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Neuroscience

Modellazione 3D di spine dendritiche con plasticità sinaptica

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/60896
Automatic Translation
*1, *1
1Center for Mathematics, Computation and Cognition, Federal University of ABC
* These authors contributed equally

Summary

Il protocollo sviluppa un modello tridimensionale (3D) di un segmento dendritico con spine dendritiche per modellare la plasticità sinaptica. La rete costruita può essere utilizzata per la modellazione computazionale del traffico di recettori AMPA nella plasticità sinaptica a lungo termine utilizzando il programma software Blender con CellBlender e MCell.

Abstract

La modellazione computazionale della diffusione e della reazione delle specie chimiche in una geometria tridimensionale (3D) è un metodo fondamentale per comprendere i meccanismi della plasticità sinaptica nelle spine dendritiche. In questo protocollo, la struttura 3D dettagliata dei dendriti e delle spine dendritiche è modellata con maglie sul software Blender con CellBlender. Le regioni sinaptiche ed extrasinaptiche sono definite sulla mesh. Successivamente, il recettore sinaptico e le molecole di ancoraggio sinaptico sono definiti con le loro costanti di diffusione. Infine, le reazioni chimiche tra i recettori sinaptici e le ancore sinaptiche sono incluse e il modello computazionale viene risolto numericamente con il software MCell. Questo metodo descrive il percorso spatiotemporale di ogni singola molecola in una struttura geometrica 3D. Pertanto, è molto utile studiare il traffico di recettori sinaptici dentro e fuori le spine dendritiche durante il verificarsi della plasticità sinaptica. Una limitazione di questo metodo è che l'elevato numero di molecole rallenta la velocità delle simulazioni. La modellazione di spine dendritiche con questo metodo permette lo studio del potenziamento omosynaptic e della depressione all'interno di singole spine e plasticità eterosyaptic tra spine dendritiche adiacenti.

Introduction

La plasticità sinaptica è stata associata all'apprendimento e alla memoria1. La plasticità sinaptica, come il potenziamento a lungo termine (LTP) e la depressione a lungo termine (LTD), è associata rispettivamente all'inserimento e alla rimozione dei recettori AMPA (AMPA) dentro e fuori la membranasinaptica 2. Le sinapsi AMPAR si trovano in cima alle strutture di piccolo volume chiamate spine dendritiche3. Ogni colonna vertebrale contiene una regione densa di proteine nella membrana post-sinaptica chiamata densità post-sinaptica (PSD). Proteine di ancoraggio presso gli AMPAR di trappola PSD nella regione sinaptica. Ci sono poche copie di AMPARs all'interno di una singola sinapsi e il traffico e la reazione di AMPARs con altre specie in spine dendritiche è un processo stocastico2,4. Ci sono diversi modelli compartimentali di traffico di recettori sinaptici a spine dendritiche5,6,7,8. Tuttavia, vi è una mancanza di modelli computazionali stocastici del traffico di AMPAR associati alla plasticità sinaptica nelle strutture 3D dei dendriti e delle loro spine dendritiche.

La modellazione computazionale è uno strumento utile per studiare i meccanismi alla base delle dinamiche di sistemi complessi come la reazione-diffusione degli AMPAR nelle spine dendritiche durante il verificarsi della plasticità sinaptica9,10,11,12. Il modello può essere utilizzato per visualizzare scenari complessi, vari parametri sensibili e fare importanti previsioni in condizioni scientifiche che coinvolgono molte variabili che sono difficili o impossibili da controllaresperimentale 12,13. La definizione del livello di dettaglio di un modello computazionale è un passaggio fondamentale per ottenere informazioni accurate sul fenomeno modellato. Un modello computazionale ideale è un delicato equilibrio tra complessità e semplicità per cogliere le caratteristiche essenziali dei fenomeni naturali senza essere proibizzabili dal punto di vista computazionale. I modelli computazionali troppo dettagliati possono essere costosi da calcolare. D'altra parte, i sistemi scarsamente dettagliati possono mancare i componenti fondamentali che sono essenziali per catturare la dinamica del fenomeno. Anche se la modellazione 3D delle spine dendritiche è computazionalmente più costosa di 2D e 1D, ci sono condizioni, come nei sistemi complessi con molte variabili non lineari che reagiscono e si diffonde nel tempo e nello spazio 3D, per le quali la modellazione a livello 3D è essenziale per ottenere informazioni sul funzionamento del sistema. Inoltre, la complessità può essere ridotta con attenzione per preservare le caratteristiche essenziali di un modello di dimensioni inferiori.

In un sistema stocastico con poche copie di una determinata specie all'interno di un piccolo volume, la dinamica media del sistema si discosta dalla dinamica media di una grande popolazione. In questo caso, è necessaria la modellazione computazionale stocastica delle particelle di diffusione della reazione. Questo lavoro introduce un metodo per la modellazione stocastica reazione-diffusione di alcune copie di AMPAR in spine dendritiche 3D. Lo scopo di questo metodo è quello di sviluppare un modello computazionale 3D di un segmento dendritico con spine dendritiche e le loro sinapsi per modellare la plasticità sinaptica.

Il metodo utilizza il software MCell per risolvere il modello numericamente, Blender per la costruzione di mesh 3D e CellBlender per creare e visualizzare le simulazioni MCell, tra cui la reazione-diffusione spatiotemporale delle molecole nelle mesh 3D14,15,16. Blender è una suite per la creazione di mesh e CellBlender è un add-on per il software di base Blender. MCell è un simulatore Monte Carlo per la reazione-diffusione di singole molecole17.

