en el panel Blender(Figura 5D), seleccione Agregar modificador. A continuación, seleccione Boolean, seleccione Operation Uniony seleccione Object spine. Pulse Aplicar para crear una malla conjunta de la dendrita y la columna vertebral(Figura 5E). Esta operación crea una nueva malla fusionando dos mallas en una sola.
      NOTA: La nueva malla será la dendrita combinada y la columna vertebral. La dendrita aislada desaparece cuando se combinan las diferentes mallas, pero la malla aislada de la columna vertebral permanece superpuesta con la nueva malla y se utiliza para generar varias copias de la misma columna vertebral. Elimine todas las espinas aisladas después de terminar la malla. Es fundamental tener una superposición completa entre el cuello de la columna vertebral y la dendrita, de lo contrario, la malla no será estanca.
  4. Establezca el objeto dendrita en el entorno CellBlender.
    1. Pulse a para anular la selección de las mallas. Haga clic con el botón derecho en la dendrita con el ratón para seleccionar solo la dendrita. Seleccione CellBlender, Model Objects ( Objetos del modelo)y active Object (Objeto activo) a Dendrite (Dendrita) y pulse + para crear el objeto Dendrite.
  5. Inserte nuevas espinas en la dendrita.
    1. Pulse 1 para cambiar a la vista lateral del cilindro. Utilice el ratón para seleccionar la malla de la columna vertebral aislada. Para insertar más espinas, siga el paso 3.3, cambiando la posición y el ángulo para insertar cada una para obtener una distribución fisiológica.
  6. Haga que la malla sea compatible con MCell. Para ello, pulse Tab para ir al modo de edición. Pulse a a para seleccionar toda la malla. Presione Crtl+T para triangular la malla. Seleccione Herramienta en el panel Blender y seleccione Eliminar dobles.
  7. Estilizar las mallas.
    1. Suaviza la malla. Pulse Tab para cambiar al modo de objeto. Seleccione Herramienta en el panel Blender y seleccione Suavizar. Seleccione CellBlender, Model Objects ( Objetos del modelo)y seleccione Add a Material (Añadir un material).
    2. Haga que la malla sea transparente seleccionando Objeto transparente y Material transparente. Cambie alfa a 0.5 y entre para que la malla sea parcialmente transparente. Pulse z para cambiar a vista sólida.
  8. Confirme si la malla sigue siendo compatible con MCell. Para ello, seleccione Análisis de malla en el panel CellBlender para asegurarse de que la malla sigue siendo estanca, de malla múltipley normal orientada hacia el exterior.
  9. Guarde el archivo de licuadora como dendrite_with_spines.blend.

4. Definir regiones de superficie

NOTA: Este procedimiento crea las regiones de superficie de la malla que más adelante se utilizarán para configurar cómo interactúan las regiones con las moléculas.

  1. Abra el archivo dendrite_with_spines en el entorno de Blender. Para ello, seleccione Archivo, Abrir, dendrite_with_spines.blendy Abrir archivo de Blender.
  2. Prepare la malla para definir las regiones de superficie. Para ello, pulse Tab para cambiar al modo de edición. Pulse z para cambiar a vista transparente(sombreado de ventana gráfica, estructura alámbrica). Pulse a a para seleccionar toda la malla de la dendrita con espinas. Seleccione Objetos de modelo. Seleccione Dendrite. Pulse t para ocultar el panel CellBlender y visualizar mejor toda la malla en el panel principal.
    1. Utilice + y – en el teclado para acercar y alejar o desplazarse con el ratón. Esto es necesario para una mejor visualización de la parte superior de las espinas para seleccionar y definir las regiones de superficie. Pulse a para anular la selección del objeto. Pulse Tab para cambiar al modo de edición. Pulse t para volver a mostrar el panel CellBlender.
  3. Defina la región de superficie PSD. Para ello, pulse b y seleccione la parte superior de una columna vertebral dendrítica con el ratón (Figura 6A,6B). Pulse + en Regiones de superficie definidas. Cambie el nombre de la región a PSD1 y haga clic la asignación (figura 6C). Pulse a para anular la selección del objeto.
  4. Defina la región de superficie extrasináptica. Para ello, pulse b y seleccione la región alrededor de la parte superior de la columna vertebral dendrítica con el ratón (Figura 6D). Repita el paso 4.3 para el nombre de la región a Extra_syn1. Repita el paso 4.3 para que las otras espinas definan las otras regiones de la malla (PSD2, PSD3, PSD4, Extra_syn2, Extra_syn3y Extra_syn4) (Figura 6F). Pulse a para anular la selección del objeto.
  5. Defina las regiones de superficie de los extremos de la dendrita. Para ello, pulse b y seleccione el extremo izquierdo de la dendrita. Cambie el nombre de la región a Left_end y haga clic en Asignar. Pulse a para anular la selección del objeto. Pulse b y seleccione el extremo derecho de la dendrita(Figura 6E). Cambie el nombre de la región a Right_end y haga clic en Asignar.
    NOTA: Mueva la malla para encontrar la mejor posición para seleccionar cada región definida.

