Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

3D-modellering av dendrittiske spines med synaptisk plastisitet

Published: May 18, 2020 doi: 10.3791/60896
Automatic Translation
*1, *1
1Center for Mathematics, Computation and Cognition, Federal University of ABC
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen utvikler en tredimensjonal (3D) modell av et dendrittisk segment med dendrittiske spines for modellering av synaptisk plastisitet. Det konstruerte nettet kan brukes til beregningsmodellering av AMPA-reseptorhandel i den langsiktige synaptiske plastisiteten ved hjelp av programmet Blender med CellBlender og MCell.

Abstract

Beregningsmodellering av diffusjon og reaksjon av kjemiske arter i en tredimensjonal (3D) geometri er en grunnleggende metode for å forstå mekanismene for synaptisk plastisitet i dendrittiske spines. I denne protokollen er den detaljerte 3D-strukturen til dendrittene og dendrittiske spines modellert med masker på programvaren Blender med CellBlender. De synaptiske og ekstrasynaptiske områdene er definert på nettet. Deretter defineres de synaptiske reseptorene og synaptiske ankermolekylene med diffusjonskonstantene. Til slutt er de kjemiske reaksjonene mellom synaptiske reseptorer og synaptiske ankere inkludert, og beregningsmodellen løses numerisk med programvaren MCell. Denne metoden beskriver den spatiotemporale banen til hvert enkelt molekyl i en 3D geometrisk struktur. Dermed er det svært nyttig å studere smugling av synaptiske reseptorer inn og ut av dendrittiske spines under forekomsten av synaptisk plastisitet. En begrensning av denne metoden er at det høye antallet molekyler bremser hastigheten på simuleringene. Modellering av dendrittiske spines med denne metoden tillater studiet av homosynaptisk potensering og depresjon i enkelt spines og heterosynaptisk plastisitet mellom nabo dendrittiske spines.

Introduction

Synaptisk plastisitet har vært forbundet med læring og minne1. Synaptisk plastisitet, som langsiktig potensering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD), er henholdsvis forbundet med innsetting og fjerning av AMPA-reseptorer (AMPARs) inn og ut av den synaptiskemembranen 2. AMPAR-synapsene er plassert på toppen av de små volumstrukturene som kalles dendrittiske spines3. Hver ryggrad inneholder et protein tett område i postsynaptisk membran kalt postsynaptisk tetthet (PSD). Ankerproteiner ved PSD-fellen AMPARs i den synaptiske regionen. Det er få kopier av AMPARs innenfor en enkelt synapse og menneskehandel og reaksjon av AMPARs med andre arter i dendrittiske spines er en stokastiskprosess 2,4. Det finnes flere kompartale modeller av synaptisk reseptorhandel ved dendrittiske spines5,6,7,8. Det er imidlertid mangel på stokastiske beregningsmodeller av smugling av AMPARer forbundet med synaptisk plastisitet ved 3D-strukturene til dendrittene og deres dendrittiske spines.

Beregningsmodellering er et nyttig verktøy for å undersøke mekanismene som ligger til grunn for dynamikken i komplekse systemer som reaksjonsdiffusivjonen av AMPARer i dendrittiske spines under forekomsten av synaptisk plastisitet9,,10,,11,,12. Modellen kan brukes til å visualisere komplekse scenarier, variere sensitive parametere og gjøre viktige spådommer under vitenskapelige forhold som involverer mange variabler som er vanskelige eller umulige å kontrollereeksperimentelle 12,,13. Å definere detaljnivået til en beregningsmodell er et grunnleggende skritt for å få nøyaktig informasjon om det modellerte fenomenet. En ideell beregningsmodell er en delikat balanse mellom kompleksitet og enkelhet for å fange de essensielle egenskapene til naturfenomenene uten å være beregningsmessig uoverkommelige. Beregningsmodeller som er for detaljerte kan være dyre å beregne. På den annen side kan systemer som er dårlig detaljerte, mangle de grunnleggende komponentene som er avgjørende for å fange dynamikken i fenomenet. Selv om 3D-modellering av dendrittiske spines er beregningsmessig dyrere enn 2D og 1D, er det forhold, for eksempel i komplekse systemer med mange ikke-lineære variabler som reagerer og sprer seg i tid og 3D-plass, for hvilken modellering på 3D-nivå er avgjørende for å få innsikt om systemets funksjon. Videre kan kompleksiteten reduseres nøye for å bevare de essensielle egenskapene til en laveredimensjonal modell.

I et stokastisk system med få kopier av en gitt art innenfor et lite volum avviker den gjennomsnittlige dynamikken i systemet fra den gjennomsnittlige dynamikken i en stor befolkning. I dette tilfellet er det nødvendig med stokastisk beregningsmodellering av reaksjonsdiffuserende partikler. Dette arbeidet introduserer en metode for stokastisk modellering av reaksjonsdiffusjon av noen få kopier av AMPARs i 3D dendrittiske spines. Formålet med denne metoden er å utvikle en 3D beregningsmodell av et dendrittisk segment med dendrittiske spines og deres synapser for modellering av synaptisk plastisitet.

Metoden bruker programvaren MCell til å løse modellen numerisk, Blender for å konstruere 3D-nett og CellBlender til å lageogvisualisere MCell-simuleringene, inkludert den romliggjørende reaksjonsdiffusjonen av molekyler i 3D-nett14,15,,16. Blender er en suite for etablering av masker og CellBlender er et tillegg for baseprogramvaren Blender. MCell er en Monte Carlo simulator for reaksjon-diffusjon av enkeltmolekyler17.

Begrunnelsen bak bruken av denne metoden består av modellering av synaptisk plastisitet for å oppnå en bedre forståelse av dette fenomenet i det mikrofysiologiske miljøet i dendrittiske spines14. Spesielt tillater denne metoden simulering av homosynaptisk potensering, homosynaptisk depresjon og heterosynaptisk plastisitet mellom dendrittiske spines14.