La logica alla base dell'uso di questo metodo consiste nella modellazione della plasticità sinaptica per ottenere una migliore comprensione di questo fenomeno nell'ambiente microfisiologico delle spine dendritiche14. In particolare, questo metodo consente la simulazione di potenziamento omosynaptic, depressione omosynaptic, e plasticità eterosynaptic tra spine dendritiche14.

Le caratteristiche di questo metodo includono la modellazione della struttura geometrica 3D del dendrite e delle sue sinapsi, la diffusione a piedi casuali e le reazioni chimiche delle molecole coinvolte nella plasticità sinaptica. Questo metodo offre il vantaggio di creare ambienti ricchi per testare ipotesi e fare previsioni sul funzionamento di un sistema non lineare complesso con un numero elevato di variabili. Inoltre, questo metodo può essere applicato non solo per studiare la plasticità sinaptica, ma anche per studiare la reazione-diffusione stocastica delle molecole nelle strutture a maglie 3D in generale.

In alternativa, le maglie 3D di strutture dendritiche possono essere costruite direttamente in Blender da ricostruzioni seriali al microscopioelettronico 18. Sebbene le mesh basate su ricostruzioni seriali forniscano strutture 3D, l'accesso ai dati sperimentali non è sempre disponibile. Così, la costruzione di maglie adattate da strutture geometriche di base, come descritto nel presente protocollo, offre flessibilità per sviluppare segmenti dendritici personalizzati con spine dendritiche.

Un altro metodo di calcolo alternativo è la simulazione di massa di reazioni ben miscelate in un volume regolare9,10,11,19,20,21,22. Le simulazioni di massa sono molto efficienti nel risolvere le reazioni di molte specie all'interno di un singolo volume ben miscelato23, ma l'approccio di massa è estremamente lento per risolvere la reazione-diffusione delle molecole all'interno di molti voxel ben miscelati in una rete 3D ad alta risoluzione. D'altra parte, il metodo attuale che utilizza simulazioni MCell di reazione-diffusione di singole particelle funziona in modo efficiente in maglie 3D ad altarisoluzione 15.

Prima di utilizzare questo metodo, ci si dovrebbe chiedere se il fenomeno studiato richiede un approccio di reazione-diffusione stocastica in una mesh 3D. Se il fenomeno ha poche copie (meno di 1.000) di almeno una delle specie che reagiscono diffondendo in una struttura geometrica complessa con piccoli scomparti volumetici come spine dendritiche, allora la modellazione stocastica della diffusione della reazione nelle maglie 3D è appropriata per l'applicazione.

Ci sono diversi passaggi necessari per costruire un modello computazionale 3D di un segmento dendritico contenente spine dendritiche con plasticità sinaptica. I passaggi principali sono l'installazione del software adeguato per la costruzione del modello, la costruzione di una singola colonna vertebrale dendritica da utilizzare come modello per creare più spine e la creazione di un segmento dendritico collegato a più spine dendritiche. Il passo per la modellazione della plasticità sinaptica consiste nell'inserire ancoraggi nella regione PSD e AMPAR nel segmento dendritico e nelle spine dendritiche. Quindi, le reazioni cinetiche tra le ancore situate presso il PSD e gli AMPAR sono definite per produrre complesse specie di ancoraggio-AMPAR che intrappolano gli AMPAR nella regione sinaptica. Rispettivamente, l'aumento e la diminuzione dell'affinità tra le ancore e gli AMPAR sinaptici creano il processo di LTP e LTD.

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Protocol

NOTA: Consultare il file supplementare 1 per il glossario dei termini utilizzati in questo protocollo.

1. Installare Blender, CellBlender e MCell

NOTA: questo protocollo richiede l'installazione di MCell, Blender e Cell Blender.

  1. Scaricare e installare il software nella home page di MCell (https://mcell.org/tutorials_iframe.html). Vai ai download nella parte superiore della pagina e quindi segui le istruzioni dettagliate per scaricare e installare il software nell'ambiente preferito (ad esempio, Linux, Mac OSX o Windows).
    NOTA: tutti i modelli computazionali e le simulazioni descritte in questo protocollo sono stati testati su un pacchetto CellBlender 1.1 che include Blender 2.78 con MCell 3.4 e CellBlender 1.1. Ha funzionato anche su Blender 2.79b. Tutti questi programmi software sono ad accesso aperto e non richiedono l'autorizzazione di ristampa da utilizzare. Le istruzioni per la costruzione e la simulazione del modello possono cambiare leggermente da una versione all'altra. Parti di questo protocollo sono state adattate dalla Repubblica ceca et al.16.

2. Creare una singola colonna vertebrale dendritica

NOTA: Questa procedura crea una rete di una singola colonna vertebrale dendritica con una testa della colonna vertebrale e un collo della colonna vertebrale utilizzando una sfera modificata.