5. Crear moléculas

  1. Cree AMPARs. Para ello, seleccione Moléculas en el panel CellBlender. Seleccione + en Moléculas definidas para insertar una nueva molécula y cambiar Nombre a AMPAR. Cambie el Tipo de molécula a Molécula de superficie y La constante de difusión a 0,05e-8 cm2/s14 para definir la constante de difusión de los AMPAR en la membrana ( Figura7A).
  2. Crear anclajes. Para ello, seleccione Moléculas en el panel CellBlender. Seleccione + en Moléculas definidas para insertar una nueva molécula y cambiar Nombre a ancla. Cambie Tipo de molécula a Molécula de superficie y cambie Constante de difusión a 0.001e-8 cm2/s14 para definir la constante de difusión de los anclajes en la membrana ( Figura7A).
  3. Para crear anclajes enlazados a AMPAR, seleccione Moléculas en el panel CellBlender. Seleccione + en moléculas definidas para insertar una nueva molécula. Cambie Nombre a anchor_AMPAR. Cambie Tipo de molécula a Molécula de superficie. Cambie Constante de difusión a 0.001e-8 cm2/s14.
  4. Cree el anchor_LTP y anchor_AMPAR_LTP. Para ello, repita el paso 5.2. Asigne a la molécula anchor_LTP. Repita el paso 5.3. Asigne a la molécula anchor_AMPAR_LTP.
    NOTA: El anchor_LTP tiene una alta afinidad por AMPAR; por lo tanto, los AMPAR aumentan en las regiones sinápticas.
  5. Cree el anchor_LTD y anchor_AMPAR_LTD. Para crear un ancla_LTD,repita el paso 5.2., Asigne a la molécula anchor_LTD. Repita el paso 5.3. Asigne a la molécula anchor_AMPAR_LTD.
    NOTA: El anchor_LTD tiene una baja afinidad para AMPAR; por lo tanto, los AMPAR disminuyen en la región sináptica.

6. Definir clases de superficie

NOTA: Este procedimiento define las clases con las propiedades asociadas a las regiones de superficie. Las regiones extrasinápticas reflejan los anclajes libres y los anclajes enlazados a AMPAR. Los extremos laterales de la dendrita reflejan todas las moléculas.

  1. Defina las propiedades de las regiones extrasinápticas.
    1. Pulse Tab para cambiar al modo de objeto. Seleccione Clases de superficie en el panel CellBlender. Presione + en la clase de superficie para definir una nueva clase de superficie.
    2. Hacer que la región extrasináptica refleje el AMPAR unido a las moléculas de anclaje.
      NOTA: Este procedimiento atrapará los anclajes y todo lo que están enlazados a ellos dentro de la región sináptica.
      1. Cambie Nombre de clase de superficie a reflective_extra_syn. Pulse + en propiedades reflective_extra_syn para asociarla con una molécula. Seleccionar moléculas ? Molécula única. Seleccione anchor_AMPAR. Seleccione Orientación > Ignorar. Seleccione Tipo & gt; Reflectante para hacer que la región muestre las moléculas anchor_AMPAR.
      2. Repita el paso 6.1.2.1 para anchor_AMPAR_LTP y anchor_AMPAR_LTD.
    3. Haga que la región extrasináptica refleje los anclajes.
      1. Pulse + en propiedades reflective_extra_syn para asociarla con una molécula. Seleccionar moléculas ? Molécula única. Seleccione ancla. Seleccione Orientación > Ignorar. Seleccione Tipo , Reflectante para hacer que la región refleje las moléculas de anclaje.
      2. Repita el paso 6.1.3.1 para anchor_LTP y anchor_LTD.
  2. Defina las propiedades de los extremos de dendrita. Para ello, presiona + en Clase de superficie para definir una nueva clase de superficie. Cambie Nombre de clase de superficie a reflective_ends. Pulse + en Propiedades para asociarlo con una molécula. Seleccionar moléculas ? Todas las moléculas de superficie. Seleccione Orientación ? Ignorar. Seleccione Tipo de tipo ? Reflectante para que refleje todas las moléculas superficiales.