Funksjonene i denne metoden inkluderer modellering av 3D geometrisk struktur av dendritt og dens synapser, diffusjonen ved tilfeldig gange, og de kjemiske reaksjonene til molekylene som er involvert med synaptisk plastisitet. Denne metoden gir fordelen av å skape rike miljøer for å teste hypoteser og gjøre spådommer om funksjonen til et komplekst ikke-lineært system med et stort antall variabler. I tillegg kan denne metoden brukes ikke bare for å studere synaptisk plastisitet, men også for å studere stokastisk reaksjonsdiffusjon av molekyler i 3D-nettstrukturer generelt.

Alternativt kan 3D-nett av dendrittiske strukturer konstrueres direkte i Blender fra elektronmikroskopet serielle rekonstruksjoner18. Selv om masker basert på serielle rekonstruksjoner gir 3D-strukturer, er tilgang til eksperimentelle data ikke alltid tilgjengelig. Dermed gir konstruksjonen av masker tilpasset fra grunnleggende geometriske strukturer, som beskrevet i dagens protokoll, fleksibilitet til å utvikle tilpassede dendrittiske segmenter med dendrittiske spines.

En annen alternativ beregningsmetode er bulksimuleringen av godt blandede reaksjoner i et vanlig volum9,,10,,11,,19,,20,,21,,22. Bulksimuleringene er svært effektive for å løse reaksjonene til mange arter innenfor et enkelt godt blandet volum23,men bulktilnærmingen er ekstremt treg for å løse reaksjonsdiffusjonen av molekyler i mange godt blandede voxels i et høyoppløselig 3D-nett. På den annen side fungerer den nåværende metoden ved hjelp av MCell-simuleringer av reaksjonsdiffusorsjon av individuelle partikler effektivt i høyoppløselige 3D-nett15.

Før du bruker denne metoden, bør man spørre om fenomenet studert krever en stokastisk reaksjonsdiffusivasjon i et 3D-nett. Hvis fenomenet har få kopier (mindre enn 1000) av minst en av de reaktive artene som sprer seg i en kompleks geometrisk struktur med små volumrom som dendrittiske spines, er stokastisk modellering av reaksjonsdiffusivasjon i 3D-nett egnet for applikasjonen.

Det er flere trinn som kreves for å konstruere en 3D beregningsmodell av et dendrittisk segment som inneholder dendrittiske spines med synaptisk plastisitet. Hovedtrinnene er installasjon av riktig programvare for bygging av modellen, bygging av en enkelt dendrittisk ryggrad som skal brukes som en mal for å lage flere spines, og etableringen av et dendrittisk segment som er forbundet med flere dendrittiske spines. Trinnet for modellering av synaptisk plastisitet består av å sette inn ankere i PSD-regionen og AMPARs i dendrittiske segmentet og dendrittiske spines. Deretter er kinetiske reaksjoner mellom ankrene som ligger ved PSD og AMPARs definert for å produsere komplekse anker-AMPAR-arter som fanger AMPARs i den synaptiske regionen. Økningen og reduksjonen av affiniteten mellom ankrene og de synaptiske AMPARene skaper prosessen med LTP og LTD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Se tilleggsfilen 1 for ordlisten over termer som brukes i denne protokollen.

1. Installer Blender, CellBlender og MCell

MERK: Denne protokollen krever installasjon av MCell, Blender og Cell Blender.

  1. Last ned og installer programvaren på MCell-hjemmesiden (https://mcell.org/tutorials_iframe.html). Gå til nedlastinger øverst på siden, og følg deretter de trinnvise instruksjonene for å laste ned og installere programvaren i det aktuelle miljøet (f.eks. Linux, Mac OSX eller Windows).
    MERK: Alle beregningsmodeller og simuleringer som er beskrevet i denne protokollen, ble testet på en CellBlender 1.1-pakke som inkluderer Blender 2,78 med MCell 3.4 og CellBlender 1.1. Det fungerte også på Blender 2.79b. Alle disse programmene er åpen tilgang og krever ikke at du skriver ut tillatelse på nytt. Instruksjonene for bygging og simulering av modellen kan endres litt fra en versjon til en annen. Deler av denne protokollen er tilpasset fra tsjekkisk et al.16.

2. Lag en enkelt dendrittisk ryggrad

MERK: Denne prosedyren skaper et nett av en enkelt dendrittisk ryggrad med ryggradshode og ryggradshals ved hjelp av en modifisert sfære.