  1. Impostare la vista 3D di Blender nel pannello principale.
    1. Aprire Blender con CellBlender già installato. Premere 5 sul tastierino numerico per passare dalla vista Prospettiva a Vista ortogonale e premere 1 per passare alla vista frontale. La vista prospettica ha profondità, ma questo non è necessario ora. Il passaggio dalla vista Prospettiva a Vista ortogonale consente una migliore visualizzazione della mesh. Premete Maiusc-C per centrare il cursore (Figura 1A).
  2. Creare la testa della colonna vertebrale.
    1. Premete Maiusc-A per aprire la tavolozza mesh. Selezionare la mesh, quindi sfera UV. Una sfera UV è una mesh mappata alla superficie 3D di una sfera. La sfera UV rappresenta la testa sferica di una colonna vertebrale dendritica di funghi. Il software presuppone che le unità della sfera UV siano micrometri.
    2. Modificare i parametri nel pannello Aggiungi sfera UV. Impostare Dimensione su 0,25 e Anelli a 32 (Figura 1B). Premere il tasto o – sul tastierino per ingrandire e ridurre rispettivamente la visualizzazione della mesh. In alternativa, utilizzare il pulsante di scorrimento del mouse per eseguire lo zoom avanti e indietro (Figura 1C).
      NOTA: la dimensione del parametro ridimensiona la dimensione della sfera originale e gli anelli dei parametri definiscono la risoluzione della mesh.
  3. Rendere la parte superiore della testa piatta.
    1. Premere TAB per passare da Blender dalla modalità oggetto , lamodalità di interazione degli oggetti standard, alla modalità di modifica. Lavorare in modalità di modifica per modificare i componenti di una mesh esistente.
    2. Una volta selezionata automaticamente la mesh creata, premere a per deselezionare la mesh creata. Premere z per rendere la mesh trasparente, che consente di visualizzare le parti che verranno modificate. Ingrandire la mesh. Premere b per selezionare i primi 3/4 della sfera con il mouse (Figura 2A). Premere CANC, selezionare verticie immettere per rimuovere i vertici (Figura 2B).
    3. Premere b e selezionare la parte superiore. Premere e, s, 0e immettere per sigillare la parte superiore con i vertici ancora selezionati. Spostare la freccia blu verso il basso per allinearsi alla parte superiore della testa della colonna vertebrale (Figura 2C). Premere z per passare alla visualizzazione a tinta unita (Figura 3A). Premere 7 per passare alla vista superiore.
      NOTA: La parte superiore della sfera è resa piatta per modellare la regione PSD della testa della colonna vertebrale.
  4. Per aumentare la risoluzione della mesh nella parte superiore della colonna vertebrale, selezionare Prima utensile e Coltello. Tagliare un cerchio con il coltello intorno al centro della parte superiore (Figura 3B). Selezionate Strumento (Tool) e Taglio loop (Loop Cut and Slide). Ripetere questo passaggio quattro volte per creare quattro cerchi concentrici intorno al centro della parte superiore (Figura 3C).
    NOTA: I cerchi concentrici vengono utilizzati per aggiungere nuovi voxel che aumenteranno la risoluzione del PSD.
  5. Creare il collo della colonna vertebrale.
    1. Premere a per deselezionare la mesh. Premere 1 per passare alla vista frontale. Premere z per rendere la mesh trasparente. Premere b e selezionare la parte inferiore della mesh (Figura 4A). Premere CANC e vertici ( Figura4B). Premere b e selezionare la parte inferiore della mesh (Figura 4C). Premere e e z, -0.45 per creare un'estrusione ( Figura4D).
      NOTA: In questo modo viene creata un'estrusione nella posizione dell'asse z a -0,45 m. Premere a per deselezionare l'intera mesh.
    2. Premere b e selezionare la parte inferiore del collo. Premere e, s e 0 per sigillare il fondo ( Figura4E). Premere a per selezionare l'intera mesh.
  6. Rendere la mesh compatibile con MCell.
    1. Premete Crtl-T per triangolare la mesh. La mesh viene trasformata in una serie di triangoli interconnessi. Questa è una procedura necessaria per rendere la mesh compatibile con MCell. Selezionare Strumento e Rimuovi doppi. Utilizzare gli strumenti Rimuovi doppi per rimuovere i vertici duplicati, se presenti, che hanno le stesse coordinate o sono molto vicini l'uno all'altro, per rendere la mesh compatibile con MCell.
      NOTA: i vertici sovrapposti doppi potrebbero essere stati creati accidentalmente durante il processo di creazione e modifica della mesh.
    2. Selezionate Oggetti modello nel pannello CellBlender. Modificare il nome dell'oggetto attivo in spine e premere il tasto s per creare il dorso dell'oggetto. Nel pannello CellBlender selezionare Mesh Analysis e quindi fare clic su Analyze Mesh (Figura 4F). Questa procedura consente di analizzare le proprietà della mesh creata, incluso il numero di vertici, spigoli, facce, area della superficie, volume e topologia mesh.
      NOTA: l'analisi stamperà le informazioni nel pannello di analisi mesh e dovrebbe essere a tenuta stagna, Manifold e Normals rivolto verso l'esterno. Questo passaggio è necessario per garantire che la mesh funzioni su MCell. In caso contrario, un passo è stato probabilmente perso. In questo caso, eliminare la mesh e ricominciare dal passaggio 2.1.
    3. Premere z per visualizzare la vista solida della colonna vertebrale. Premere File e Salva per avere una copia del file del frullatore con il dorso sul disco.
      NOTA: le quote (ad esempio, lunghezza, diametro, dimensione) delle mesh sono in micrometri. Vedere il glossario per il significato di ogni scelta rapida da tastiera.