7. Asigne las clases creadas a cada región de superficie

NOTA: Este paso asigna las clases de superficie a las regiones de superficie.

  1. Asigne las propiedades de los extremos de la dendrita.
    1. Pulse + para asignar una clase de superficie con una región. Seleccione reflective_ends para Nombre de clase de superficie ( Figura7C). Seleccione Dendrite para Nombre de objeto. Seleccione Región especificada para Selección de región. Seleccione Left_end para Nombre de región.
    2. Repita el paso 7.1.1 para el Right_end (Figura 7D).
  2. Asigne las propiedades de las regiones extrasinápticas.
    1. Pulse + para asignar una clase de superficie con una región. Seleccione reflective_extra_syn para Nombre de clase de superficie. Seleccione Dendrite para Nombre de objeto. Seleccione Región especificada para Selección de región. Seleccione Extra_syn1 en Nombre de región.
    2. Repita el paso 7.2.1 para Extra_syn2, Extra_syn3y Extra_syn4.

8. Coloque moléculas en la malla

NOTA: Este paso coloca los AMPAR, los anclajesy el AMPAR enlazados a anclajes en la malla.

  1. Para colocar moléculas AMPAR en la malla, seleccione Colocación de moléculas en el panel CellBlender. Pulse + en los sitios de liberación/colocación para crear un nuevo sitio de lanzamiento. Cambie el nombre del sitio a relAMPAR (Figura 7B). Seleccione 1,000 Molécula á AMPAR. Objeto/Región - Dendrita[ALL]-(Dendrite[Left_end]+Dendrita[Right_end]). Quantity to Release
  2. Coloque moléculas de anclaje en la malla.
    1. Seleccione Colocación de moléculas en el panel CellBlender. Pulse + en los sitios de liberación/colocación para crear un nuevo sitio de lanzamiento. Cambie Nombre del sitio a rel_anchor_PSD1. Seleccione Anclajede molécula. Objeto/Región - Dendrita[PSD1]. Cantidad a liberar 200.
    2. Repita el paso 8.2.1 para PSD2, PSD3y PSD4.
  3. Coloque anchor_LTP moléculas en la malla. Para ello, seleccione Colocación de moléculas en el panel CellBlender. Pulse + en los sitios de liberación/colocación para crear un nuevo sitio de lanzamiento. Cambie Nombre del sitio a rel_anchor_LTP_PSD1. Seleccione Molécula anchor_LTP anchor_LTP. Objeto/Región > Dendrita[PSD1]. Quantity to Release 0
    NOTA: anchor_LTP es un ancla con alta afinidad de unión para AMPAR.
  4. Coloque anchor_LTD moléculas en la malla repitiendo el paso 8.3 para anchor_LTD.
    NOTA: anchor_LTD es un ancla con baja afinidad de unión para AMPAR.

9. Crear las reacciones químicas

  1. Creación de la reacción entre el ancla y los AMPAR.
    1. Seleccione Reacciones (Figura 7D) para crear las reacciones. Pulse + para incluir una nueva reacción. Reactantes de anclaje' + AMPAR'. Tipo de reacción <->. Esto define una reacción bidireccional. Productos de anchor_AMPAR'. 0.03 0.05 Forward Rate Backward Rate
  2. Cree la reacción entre ANCHOR_LTP y AMPARs. Para ello, repita el paso 9.1, pero reemplace el ancla por anchor_LTP,y utilice una velocidad de retroceso de 0,005 para aumentar la afinidad entre los reactivos.
  3. Cree la reacción entre anchor_LTD y AMPARs y guarde el archivo. Para ello, repita el paso 9.2, pero reemplace el ancla por anchor_LTD,y utilice una velocidad hacia atrás 0,5 para disminuir la afinidad entre los reactivos. A continuación, guarde el archivo.