  1. Konfigurer Blender 3D-visning på hovedpanelet.
    1. Åpne Blender med CellBlender allerede installert. Trykk på 5 på tastaturet for å endre fra perspektiv til ortogonalvisning, og trykk på 1 for å bytte til frontvisning. Perspektivvisningen har dybde, men dette er ikke nødvendig nå. Endring fra perspektiv til ortogonalt syn gir bedre visualisering av nettet. Trykk SKIFT+C for å midtstille markøren (figur 1A).
  2. Lag ryggraden hodet.
    1. Trykk SKIFT+A for å åpne nettpaletten. Velg Mesh, og velg deretter UV-sfære. En UV-sfære er et nett som er kartlagt til 3D-overflaten av en sfære. UV-sfæren representerer det sfæriske hodet til en sopp dendrittisk ryggrad. Programvaren forutsetter at enhetene i UV-sfæren er mikrometer.
    2. Endre parametrene på Legg til UV-sfærepanel. Endre størrelse til 0,25 og ring til 32 (figur 1B). Trykk på + eller – på tastaturet for å zoome inn og zoome ut av visualiseringen av nettet. Alternativt kan du bruke rulleknappen i musen til å zoome inn og ut (Figur 1C).
      MERK: Parameterstørrelsen skalerer størrelsen på den opprinnelige sfæren, og parameterringene definerer oppløsningen på nettet.
  3. Gjør toppen av hodet flatt.
    1. Trykk Tab for å bytte Blender fra objektmodus, standard objektmedvirkningsmodustil Redigeringsmodus. Arbeid i redigeringsmodus for å endre komponentene i et eksisterende nett.
    2. Når det opprettede nettet er valgt automatisk, trykker du på a for å fjerne merket for det opprettede nettet. Trykk z for å gjøre nettet gjennomsiktig, noe som bidrar til å visualisere delene som skal redigeres. Zoom inn på nettet. Trykk b for å velge toppen 3/4 av sfæren med musen (figur 2A). Trykk slett, velg toppunkt ,og skriv inn for å fjerne toppunktene (Figur 2B).
    3. Trykk på b og velg toppen. Trykk på e, s, 0, og angi for å forsegle toppen med toppunktene fortsatt valgt. Flytt den blå pilen ned for å justere til toppen av ryggradshodet (figur 2C). Trykk z for å bytte til heldekkende visning (figur 3A). Trykk på 7 for å bytte til toppvisning.
      MERK: Toppen av sfæren er laget flatt for å modellere PSD-regionen i ryggraden hodet.
  4. Hvis du vil øke nettingoppløsningen øverst i ryggraden, velger du Verktøy og kniv . Klipp en sirkel med kniven rundt midten av toppen (Figur 3B). Velg Verktøy og Sløyfe klipp ut og Skyv. Gjenta dette trinnet fire ganger for å opprette fire konsentriske sirkler rundt midten av toppen (figur 3C).
    MERK: De konsentriske sirklene brukes til å legge til nye voxels som vil øke oppløsningen til PSD.
  5. Lag ryggradshalsen.
    1. Trykk på a for å oppheve valget av nettet. Trykk på 1 for å bytte til forsiden. Trykk z for å gjøre nettet gjennomsiktig. Trykk b, og velg deretter bunnen av nettet (figur 4A). Trykk på slett og toppunkt ( figur4B). Trykk b og velg bunnen av nettet (figur 4C). Trykk på e og z, -0,45 for å opprette en ekstrudering (figur 4D).
      MERK: Dette skaper en ekstrudering til z-akseposisjonen ved -0,45 μm. Trykk på a for å fjerne merket for hele nettet.
    2. Trykk b og velg bunnen av nakken. Trykk på e, sog 0 for å forsegle bunnen ( figur4E). Trykk på a for å velge hele nettet.
  6. Gjør nettet kompatibelt med MCell.
    1. Trykk På Crtl+T for å triangulere nettet. Nettet er forvandlet til et sett med sammenkoblede trekanter. Dette er en nødvendig prosedyre for å gjøre nettet kompatibelt med MCell. Velg Verktøy og Fjern dobler. Bruk fjern double-verktøyene til å fjerne dupliserte toppunkt, hvis noen, som har de samme koordinatene eller er svært nær hverandre, for å gjøre nettet kompatibelt med MCell.
      MERK: Doble oversatte toppunkt kan ha blitt opprettet ved et uhell under prosessen med mesh opprettelse og redigering.
    2. Velg Modellobjekter i CellBlender-panelet. Endre navnet på det aktive objektet til ryggraden, og trykk + for å opprette objekt ryggraden. Velg Nettanalyse på CellBlender-panelet,og klikk deretter på Analyser nett (figur 4F). Mesh Analysis Denne prosedyren vil analysere egenskapene til det opprettede nettet, inkludert antall toppunkt, kanter, ansikter, overflateareal, volum og nettingtopologi.
      MERK: Analysen vil skrive ut informasjonen i Datapanel for mesh, og den skal være vanntett, manifold og utadvendte normaler. Dette trinnet er nødvendig for å sikre at nettet vil fungere på MCell. Ellers ble et skritt sannsynligvis savnet. I dette tilfellet sletter du nettet og starter fra trinn 2.1 på nytt.
    3. Trykk z for å visualisere den solide utsikten over ryggraden. Trykk fil og lagre for å få en kopi av blenderfilen med ryggraden på disken.
      MERK: Dimensjonene (det vil si lengde, diameter, størrelse) på nettene er i mikrometer. Se ordlisten for betydningen av hver hurtigtast.