3. Creazione di un dendrite con più spine

  1. Generare una colonna vertebrale come descritto in precedenza nelle sezioni 2.1–2.6. Premere a per deselezionare la colonna vertebrale. Per centrare il cursore, digitare Maiusc-C.
  2. Creare un dendrite. Premete Maiusc-A per aprire la tavolozza mesh. Selezionare Mesh , quindi Cilindro. Modificare i parametri nel menu Aggiungi cilindro: Raggio : 0,3 m, Profondità e 2 m. Premere Invio.
    NOTA: Il raggio e la profondità dei parametri sono definiti in base alle caratteristiche geometriche del dendrite.
  3. Inserire una colonna vertebrale nel dendrite.
    1. Premere r e digitare 90 per ruotare il cilindro di 90 gradi ( Figura5A). Utilizzare la freccia blu per trascinare il cilindro verso il basso verso il basso fino alla parte inferiore della colonna vertebrale. Premere 3 sul tastierino per avere una vista frontale del cilindro.
    2. Premere z per rendere la mesh trasparente. Utilizzare il mouse per spostare la freccia normale blu del cilindro verso il basso per spostare la base della colonna vertebrale all'interno del cilindro (Figura 5B). Premere a per deselezionare tutti gli oggetti.
    3. Utilizzare il pulsante destro del mouse per selezionare la dendrite (Figura 5C). Selezionare Modificatore nel pannello Blender (Figura 5D), selezionare Aggiungi modificatore. Selezionare quindi Boolean , quindiUnione operazione , quindi SelezionareOggetto spine. Premere Applica per creare una mesh articolare della dendrite e della colonna vertebrale (Figura 5E). Questa operazione crea una nuova mesh che unisce due mesh in una singola.
      NOTA: La nuova maglia sarà la dendrite combinata e la colonna vertebrale. Il dendrite isolato scompare quando le diverse mesh vengono combinate, ma la mesh isolata della colonna vertebrale rimane sovrapposta alla nuova mesh e viene utilizzata per generare più copie della stessa colonna vertebrale. Eliminare tutte le spine isolate dopo aver terminato la mesh. È fondamentale avere una sovrapposizione completa tra il collo della colonna vertebrale e il dendrite, altrimenti la maglia non sarà a tenuta stagna.
  4. Impostare l'oggetto dendrite nell'ambiente CellBlender.
    1. Premere a per deselezionare le mesh. Fare clic con il pulsante destro del mouse nel dendrite con il mouse per selezionare solo il dendrite. Selezionate CellBlender, Oggetti modello (Model Objects)e modificate Oggetto attivo in Dendrite e premete il tasto s per creare l'oggetto Dendrite.
  5. Inserire nuove spine nel dendrite.
    1. Premere 1 per passare alla vista laterale del cilindro. Utilizzare il mouse per selezionare la mesh del dorso isolato. Per inserire altre spine, seguire il punto 3.3, cambiando la posizione e l'angolo per inserire ciascuna di essi per ottenere una distribuzione fisiologica.
  6. Rendere la mesh compatibile con MCell. A tale scopo, premere TAB per passare alla modalità di modifica. Premere a per selezionare l'intera mesh. Premete Crtl-T per triangolare la mesh. Selezionate Strumento nel pannello Frullatore e selezionate Rimuovi doppi.
  7. Stilizzare le maglie.
    1. Asciare la mesh. Premere TAB per passare alla modalità oggetto. Selezionate Strumento nel pannello Frullatore e selezionate Arrotonda . Selezionate CellBlender, Oggetti modello (Model Objects)e Aggiungi materiale (Add a Material).
    2. Rendere la mesh trasparente selezionando Trasparente oggetto e Materiale trasparente. Impostare alfa su 0,5 e immettere per rendere la mesh parzialmente trasparente. Premere z per passare alla vista a tinta unita.
  8. Verificare se la mesh è ancora compatibile con MCell. A tale scopo, selezionate Analisi mesh nel pannello CellBlender per assicurarsi che la mesh sia ancora a tenuta stagna, mesh collettoree normale rivolto verso l'esterno.
  9. Salvare il file del frullatore dendrite_with_spines.blend.

4. Definire le regioni di superficie

NOTA: questa procedura crea le regioni di superficie della mesh che in seguito verranno utilizzate per impostare il modo in cui le regioni interagiscono con le molecole.

  1. Aprire il file dendrite_with_spines nell'ambiente Blender. A tale scopo, selezionare File, Apri , dendrite_with_spines.blende Apri file Blender.
  2. Preparare la mesh per la definizione delle regioni di superficie. A tale scopo, premere TAB per passare alla modalità di modifica. Premere z per passare alla vista trasparente (Ombreggiatura finestra, wireframe). Premere a per selezionare l'intera mesh del dendrite con spine. Selezionare Oggetti modello. Selezionare Dendrite. Premere t per nascondere il pannello CellBlender e visualizzare meglio l'intera mesh nel pannello principale.
    1. Utilizzare i tasti di scelta rapida per ingrandire e ridurre o scorrere con il mouse. Ciò è necessario per una migliore visualizzazione della parte superiore delle spine per selezionare e definire le regioni di superficie. Premere a per deselezionare l'oggetto. Premere TAB per passare alla modalità di modifica. Premere t per visualizzare nuovamente il pannello CellBlender.
  3. Definire la regione della superficie PSD. A tale scopo, premere b e selezionare la parte superiore di un dorso dendritico con il mouse (Figura 6A,6B). Premere il tasto su Regioni superficie definite. Modificare il nome dell'area in PSD1 e fare clic su Assegna (Figura 6C). Premere a per deselezionare l'oggetto.
  4. Definire la regione della superficie extrasinaptica. A tale scopo, premere b e selezionare l'area intorno alla parte superiore del dorso dendritico con il mouse (Figura 6D). Ripetere il passaggio 4.3 per il nome dell'area da Extra_syn1. Ripetere il passaggio 4.3 per le altre spine per definire le altre aree della mesh (PSD2, PSD3, PSD4, Extra_syn2, Extra_syn3 e Extra_syn4) (Figura 6F). Premere a per deselezionare l'oggetto.
  5. Definite le regioni di superficie delle estremità del dendrite. A tale scopo, premere b e selezionare l'estremità sinistra del dendrite. Modificare il nome dell'area in Left_end fare clic su Assegna. Premere a per deselezionare l'oggetto. Premere b e selezionare l'estremità destra della dendrite (Figura 6E). Modificare il nome dell'area in Right_end fare clic su Assegna.
    NOTA: spostare la mesh per trovare la posizione migliore per selezionare ogni regione definita.