10. Trazar la salida del modelo

  1. Trazar anclajes enlazados a AMPAR en el PSD1 durante la condición basal. Para ello, seleccione Configuración de salida de trazado. Pulse + para definir las moléculas. Seleccione anchor_AMPAR en Molécula. Seleccione dendrita en Objeto. Seleccione PSD1 en Región. Repita el paso 10.1 para todas las regiones PSD.
    NOTA: Es útil observar el número basal de AMPAR atrapados en el PSD de cada columna dendrítica. El número de anclajes enlazados a AMPAR puede aumentar o disminuir en comparación con las condiciones basales durante LTP y LTD.
  2. Trazar anclajes enlazados a AMPAR en el PSD1 durante LTP. Para ello, repita el paso 10.1. Reemplace anchor_AMPAR por anchor_AMPAR_LTPy, a continuación, trazar los anclajes enlazados a AMPAR en el PSD1 durante LTD y, finalmente, repetir el paso 10.1, pero reemplazar anchor_AMPAR_LTP con anchor_AMPAR_LTD.

11. Ejecute las simulaciones

  1. Para ejecutar la condición basal, seleccione Ejecutar simulación. Seleccione Iteraciones 30.000. Ajuste el paso de tiempo a 1e-3 s. Pulse Exportar y ejecutar. Espere hasta que finalice la simulación. Puede tardar de minutos a horas.
    NOTA: En la condición basal, no hay liberación de anchor_LTP y rel_anchor_LTD moléculas. En cuanto a los parámetros de la simulación, el número de iteraciones debe ser lo suficientemente largo como para poder observar la difusión de AMPAR de las dendritas y su anclaje en PSD. Los pequeños pasos de tiempo son más precisos pero más lentos para completar la simulación.
  2. Seleccione Volver a cargar datos de visualización. Seleccione la animación de reproducción para visualizar los resultados espaciotemporales (Figura 8). Seleccione Configuración de salida de trazado. Pulse Trazar.
    NOTA: Los gráficos generados por CellBlender son series temporales aisladas de las especies químicas seleccionadas. Los programas de terceros se pueden utilizar para importar los datos guardados de múltiples simulaciones para crear trazados superpuestos de varias condiciones (por ejemplo, basal, LTP, LTD; véase la Figura 8).
  3. Ejecute la condición de potenciación homosináptica (es decir, LTP; véase la figura 8). Para ello, seleccione Colocación de moléculas en el panel CellBlender. Seleccione rel_anchor_LTP_PSD1 en los sitios de liberación/colocación.
  4. Cambie la cantidad a liberación 200. Seleccione rel_anchor_LTD_PSD1 en los sitios de liberación/colocación. Cambie la cantidad a liberación . 0 Seleccione rel_anchor _PSD1 en los sitios de liberación/colocación. Cambie la cantidad a liberación . 0 Repita los pasos 11.1–11.2.
  5. Ejecute la condición de depresión homosynaptic (es decir, LTD; véase la figura 8). Para ello, la versión 200 rel_anchor_LTD_PSD1 en lugar de rel_ANCHOR_LTP_PSD1. Establezca rel_anchor y rel_anchor_LTP_PSD1 en cero. Repita los pasos 11.1–11.2.

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Representative Results

Estos resultados proporcionan los pasos para la construcción de una malla 3D que simula una columna vertebral dendrítica con la cabeza de la columna vertebral y el cuello de la columna vertebral(Figura 1 a Figura 4). Además, se pueden insertar múltiples espinas dendríticas en un solo segmento dendrítico (Figura 5) para estudiar la plasticidad heterosináptica de ampers14. El PSD en la parte superior de la cabeza de la columna vertebral (Figura 6) es el lugar donde los anclajes sinápticos se unen a los AMPAR y los atrapan temporalmente en la sinapsis (Figura 7, Figura 8).

La plasticidad sináptica podría verificarse aproximadamente a través de cambios en el número de especies de anchor_AMPAR, anchor_AMPAR_LTPy anchor_AMPAR_LTD en cada columna vertebral. Para el cálculo exacto de la ocurrencia de plasticidad sináptica, se recomienda calcular la variación en el número total de AMPAR anclados y libres en la sinapsis. Esto se puede realizar utilizando programas de terceros para abrir los datos guardados de la simulación para resumir la serie temporal de los AMPAR libres y los AMPAR anclados en cada PSD (Figura 8).