3. Opprette en dendritt med flere spines

  1. Generer en ryggrad som beskrevet tidligere i pkt. 2.1–2.6. Trykk på a for å velge bort ryggraden. Skriv inn Skift+C for å midtstille markøren.
  2. Opprett en dendritt. Trykk SKIFT+A for å åpne nettpaletten. Velg Netting og deretter Sylinder. Endre parametrene på Legg til sylinder-menyen: Radius = 0,3 μm, Dybde = 2 μm. Trykk Enter.
    MERK: Parameterradiusen og dybden er definert i henhold til den geometriske egenskapene til dendritten.
  3. Sett inn en ryggrad i dendritten.
    1. Trykk r og type 90 for å rotere sylinderen 90° ( Figur5A). Bruk den blå pilen til å dra sylinderen ned til bunnen av ryggraden. Trykk 3 på tastaturet for å ha en frontvisning av sylinderen.
    2. Trykk z for å gjøre nettet gjennomsiktig. Bruk musen til å flytte den blå normal pilen på sylinderen nedover for å flytte bunnen av ryggraden til det indre av sylinderen (Figur 5B). Trykk på a for å oppheve merkingen av alle objekter.
    3. Bruk høyre knapp på musen til å velge dendritt (figur 5C). Velg Modifikator på Blender-panelet (Figur 5D), og velg Legg til modifikator. Velg deretter Boolsk, velg Operasjonsunion, og velg Objektrad . Trykk på Påfør for å lage et felles nett av dendritten og ryggraden (figur 5E). Denne operasjonen skaper et nytt nett som fusjonerer to masker til ett enkelt.
      MERK: Det nye nettet vil være den kombinerte dendritt og ryggraden. Den isolerte dendritten forsvinner når de forskjellige nettene kombineres, men det isolerte ryggraden mesh forblir overlappet med det nye nettet og brukes til å generere flere kopier av samme ryggrad. Slett alle de isolerte piggene etter endt mesh. Det er viktig å ha en fullstendig overlapping mellom ryggraden halsen og dendritt, ellers vil nettet ikke være vanntett.
  4. Sett det dendrittobjektet i CellBlender-miljøet.
    1. Trykk på a for å fjerne merkingen av nettene. Høyreklikk i dendritt med musen for å velge dendritt bare. Velg CellBlender, Modellobjekter, og endre aktivt objekt til Dendrite, og trykk + for å opprette dendrittobjektet.
  5. Sett inn nye spines i dendritt.
    1. Trykk på 1 for å bytte til sidevisningen av sylinderen. Bruk musen til å velge nettet av den isolerte ryggraden. For å sette inn flere spines, følg trinn 3.3, endre posisjonen og vinkelen for å sette inn hver enkelt for å oppnå en fysiologisk fordeling.
  6. Gjør nettet kompatibelt med MCell. Dette gjør du ved å trykke TAB for å gå til redigeringsmodus. Trykk på a for å velge hele nettet. Trykk På Crtl+T for å triangulere nettet. Velg Verktøy (Tool) på Blender-panelet, og velg Fjern dobler (Remove Doubles). Tool
  7. Stilisere nettene.
    1. Glatt nettet. Trykk tab for å bytte til objektmodus. Velg Verktøy på Blender-panelet, og velg Glatt. Velg CellBlender, Modellobjekter, og velg Legg til et materiale.
    2. Gjør nettet gjennomsiktig ved å velge Objekt gjennomsiktig og Material Transparent. Bytt alfa til 0,5 og gå inn for å gjøre nettet delvis gjennomsiktig. Trykk z for å bytte til heldekkende visning.
  8. Bekreft om nettet fortsatt er kompatibelt med MCell. Hvis du vil gjøre dette, velger du Nettanalyse på CellBlender-panelet for å forsikre deg om at nettet fortsatt er vanntett, manifoldnett og utovervendt normal.
  9. Lagre blenderfilen som dendrite_with_spines.blend.

4 Definere overflateområder

MERK: Denne fremgangsmåten oppretter overflateområdene i nettet som senere skal brukes til å konfigurere hvordan områdene samhandler med molekylene.

  1. Åpne filen dendrite_with_spines Blender-miljøet. Dette gjør du ved å velgeFil , Åpne, dendrite_with_spines.blendog Åpne Blender-fil.
  2. Forbered nettet for å definere overflateområdene. Hvis du vil gjøre dette, trykker du TAB for å endre til redigeringsmodus. Trykk z for å bytte til gjennomsiktig visning (Viewport skyggelegging, trådramme). Trykk på a for å velge hele nettet av dendritt med spines. Velg Modellobjekter. Velg Dendrite. Trykk t for å skjule CellBlender-panelet og bedre visualisere hele nettet i hovedpanelet.
    1. Bruk + og – på tastaturet for å zoome inn og ut eller bla med musen. Dette er nødvendig for bedre visualisering av toppen av spines for å velge og definere overflateområdene. Trykk på a for å oppheve valget av objektet. Trykk tab for å endre til redigeringsmodus. Trykk på t for å vise CellBlender-panelet igjen.
  3. Definer PSD-overflateområdet. Hvis du vil gjøre dette, trykker du b og velger toppen av en dendrittisk ryggrad med musen ( figur6A,6B). Trykk + på Definerte Overflateområder. Endre områdenavnet til PSD1, og klikk Tilordne (Figur 6C). Trykk på a for å oppheve valget av objektet.
  4. Definer det ekstrasynaptiske overflateområdet. Hvis du vil gjøre dette, trykker du b og velger regionen rundt toppen av den dendrittiske ryggraden med musen ( figur6D). Gjenta trinn 4.3 for områdenavnet for å Extra_syn1. Gjenta trinn 4.3 for de andre piggene for å definere de andre områdene av nettet (PSD2, PSD3, PSD4, Extra_syn2, Extra_syn3og Extra_syn4) (figur 6F). Trykk på a for å oppheve valget av objektet.
  5. Definer overflateområdene i endene av dendritten. Hvis du vil gjøre dette, trykker du b og velger venstre ende av dendritten. Endre områdenavnet for å Left_end, og klikk Tilordne. Trykk på a for å oppheve valget av objektet. Trykk b og velg høyre ende av dendritt (figur 6E). Endre områdenavnet til Right_end, og klikk Tilordne.
    MERK: Flytt nettet for å finne den beste posisjonen for å velge hvert definert område.

5. Lag molekyler

  1. Opprett amparer. Hvis du vil gjøre dette, velger du Molekyler på CellBlender-panelet. Velg + på definerte molekyler for å sette inn et nytt molekyl og endre navn til AMPAR. Endre molekyltype til overflatemolekyl og diffusjon konstant til 0,05e-8 cm2/ s14 for å definere diffusjonstanten til AMPARs i membranen (figur 7A).
  2. Opprett ankere. Hvis du vil gjøre dette, velger du Molekyler på CellBlender-panelet. Velg + på definerte molekyler for å sette inn et nytt molekyl og endre navn til anker. Endre molekyltype til overflatemolekyl og endre diffusjonskonstanten til 0,001e-8 cm2/s14 for å definere diffusjonstanten til ankere i membranen (figur 7A).
  3. Hvis du vil opprette ankere bundet til amparer, velger du Molekyler i CellBlender-panelet. Velg + på definerte molekyler for å sette inn et nytt molekyl. Endre navn til anchor_AMPAR. Endre molekyltype til overflatemolekyl. Endre Diffusjon Konstant til 0,001e-8 cm2/s14.
  4. Opprett anchor_LTP og anchor_AMPAR_LTP. Hvis du vil gjøre dette, gjentar du trinn 5.2. Gi molekylet et navn anchor_LTP. Gjenta trinn 5.3. Gi molekylet et navn anchor_AMPAR_LTP.
    MERK: Anchor_LTP har en høy affinitet for AMPAR; dermed øker AMPARs i de synaptiske regionene.
  5. Opprett anchor_LTD og anchor_AMPAR_LTD. Hvis du vil opprette _LTD ,gjentar du trinn 5.2. Gi molekylet et navn anchor_LTD. Gjenta trinn 5.3. Gi molekylet et navn anchor_AMPAR_LTD.
    MERK: Anchor_LTD har lav affinitet for AMPAR; dermed reduseres AMPARs i det synaptiske området.