5. Creare molecole

  1. Creare AMPARS. A tale scopo, selezionare Molecole nel pannello CellBlender. Selezionare su Molecole definite per inserire una nuova molecola e impostare Nome su AMPAR. Modificare il tipo di molecola in Molecule di superficie e Costante di diffusione in 0,05e-8 cm2/s14 per definire la costante di diffusione degli AMPAR nella membrana ( Figura7A).
  2. Crea ancoraggi. A tale scopo, selezionare Molecole nel pannello CellBlender. Selezionare il segno più su Molecole definite per inserire una nuova molecola e impostare Nome su ancoraggio. Modificare il tipo di molecola in Molecule di superficie e modificare La costante di diffusione in 0,001e-8 cm2/s14 per definire la costante di diffusione degli ancoraggi nella membrana ( Figura7A).
  3. Per creare ancoraggi associati ad AMPARs, selezionate Molecole nel pannello CellBlender. Per inserire una nuova molecola, selezionare il segno più su Molecole definite. Modificare Nome in anchor_AMPAR. Cambia tipo molecola in Molecule di superficie. Modificare la costante di diffusione in 0.001e-8 cm2/s14.
  4. Creare il anchor_LTP e anchor_AMPAR_LTP. A tale scopo, ripetere il passaggio 5.2. Denominare la molecola anchor_LTP. Ripetere il passaggio 5.3. Denominare la molecola anchor_AMPAR_LTP.
    NOTA: il anchor_LTP ha un'alta affinità per AMPAR; pertanto, gli AMPAR aumentano nelle regioni sinaptiche.
  5. Creare il anchor_LTD e anchor_AMPAR_LTD. Per creare un'_LTD,ripetere il passaggio 5.2., Denominare la molecola anchor_LTD. Ripetere il passaggio 5.3. Denominare la molecola anchor_AMPAR_LTD.
    NOTA: il anchor_LTD ha una bassa affinità per AMPAR; pertanto, gli AMPAR diminuiscono nella regione sinaptica.

6. Definire le classi di superficie

NOTA: questa procedura definisce le classi con le proprietà associate alle regioni di superficie. Le regioni extrasnaptiche riflettono le ancore e le ancore libere legate ad AMPAR. Le estremità successive del dendrite riflettono tutte le molecole.

  1. Definire le proprietà delle regioni extrasnaptiche.
    1. Premere TAB per passare alla modalità oggetto. Selezionare Classi superficie nel pannello CellBlender. Premere il tasto sulla classe di superficie per definire una nuova classe di superficie.
    2. Fai in modo che la regione extrasnaptica rifletta l'AMPAR legato alle molecole di ancoraggio.
      NOTA: Questa procedura intrappola le ancore e tutto ciò che vi è associato all'interno della regione sinaptica.
      1. Modificare il nome della classe di superficie in reflective_extra_syn. Premere il tasto reflective_extra_syn proprietà per associarlo a una molecola. Selezionare Le molecole Molecule singola. Selezionare anchor_AMPAR. Selezionate Orientamento (Orientation) e Ignora (Ignore). Selezionare Tipo ( Tipo) - Riflesso per fare in modo che la regione mostri le anchor_AMPAR molecole.
      2. Ripetere il passaggio 6.1.2.1 per anchor_AMPAR_LTP e anchor_AMPAR_LTD.
    3. Fai in modo che la regione extrasnaptica rifletta le ancore.
      1. Premere il tasto reflective_extra_syn proprietà per associarlo a una molecola. Selezionare Le molecole Molecule singola. Selezionare ancoraggio. Selezionate Orientamento (Orientation) e Ignora (Ignore). Selezionate Tipo (Type) e Riflettente (Reflective) per fare in modo che la regione rifletta le molecole di ancoraggio.
      2. Ripetere il passaggio 6.1.3.1 per anchor_LTP e anchor_LTD.
  2. Definire le proprietà delle estremità dendrite. A tale scopo, premere il tasto s su Classe di superficie per definire una nuova classe di superficie. Modificare il nome della classe di superficie in reflective_ends. Premere il tasto su Proprietà per associarlo a una molecola. Selezionare Le molecole Tutte le molecole di superficie. Selezionare Orientamento . Ignora. Selezionare Tipo Riflettente per farlo riflettere tutte le molecole di superficie.

7. Assegnare le classi create a ciascuna regione di superficie

NOTA: questo passo assegna le classi di superficie alle regioni di superficie.

  1. Assegnare le proprietà delle estremità del dendrite.
    1. Premere il tasto s per assegnare una classe di superficie a una regione. Selezionare reflective_ends nome della classe di superficie (Figura 7C). Selezionare Dendrite come Nome oggetto. Selezionare Regione specificata per Selezione regione. Selezionare Left_end nome area.
    2. Ripetere il passaggio 7.1.1 per il Right_end (figura 7D).
  2. Assegnare le proprietà delle regioni extrasnaptiche.
    1. Premere il tasto s per assegnare una classe di superficie a una regione. Selezionare reflective_extra_syn nome classe superficie. Selezionare Dendrite come Nome oggetto. Selezionare Regione specificata per Selezione regione. Selezionare Extra_syn1 nome area.
    2. Ripetere il passaggio 7.2.1 per Extra_syn2, Extra_syn3, e Extra_syn4.