La liberación de AMPAR en la malla permitió la observación de su difusión por un paseo aleatorio estocástico a lo largo de la dendrita y las espinas dendríticas. Los factores que modifican la afinidad de los AMPAR para los anclajes, tales como las modificaciones posttranslacionales y las alteraciones de las tasas de endocitosis y exocitosis, pueden atrapar a los AMPAR en el PSD24,,25,,26. La unión de AMPAR con los anclajes situados en el PSD atrapó una alta densidad de AMPAR en la sinapsis. La potenciación homosináptica (Figura 9) y la depresión (Figura 10) podrían verificarse respectivamente mediante aumentos y disminuciones en el número de AMPAR anclados causados por cambios en la afinidad de los AMPAR por anclajes en comparación con la condición basal (Figura 11). Los factores que redujeron la afinidad de los AMPAR con los anclajes liberaron múltiples AMPAR de una columna dendrítica (es decir, depresión homosináptica) y potenciación heterosináptica inducida en las espinas vecinas. También, factores que aumentaron la afinidad de amperes para los anclajes en una columna vertebral inducida potenciación homosináptica en esa columna vertebral y depresión heterosináptica en las espinas vecinas14. De esta manera, se observó plasticidad heterosináptica como el efecto opuesto en las espinas vecinas de la plasticidad homosináptica inducida en una columna vertebral dada. Por ejemplo, la inducción homosináptica de LTP en una sola columna vertebral creó un efecto LTD heterosináptico en las espinas vecinas (Figura 8E,F,G).

Figure 1
Figura 1: Creación de la cabeza de la columna vertebral dendrítica utilizando una malla esférica. (A) Adición de la esfera UV. (B) Configuración de las dimensiones de la esfera. (C) Observación de la esfera creada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Construcción de la región superior. (A) Selección de la región superior de la esfera. (B) Eliminación de la región seleccionada para que sea plana. (C) Sellado de la tapa plana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Creación de áreas concéntricas en la parte superior de la columna vertebral. (A) Visualización de la parte superior. (B) Uso de un cuchillo para definir una región concéntrica. (C) Creación de varias regiones concéntricas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Creación del cuello dendrítico de la columna vertebral. (A) Selección de la parte inferior de la esfera modificada. (B) Eliminación de los vértices seleccionados. (C) Selección de la parte inferior. (D) Extrusión de la parte inferior para crear el cuello de la columna vertebral. (E) Sellar la parte inferior del cuello de la columna vertebral. (F) Análisis de la columna vertebral creada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Creación de la dendrita con múltiples espinas. (A) Uso de la malla cilíndrica para crear una dendrita. (B) Alinear la columna vertebral dendrítica con el cilindro. (C) Unir el cilindro con la columna vertebral. (D) La operación booleana para unir las mallas. (E) La nueva malla combinada. (F) Adición de la segunda columna vertebral. (G) Adición de la tercera columna vertebral. (H) Adición de la cuarta columna vertebral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Definición de la región PSD y la zona perisináptica. (A) Selección de la región PSD. (B) Vista detallada del PSD creado. (C) Definición de la región de superficie PSD. (D) Selección y definición de la zona perisináptica alrededor del PSD. (E) Selección y definición de la superficie lateral de la dendrita. (F) Regiones de superficie definidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Definición de las moléculas superficiales. (A) Definición de AMPAR, anclaje y AMPAR enlazados al ancla. (B) Definición de la ubicación y cantidad de las copias AMPAR. (C) Definición de las clases de superficie. (D) Asignación de clases de superficie. (E) Creación de las reacciones químicas entre las moléculas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Resultados representativos de la plasticidad sináptica. (A) Diferentes mallas de un segmento dendrítico con dos, cuatro u ocho espinas. (B) Una visión diferente del segmento dendrítico con ocho espinas. (C) Vista detallada de una columna dendrítica con AMPAR y anclajes en el PSD. (D) Diagrama del tráfico de AMPAR dentro y fuera de la DSP a través de sus interacciones con los anclajes. (E-G) Las curvas muestran el número de AMPAR sinápticos en cada PSD para la condición basal y durante LTP y LTD. La inducción de LTP homosynáptico o LTD en una sola columna vertebral creó un efecto heterosináptico en las espinas cercanas para la malla con dos espinas (E), cuatro espinas (F), y ocho espinas (G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Resultado representativo de la condición LTP. (A) El eje X es el tiempo y el eje Y es el número del complejo anchor_LTP_AMPAR en PSD1. Hubo un lanzamiento de 200 anchor_LTP libres al principio de la simulación. Se formó un mayor número de enlaces con anclajes en comparación con la condición basal (Figura 11) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Resultado representativo de la condición LTD. (A) El eje X es el tiempo y el eje Y es el número del complejo anchor_LTD_AMPAR en PSD1. Hubo un lanzamiento de 200 anchor_LTD libres al principio de la simulación. Se formó un menor número de enlaces con anclajes en comparación con la condición basal(Figura 11). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Resultado representativo durante la condición basal. (A) El eje X es el tiempo y el eje Y es el número del complejo anchor_AMPAR en PSD1. Hubo un lanzamiento de 200 anclajes libres al principio de la simulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este artículo presenta un método para la construcción de mallas 3D para modelar procesos de plasticidad sináptica de reacción-difusión en un segmento dendrítico con espinas dendríticas. El modelo desarrollado contiene un segmento dendrítico con pocas espinas dendríticas. La difusión lateral y la reacción de los AMPAR con anclajes sinápticos permiten la simulación de la dinámica basal. Los pasos críticos en el protocolo son cortar la esfera para la creación de la parte superior de la cabeza de la columna vertebral (Figura 1, Figura 2, Figura 3), la extrusión para crear el cuello de la columna vertebral (Figura 4), y la unión de la dendrita y las espinas en una sola malla (Figura 5). Es fundamental tener una superposición completa entre el cuello de la columna vertebral y la dendrita; de lo contrario, la malla no será estanca. Otros pasos críticos son la selección de las regiones de membrana y la definición de las clases de superficie (Figura 6, Figura 7). Guarde los archivos para cada paso crítico con un nombre diferente.