6. Definer overflateklasser

Merk: Denne fremgangsmåten definerer klassene med egenskapene som er knyttet til overflateområdene. De ekstrasynaptiske områdene gjenspeiler de frie ankere og ankere som er bundet til AMPAR. De laterale endene av dendritten reflekterer alle molekylene.

  1. Definer egenskapene for de ekstrasynaptiske områdene.
    1. Trykk tab for å bytte til objektmodus. Velg Surface-klasser i CellBlender-panelet. Trykk på + på Surface Class for å definere en ny overflateklasse.
    2. Få det ekstrasynaptiske området til å reflektere AMPAR bundet til ankermolekylene.
      MERK: Denne prosedyren vil fange ankrene og alt som er bundet til dem innenfor det synaptiske området.
      1. Endre Surface Class Name til reflective_extra_syn. Trykk + på reflective_extra_syn Egenskaper for å knytte det til et molekyl. Velg Molekyler | Enkelt molekyl. Velg anchor_AMPAR. Velg Retning = Ignorer. Velg Type = Reflekterende for å få regionen til å vise anchor_AMPAR molekylene.
      2. Gjenta trinn 6.1.2.1 for anchor_AMPAR_LTP og anchor_AMPAR_LTD.
    3. Få det ekstrasynaptiske området til å reflektere ankrene.
      1. Trykk + på reflective_extra_syn Egenskaper for å knytte det til et molekyl. Velg Molekyler | Enkelt molekyl. Velg anker. Velg Retning = Ignorer. Velg Type = Reflekterende for å få regionen til å reflektere ankermolekylene.
      2. Gjenta trinn 6.1.3.1 for anchor_LTP og anchor_LTD.
  2. Definer egenskapene for dendrittendene. Hvis du vil gjøre dette, trykker du på + på Surface Class for å definere en ny overflateklasse. Endre Surface Class Name til reflective_ends. Trykk + på Egenskaper for å knytte det til et molekyl. Velg Molekyler | Alle overflatemolekyler. Velg Retning | Ignorer. Velg Type | Reflekterende for å få det til å reflektere alle overflatemolekyler.

7. Tilordne de opprettede klassene til hvert overflateområde

MERK: Dette trinnet tilordner overflateklassene til overflateområdene.

  1. Tilordne egenskapene for endene av dendritt.
    1. Trykk på + for å tilordne en overflateklasse med et område. Velg reflective_ends for Surface Class Name ( figur7C). Velg Dendritt for objektnavn. Velg Angitt område for områdevalg. Velg Left_end for Områdenavn.
    2. Gjenta trinn 7.1.1 for Right_end (figur 7D).
  2. Tilordne egenskapene for de ekstrasynaptiske områdene.
    1. Trykk på + for å tilordne en overflateklasse med et område. Velg reflective_extra_syn for Surface Class-navn. Velg Dendritt for objektnavn. Velg Angitt område for områdevalg. Velg Extra_syn1 for Områdenavn.
    2. Gjenta trinn 7.2.1 for Extra_syn2 , Extra_syn3og Extra_syn4.

8. Plasser molekyler på nettet

MERK: Dette trinnet plasserer AMPARs, ankere og AMPAR bundet til ankere på nettet.

  1. Hvis du vil plassere AMPAR-molekyler Molecules på nettet, velger du Molekylplassering på CellBlender-panelet. Trykk + på utgivelses-/plasseringsnettstedene for å opprette et nytt utgivelsesområde. Endre områdenavn til relAMPAR (figur 7B). Velg Molekyl = AMPAR. Objekt/område = Dendritt[ALL]-(Dendritt[Left_end]+Dendritt[Right_end]). Antall som skal frigis = 1000.
  2. Plasser ankermolekyler på nettet.
    1. Velg Molekylplassering på CellBlender-panelet. Trykk + på utgivelses-/plasseringsnettstedene for å opprette et nytt utgivelsesområde. Endre områdenavn til rel_anchor_PSD1. Velg Molekylanker. Objekt/område = Dendritt[PSD1]. Antall som skal frigis = 200.
    2. Gjenta trinn 8.2.1 for PSD2, PSD3og PSD4.
  3. Plasser anchor_LTP molekyler på nettet. Hvis du vil gjøre dette, velger du Molekylplassering på CellBlender-panelet. Trykk + på utgivelses-/plasseringsnettstedene for å opprette et nytt utgivelsesområde. Endre områdenavn til rel_anchor_LTP_PSD1. Velg Molekyl = anchor_LTP. Objekt/område = Dendritt[PSD1]. Antall som skal frigis = 0.
    MERK: anchor_LTP er et anker med høy bindingsaffinitet for AMPARs.
  4. Plasser anchor_LTD molekyler på nettet ved å gjenta trinn 8.3 for anchor_LTD.
    MERK: anchor_LTD er et anker med lav bindingsaffinitet for AMPARs.

9. Lag de kjemiske reaksjonene

  1. Skape reaksjonen mellom anker og AMPARs.
    1. Velg Reaksjoner (figur 7D) for å opprette reaksjonene. Trykk på + for å inkludere en ny reaksjon. Reaktanter = anker' + AMPAR'. Reaksjonstype = <->. Dette definerer en toveis reaksjon. Produkter = anchor_AMPAR'. Forward Rate = 0,03. Bakoverhastighet = 0,05.
  2. Lag reaksjonen mellom ANCHOR_LTP og AMPARs. Hvis du vil gjøre dette, gjentar du trinn 9.1, men erstatter anker med anchor_LTP, og bruker en bakoverhastighet = 0,005 for å øke affiniteten mellom reaktantene.
  3. Opprett reaksjonen mellom anchor_LTD og AMPARs og lagre filen. Hvis du vil gjøre dette, gjentar du trinn 9.2, men erstatter anker med anchor_LTD, og bruker en bakoverhastighet = 0,5 for å redusere affiniteten mellom reaktantene. Lagre deretter filen.