8. Posizionare le molecole sulla rete

NOTA: questo passaggio posiziona gli AMPAR, gli ancoraggie GLI AMPAR associati agli ancoraggi sulla mesh.

  1. Per posizionare molecole AMPAR sulla mesh, selezionare Posizionamento molecule nel pannello CellBlender. Premere il tasto s su Siti di rilascio/posizionamento per creare un nuovo sito di rilascio. Modificare il nome del sito in relAMPAR (Figura 7B). 1,000 Selezionare Molecule . Quantity to Release OGGETTO/Regione AMPAR, Dendrite[ALL]-(Dendri Right_endte[Left_end].
  2. Posizionare le molecole di ancoraggio sulla mesh.
    1. Selezionare Posizionamento molecule nel pannello CellBlender. Premere il tasto s su Siti di rilascio/posizionamento per creare un nuovo sito di rilascio. Modificare nome sito in rel_anchor_PSD1. Selezionare anchorAncoraggio Molecule Quantity to Release . Object/Region .
    2. Ripetere il passaggio 8.2.1 per PSD2, PSD3e PSD4.
  3. Posizionare anchor_LTP molecole sulla mesh. A tale scopo, selezionare Posizionamento molecolare nel pannello CellBlender. Premere il tasto s su Siti di rilascio/posizionamento per creare un nuovo sito di rilascio. Modificare nome sito in rel_anchor_LTP_PSD1. Selezionare Molecule anchor_LTP. Oggetto/Regione - Dendrite[PSD1]. Quantità da rilasciare : 0. Object/Region
    NOTA: anchor_LTP un ancoraggio con elevata affinità di associazione per ampARS.
  4. Posizionare anchor_LTD molecole sulla mesh ripetendo il passaggio 8.3 per anchor_LTD.
    NOTA: anchor_LTD un ancoraggio con affinità di associazione bassa per gli AMPAR.

9. Creare le reazioni chimiche

  1. Creazione della reazione tra ancoraggio e AMPARs.
    1. Selezionare Reazioni (Figura 7D) per creare le reazioni. Premere il tasto s per includere una nuova reazione. I reazionanti : ancoraggio ' , AMPAR'. Tipo di reazione : <->. Questo definisce una reazione bidirezionale. Prodotti : anchor_AMPAR'. Tasso di inoltro - 0,03. Tasso all'indietro - 0,05.
  2. Create la reazione tra ANCHOR_LTP e AMPAR. A tale scopo, ripetere il passaggio 9.1, ma sostituire ancoraggio con anchor_LTPe utilizzare una frequenza all'indietro di 0,005 per aumentare l'affinità tra i reanti.
  3. Creare la reazione tra anchor_LTD e AMPARs e salvare il file. A tale scopo, ripetere il passaggio 9.2, ma sostituire ancoraggio con anchor_LTDe utilizzare una frequenza all'indietro di 0,5 per ridurre l'affinità tra i reanti. Quindi salvare il file.

10. Tracciare l'output del modello

  1. Ancoraggi di stampa associati agli AMPAR in corrispondenza del PSD1 durante la condizione basale. A tale scopo, selezionare Impostazioni output di stampa. Premere il tasto s per definire le molecole. Selezionare anchor_AMPAR su Molecule. Selezionare dendrite sull'oggetto. Selezionare PSD1 sulla regione. Ripetere il passaggio 10.1 per tutte le regioni PSD.
    NOTA: È utile osservare il numero basale di AMPAR intrappolati al PSD di ogni colonna vertebrale dendritica. Il numero di ancoraggi associati agli AMPAR può aumentare o diminuire rispetto alle condizioni basali durante LTP e LTD.
  2. Ancoraggi di stampa associati agli AMPAR in corrispondenza di PSD1 durante LTP. A tale scopo, ripetere il passaggio 10.1. Sostituire anchor_AMPAR con anchor_AMPAR_LTP, quindi stampare gli ancoraggi associati agli AMPAR in PSD1 durante LA LTD e infine ripetere il passaggio 10.1, ma sostituire anchor_AMPAR_LTP con anchor_AMPAR_LTD.

11. Eseguire le simulazioni

  1. Per eseguire la condizione di base, selezionare Esegui simulazione. Selezionare Iterazioni : 30.000. Impostare il passaggio di tempo - 1e-3 s. Premere Esporta ed esegui. Attendere il termine della simulazione. Potrebbero essere tra i minuti e le ore.
    NOTA: Nella condizione basale, non vi è alcun rilascio di anchor_LTP e rel_anchor_LTD molecole. Per quanto riguarda i parametri della simulazione, il numero di iterazioni deve essere abbastanza lungo da poter osservare la diffusione degli AMPAR dai dendriti e il loro ancoraggio a PSD. I piccoli tempi sono più precisi ma più lenti per completare la simulazione.
  2. Selezionare Ricarica dati di visualizzazione. Selezionare Riproduci animazione per visualizzare i risultati dello spatiotemporal ( Figura8). Selezionare Impostazioni output di stampa. Premere Stampa.
    NOTA: I grafici generati da CellBlender sono serie temporali isolate delle specie chimiche selezionate. I programmi di terze parti possono essere utilizzati per importare i dati salvati da più simulazioni per creare grafici sovrapposti di diverse condizioni (ad esempio, basale, LTP, LTD; vedere la figura 8).
  3. Eseguire la condizione di potenziamento omosynaptic (ad esempio, LTP; vedere la figura 8). A tale scopo, selezionare Posizionamento molecolare nel pannello CellBlender. Selezionare rel_anchor_LTP_PSD1 siti di rilascio/posizionamento.
  4. Modificare la quantità in modo che sia disponibile per il rilascio: 200. Selezionare rel_anchor_LTD_PSD1 siti di rilascio/posizionamento. Modificare la quantità in rilascio : 0. Selezionare rel_anchor _PSD1 siti di rilascio/posizionamento. Modificare la quantità in rilascio : 0. Ripetere i passaggi da 11.1 a 11.2.
  5. Eseguire la condizione di depressione omosynaptic (ad esempio, LTD; vedere figura 8). A tale scopo, release 200 rel_anchor_LTD_PSD1 anziché rel_ANCHOR_LTP_PSD1. Impostare rel_anchor e rel_anchor_LTP_PSD1 su zero. Ripetere i passaggi da 11.1 a 11.2.