Utilice la herramienta de análisis de malla para asegurarse de que la malla es estanca, múltiple y orientada hacia afuera normal después de crear la sola columna vertebral y después de crear la dendrita combinada con la columna vertebral. Si la malla falla este análisis, vuelva a la última versión correcta guardada. Algunos pasos pueden ser ligeramente diferentes dependiendo de la versión del software instalado, el sistema operativo y el tipo de teclado.

Este protocolo simula el tráfico de moléculas AMPAR en la malla 3D(Figura 8, Figura 9, Figura 10, Figura 11), que es clave para la transmisión excitatoria neuronal y plasticidad sináptica. El tráfico de moléculas individuales en una malla 3D es una característica valiosa de este modelo con respecto a los métodos existentes basados en volúmenes bien mezclados con distribuciones homogéneas de moléculas21,,22,que no es la condición fisiológica en las sinapsis27. Una limitación de esta técnica es el alto costo computacional y la velocidad lenta de las simulaciones que utilizan un alto número de copias de cada molécula y un alto número de reacciones químicas entre ellas. Esta restricción se puede superar reduciendo el número de copias de cada especie.

La construcción de un sistema con una malla 3D realista y seguimiento espaciotemporal de moléculas es una poderosa herramienta para probar escenarios mecánicos que pueden dar grandes perspectivas sobre el funcionamiento de sistemas con un alto número de variables no lineales.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención de la Fundación Estatal de Ciencias de Sao Paulo (FAPESP) #2015/50122-0 e IRTG-GRTK 1740/2, por la subvención IBM/FAPESP #2016/18825-4, y por la subvención FAPESP #2018/06504-4.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blender Blender Foundation https://www.blender.org/
CellBlender University of Pittsburgh https://mcell.org/
Mcell University of Pittsburgh https://mcell.org/