10. Plott utgangen av modellen

  1. Plot ankere bundet til AMPARs på PSD1 under basal tilstand. Hvis du vil gjøre dette, velger du Innstillinger for plottutdata. Trykk på + for å definere molekylene. Velg anchor_AMPAR på Molekyl. Velg dendritt på objekt. Velg PSD1 på Region. Gjenta trinn 10.1 for alle PSD-regioner.
    MERK: Det er nyttig å observere basal antall fanget AMPARs til PSD av hver dendrittiske ryggrad. Antall ankere som er bundet til AMPARer, kan øke eller reduseres sammenlignet med basalforholdene under LTP og LTD.
  2. Plottankere bundet til AMPARs ved PSD1 under LTP. Gjør dette ved å gjenta trinn 10.1. Erstatt anchor_AMPAR med anchor_AMPAR_LTP, deretter plott ankere bundet til AMPARs på PSD1 under LTD og til slutt gjenta trinn 10.1, men erstatt anchor_AMPAR_LTP med anchor_AMPAR_LTD.

11. Kjør simuleringene

  1. Hvis du vil kjøre basalbetingelsen, velger du Kjør simulering. Velg Iterasjoner = 30 000. Angi tidstrinn = 1e-3 s. Trykk Eksporter og kjør. Vent til simuleringen er over. Det kan ta fra minutter til timer.
    MERK: I basal tilstand er det ingen frigjøring av anchor_LTP og rel_anchor_LTD molekyler. Når det gjelder parametrene for simuleringen, må antall iterasjoner være lenge nok til å kunne observere diffusjonen av AMPARs fra dendrittene og deres forankring ved PSD. Små tidstrinn er mer presise, men langsommere for å fullføre simuleringen.
  2. Velg Last inn visualiseringsdata på nytt. Velg spill av animasjon for å visualisere de spatiotemporale resultatene ( figur8). Velg Innstillinger for plottutdata. Trykk på Plot.
    MERK: Grafene som genereres av CellBlender er isolerte tidsserier av de valgte kjemiske artene. Tredjepartsprogrammer kan brukes til å importere dataene som er lagret fra flere simuleringer, til å opprette overlagte plott med flere betingelser (f.eks. basal, LTP, LTD; se figur 8).
  3. Kjør homosynaptisk potenserende tilstand (det vil vil at LTP; se figur 8). Hvis du vil gjøre dette, velger du Molekylplassering på CellBlender-panelet. Velg rel_anchor_LTP_PSD1 på utgivelses-/plasseringsnettstedene.
  4. Endre antall som skal frigis = 200. Velg rel_anchor_LTD_PSD1 på utgivelses-/plasseringsnettstedene. Endre antallet som skal frigis = 0. Velg rel_anchor _PSD1 på utgivelses-/plasseringsnettstedene. Endre antallet som skal frigis = 0. Gjenta trinn 11.1–11.2.
  5. Kjør homosynaptisk depresjon tilstand (det vil vil at, LTD; se figur 8). Hvis du vil gjøre dette, slipper du 200 rel_anchor_LTD_PSD1 stedet for rel_ANCHOR_LTP_PSD1. Sett rel_anchor og rel_anchor_LTP_PSD1 til null. Gjenta trinn 11.1–11.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse resultatene gir trinnene for bygging av et 3D-nett som simulerer en dendrittisk ryggrad med ryggradshode og ryggradshals (figur 1 til figur 4). I tillegg kan flere dendrittiske spines settes inn i et enkelt dendrittisk segment (figur 5) for å studere heterosynaptisk plastisitet av AMPARs14. PSD på toppen av ryggradshodet (figur 6) er stedet der synaptiske ankere binder seg til AMPARer og fanger dem midlertidig ved synapsen (figur 7, figur 8).

Synaptisk plastisitet kan verifiseres omtrent gjennom endringer i antall arter av anchor_AMPAR, anchor_AMPAR_LTP, og anchor_AMPAR_LTD på hver ryggrad. For den nøyaktige beregningen av forekomsten av synaptisk plastisitet anbefales det å beregne variasjonen i det totale antallet forankrede og gratis AMPARs ved synapsen. Dette kan utføres ved hjelp av tredjepartsprogrammer for å åpne de lagrede dataene i simuleringen for å summere tidsserien til de frie AMPARene og de forankrede AMPARene på hver PSD (figur 8).

Utgivelsen av AMPARs på nettet tillot observasjon av deres diffusjon av en stokastisk tilfeldig tur langs dendritt og dendrittiske spines. Faktorer som endrer affiniteten til AMPARs for ankrene, for eksempel posttranslational modifikasjoner og endringer av frekvensen av endocytose og eksocytose, kan fange AMPARs på PSD24,25,26. Bindingen av AMPARs med ankrene som ligger ved PSD fanget en høy tetthet av AMPARs på synapse. Homosynaptisk potensering (figur 9) og depresjon (figur 10) kan verifiseres henholdsvis gjennom økninger og reduksjoner i antall forankrede AMPARer forårsaket av endringer i ampaRs affinitet av ankere i forhold til basaltilstanden (figur 11). Faktorer som reduserte affiniteten til AMPARs med ankrene utgitt flere AMPARs fra en dendrittisk ryggrad (det vil si homosynaptisk depresjon) og indusert heterosynaptisk potensering ved de nærliggende spines. Også faktorer som økte affiniteten til AMPARs for ankrene ved en ryggrad indusert homosynaptisk potensering ved den ryggraden og heterosynaptisk depresjon ved de nærliggende spines14. På denne måten ble heterosynaptisk plastisitet observert som motsatt effekt ved de nærliggende piggene i homosynaptisk plastisitet indusert ved en gitt ryggrad. For eksempel skapte homosynaptisk LTP-induksjon ved en enkelt ryggrad en heterosynaptisk LTD-effekt ved de nærliggende piggene (figur 8E,F,G).