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Representative Results

Questi risultati forniscono i passaggi per la costruzione di una mesh 3D che simula una colonna vertebrale dendritica con una testa della colonna vertebrale e il collo della colonna vertebrale (Da 1 a Figura 4). Inoltre, più spine dendritiche possono essere inserite in un singolo segmento dendritico (Figura 5) per studiare la plasticità eterosynaptica di AMPARs14. Il PSD nella parte superiore della testa della colonna vertebrale (Figura 6) è il luogo in cui le ancore sinaptiche si legano agli AMPAR e le intrappolano temporaneamente alla sinapsi (Figura 7, Figura 8).

La plasticità sinaptica potrebbe essere verificata approssimativamente attraverso cambiamenti nel numero di specie di anchor_AMPAR, anchor_AMPAR_LTPe anchor_AMPAR_LTD ad ogni colonna vertebrale. Per il calcolo esatto del verificarsi della plasticità sinaptica, si consiglia di calcolare la variazione nel numero totale di AMPAR ancorati e liberi alla sinapsi. Questo può essere eseguito utilizzando programmi di terze parti per aprire i dati salvati della simulazione per sommare la serie di tempo degli AMPAR gratuiti e gli AMPAR ancorati in ogni PSD (Figura 8).

Il rilascio di AMPAR sulla rete ha permesso l'osservazione della loro diffusione da una camminata casuale stocastica lungo le spine dendrite e dendritiche. I fattori che modificano l'affinità degli AMPAR per le ancore, come le modifiche post-translazionisali e le alterazioni dei tassi di endocitosi ed esocitosi, possono intrappolare gli AMPAR al PSD24,25,26. Il legame degli AMPAR con le ancore situate al PSD ha intrappolato un'alta densità di AMPAR alla sinapsi. Il potenziamento omosattico (Figura 9) e la depressione (Figura 10) possono essere verificati rispettivamente attraverso aumenti e diminuzioni del numero di AMPAR ancorati causati da modifiche nell'affinità degli AMPAR da parte di ancoraggi rispetto alla condizione basale (Figura 11). Fattori che hanno ridotto l'affinità degli AMPAR con le ancore hanno rilasciato più AMPAR da una colonna vertebrale dendritica (cioè depressione omosynaptic) e un potenziamento eterosyaptico indotto alle spine vicine. Inoltre, fattori che hanno aumentato l'affinità di AMPAR per le ancore a una colonna vertebrale indotto potenziamento omosynaptic a quella colonna vertebrale e depressione eterosynaptic alle spine vicine14. In questo modo, la plasticità eterosyaptica è stata osservata come l'effetto opposto alle spine vicine della plasticità omosynaptic indotta a una determinata colonna vertebrale. Ad esempio, l'induzione LTP omosynaptica a una singola colonna vertebrale ha creato un effetto LTD eterosyaptico alle spine vicine (Figura 8E,F,G).