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References

  1. Sweatt, J. D. Neural plasticity and behavior - sixty years of conceptual advances. Journal of Neurochemistry. 139, 179-199 (2016).
  2. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320 (5873), 201-205 (2008).
  3. Buonarati, O. R., Hammes, E. A., Watson, J. F., Greger, I. H., Hell, J. W. Mechanisms of postsynaptic localization of AMPA-type glutamate receptors and their regulation during long-term potentiation. Science Signaling. 12 (562), 6889 (2019).
  4. Nair, D., et al. Super-Resolution Imaging Reveals That AMPA Receptors Inside Synapses Are Dynamically Organized in Nanodomains Regulated by PSD95. Journal of Neuroscience. 33 (32), 13204-13224 (2013).
  5. Czöndör, K., et al. Unified quantitative model of AMPA receptor trafficking at synapses. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (9), 3522-3527 (2012).
  6. Triesch, J., Vo, A. D., Hafner, A. S. Competition for synaptic building blocks shapes synaptic plasticity. eLife. 7, 37836 (2018).
  7. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Biophysical model of AMPA receptor trafficking and its regulation during long-term potentiation/long-term depression. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12362-12373 (2006).
  8. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Modeling the role of lateral membrane diffusion in AMPA receptor trafficking along a spiny dendrite. Journal of Computational Neuroscience. 25 (2), 366-389 (2008).
  9. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Stochastic Induction of Long-Term Potentiation and Long-Term Depression. Scientific Reports. 6, 30899 (2016).
  10. Kotaleski, J. H., Blackwell, K. T. Modelling the molecular mechanisms of synaptic plasticity using systems biology approaches. Nature Reviews Neuroscience. 11 (4), 239-251 (2010).
  11. Bhalla, U. S. Molecular computation in neurons: a modeling perspective. Current Opinion in Neurobiology. 25, 31-37 (2014).
  12. Czöndör, K., Thoumine, O. Biophysical mechanisms regulating AMPA receptor accumulation at synapses. Brain Research Bulletin. 93, 57-68 (2013).
  13. Bromer, C., et al. Long-term potentiation expands information content of hippocampal dentate gyrus synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2410-2418 (2018).
  14. Antunes, G., Simoes-de-Souza, F. M. AMPA receptor trafficking and its role in heterosynaptic plasticity. Scientific Reports. 8 (1), 10349 (2018).
  15. Kerr, R. A., et al. Fast monte carlo simulation methods for biological reaction-diffusion systems in solution and on surfaces. SIAM Journal on Scientific Computing. 30 (6), 3126 (2008).
  16. Czech, J., Dittrich, M., Stiles, J. R. Rapid Creation, Monte Carlo Simulation, and Visualization of Realistic 3D Cell Models. Systems Biology. 500, 237-287 (2009).
  17. Stiles, J., Bartol, T., et al. Monte Carlo Methods for Simulating Realistic Synaptic Microphysiology Using MCell. Computational Neuroscience. De Schutter,, et al. , CRC Press. (2000).
  18. Jorstad, A., et al. NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks. Neuroinformatics. 13 (1), 83-92 (2015).
  19. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes de Souza, F. M. Modelling intracellular competition for calcium: kinetic and thermodynamic control of different molecular modes of signal decoding. Scientific Reports. 6, 23730 (2016).
  20. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Molecular mechanisms of detection and discrimination of dynamic signals. Scientific Reports. 8 (1), 2480 (2018).
  21. Hoops, S., et al. COPASI--a COmplex PAthway SImulator. Bioinformatics. 22 (24), 3067-3074 (2006).
  22. Faeder, J. R., Blinov, M. L., Hlavacek, W. S. Rule-based modeling of biochemical systems with BioNetGen. Methods in Molecular Biology. 500, 113-167 (2009).
  23. Gillespie, D. T. Exact stochastic simulation of coupled chemical reactions. Journal of Physical Chemistry. 81 (25), 21 (1977).
  24. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
  25. Matsuda, S., Launey, T., Mikawa, S., Hirai, H. Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons. EMBO Journal. 19 (12), 2765-2774 (2000).
  26. Ahmad, M., et al. Postsynaptic Complexin Controls AMPA Receptor Exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
  27. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annual Review of Biochemistry. 76, 823-847 (2007).

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Neurociencia Número 159 Tráfico de receptores AMPA reacción-difusión plasticidad sináptica espinas dendríticas modelado computacional potenciación a largo plazo depresión a largo plazo plasticidad heterosináptica
Modelado 3D de espinas dendríticas con plasticidad sináptica
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Antunes, G., Simoes de Souza, F. M. 3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity. J. Vis. Exp. (159), e60896, doi:10.3791/60896 (2020).

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