Figure 1
Figur 1: Opprettelse av dendrittiske ryggraden hodet ved hjelp av en sfærisk mesh. (A)Legge til UV-sfæren. (B)Sette opp sfæredimensjonene. (C) Observere den opprettede sfæren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bygging av den øverste regionen. (A) Velge den øverste regionen av sfæren. (B) Fjerne det valgte området for å gjøre det flatt. (C) Tetting av den flate toppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Opprette konsentriske områder på toppen av ryggraden. (A) Visualisere toppen. (B) Bruke en kniv til å definere et konsentrisk område. (C) Opprette flere konsentriske regioner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Opprette dendrittiske ryggradshalsen. (A) Velge bunnen av den modifiserte sfæren. (B) Slette de valgte toppunktene. (C) Velge bunnen. (D) Ekstrudering av bunnen for å skape ryggraden halsen. (E) Tetting bunnen av ryggraden halsen. (F) Analysere den opprettede ryggraden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Opprettelse av dendritt med flere spines. (A)Bruk det sylindriske nettet til å lage en dendritt. (B)Justere dendrittiske ryggraden med sylinderen. (C) Bli med sylinderen med ryggraden. (D)Den boolske operasjonen for å bli med i nettene. (E) Det nye kombinerte nettet. (F) Legge til den andre ryggraden. (G) Legge til den tredje ryggraden. (H)Legge til den fjerde ryggraden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Definere PSD-regionen og perisynaptisk sone. (A) Velge PSD-regionen. (B) Detaljert visning av den opprettede PSD. (C) Definere PSD overflateområdet. (D) Velge og definere perisynaptisk sone rundt PSD. (E) Velge og definere den laterale overflaten av dendritt. (F)Definerte overflateområder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Definere overflatemolekylene. (A)Definere AMPAR, anker og AMPAR bundet til anker. (B) Definere lokasjon og antall AMPAR-kopier. (C) Definere Overflateklasser. (D) Tilordne Overflateklasser. (E) Skape kjemiske reaksjoner mellom molekylene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Representative resultater av synaptisk plastisitet. (A)Forskjellige masker av et dendrittisk segment med to, fire eller åtte pigger. (B) En annen visning av dendrittiske segmentet med åtte pigger. (C) Detaljert visning av en dendrittisk ryggrad med AMPARer og ankere ved PSD. (D) Diagram over smugling av AMPARs inn og ut av PSD gjennom deres interaksjoner med ankrene. (E-G) Kurvene viser antall synaptiske AMPARer ved hver PSD for basal tilstand og under LTP og LTD. Induksjonen av homosynaptisk LTP eller LTD ved en enkelt ryggrad skapte en heterosynaptisk effekt i de nærliggende piggene for nettet med to spines (E), fire spines (F) og åtte spines (G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Representativt resultat av LTP-betingelsen. (A) X-aksen er tiden og y-aksen er nummeret på den komplekse anchor_LTP_AMPAR psd1. Det var en utgivelse av 200 anchor_LTP i begynnelsen av simuleringen. Et høyere antall obligasjoner med ankere ble dannet i forhold til basal tilstand (Figur 11) Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: Representativt resultat av LTD-betingelsen. (A) X-aksen er tiden, og y-aksen er nummeret på den komplekse anchor_LTD_AMPAR psd1. Det var en utgivelse av 200 anchor_LTD i begynnelsen av simuleringen. Et lavere antall obligasjoner med ankere ble dannet i forhold til basal tilstand (figur 11). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Representativt resultat under basal tilstand. (A) X-aksen er tiden og y-aksen er nummeret på den komplekse anchor_AMPAR psd1. Det var en utgivelse av 200 gratis ankere i begynnelsen av simuleringen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen presenterer en metode for bygging av 3D-nett for modellering av reaksjonsdiffusivjonssynaptiske plastisitetsprosesser i et dendrittisk segment med dendrittiske spines. Den utviklede modellen inneholder et dendrittisk segment med få dendrittiske spines. Den laterale diffusjonen og reaksjonen til AMPARer med synaptiske ankere tillater simulering av basaldynamikken. De kritiske trinnene i protokollen er å kutte sfæren for å skape toppen av ryggraden hodet (Figur 1, Figur 2, Figur 3), ekstrudering for å skape ryggraden halsen (Figur 4), og sammenføyning av dendritt og spines i et enkelt nett (Figur 5). Det er viktig å ha en fullstendig overlapping mellom ryggradshalsene og dendritten; Ellers vil nettet ikke være vanntett. Andre kritiske trinn er valg av membranområdene og definisjonen av overflateklassene (figur 6, figur 7). Lagre filene for hvert kritiske trinn med et annet navn.

Bruk nettanalyseverktøyet for å sikre at nettet er vanntett, mangfoldig og utovervendt normalt etter å ha opprettet enkeltryggraden og etter å ha opprettet den kombinerte dendritten med ryggraden. Hvis nettet mislykkes denne analysen, går du tilbake til den sist riktige versjonen som er lagret. Noen trinn kan være litt forskjellige avhengig av hvilken versjon av programvaren som er installert, operativsystemet og typen tastatur.

Denne protokollen simulerer smugling av AMPAR-molekyler i 3D-nettet (figur 8, figur 9, figur 10, figur 11), som er nøkkelen for nevronal eksikulatorisk overføring og synaptisk plastisitet. Smugling av enkeltmolekyler i et 3D-nett er et verdifullt trekk ved denne modellen med hensyn til eksisterende metoder basert på godt blandede volumer med homogene fordelingerav molekyler 21,22, som ikke er den fysiologiske tilstanden ved synapsene27. En begrensning av denne teknikken er den høye beregningskostnaden og den langsomme hastigheten på simuleringer som bruker et høyt antall kopier av hvert molekyl og et høyt antall kjemiske reaksjoner mellom dem. Denne begrensningen kan overvinnes ved å redusere antall kopier av hver art.