Figure 1
Figura 1: Creazione della testa dendritica della colonna vertebrale utilizzando una rete sferica. (A) Aggiunta della sfera UV. (B) Impostazione delle quote della sfera. (C) Osservando la sfera creata. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Costruzione della regione superiore. (A) Selezione dell'area superiore della sfera. (B) Rimozione dell'area selezionata per renderlo piatta. (C) Sigillare la parte superiore piatta. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Creazione di aree concentriche sulla parte superiore della colonna vertebrale. (A) Visualizzazione della parte superiore. (B) Utilizzo di un coltello per definire una regione concentrica. (C) Creazione di più aree concentriche. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Creazione del collo dendritico della colonna vertebrale. (A) Selezione della parte inferiore della sfera modificata. (B) Eliminazione dei vertici selezionati. (C) Selezione della parte inferiore. (D) Estrusione del fondo per creare il collo della colonna vertebrale. (E) Sigillare il fondo del collo della colonna vertebrale. (F) Analisi del dorso creato. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Creazione del dendrite con più spine. (A) Utilizzo della mesh cilindrica per creare un dendrite. (B) Allineamento della colonna vertebrale dendritica con il cilindro. (C) Unire il cilindro con la colonna vertebrale. (D) L'operazione booleana per unire le mesh. (E) La nuova mesh combinata. (F) Aggiunta della seconda colonna vertebrale. (G) Aggiunta della terza colonna vertebrale. (H) Aggiunta della quarta colonna vertebrale. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Definizione dell'area PSD e della zona perisynaptic. (A) Selezione dell'area PSD. (B) Vista dettagliata del PSD creato. (C) Definizione della regione della superficie PSD. (D) Selezione e definizione della zona perisyaptic intorno al PSD. (E) Selezione e definizione della superficie laterale del dendrite. (F) Regioni di superficie definite. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Definizione delle molecole di superficie. (A) Definizione di AMPAR, ancoraggio e AMPAR associati all'ancoraggio. (B) Definizione dell'ubicazione e della quantità delle copie AMPAR. (C) Definizione delle classi di superficie. (D) Assegnazione delle classi di superficie. (E) Creare le reazioni chimiche tra le molecole. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Risultati rappresentativi della plasticità sinaptica. (A) Mesh diverse di un segmento dendritico con due, quattro o otto spine. (B) Una visione diversa del segmento dendritico con otto spine. (C) Vista dettagliata di una colonna vertebrale dendritica con AMPAR e ancoraggi al PSD. (D) Diagramma del traffico di AMPAR dentro e fuori il PSD attraverso le loro interazioni con le ancore. (E-G) Le curve mostrano il numero di AMPAR sinaptici ad ogni PSD per la condizione basale e durante LTP e LTD. L'induzione di LTP o LTD omosynaptic a una singola colonna vertebrale ha creato un effetto eterosyaptico nelle spine vicine per la maglia con due spine (E), quattro spine (F) e otto spine (G). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Risultato rappresentativo della condizione LTP. (A) L'asse x è il tempo e l'asse y è il numero del anchor_LTP_AMPAR in PSD1. All'inizio della simulazione è stato rilasciato anchor_LTP 200 persone libere. Un maggior numero di legami con ancoraggi è stato formato rispetto alla condizione basale (Figura 11) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: Risultato rappresentativo della condizione LTD. A)L'asse x è il tempo e l'asse y è il numero del numero di anchor_LTD_AMPAR in PSD1. All'inizio della simulazione è stato rilasciato anchor_LTD 200 persone libere. Rispetto alla condizione basale (Figura 11)è stato formato un numero inferiore di legami con ancore. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11: Risultato rappresentativo durante la condizione basale. (A) L'asse x è il tempo e l'asse y è il numero del anchor_AMPAR in PSD1. All'inizio della simulazione è stato rilasciato 200 ancoraggi liberi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo articolo presenta un metodo per la costruzione di maglie 3D per la modellazione di processi di plasticità sinaptica reazione-diffusione in un segmento dendritico con spine dendritiche. Il modello sviluppato contiene un segmento dendritico con poche spine dendritiche. La diffusione laterale e la reazione degli AMPAR con ancoraggi sinaptici consentono la simulazione delle dinamiche basali. I passaggi critici del protocollo sono il taglio della sfera per la creazione della parte superiore della testa della colonna vertebrale (Figura 1, Figura 2, Figura 3), l'estrusione per creare il collo della colonna vertebrale (Figura 4) e l'unione del dendrite e delle spine in una singola mesh (Figura 5). È fondamentale avere una sovrapposizione completa tra il collo della colonna vertebrale e il dendrite; in caso contrario, la mesh non sarà a tenuta stagna. Altri passaggi critici sono la selezione delle regioni della membrana e la definizione delle classi di superficie (Figura 6, Figura 7). Salvare i file per ogni passaggio critico con un nome diverso.

Utilizzare lo strumento di analisi mesh per garantire che la mesh sia a tenuta stagna, molteplici e rivolta verso l'esterno normale dopo aver creato la singola colonna vertebrale e dopo aver creato il dendrite combinato con la colonna vertebrale. Se la mesh non riesce, tornare all'ultima versione corretta salvata. Alcuni passaggi possono essere leggermente diversi a seconda della versione del software installato, del sistema operativo e del tipo di tastiera.

Questo protocollo simula il traffico di molecole AMPAR nella mesh 3D (Figura 8, Figura 9, Figura 10, Figura 11), che è fondamentale per la trasmissione ecitaria neuronale e plasticità sinaptica. Il traffico di singole molecole in una mesh 3D è una caratteristica preziosa di questo modello rispetto ai metodi esistenti basati su volumi ben miscelati con distribuzioni omogenee dimolecole 21,22, che non è la condizione fisiologica alle sinapsi27. Una limitazione di questa tecnica è l'alto costo computazionale e la velocità lenta delle simulazioni che utilizzano un numero elevato di copie di ogni molecola e un elevato numero di reazioni chimiche tra di loro. Questo vincolo può essere superato riducendo il numero di copie di ciascuna specie.

La costruzione di un sistema con una mesh 3D realistica e il tracciamento spatiotemporale delle molecole è un potente strumento per testare scenari meccanici che possono fornire grandi informazioni sul funzionamento dei sistemi con un elevato numero di variabili non lineali.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione della Sao Paulo State Science Foundation (FAPESP) #2015/50122-0 e IRTG-GRTK 1740/2, dalla sovvenzione IBM/FAPESP #2016/18825-4 e dalla sovvenzione FAPESP #2018/06504-4.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blender Blender Foundation https://www.blender.org/
CellBlender University of Pittsburgh https://mcell.org/
Mcell University of Pittsburgh https://mcell.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neuroscienze Problema 159 traffico di recettori AMPA diffusione della reazione plasticità sinaptica spine dendritiche modellazione computazionale potenziamento a lungo termine depressione a lungo termine plasticità eterosyaptic
Modellazione 3D di spine dendritiche con plasticità sinaptica
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Antunes, G., Simoes de Souza, F. M. 3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity. J. Vis. Exp. (159), e60896, doi:10.3791/60896 (2020).

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