Byggingen av et system med en realistisk 3D-mesh og spatiotemporal sporing av molekyler er et kraftig verktøy for å teste mekaniske scenarier som kan gi stor innsikt om funksjon av systemer med et høyt antall ikke-lineære variabler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av Sao Paulo State Science Foundation (FAPESP) stipend #2015/50122-0 og IRTG-GRTK 1740/2, av IBM/FAPESP stipend #2016/18825-4, og av FAPESP stipend #2018/06504-4.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blender Blender Foundation https://www.blender.org/
CellBlender University of Pittsburgh https://mcell.org/
Mcell University of Pittsburgh https://mcell.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sweatt, J. D. Neural plasticity and behavior - sixty years of conceptual advances. Journal of Neurochemistry. 139, 179-199 (2016).
  2. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320 (5873), 201-205 (2008).
  3. Buonarati, O. R., Hammes, E. A., Watson, J. F., Greger, I. H., Hell, J. W. Mechanisms of postsynaptic localization of AMPA-type glutamate receptors and their regulation during long-term potentiation. Science Signaling. 12 (562), 6889 (2019).
  4. Nair, D., et al. Super-Resolution Imaging Reveals That AMPA Receptors Inside Synapses Are Dynamically Organized in Nanodomains Regulated by PSD95. Journal of Neuroscience. 33 (32), 13204-13224 (2013).
  5. Czöndör, K., et al. Unified quantitative model of AMPA receptor trafficking at synapses. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (9), 3522-3527 (2012).
  6. Triesch, J., Vo, A. D., Hafner, A. S. Competition for synaptic building blocks shapes synaptic plasticity. eLife. 7, 37836 (2018).
  7. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Biophysical model of AMPA receptor trafficking and its regulation during long-term potentiation/long-term depression. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12362-12373 (2006).
  8. Earnshaw, B. A., Bressloff, P. C. Modeling the role of lateral membrane diffusion in AMPA receptor trafficking along a spiny dendrite. Journal of Computational Neuroscience. 25 (2), 366-389 (2008).
  9. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Stochastic Induction of Long-Term Potentiation and Long-Term Depression. Scientific Reports. 6, 30899 (2016).
  10. Kotaleski, J. H., Blackwell, K. T. Modelling the molecular mechanisms of synaptic plasticity using systems biology approaches. Nature Reviews Neuroscience. 11 (4), 239-251 (2010).
  11. Bhalla, U. S. Molecular computation in neurons: a modeling perspective. Current Opinion in Neurobiology. 25, 31-37 (2014).
  12. Czöndör, K., Thoumine, O. Biophysical mechanisms regulating AMPA receptor accumulation at synapses. Brain Research Bulletin. 93, 57-68 (2013).
  13. Bromer, C., et al. Long-term potentiation expands information content of hippocampal dentate gyrus synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2410-2418 (2018).
  14. Antunes, G., Simoes-de-Souza, F. M. AMPA receptor trafficking and its role in heterosynaptic plasticity. Scientific Reports. 8 (1), 10349 (2018).
  15. Kerr, R. A., et al. Fast monte carlo simulation methods for biological reaction-diffusion systems in solution and on surfaces. SIAM Journal on Scientific Computing. 30 (6), 3126 (2008).
  16. Czech, J., Dittrich, M., Stiles, J. R. Rapid Creation, Monte Carlo Simulation, and Visualization of Realistic 3D Cell Models. Systems Biology. 500, 237-287 (2009).
  17. Stiles, J., Bartol, T., et al. Monte Carlo Methods for Simulating Realistic Synaptic Microphysiology Using MCell. Computational Neuroscience. De Schutter,, et al. , CRC Press. (2000).
  18. Jorstad, A., et al. NeuroMorph: A Toolset for the Morphometric Analysis and Visualization of 3D Models Derived from Electron Microscopy Image Stacks. Neuroinformatics. 13 (1), 83-92 (2015).
  19. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes de Souza, F. M. Modelling intracellular competition for calcium: kinetic and thermodynamic control of different molecular modes of signal decoding. Scientific Reports. 6, 23730 (2016).
  20. Antunes, G., Roque, A. C., Simoes-de-Souza, F. M. Molecular mechanisms of detection and discrimination of dynamic signals. Scientific Reports. 8 (1), 2480 (2018).
  21. Hoops, S., et al. COPASI--a COmplex PAthway SImulator. Bioinformatics. 22 (24), 3067-3074 (2006).
  22. Faeder, J. R., Blinov, M. L., Hlavacek, W. S. Rule-based modeling of biochemical systems with BioNetGen. Methods in Molecular Biology. 500, 113-167 (2009).
  23. Gillespie, D. T. Exact stochastic simulation of coupled chemical reactions. Journal of Physical Chemistry. 81 (25), 21 (1977).
  24. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
  25. Matsuda, S., Launey, T., Mikawa, S., Hirai, H. Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons. EMBO Journal. 19 (12), 2765-2774 (2000).
  26. Ahmad, M., et al. Postsynaptic Complexin Controls AMPA Receptor Exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
  27. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annual Review of Biochemistry. 76, 823-847 (2007).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 159 AMPA reseptorhandel reaksjonsdiffusjon synaptisk plastisitet dendrittiske spines beregningsmodellering langsiktig potensering langsiktig depresjon heterosynaptisk plastisitet
3D-modellering av dendrittiske spines med synaptisk plastisitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Antunes, G., Simoes de Souza, F. M.… More

Antunes, G., Simoes de Souza, F. M. 3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity. J. Vis. Exp. (159), e60896, doi:10.3791/60896 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter